Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att skapa utvecklingsrelevanta humana hjärtorganoider (hHOs) effektivt med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller genom självorganisering. Protokollet bygger på sekventiell aktivering av utvecklingssignaler och producerar mycket komplexa, funktionellt relevanta mänskliga hjärtvävnader.
Abstract
Förmågan att studera mänsklig hjärtutveckling i hälsa och sjukdom är mycket begränsad av förmågan att modellera komplexiteten hos det mänskliga hjärtat in vitro. Att utveckla effektivare organliknande plattformar som kan modellera komplexa in vivo-fenotyper , såsom organoider och organ-på-ett-chip, kommer att förbättra förmågan att studera mänsklig hjärtutveckling och sjukdom. Detta dokument beskriver ett protokoll för att generera mycket komplexa mänskliga hjärtat organoider (hHOs) genom självorganisering med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller och stegvis utvecklingsmässiga utbildningsaktivering med hjälp av små molekylhämmare. Embryoidkroppar (EBs) genereras i en 96-brunnsplatta med rundbottnade, ultralåga fästbrunnar, vilket underlättar suspensionskulturen hos individualiserade konstruktioner.
EBs genomgår differentiering i hHOs genom en tre-steg Wnt signalering modulering strategi, som innebär en första Wnt utbildnings aktivering för att inducera hjärt mesoderm öde, ett andra steg av Wnt hämning för att skapa slutgiltiga hjärt härstamningar och en tredje Wnt aktivering steg för att inducera proepicardial organ vävnader. Dessa steg, utförda i ett 96-brunnsformat, är mycket effektiva, reproducerbara och producerar stora mängder organoider per körning. Analys av immunofluorescens imaging från dag 3 till dag 11 av differentiering avslöjar första och andra hjärtat fält specifikationer och mycket komplexa vävnader inuti hHOs dag 15, inklusive hjärtmuskel vävnad med regioner av förmakscancer och ventrikulärt kardiomyocyter, samt inre kammare fodrade med endokardial vävnad. Organoiderna uppvisar också ett invecklat vaskulär nätverk genom hela strukturen och ett yttre foder av epicardial vävnad. Ur funktionell synvinkel slår hHOs robust och presenterar normal kalciumaktivitet som bestäms av Fluo-4 live imaging. Sammantaget utgör detta protokoll en solid plattform för in vitro-studier i mänskliga organliknande hjärtvävnader.
Introduction
Medfödda hjärtfel (CHD) är den vanligaste typen av medfödd defekt hos människor och påverkar cirka 1% av alla levande födda1,2,3. Under de flesta omständigheter är orsakerna till chd fortfarande okända. Förmågan att skapa mänskliga hjärtmodeller i labbet som liknar det utvecklande mänskliga hjärtat utgör ett viktigt steg framåt för att direkt studera de underliggande orsakerna till CHD hos människor snarare än i surrogatdjurmodeller.
Symbolen för laboratorieodlade vävnadsmodeller är organoider, 3D-cellkonstruktioner som liknar ett organ av intresse för cellsammansättning och fysiologisk funktion. Organoider härrör ofta från stamceller eller stamceller och har framgångsrikt använts för att modellera många organ som hjärnan4,5, njure6,7, tarm8,9, lung10,11, lever12,13 och bukspottkörtel14,15 , bara för att nämna några. Nyligen genomförda studier har dykt upp som visar möjligheten att skapa självmonterande hjärtorganoider för att studera hjärtutveckling in vitro. Dessa modeller inkluderar användning av mus embryonala stamceller (mESCs) för att modellera tidig hjärtutveckling16,17 upp till atrioventrikulär specifikation18 och mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) för att generera multi-bakterie lager hjärt-endoderm organoider19 och kammade kardioider20 med mycket komplex cellulär sammansättning.
Detta dokument presenterar ett nytt 3-stegs WNT modulering protokoll för att generera mycket komplexa hHOs på ett effektivt och kostnadseffektivt sätt. Organoider genereras i 96-brunnsplattor, vilket resulterar i ett skalbart system med hög genomströmning som enkelt kan automatiseras. Denna metod bygger på att skapa hPSC aggregat och utlösa utvecklingsmässiga steg av cardiogenesis, inklusive mesoderm och hjärt mesoderm bildandet, första och andra hjärtat fält specifikation, proepicardial organ bildas och atrioventricular specifikation. Efter 15 dagar av differentiering innehåller hHOs alla större cell härstamningar som finns i hjärtat, väldefinierade inre kammare, förmakscelliga och ventrikulära kammare och ett vaskulär nätverk i hela organoiden. Detta mycket sofistikerade och reproducerbara hjärtorganoidsystem är mottagligt för att undersöka strukturella, funktionella, molekylära och transkriptomiska analyser i studien av hjärtutveckling och sjukdomar och farmakologisk screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hPSC-kultur och underhåll
OBS: De humana inducerade PSC (hiPSCs) eller mänskliga embryonala stamceller (hESCs) måste odlas i minst 2 på varandra följande passager efter upptining innan de används för att generera EBs för differentiering eller ytterligare kryopreservation. hPSCs odlas i PSC-medium (se materialtabellen) på källarmembran-extracellulär matris (BM-ECM)-belagda 6-brunnskulturplattor. När du utför medelstora förändringar på hPSCs i 6-brunnsplattor, tillsätt mediet direkt till brunnens inre sida snarare än direkt ovanpå cellerna för att förhindra oönskad cellavlossning eller stress. Användare bör akta sig för förvärmda PSC-medier som inte bör värmas vid 37 °C. Alla PSC-medier som används i detta protokoll var termostable.
- För att belägga brunnsplattorna med BM-ECM, tina en alikvot av BM-ECM (lagrad vid -20 °C enligt tillverkarens instruktioner) på is och blanda 0,5 mg BM-ECM med 12 ml kallt Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM)/F12 medium (lagrat vid 4 °C). Fördela 2 ml DMEM/F12-BM-ECM-blandningen på varje brunn på en 6-brunnsplatta och inkubera vid 37 °C i minst 2 timmar.
- För att tina cellerna tina först hPSC cryovial i en 37 °C pärla eller vattenbad i 1-2 min tills endast en liten mängd is är synlig. Överför de tinade cellerna till ett centrifugrör och tillsätt långsamt 8-9 ml PSC-mediet kompletterat med 2 μM AV ROCK-hämmaren, thiazovivin (Thiaz) och centrifugera vid 300 × g i 5 min. Ta bort supernatanten och återanvänd cellpelleten i PSC-mediet kompletterat med 2 μM Thiaz. Fördela cellerna i odlingsmediet i 1-2 brunnar beroende på kryovialcellens koncentration och kultur vid 37 °C, 5% CO2 i 24 timmar innan psc-mediet ändras.
- Ändra mediet på cellerna med 48 h intervall. Utför tvättar och medelstora förändringar med DMEM/F12 (1 ml/brunn) respektive PSC-mediet (2 ml/brunn).
OBS: Tvättar hjälper till att ta bort cellavfall och skräp medan nya medieförändringar ger cellerna en förnyad näringskälla. - Passage cellerna vid underflöde (60-80% sammanflöde) genom att aspirera mediet och tvätta sedan varje brunn med 1 ml 1x Dulbeccos fosfatbuffrade lösning (inget kalcium, inget magnesium; DPBS). Aspirera DPBS och tillsätt 1 ml av dissociation reagens för hPSCs (se tabellen över material), följt av strävan av alla utom en tunn film av reagenset efter 10 s.
- Inkubera i 2-5 min med den tunna filmen av dissociation reagens för hPSCs tills luckor bildas mellan celler.
Tiden för att stoppa dissociationen är celllinjeberoende. - Tillsätt 1 ml PSC-mediet kompletterat med 2 μM Thiaz (PSC medium+Thiaz) till brunnen och knacka försiktigt på plattan för att inducera cellavlossning. Pipettera de fristående cellerna i mediet 1-2 gånger för att bryta upp några stora kolonier och återanvända cellerna i PSC medium + Thiaz i ett 1: 6 brunnsförhållande (celler från 1 brunn resuspended i 12 ml odlingsmedium). Replate cellerna på BM-ECM-belagda brunnar.
2. Generering av 3D självmonterande mänskliga hjärtorganoider
- Embryoidkropp (EB) bildning:
OBS: Det är absolut nödvändigt att begränsa observerbara differentierade celler före embryoid kroppsbildning. Två till tre brunnar av en 6-brunnsplatta vid en 60-80% confluency kommer att ge tillräckligt med celler för en enda 96-väl tallrik organoider. Alla medier ska alikvoteras och värmas upp i ett 37 °C pärla eller vattenbad innan något medium ändras för att minimera temperaturchock för EBs eller organoider (detta inkluderar inte reagenser för cellavskiljning). Se figur 1A,B.- Dag -2
- För att skapa EBs, på dag -2, tvätta underkonfluent hPSCs (60-80% confluent) med DPBS i minst 10 s för att tvätta eventuella cellskräp och aspirera DPBS.
- För att lossa cellerna och släppa dem i ett encellstillstånd, tillsätt 1 ml dissociation av rumstempoceller (se materialtabellen) till varje brunn i 3-6 min. Knacka försiktigt på plattan ~ 5 gånger varje minut för att inducera avlossning medan du kontrollerar under mikroskopet. Tillsätt 1 ml PSC medium+Thiaz för att stoppa reaktionen.
- För att samla in cellerna och bryta upp eventuella återstående aggregat, pipettera mediet upp och ner i brunnen 2-3 gånger för att generera en encellig suspension. Överför encellsfjädringen till ett centrifugrör och snurra i 5 minuter vid 300 × g.
- För att erhålla önskad cellkoncentration, kassera supernatanten och återanvänd cellerna i 1 ml PSC medium+Thiaz. Räkna cellerna med en cellräknare eller hemocytometer och späd cellerna i PSC medium+Thiaz till en koncentration av 100 000 celler/ml.
- För att fördela cellerna för EB-bildning, använd en flerkanalspipett för att lägga till 100 μL (10 000 celler) till varje brunn på en rundbottnad ultralåg fastsättning 96-brunnsplatta. Centrifugera plattan vid 100 × g i 3 min och inkubera i 24 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag -1
- Ta försiktigt bort 50 μL medium från varje brunn och tillsätt 200 μL färskt PSC-medium som värms upp till 37 °C för att uppnå en slutlig volym på 250 μL per brunn. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Ta bort och tillsätt medium försiktigt på sidan av brunnen för att undvika att störa EBs längst ner i brunnen. På grund av DE ES:s känsliga karaktär och suspensionskulturen är det nödvändigt att lämna en liten mängd vätska i varje brunn när man byter medium för att undvika att störa EB: erna.
- Ta försiktigt bort 50 μL medium från varje brunn och tillsätt 200 μL färskt PSC-medium som värms upp till 37 °C för att uppnå en slutlig volym på 250 μL per brunn. Inkubera cellerna i 24 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag -2
- Differentiering av humant hjärtaorganoid (hHO):
OBS: Alla medier ska värmas upp i ett 37 °C pärla eller vattenbad innan media ändras. Ta bort och tillsätt medium försiktigt på sidan av brunnen för att undvika att störa de utvecklande organoiderna längst ner i brunnen. Tvättar behövs inte mellan medieförändringar för att minimera agitation och möjliggöra gradvis avlägsnande av hämmare och tillväxtfaktorer. RPMI med 2% B-27 tillägg (Tabell över material) användes under hela differentieringsprotokollet. B-27 tillägg innehåller insulin om inte annat anges (insulinfritt i dag 0-5). Se bild 1C.- Dag 0
- För att initiera differentiering mot en mesoderm härstamning, ta bort 166 μL medium från varje brunn (~ 2/3 av den totala brunnsvolymen) och tillsätt 166 μL RPMI 1640 innehållande insulinfritt B-27-tillägg, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng/mL benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4) och 1,875 ng/mL benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4) och 1,875 ng/mL benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4) och 1,875 ng/mL benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4) och 1,5 1,25 ng/mL BMP4 och 1 ng/mL Activin A. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag 1
- Ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL färsk RPMI 1640 med insulinfritt B-27-tillägg. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag 2
- För att inducera hjärtmesomatspecifikation, ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL RPMI 1640 innehållande insulinfritt B-27-tillägg och 3 μM Wnt-C59 för en slutlig brunnskoncentration på 2 μM Wnt-C59.
- Dag 4
- Ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL färsk RPMI 1640 med insulinfritt B-27-tillägg. Inkubera i 48 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag 6
- Ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL RPMI 1640 med B-27 tillägg. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
- Dag 7
- För att inducera proepicardial differentiering, ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL färsk RPMI 1640 innehållande B-27 tillägg och 3 μM CHIR99021 för en slutlig brunnskoncentration på 2 μM CHIR99021. Inkubera i 1 h vid 37 °C, 5% CO2.
- Ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL färsk RPMI 1640 som innehåller B-27-tillägg. Inkubera i 48 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Extra försiktighet rekommenderas vid denna andra medelstora förändring på dag 7 eftersom organoiderna är mer benägna att röra sig på grund av mediaförändringar. - Från dag 7 och framåt till insamling eller överföring för analys eller experiment, utför medelstora förändringar var 48: e timme genom att ta bort 166 μL medium från varje brunn och tillsätt 166 μL färsk RPMI 1640 innehållande B-27 tillägg.
OBS: Organoider är redo för analyser och experiment dag 15 om inte tidigare utvecklingsstadier är av intresse. De kan odlas förbi dag 15 för långsiktiga kultur- eller mognadsexperiment.
- Dag 0
3. Organoid analys
- Överföring av hela organoider (levande eller fasta)
OBS: För levande organoidöverföring, se till att pipettspetsar som används är sterila.- Skär av spetsen från en P200 pipetterspets 5-10 mm från spetsöppningen, vilket resulterar i en bred öppning på ~2-3 mm diameter.
- För in spetsen rakt i den runda bottenbrunnen som innehåller organoiden så att pipetten är helt vertikal (vinkelrät mot plattan). Se till att pipettkolven redan är intryckt hela vägen innan spetsen sätts in i mediet.
- Släpp långsamt pipetten kolven, ta upp tillräckligt med medium (100-200 μL) för att samla organoiden.
- Överför organoiden i medium till måldestinationen (t.ex. för fixering, liveavbildning, elektrofysiologiinspelning, ny plåtkultur).
- Fixering av organoider
OBS: Fixering och färgning av organoider kan göras antingen i 96-brunnsodlingsplattan eller mikrocentrifugerören. Paraformaldehyd (PFA) ska endast hanteras i en rökhuv.- För fixering i mikrocentrifugerör, överför levande organoider till separata rör med 1-8 organoider per rör.
OBS: Överskrid inte 8 organoider per rör. - Ta försiktigt bort och kassera så mycket medium från röret som möjligt utan att röra vid organoiderna.
- Tillsätt 4% PFA till varje rör eller brunn (300-400 μL per mikrocentrifugerör och 100-200 μL per brunn på en 96-välplatta). Inkubera vid rumstemperatur i 30-45 min.
OBS: Inkubationstider över 1 h kan kräva antigenhämtningssteg och rekommenderas inte. - Kassera PFA på ett säkert sätt utan att störa organoiderna. Utför 3 tvättar med DPBS kompletterat med 1,5 g/l glycin (DPBS/Gly), med samma volym som används för 4% PFA, väntar 5 min mellan tvättar. Ta bort DPBS/Gly och fortsätt till immunstaining eller andra analyser eller tillsätt DPBS och förvara vid 4 °C för framtida användning i upp till 2 veckor.
OBS: Lagring av fasta organoider längre än 2 veckor kan leda till vävnadsnedbrytning och kontamination och rekommenderas inte.
- För fixering i mikrocentrifugerör, överför levande organoider till separata rör med 1-8 organoider per rör.
- Hela montering immunofluorescent färgning
- Tillsätt 100 μL blockerings-/permeabiliseringslösning (10% normalt åsneserum + 0,5% bovint serumalbumin (BSA) + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) till varje brunn eller rör som innehåller de fasta organoiderna. Inkubera vid rumstemperatur över natten på en shaker.
OBS: Överskrid inte 8 organoider per rör. - Ta försiktigt bort och kassera så mycket av blockeringslösningen som möjligt utan att röra vid organoiderna. Utför 3 tvättar med DPBS, vänta 5 min mellan tvättar.
- Förbered den primära antikroppslösningen (1% normalt åsneserum + 0, 5% BSA + 0, 5% Triton X-100 i 1x DPBS) med önskade primära antikroppar vid de rekommenderade koncentrationerna. Inkubera vid 4 °C i 24 timmar på en shaker.
- Ta försiktigt bort och kassera så mycket av antikroppslösningen som möjligt utan att röra vid organoiderna. Utför 3 tvättar med DPBS, vänta 5 min mellan tvättar.
- Förbered sekundär antikroppslösning (1% normalt åsneserum + 0, 5% BSA + 0, 5% Triton X-100 i 1x DPBS) med önskade sekundära antikroppar vid de rekommenderade koncentrationerna. Om antikropparna är fluorescerande märkta, inkubera vid 4 °C i mörker (t.ex. täckt av aluminiumfolie) i 24 timmar på en shaker.
- Ta försiktigt bort och kassera så mycket av antikroppslösningen som möjligt utan att röra vid organoiderna. Utför 3 tvättar med DPBS, vänta 5 min mellan tvättar.
- Förbered diabilder med pärlor (90-300 μm i diameter) monterade i ett monteringsmedium (se materialbordet) nära kanterna på bilden där täckslipet med organoiderna kommer att placeras.
OBS: Det rekommenderas att monteringsmediet runt pärlorna torkar innan du fortsätter; detta förhindrar pärlor från att röra sig runt. Se figur 2. - Överför de färgade organoiderna med hjälp av en skuren pipettspets på rutschkanan, mellan pärlorna, vilket säkerställer avstånd för att undvika kontakt mellan organoiderna en gång på bilden. Använd hörnet av en hoprullad laboratorieservett för att försiktigt avlägsna överflödig vätska runt organoiden.
- Täck organoiderna med monteringsrensningsmedium (fruktos-glycerol clearinglösning är 60% (vol/vol) glycerol och 2,5 M fruktos)37 med 120-150 μL av monterings-clearingmediet per bild.
OBS: Vi rekommenderar att du använder en skärpipettspets när du arbetar med monteringsmaterialet eftersom det är mycket trögflytande. - Håll omslaget över rutschkanan med organoiderna täckta med monteringsrensningslösning och tryck långsamt täcket över rutschkanan, så att organoiderna är mellan de monterade pärlorna.
- Försegla omkretsen av täckslipet på rutschkanan med hjälp av topplacks nagellack. Låt glidbilden torka i mörkret vid rumstemperatur i 1 h. Förvara vid 4 °C i mörker för långtidsförvaring.
- Tillsätt 100 μL blockerings-/permeabiliseringslösning (10% normalt åsneserum + 0,5% bovint serumalbumin (BSA) + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) till varje brunn eller rör som innehåller de fasta organoiderna. Inkubera vid rumstemperatur över natten på en shaker.
- Kalcium övergående avbildning i levande hjärtorganoider
OBS: Enligt tillverkarens instruktioner rekonstruerades Fluo4-AM i dimetylsulfoxid (DMSO) till en slutlig beståndslösningskoncentration på 0,5 mM. Fluo4-AM lades direkt till organoidbrunn i 96-brunnsplattan.- Utför 2 tvättar på organoiderna med RPMI 1640 medium.
- Ta bort 166 μL av det förbrukade mediet från brunnen.
- Tillsätt 166 μL varm RPMI 1640 medium, ta bort 166 μL medium och tillsätt 166 μL färsk RPMI 1640 medium.
OBS: Tvättarna görs för att avlägsna avfallsmaterial och cellrester. Två tredjedelar av mediet avlägsnas från brunnarna under tvättar för att undvika att störa organoiderna längst ner i brunnen före den funktionella analysen.
- Tillsätt Fluo4-AM medium till organoiderna.
- Tillsätt Fluo4-AM rekonstituerad i DMSO till RPMI 1640 innehållande B-27 tillägg för att förbereda en 1,5 μM lösning.
- Ta bort 166 μL medium från brunnen.
- Tillsätt 166 μL 1,5 μM Fluo4-AM i RPMI 1640 innehållande B-27-tillägg för en slutlig brunnskoncentration på 1 μM. Inkubera vid 37 °C, 5% CO2 i 30 min.
- Utför 2 tvättar enligt steg 3.4.1.
- Tillsätt 166 μL RPMI 1640 innehållande B-27 tillägg till brunnen.
- Överför organoiden med hjälp av en skuren spets av en P200-pipettspets till en petriskål med glasbotten (t.ex. 8-väl kammat täckglas med #1,5 högpresterande täckglas) med 100-200 μL medium.
OBS: Se avsnitt 3.1 om överföring av hela organoider. - Föreställ dig att organoiderna lever under ett mikroskop med en temperatur- och CO2-kontrollerad kammare vid 37 °C, 5% CO2.
- Spela in flera 10-20 s videor på olika platser över hela organoiden, vilket visar ökningen och minskningen av fluorescensintensiteten när kalciumet kommer in och ut ur cellerna.
OBS: För högupplösta inspelningar rekommenderas att spela in med en hastighet av 10 fps eller snabbare; 50 fps rekommenderas. - Analysera videorna med hjälp av bildanalysprogramvara (t.ex. ImageJ) genom att välja områden av intresse och mäta intensitetsnivåer över tid.
- Normalisera intensitetsinspelningarna med ΔF/F0 jämfört med tiden i millisekunder och plotta.
- Utför 2 tvättar på organoiderna med RPMI 1640 medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att uppnå självorganiserande hHO in vitro, ändrade vi och kombinerade differentieringsprotokoll som tidigare beskrivits för 2D monolayer differentiering av kardiomyocyter21 och epicardial celler22 med Wnt utbildningsmodulatorer och för 3D precardiac organoider16 med hjälp av tillväxtfaktorerna BMP4 och Activin A. Med hjälp av 96-brunnsplattan EB och hHO differentieringsprotokoll som beskrivs här och visas i figur 1 optimerades koncentrationerna och exponeringstiden för Wnt-banaktivatorn CHIR99021 för att ge mycket reproducerbara och komplexa hHOs som härrör från mänskliga pspscs. hPSCs eller hESC odlade i PSC-medium till 60-80% sammanflöde i koloniliknande bildning med minimal till ingen synlig differentiering är idealiska för EB-generering (figur 1B).
EBs tilläts inkubera i 48 timmar med en medelstor förändring efter 24 timmar innan differentiering började på dag 0. På dag 0 ska EBs visas som ett mörkt sfäriskt aggregat i mitten av varje brunn under ett ljusmikroskop (figur 1B). Differentieringsprotokollet börjar dag 0 med Wnt-vägen aktivering och tillväxtfaktor tillägg för exakt 24 h. Denna mesoderminduktion följt av en hjärt mesoderm induktion dag 2 med Wnt utbildningshämmare Wnt-C59 kommer att resultera i en betydande utvidgning av organoiden från ~ 200 μm i diameter till 500-800 μm i diameter på dag 4 och till så mycket som 1 mm (organoider kan uppleva en liten minskning av storleken vid dag 15 (figur 1C)). HHO kommer att börja slå så tidigt som dag 6 (Video 1), med 100% av organoiderna visar synlig misshandel dag 10 (Video 2) (såvida det inte genomgår läkemedelsbehandling eller om otillräckliga hPSCs användes för att generera EBs). Detta har observerats i 5 distinkta hPSC cellinjer23.
För att utvärdera hHOs förmåga att representera olika steg i hjärtats fysiologiska utveckling samlade vi organoider vid olika tidpunkter under differentieringsprotokollet och letade efter närvaro och transkriptomiskt uttryck av hjärtfältmarkörer. Immunofluorescent färgning för det första hjärtfältet (FHF) markör, HAND1, och andra hjärtat fältet (SHF) markör, HAND2, visade deras nukleära närvaro i dessa hjärt stamceller uppstår vid cirka dag 3 och dag 5, respektive (figur 3A).
Uttrycket av båda markörer sker i regioner av organoiderna som minskar i storlek efter dag 7 för FHF och efter dag 9 för SHF. Intressant nog visade bilder med hög förstoring av dag 7 organoider att de flesta HAND1-uttryckande celler var kardiomyocyt i ursprung (som visas av kardiomyocyt-specifika markören TNNT2). Däremot uttryckte många av de HAND2-uttryckande cellerna inte kardiomyocytmarkören (figur 3B). Denna iakttagelse är i överensstämmelse med precardiac organoider härrör från mus ESCs visar utvecklingen av icke-myocyte celler från SHF stamceller16. Det är viktigt att notera att RNA-sekvenseringsdata visar att RNA-transkripten för både HAND1 och HAND2 uttrycktes från dag 3 och framåt, med FHF-markören mer uttalad mellan dag 3 och 11 och SHF-markören uttrycktes mer efter dag 13 (figur 3C).
Immunofluoreescence färgning visade förekomsten av markörer av olika cell-typ härstamningar som utgör det mänskliga hjärtat. Hjärtmuskelvävnad (identifierbar med hjälp av kardiomyocytspecifik markör TNNT2) intill epikial vävnad (markerad med den nukleära transkriptionsfaktorn WT1 och epitelmembranmarkören TJP1) (figur 4A). Endokardial celler uttrycker NFATC1 upptäcktes fodra väggarna i inre kammaren-liknande strukturer inom organoiderna (figur 4B). Endotelceller i ett kärlliknande nätverk kan ses redan dag 13 av differentiering (figur 4C). Slutligen rapporterar vi förekomsten av hjärt fibroblasts blandas i hela organoiden (figur 4D). Dessa markörer av celltyp observerades också i genuttrycksprofilerna RNA-Seq (figur 4E). Sammansättningen av celltyper i organoiderna, mätt efter område av den organoid de upptar, konstaterades vara ~ 58% kardiomyocyter, medan resten består av icke-myocyt hjärtceller, inklusive epicardial celler (~ 15%), endokardialceller (~ 13%), hjärtfibblaster (~ 12%), och endotelceller (~ 1%) (figur 4F).
Organoidernas elektrofysiologiska funktion mättes genom levande kalcium imaging av enskilda celler i hela organoider. Fluo-4 fluorescensintensiteten varierar över tid på grund av kalciuminträde och utgång från cellen, vilket avslöjar regelbundna åtgärdspotentialer (figur 5A). Värmekartor som visar kalciumintensiteter över en högförstoringsregion i organoiden visar den ökade intensiteten på grund av kalcium transienter i enskilda celler (figur 5B och video 3).
Figur 1: Embryoidkroppsgenerering och steg för kroppsdifferentiering av hjärta. (3) 96-brunnsplattan centrifugeras sedan, vilket gör att cellerna kan aggregeras i mitten. (4) Med tiden, efter tillsats av tillväxtfaktorer och vägmodulatorer, börjar embryoidkroppen differentiera sig till flera hjärtstammar och bilda rumsligt och fysiologiskt relevanta distinkta cellpopulationer som omger inre mikrochamber. B) Representativa bilder av utvecklingen av embryoidkroppsgenerering, som börjar med 2-dimensionell iPSC-kultur (vänster) och slutar med en embryoidkropp dag 0 (höger). Skalstång = 500 μm. (C) Sammanfattning av humant hjärtaorganoid differentieringsprotokoll, inklusive kemiska vägmodulatorer och hämmare med respektive tidpunkter, varaktigheter och utveckling av organoida bilder under ljusmikroskopi från dag 1 till dag 15. skalstång = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Hel organoidmontering på diabilder för avbildning. Steg för att förbereda diabilder och montering av organoider för avbildning. A) Placering av mikrober i periferin på en glasrutschbana. B) Täcka mikroberna med monteringsmedium. C) Överföra organoider till glidningen mellan pärlorna och avlägsna överflödig vätska som omger organoiderna. D) Täcka organoiderna med clearing/monteringsmedium. (E) Placera täckslipet ovanpå rutschkanan med organoider och pärlor. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Första hjärtfält och andra hjärtfältsspecifikation i hHOs rekapitulerar fysiologisk utveckling av mänskligt hjärta. (A) Konfokal immunofluorescensbilder från dag 3 till dag 11 hHOs som visar bildandet av FHF (HAND1, top) och SHF (HAND2, botten) och kardiomyocyter (TNNT2) och nukleärt färgämne DAPI; skalstänger = 500 μm. (B) Bilder med hög förstoring av dag 7-organoider som visar samlokalisering av HAND1 och HAND2 med kardiomyocytmarkören TNNT2; skalstänger = 50 μm. (C) RNA-Seq genuttrycksprofiler för FHF-markör HAND1 (röd) och SHF-markör HAND2 (blå) från dag 0 till dag 19. Förkortningar: hHOs = humana hjärtorganoider; FHF = första hjärtfältet; SHF = andra hjärtfältet; HAND = hjärt- och neuralvapenderivat uttryckta; TNNT2 = hjärt troponin T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: hHOs utvecklamultiple hjärt härstamningar. (A-D) Konfokal immunofluorescens bilder av dag 15 hHOs visar bildandet av kardiomyocyter (TNNT2) och färgning med nukleära färgämne DAPI i icke-myocyt hjärtceller. A) Hela organoiden och den höga förstoringen av epicardialmarkör WT1 (grön) och epitelmembranmarkör TJP1 (vit) som visar epitelceller av epiteliskt ursprung ovanpå och intill myokardvävnad. Skalstång = 500 μm, infälld = 50 μm. (B) Endocardial markör NFATC1 (grön) uttryck på kamrarnas foder; skalstång = 500 μm. (C) Endotelfartygsnätverk i hHOs som visas av PECAM1 (grön). Skalstång = 500 μm. (D) Hjärtfibblaster markörer THY1 respektive VIM visas i grönt och vitt, fördelade över hela organoiden. Skalstapel = 500 μm. (E) RNA-Seq genuttrycksprofiler för de viktigaste celltyperna som finns i hHOs från dag 0 till 19 av differentiering. Förkortningar: hHOs = humana hjärtorganoider; TNNT2 = hjärt troponin T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole; WT1 = Wilms tumör-1 transkriptionsfaktor; NFATC1 = cytoplasmisk kärnfaktor för aktiverad T-cell; PECAM1 = trombocyt endotelcells vidhäftningsmolekyl-1; VIM = vimentin. (F) Cirkeldiagram över genomsnittlig vävnadstypsammansättning i hHOs, beräknat som det procentuella området med respektive cellmarkör över en hel organoid genom kärnfärgning över tre z-plan i hela organoiden med ImageJ. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Fluo-4 levande kalcium transienta inspelningar i levande mänskliga hjärtat organoider. (A) Representativa övergående kalciumregistreringar av enskilda kardiomyocyter inom hela organoider. B) Värmekarta som visar låga kalciumnivåer och toppkalciumnivåer mellan aktionspotentialer som bestäms av Fluo-4-intensiteten. skalstaplar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Live imaging av representativ organoid som härrör från hPSCs dag 6 av differentiering under ljusmikroskopi vid rumstemperatur. Förkortning: hPSC = human pluripotent stamcell. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Live imaging av representativ organoid som härrör från hPSCs dag 15 av differentiering under ljusmikroskopi vid rumstemperatur. Förkortning: hPSC = human pluripotent stamcell. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Liveinspelning av dag 10 organoid som visar värmekarta över kalcium transienter under ett fluorescensmikroskop. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De senaste framstegen inom humana stamcellsbaserade kardiomyocyter och andra celler av hjärtursprung har använts för att modellera mänsklig hjärtutveckling22,24,25 och sjukdom26,27,28 och som verktyg för att screena terapeutiska läkemedel29,30 och giftiga ämnen31,32 . Här rapporterar vi ett lättimperierat, mycket reproducerbart protokoll för att generera och differentiera EBs till mycket komplexa hHOs. Det här protokollet har lyckats i flera cellinjer, inklusive hPSCs och hESCs23, som visar konsekventa slagfrekvenser och celltypsorganisation. Detta protokoll drar aspekter från tidigare beskrivna protokoll för kardiomyocyt differentiering24, epicardial cell differentiering22 och precardiac organoider härrör från musen ESCs16 och optimerar stegvis modulering av kanoniska WNT signalering med kemiska hämmare och tillväxtfaktorer i ett fullt definierat medium. Flera optimeringsmetoder användes i genereringen av detta protokoll.
För det första har koncentrationerna av kemiska hämmare och exponeringstiden, liksom tillägg av tillväxtfaktorer, optimerats för 3D-miljön och diskuteras i tidigare arbete23. Dessa optimerades för att klargöra strukturer med fysiologisk komplexitet och representation av in vivo mänskliga hjärtat, med fysiologisk sammansättning och förhållanden av kardiomyocyter till icke-myocyte hjärtcell typer (epicardial celler, hjärt fibroblaster). För det andra möjliggör två tredjedelars medelförändringsstrategi minimal agitation av EBs/ organoider, eftersom de sitter i suspension nära botten av brunnen, samtidigt som de underlättar en gradientexponering för kemiska hämmare och tillväxtfaktorer när mediet uppdateras. Kombinationen av hjärt mesoderm differentiering genom Wnt utbildnings aktivering, följt av hämning24, och efterföljande induktion av proepicardial specifikation via en andra Wnt utbildnings aktivering22, möjliggör ett enda protokoll för att ge mycket komplexa hHOs. Organoiderna växer upp till 1 mm efter 15 dagars differentiering och kan enkelt överföras för levande eller fasta analyser och analyser. För det tredje, med tanke på organoidernas stora storlek, konstaterades användningen av mikrober eller andra liknande strukturer för att upprätthålla utrymmet mellan rutschkanan och täckslipet för att bättre bevara 3D-strukturen hos organoiderna och förbättra avbildningsprocessen.
Denna utvecklande mänskliga hjärtmodell ger tillgång till annars otillgängliga stadier av hjärtutveckling, såsom tidig första och andra hjärtat fältspecifikation-observeras mellan dag 3 och 9 av differentiering-och organisation i hjärt stamceller som ger upphov till hjärtvävnader, inklusive myokardi, endokardi, epicardium, endotel, endotel vaskulatur och stödja hjärt fibroblaster, som observerades på dag 15 av differentiering. De vävnadstyper som finns i hjärtat organoider härrör från detta protokoll är mycket representativa för mänskliga fetala hjärtat i både komposition33 och transkriptomic profil23,34. De kan därför underlätta vävnads-vävnad och cell-cellen högre ordning interaktioner som liknar in vivo hjärtat. Detta protokoll var mycket effektivt och reproducerbart över experiment och cellinjer, vilket ger organoider som till största delen består av kardiomyocyter och inkluderar icke-myocyt hjärtceller, såsom epicardial celler, endokardceller, hjärtfibblaster och endotelceller, som representerar den fysiologiska kompositionen23,33,35.
Analyser av den ytterstastrukturen i de formande kardiomyocyterna via transmission elektronmikroskopi och utvecklingen av kammare och ett vaskulär nätverk via optisk koherenstomografi och konfokal avbildning diskuteras i detalj i tidigare arbete23. En stor fördel med detta hjärta organoid protokoll över andra befintliga protokoll nyligen publicerade17,18,19,20,36,37 är den robusta bildandet av ett endotel nätverk i hela organoiden, vilket möjliggör förmågan att undersöka vaskulär utveckling och sjukdom i det tidiga mänskliga hjärtat, utan behov av ytterligare externa induktioner till protokollet. Slutligen är funktionell analys av hjärtat organoider uppnåelig genom olika metoder, inklusive användning av ett kalciumkänsligt färgämne för att spåra kalcium transienter i kardiomyocyterna över organoiden. Med hjälp av högupplöst mikroskopi registrerade vi fluorescensintensiteten hos kalcium som kommer in och ut ur celler och observerade mycket representativa åtgärdspotentialer. Andra möjliga funktionella analysmetoder inkluderar användning av en transgen linje med en kalciumkänslig indikator eller direkt registrering med hjälp av en mikroelektrodmatris23.
Hjärtat organoider beskrivs här är rekapitalisering av den utvecklande mänskliga fetala hjärtat, men är begränsade i att visa mer mogna, vuxna-liknande funktioner. Framtida protokoll kan bygga på protokollet som beskrivs här för att inducera mognad i dessa organoider och ge konstruktioner som bättre modellerar det vuxna hjärtat. Dessutom är detta protokoll utformat för att skapa miniatyrmodeller av det mänskliga hjärtat och är begränsat till forskningsstudier av hjärtutveckling och sjukdom eller för läkemedelsscreening och kanske inte är lämpligt som ett medel för klinisk intervention såsom ersättning av hjärtvävnad via transplantation. Sammantaget beskriver vi här ett lätt att följa och kostnadseffektivt protokoll för att generera mycket reproducerbara och sofistikerade mänskliga hjärtorganoider som kan underlätta forskningsstudier inom mänsklig hjärtutveckling, sjukdomsettiologi och farmakologisk screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer K01HL135464 och R01HL151505 och av American Heart Association under tilldelningsnummer 19IPLOI34660342. Vi vill tacka MSU Advanced Microscopy Core och Dr. William Jackson vid MSU Department of Pharmacology and Toxicology för tillgång till konfokala mikroskop, IQ Microscopy Core och MSU Genomics Core för sekvenseringstjänster. Vi vill också tacka alla medlemmar i Aguirre Lab för deras värdefulla kommentarer och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| Other | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermal Mixer | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al.
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al.
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
