Summary
Здесь мы описываем протокол для создания органоидов сердца человека (hHO), имеющих отношение к развитию, эффективно используя плюрипотентные стволовые клетки человека путем самоорганизации. Протокол опирается на последовательную активацию сигналов развития и производит очень сложные, функционально значимые ткани сердца человека.
Abstract
Способность изучать развитие сердца человека в области здоровья и болезней сильно ограничена способностью моделировать сложность человеческого сердца in vitro. Разработка более эффективных органоподобных платформ, которые могут моделировать сложные фенотипы in vivo , такие как органоиды и органы на чипе, повысит способность изучать развитие сердца и болезни человека. В этой статье описывается протокол генерации очень сложных органоидов сердца человека (hHO) путем самоорганизации с использованием плюрипотентных стволовых клеток человека и ступенчатой активации путей развития с использованием ингибиторов малых молекул. Эмбриоидные тела (ЭБ) генерируются в 96-луночной пластине с круглодонными, сверхнизкими прикрепленными колодцами, что облегчает культуру суспензии индивидуализированных конструкций.
ЭБ подвергаются дифференцировке в hHO с помощью трехступенчатой стратегии модуляции сигналов Wnt, которая включает в себя начальную активацию пути Wnt, чтобы вызвать судьбу сердечной мезодермы, второй шаг ингибирования Wnt для создания окончательных сердечных линий и третий шаг активации Wnt для индуцирования тканей проэпикардиальных органов. Эти этапы, выполненные в формате 96 лунок, являются высокоэффективными, воспроизводимыми и производят большое количество органоидов за прогон. Анализ с помощью иммунофлуоресцентной визуализации с 3 по 11 день дифференцировки выявляет особенности первого и второго полей сердца и очень сложные ткани внутри hHO на 15-й день, включая ткань миокарда с областями предсердных и желудочковых кардиомиоцитов, а также внутренние камеры, выстланные тканью эндокарда. Органоиды также демонстрируют сложную сосудистую сеть по всей структуре и внешнюю оболочку эпикардиальной ткани. С функциональной точки зрения hHO уверенно бьются и представляют нормальную активность кальция, как определено с помощью живой визуализации Fluo-4. В целом, этот протокол представляет собой прочную платформу для исследований in vitro в органоподобных сердечных тканях человека.
Introduction
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и затрагивают примерно 1% всех живорождений1,2,3. В большинстве случаев причины ИБС остаются неизвестными. Способность создавать модели человеческого сердца в лаборатории, которые очень похожи на развивающееся человеческое сердце, представляет собой значительный шаг вперед для непосредственного изучения основных причин ИБС у людей, а не у суррогатных животных моделей.
Воплощением лабораторно выращенных моделей тканей являются органоиды, 3D-клеточные конструкции, которые напоминают орган, представляющий интерес по клеточному составу и физиологической функции. Органоиды часто получают из стволовых клеток или клеток-предшественников и успешно используются для моделирования многих органов, таких как мозг4,5, почки6,7, кишечник8,9, легкие10,11, печень12,13 и поджелудочная железа14,15 , и это лишь некоторые из них. Появились недавние исследования, демонстрирующие целесообразность создания самособирающихся сердечных органоидов для изучения развития сердца in vitro. Эти модели включают использование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs) для моделирования раннего развития сердца16,17 до атриовентрикулярной спецификации18 и плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) для генерации органоидов сердечно-эндодермы с несколькими зародышевыми слоями19 и камерных кардиоидов20 с очень сложным клеточным составом.
В этой статье представлен новый 3-ступенчатый протокол модуляции WNT для создания очень сложных hHO эффективным и экономичным способом. Органоиды генерируются в 96-луночных пластинах, что приводит к масштабируемой, высокопроизводительной системе, которая может быть легко автоматизирована. Этот метод основан на создании агрегатов hPSC и запуске этапов развития кардиогенеза, включая формирование мезодермы и сердечной мезодермы, спецификацию первого и второго поля сердца, формирование проэпикардиальных органов и атриовентрикулярную спецификацию. После 15 дней дифференцировки hHO содержат все основные клеточные линии, обнаруженные в сердце, четко определенные внутренние камеры, предсердные и желудочковые камеры и сосудистую сеть по всему органоиду. Эта очень сложная и воспроизводимая органоидная система сердца поддается исследованию структурных, функциональных, молекулярных и транскриптомных анализов при изучении развития сердца, заболеваний и фармакологического скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура и обслуживание hPSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Индуцированные человеком PSC (hiPSCs) или эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) необходимо культивировать в течение по крайней мере 2 последовательных проходов после оттаивания, прежде чем их использовать для генерации ЭБ для дифференцировки или дальнейшей криоконсервации. hPSCs культивируют в среде PSC (см. Таблицу материалов) на 6-луночных культуральных пластинах с покрытием из 6 скважин с базальной мембраной-внеклеточным матриксом (BM-ECM). При выполнении изменений среды на гПСК в 6-луночных пластинах добавляйте среду непосредственно на внутреннюю сторону скважины, а не непосредственно поверх клеток, чтобы предотвратить нежелательное отслоение клеток или стресс. Пользователям следует с осторожностью относиться к предварительному нагреванию сред PSC, которые не должны нагреваться при 37 °C; все PSC-среды, используемые в этом протоколе, были термостабильными.
- Чтобы покрыть плиты скважин BM-ECM, разморозьте одну аликвоту BM-ECM (хранится при -20 °C в соответствии с инструкциями производителя) на льду и смешайте 0,5 мг BM-ECM с 12 мл холодной модифицированной среды Dulbecco Eagle's (DMEM)/F12 (хранится при 4 °C). Распределите 2 мл смеси DMEM/F12-BM-ECM на каждую скважину из 6-луночной плиты и инкубируйте при 37 °C в течение не менее 2 ч.
- Чтобы оттаять клетки, сначала разморозьте криовиал hPSC на бусине 37 °C или водяной бане в течение 1-2 минут, пока не будет видно только небольшое количество льда. Переместите размороженные клетки в центрифужную трубку и медленно добавляют 8-9 мл среды PSC, дополненной 2 мкМ ингибитора ROCK, тиазовивином (Thiaz), и центрифугой при 300 × г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде PSC, дополненной 2 мкМ Тиаза. Распределяют клетки в питательной среде в 1-2 лунки в зависимости от концентрации криовиальных клеток и культуры при 37 °С, 5% CO2 в течение 24 ч перед изменением среды PSC.
- Меняйте среду на ячейках с интервалом 48 ч. Выполняйте промывку и замену среды с использованием DMEM/F12 (1 мл/скважина) и среды PSC (2 мл/скважина) соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки помогают удалить клеточные отходы и мусор, в то время как изменения свежих сред обеспечивают клетки обновленным источником питательных веществ. - Пропустить клетки при субконфлюенсе (60-80% слива) путем аспирации среды, затем промыть каждую лунку 1 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco (без кальция, без магния; ДПБС). Аспирировать DPBS и добавить 1 мл диссоциационного реагента для hPSCs (см. Таблицу материалов), после чего через 10 с следует аспирация всех, кроме тонкой пленки реагента.
- Инкубировать в течение 2-5 мин тонкой пленкой диссоциационного реагента для гПСК до образования промежутков между клетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время прекращения диссоциации зависит от клеточной линии. - Добавьте в лунку 1 мл среды PSC, дополненной 2 мкМ Тиаза (среда PSC + Thiaz), и осторожно постучите по пластине, чтобы вызвать отслоение клеток. Пипетку отделил клетки в среде 1-2 раза, чтобы разбить какие-либо крупные колонии, и повторно суспендировать клетки в PSC среде+Thiaz в соотношении 1:6 лунки (клетки из 1 скважины повторно суспендированы в 12 мл питательной среды). Перекладывайте ячейки на скважины с покрытием BM-ECM.
2. Генерация 3D самособирающихся органоидов человеческого сердца
- Формирование эмбриоидного тела (EB):
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо ограничить наблюдаемые дифференцированные клетки до формирования эмбрионального тела. Две-три скважины из 6-луночной пластины при слиянии 60-80% дадут достаточно клеток для одной 96-луночной пластины органоидов. Все среды должны быть аликвотированы и нагреты на шарике или водяной бане при температуре 37 °C до изменения любой среды, чтобы свести к минимуму температурный шок для ЭБ или органоидов (это не включает реагенты диссоциации клеток). См. рисунок 1A,B.- День -2
- Чтобы создать ЭБ, в день -2 промывайте субслияющиеся hPSCs (60-80% сливающиеся) с DPBS в течение не менее 10 с, чтобы промыть любой клеточный мусор и аспирировать DPBS.
- Чтобы отсоединить клетки и высвободить их в одноклеточное состояние, добавляют в каждую лунку по 1 мл реагента диссоциации клеток комнатной температуры (см. Таблицу материалов) в течение 3-6 мин. Осторожно постукивайте по пластине ~ 5 раз в минуту, чтобы вызвать отслоение во время проверки под микроскопом. Добавьте 1 мл PSC medium +Thiaz, чтобы остановить реакцию.
- Чтобы собрать клетки и разбить оставшиеся агрегаты, пипеткой среду вверх и вниз в скважине 2-3 раза, чтобы получить одноклеточную суспензию. Переложите одноэлементную суспензию в центрифужную трубку и вращайте в течение 5 мин при 300 × г.
- Чтобы получить желаемую концентрацию клеток, отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды PSC + Thiaz. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток или гемоцитометра и разбавьте клетки в среде PSC + Thiaz до концентрации 100 000 клеток / мл.
- Чтобы распределить ячейки для формирования ЭБ, используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 100 мкл (10 000 клеток) к каждой скважине круглодонной сверхнизкой пластины с прикреплением 96 скважин. Центрифугируют пластину при 100 × г в течение 3 мин и инкубируют в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День -1
- Осторожно удалите 50 мкл среды из каждой скважины и добавьте 200 мкл свежей среды PSC, нагретой до 37 °C, чтобы достичь конечного объема 250 мкл на скважину. Инкубируют клетки в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно удалите и добавьте среду на боковой стороне скважины, чтобы не нарушить ЭБ на дне скважины. Из-за деликатного характера ЭБ и культуры суспензии необходимо оставлять небольшой объем жидкости в каждой скважине при смене среды, чтобы не беспокоить ЭБ.
- Осторожно удалите 50 мкл среды из каждой скважины и добавьте 200 мкл свежей среды PSC, нагретой до 37 °C, чтобы достичь конечного объема 250 мкл на скважину. Инкубируют клетки в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День -2
- Дифференциация органоидов сердца человека (hHO):
ПРИМЕЧАНИЕ: Все среды должны быть нагреты на шарике или водяной бане при температуре 37 °C до любой замены среды. Осторожно удалите и добавьте среду на стороне лунки, чтобы не нарушить развитие органоидов на дне лунки. Промывки не нужны между изменениями среды, чтобы свести к минимуму возбуждение и обеспечить постепенное удаление ингибиторов и факторов роста. RPMI с добавкой 2% B-27 (Таблица материалов) использовался на протяжении всего протокола дифференциации. Добавка B-27 содержит инсулин, если не указано иное (без инсулина в дни 0-5). См. рисунок 1С.- День 0
- Чтобы начать дифференцировку в направлении линии мезодермы, удалите 166 мкл среды из каждой лунки (~2/3 общего объема скважины) и добавьте 166 мкл RPMI 1640, содержащего инсулиновую добавку B-27, 6 мкМ CHIR99021, 1,875 нг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP4) и 1,5 нг/мл активина А для конечной концентрации в скважине 4 мкМ CHIR99021, 1,25 нг/мл BMP4 и 1 нг/мл Активина А. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День 1
- Удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежего RPMI 1640 с инсулиновой добавкой B-27. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День 2
- Чтобы индуцировать сердечную мезодерму, удаляют 166 мкл среды из каждой лунки и добавляют 166 мкл RPMI 1640, содержащего инсулиновую добавку B-27 и 3 мкМ Wnt-C59 для конечной концентрации в скважине 2 мкМ Wnt-C59. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День 4
- Удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежего RPMI 1640 с инсулиновой добавкой B-27. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День 6
- Удалите 166 мкл среды из каждой скважины и добавьте 166 мкл RPMI 1640 с добавкой B-27. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C, 5% CO2.
- День 7
- Чтобы индуцировать дифференцировку проэпикарда, удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежего RPMI 1640, содержащего добавку B-27, и 3 мкМ CHIR99021 для конечной концентрации в скважине 2 мкМ CHIR99021. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C, 5% CO2.
- Удалите 166 мкл среды из каждой лунки и добавьте 166 мкл свежей добавки RPMI 1640, содержащей B-27. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная осторожность рекомендуется при этом втором изменении среды на 7-й день, так как органоиды более склонны к движению из-за изменений среды. - Начиная с 7-го дня и далее до сбора или переноса для анализа или экспериментирования, выполняйте изменения среды каждые 48 ч, удаляя 166 мкл среды из каждой лунки и добавляйте 166 мкл свежей добавки RPMI 1640, содержащей B-27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды готовы к анализу и экспериментированию на 15-й день, если более ранние стадии развития не представляют интереса. Их можно культивировать в течение 15-го дня для долгосрочных экспериментов по культуре или созреванию.
- День 0
3. Органоидный анализ
- Перенос целых органоидов (живых или фиксированных)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для переноса живых органоидов убедитесь, что используемые наконечники пипеток стерильны.- Отрежьте наконечник пипетки P200 на 5-10 мм от отверстия наконечника, в результате чего получится широкое отверстие диаметром ~2-3 мм.
- Вставьте наконечник прямо в круглый нижний колодец, содержащий органоид, чтобы пипетка была полностью вертикальной (перпендикулярной пластине). Убедитесь, что плунжер пипетки уже нажат до конца, прежде чем вставлять наконечник в среду.
- Медленно отпустите плунжер пипетки, занимая достаточное количество среды (100-200 мкл) для сбора органоида.
- Перенесите органоид в среде к целевому месту назначения (например, для фиксации, визуализации в реальном времени, электрофизиологической записи, новой культуры пластин).
- Фиксация органоидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация и окрашивание органоидов может быть выполнено либо в 96-луночной культуральной пластине, либо в микроцентрифужных трубках. Параформальдегид (PFA) следует обрабатывать только в вытяжном шкафу.- Для фиксации в микроцентрифужных трубках переведите живые органоиды в отдельные трубки с 1-8 органоидами на трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 8 органоидов на трубку. - Осторожно удалите и выбросьте из трубки как можно больше среды, не прикасаясь к органоидам.
- Добавьте 4% PFA в каждую трубу или лунку (300-400 мкл на микроцентрифужную трубку и 100-200 мкл на скважину 96-луночной пластины). Инкубировать при комнатной температуре в течение 30-45 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации более 1 ч может потребовать этапов извлечения антигена и не рекомендуется. - Безопасно выбрасывайте PFA, не нарушая органоиды. Выполните 3 промывки с DPBS, дополненным 1,5 г / л глицина (DPBS / Gly), используя тот же объем, который используется для 4% PFA, ожидая 5 минут между стирками. Удалите DPBS / Gly и приступайте к иммуноокрашивающим или другим анализам или добавьте DPBS и храните при 4 °C для будущего использования в течение 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение фиксированных органоидов в течение более 2 недель может привести к деградации тканей и загрязнению и не рекомендуется.
- Для фиксации в микроцентрифужных трубках переведите живые органоиды в отдельные трубки с 1-8 органоидами на трубку.
- Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание
- Добавьте 100 мкл блокирующего/пермеабилизирующего раствора (10% обычной ослиной сыворотки + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 0,5% тритона X-100 в 1x DPBS) в каждую лунку или трубку, содержащую фиксированные органоиды. Инкубировать при комнатной температуре на ночь на шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 8 органоидов на трубку. - Осторожно удалите и выбросьте как можно больше блокирующего раствора, не прикасаясь к органоидам. Выполните 3 стирки с DPBS, ожидая 5 минут между стирками.
- Готовят раствор первичного антитела (1% нормальная ослиная сыворотка + 0,5% BSA + 0,5% Тритон X-100 в 1x DPBS) с желаемыми первичными антителами в рекомендуемых концентрациях. Инкубировать при 4 °C в течение 24 ч на шейкере.
- Осторожно удалите и выбросьте как можно больше раствора антител, не прикасаясь к органоидам. Выполните 3 стирки с DPBS, ожидая 5 минут между стирками.
- Готовят раствор вторичных антител (1% нормальная ослиная сыворотка + 0,5% BSA + 0,5% Тритон X-100 в 1x DPBS) с желаемыми вторичными антителами в рекомендуемых концентрациях. Если антитела флуоресцентно маркированы, инкубируйте при 4 °C в темноте (например, покрыты алюминиевой фольгой) в течение 24 ч на шейкере.
- Осторожно удалите и выбросьте как можно больше раствора антител, не прикасаясь к органоидам. Выполните 3 стирки с DPBS, ожидая 5 минут между стирками.
- Подготовьте слайды с бусинами (диаметром 90-300 мкм), установленными в монтажной среде (см. Таблицу материалов) по краям слайда, где будет размещена крышка с органоидами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется дать монтажной среде вокруг бусин высохнуть, прежде чем продолжить; это предотвратит перемещение бусин. См. рисунок 2. - Перенесите окрашенные органоиды с помощью вырезанного наконечника пипетки на слайд, между бусинами, обеспечивая расстояние, чтобы избежать контакта между органоидами на слайде. Используйте угол свернутой лабораторной салфетки, чтобы аккуратно удалить лишнюю жидкость вокруг органоида.
- Покрыть органоиды монтажно-очистительной средой (раствор для очистки фруктозы-глицерина составляет 60% (об/об)глицерина и 2,5 М фруктозы)37 , используя 120-150 мкл монтажно-очистительной среды на слайд.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с монтажно-очистительной средой рекомендуется использовать вырезанный наконечник пипетки, так как он очень вязкий. - Наведите крышку на слайд с органоидами, покрытыми монтажно-очистительным раствором, и медленно нажмите на крышку над слайдом, убедившись, что органоиды находятся между установленными бусинами.
- Запечатайте периметр обшивки на слайде с помощью лака для ногтей верхнего слоя. Дайте горке высохнуть в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч. Хранить при температуре 4 °C в темноте для длительного хранения.
- Добавьте 100 мкл блокирующего/пермеабилизирующего раствора (10% обычной ослиной сыворотки + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) + 0,5% тритона X-100 в 1x DPBS) в каждую лунку или трубку, содержащую фиксированные органоиды. Инкубировать при комнатной температуре на ночь на шейкере.
- Кальциевая транзиторная визуализация в живых органоидах сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с инструкциями завода-изготовителя Fluo4-AM был восстановлен в диметилсульфоксиде (ДМСО) до конечной концентрации исходного раствора 0,5 мМ. Fluo4-AM добавляли непосредственно в органоидную скважину в 96-луночной пластине.- Выполните 2 промывки органоидов с использованием среды RPMI 1640.
- Извлеките из скважины 166 мкл отработанной среды.
- Добавьте 166 мкл нагретой среды RPMI 1640, удалите 166 мкл среды и добавьте 166 мкл свежей среды RPMI 1640.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки выполняются для удаления отходов и мусора в ячейках. Две трети среды удаляются из лунок во время промывки, чтобы не нарушить органоиды на дне скважины перед функциональным анализом.
- Добавьте среду Fluo4-AM к органоидам.
- Добавьте Fluo4-AM, восстановленный в DMSO, к RPMI 1640, содержащему добавку B-27, для приготовления раствора 1,5 мкМ.
- Извлеките из лунки 166 мкл среды.
- Добавьте 166 мкл 1,5 мкМ Fluo4-AM в RPMI 1640, содержащий добавку B-27 для конечной концентрации в скважине 1 мкМ. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2 в течение 30 мин.
- Выполните 2 промывки, как в шаге 3.4.1.
- Добавьте в скважину 166 мкл RPMI 1640, содержащего добавку B-27.
- Используя разрезанный наконечник наконечника пипетки P200, перенесите органоид в чашку Петри со стеклянным дном (например, 8-камерное покровное стекло с высокоэффективным покровным стеклом No 1,5) со 100-200 мкл среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. раздел 3.1 о переносе целых органоидов. - Представьте себе органоиды, живущие под микроскопом с камерой с контролируемой температурой и CO2 при 37 °C, 5% CO2.
- Запишите несколько видео по 10-20 с в разных местах по всему органоиду, показывая увеличение и уменьшение уровней интенсивности флуоресценции по мере того, как кальций входит и выходит из клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для записей с высоким разрешением рекомендуется записывать на скорости 10 кадров в секунду или выше; Рекомендуется 50 кадров в секунду. - Анализируйте видео с помощью программного обеспечения для анализа изображений (например, ImageJ), выбирая интересующие регионы и измеряя уровни интенсивности с течением времени.
- Нормализуйте записи интенсивности с помощью ΔF/F0 по отношению ко времени в миллисекундах и графику.
- Выполните 2 промывки органоидов с использованием среды RPMI 1640.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для достижения самоорганизующегося hHO in vitro мы модифицировали и комбинировали протоколы дифференцировки, ранее описанные для 2D-монослойной дифференцировки кардиомиоцитов21 и эпикардиальных клеток22 с использованием модуляторов пути Wnt и для 3D-прекардиальных органоидов16 с использованием факторов роста BMP4 и Activin A. Использование 96-луночной пластинки EB и протокола дифференцировки hHO, описанного здесь и показанного на рисунке 1 , концентрации и продолжительность воздействия активатора пути Wnt CHIR99021 были оптимизированы для получения высоковоспроизводимых и сложных hHO, полученных из человеческих PSC. hPSCs или hESCs, культивируемые в среде PSC до 60-80% слияния в колониеподобной формации с минимальной или нулевой видимой дифференциацией, идеально подходят для генерации EB (рисунок 1B).
ЭБ разрешали инкубировать в течение 48 ч со средним изменением через 24 ч до начала дифференцировки в день 0. На 0-й день ЭБ должны появиться в виде темного сферического агрегата в центре каждой скважины под световым микроскопом (рисунок 1В). Протокол дифференцировки начинается на 0-й день с активации пути Wnt и добавления фактора роста ровно в течение 24 ч. Эта индукция мезодермы с последующей индукцией сердечной мезодермы на 2-й день с использованием ингибитора пути Wnt Wnt-C59 приведет к значительному увеличению органоида с ~ 200 мкм в диаметре до 500-800 мкм в диаметре на 4-й день и до 1 мм (органоиды могут испытывать небольшое уменьшение размера к 15-му дню (рисунок 1C)). hHO начнет бить уже на 6-й день (Видео 1), причем 100% органоидов показывают видимое избиение к 10-му дню (Видео 2) (если только они не проходят медикаментозное лечение или если для генерации ЭБ использовались неадекватные hPSCs). Это наблюдалось в 5 различных клеточных линиях hPSC23.
Чтобы оценить способность hHO представлять различные этапы физиологического развития сердца, мы собрали органоиды в различные моменты времени на протяжении всего протокола дифференцировки и искали наличие и транскриптомную экспрессию маркеров сердечного поля. Иммунофлуоресцентное окрашивание для первого маркера сердечного поля (FHF), HAND1, и маркера второго поля сердца (SHF), HAND2, выявило их ядерное присутствие в этих сердечных клетках-предшественниках, возникающих примерно на 3-й и 5-й день соответственно (рисунок 3A).
Экспрессия обоих маркеров происходит в областях органоидов, которые уменьшаются в размерах после 7-го дня для FHF и после 9-го дня для SHF. Интересно, что изображения с высоким увеличением органоидов 7-го дня показали, что большинство HAND1-экспрессирующих клеток были кардиомиоцитарными по происхождению (как показано кардиомиоцит-специфическим маркером TNNT2). Напротив, многие из HAND2-экспрессирующих клеток не экспрессировали маркер кардиомиоцитов (рисунок 3B). Это наблюдение согласуется с прекардиальными органоидами, полученными из мышиных ЭСК, демонстрирующими развитие немиоцитарных клеток из клеток-предшественников СВЧ16. Важно отметить, что данные РНК-секвенирования показывают, что транскрипты РНК как для HAND1, так и для HAND2 были экспрессированы с 3-го дня и далее, причем маркер FHF был более высоко выражен между днями 3 и 11, а маркер SHF был более выражен после 13-го дня (рисунок 3C).
Иммунофлуоресцентное окрашивание выявило наличие маркеров различных клеточных линий, составляющих сердце человека. Ткань миокарда (идентифицируемая с помощью кардиомиоцит-специфического маркера TNNT2) примыкает к эпикардиальной ткани (отмечена фактором ядерной транскрипции WT1 и маркером эпителиальной мембраны TJP1) (рисунок 4A). Были обнаружены клетки эндокарда, экспрессирующие NFATC1, выстилающие стенки внутренних камероподобных структур внутри органоидов (рисунок 4B). Эндотелиальные клетки в сосудоподобной сети можно увидеть уже на 13-й день дифференцировки (рисунок 4С). Наконец, мы сообщаем о наличии сердечных фибробластов, смешанных по всему органоиду (рисунок 4D). Эти маркеры клеточного типа также наблюдались в профилях экспрессии генов RNA-Seq (рисунок 4E). Было обнаружено, что состав типов клеток в органоидах, измеренный площадью органоида, который они занимают, составляет ~ 58% кардиомиоцитов, а остальная часть состоит из немиоцитарных сердечных клеток, включая эпикардиальные клетки (~ 15%), клетки эндокарда (~ 13%), сердечные фибробласты (~ 12%) и эндотелиальные клетки (~ 1%) (рисунок 4F).
Электрофизиологическая функция органоидов измерялась с помощью живой кальциевой визуализации отдельных клеток в целых органоидах. Интенсивность флуоресценции Флуо-4 изменяется со временем из-за поступления и выхода кальция из клетки, выявляя регулярные потенциалы действия (рисунок 5А). Тепловые карты, показывающие интенсивность кальция над областью высокого увеличения органоида, показывают повышенную интенсивность из-за переходных процессов кальция в отдельных клетках (рисунок 5B и видео 3).
Рисунок 1: Генерация эмбрионального тела и этапы дифференцировки органоидов сердца. (A) (1-2) Диссоциированные клетки засеваются в лунки из 96-луночной сверхнизкой пластины прикрепления через многоканальную пипетку. (3) Затем пластина из 96 лунок центрифугируется, что позволяет ячейкам агрегироваться в центре. (4) Со временем, после добавления факторов роста и модуляторов путей, эмбриоидное тело начинает дифференцироваться в несколько сердечных линий и формировать пространственно и физиологически значимые различные клеточные популяции, окружающие внутренние микрокамеры. (B) репрезентативные изображения прогрессирования генерации эмбрионального тела, начиная с 2-мерной культуры iPSC (слева) и заканчивая эмбриональным телом Дня 0 (справа); шкала bar = 500 мкм. (C) Краткое изложение протокола дифференцировки органоидов сердца человека, включая модуляторы и ингибиторы химических путей с соответствующими временными точками, длительностями и развивающимися органоидными изображениями при световой микроскопии с 1 по 15 день; шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Крепление целых органоидов на слайдах для визуализации. Этапы подготовки слайдов и монтажа органоидов для визуализации. (A) Размещение микрошариков на периферии стеклянной горки. (B) Покрытие микрошариков монтажной средой. (C) Перенос органоидов на слайд между бусинами и удаление лишней жидкости, окружающей органоиды. (D) Покрытие органоидов очищающей/монтажной средой. (E) Размещение крышки поверх слайда с органоидами и бусинами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Первая спецификация поля сердца и вторая спецификация поля сердца в hHO рекапитулирует физиологическое развитие сердца человека. (A) Конфокальные иммунофлуоресцентные изображения с 3-го по 11-й день hHO, показывающие образование FHF (HAND1, вверху) и SHF (HAND2, внизу), а также кардиомиоцитов (TNNT2) и ядерного красителя DAPI; шкала баров = 500 мкм. (B) Изображения с высоким увеличением органоидов 7-го дня, показывающие колокализацию HAND1 и HAND2 с маркером кардиомиоцитов TNNT2; шкала баров = 50 мкм. (C) профилей экспрессии генов RNA-Seq маркера FHF HAND1 (красный) и маркера SHF HAND2 (синий) с 0-го по 19-й день. Сокращения: hHO = органоиды сердца человека; FHF = первое поле сердца; СВЧ = второе поле сердца; HAND = выраженные производные сердца и нервного гребня; TNNT2 = сердечный тропонин T2; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: hHO развивают много сердечных линий. (А-Д) Конфокальные иммунофлуоресцентные изображения 15 гГО дня, показывающие образование кардиомиоцитов (TNNT2) и окрашивание ядерным красителем DAPI в немиоцитарных сердечных клетках. (A) Цельный органоид и высокое увеличение эпикардиального маркера WT1 (зеленый) и маркера эпителиальной мембраны TJP1 (белый), показывающие эпикардиальные клетки эпителиального происхождения сверху и рядом с тканью миокарда; шкала bar = 500 мкм, вставка = 50 мкм. (B) Эндокардиальный маркер NFATC1 (зеленый) выражение на облицовке камер; шкала bar = 500 мкм. (C) Эндотелиальная сеть сосудов в hHO показана PECAM1 (зеленый). Шкала бара = 500 мкм. (D) Маркеры фибробластов сердца THY1 и VIM показаны зеленым и белым цветом соответственно, распределенными по всему органоиду. Шкала бара = 500 мкм. (E) РНК-Seq профили экспрессии генов основных типов клеток, присутствующих в hHO с 0 по 19 дни дифференцировки. Сокращения: hHO = органоиды сердца человека; TNNT2 = сердечный тропонин T2; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; WT1 = фактор транскрипции опухоли Вильма-1; NFATC1 = цитоплазматический ядерный фактор активированной Т-клетки; PECAM1 = молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов-1; ВИМ = виментин. (F) Круговая диаграмма среднего состава типа ткани в hHO, рассчитанная как процентная площадь с соответствующим клеточным маркером над всем органоидом путем ядерного окрашивания через три z-плоскости по всему органоиду с использованием ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Fluo-4 живые записи переходных кальция в живых органоидах сердца человека. (A) Репрезентативные записи кальциевых переходных процессов отдельных кардиомиоцитов в целых органоидах. (B) Тепловая карта, показывающая низкие и пиковые уровни кальция между потенциалами действия, определяемыми интенсивностью Fluo-4; шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Живая визуализация репрезентативного органоида, полученного из hPSCs на 6-й день дифференцировки под световой микроскопией при комнатной температуре. Аббревиатура: hPSC = плюрипотентная стволовая клетка человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Живая визуализация репрезентативного органоида, полученного из гПСК на 15-й день дифференцировки под световой микроскопией при комнатной температуре. Аббревиатура: hPSC = плюрипотентная стволовая клетка человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 3: Живая запись органоида 10-го дня, показывающая тепловую карту переходных процессов кальция под флуоресцентным микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Последние достижения в области кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток человека, и других клеток сердечного происхождения были использованы для моделирования развития сердца человека22,24,25 и болезней26,27,28 и в качестве инструментов для скрининга терапевтических средств29,30 и токсичных агентов31,32 . Здесь мы сообщаем о простом в реализации, высоко воспроизводимом протоколе для генерации и дифференциации ЭБ в очень сложные hHO. Этот протокол был успешным в нескольких клеточных линиях, включая HPSC и hESCs23, демонстрируя последовательные частоты биения и организацию типа клеток. Этот протокол извлекает аспекты из ранее описанных протоколов дифференцировки кардиомиоцитов24, дифференцировки эпикардиальных клеток22 и прекардиальных органоидов, полученных из мышиных ESCs16, и оптимизирует ступенчатую модуляцию канонической сигнализации WNT с использованием химических ингибиторов и факторов роста в полностью определенной среде. При создании этого протокола было использовано несколько методологий оптимизации.
Во-первых, концентрации химических ингибиторов и продолжительность воздействия, а также добавление факторов роста были оптимизированы для 3D-среды и обсуждались в предыдущей работе23. Они были оптимизированы для выяснения структур с физиологической сложностью и представлением in vivo человеческого сердца, с физиологическим составом и соотношением кардиомиоцитов к немиоцитарным типам сердечных клеток (эпикардиальные клетки, сердечные фибробласты). Во-вторых, стратегия изменения среды на две трети обеспечивает минимальное перемешивание ЭБ/органоидов, поскольку они находятся в суспензии вблизи дна скважины, а также облегчает градиентное воздействие химических ингибиторов и факторов роста при обновлении среды. Комбинация дифференцировки мезодермы сердца посредством активации пути Wnt с последующим ингибированием24 и последующей индукции спецификации проэпикардиала через вторую активацию пути Wnt22 позволяет одному протоколу выдавать очень сложные hHO. Органоиды вырастают до 1 мм после 15 дней дифференцировки и могут быть легко перенесены для живых или фиксированных анализов и анализов. В-третьих, учитывая большой размер органоидов, было обнаружено, что использование микрошариков или других подобных структур для поддержания пространства между слайдом и крышкой лучше сохраняет 3D-структуру органоидов и улучшает процесс визуализации.
Эта развивающаяся модель сердца человека позволяет получить доступ к недоступным в противном случае стадиям развития сердца, таким как ранняя спецификация первого и второго поля сердца, наблюдаемая между 3 и 9 днями дифференцировки, и организация в сердечные клетки-предшественники, которые дают начало сердечным тканям, включая миокард, эндокард, эпикард, эндотелиальную сосудистую систему и поддерживающие сердечные фибробласты, которые наблюдались на 15-й день дифференцировки. Типы тканей, присутствующие в органоидах сердца, полученных из этого протокола, являются весьма репрезентативными для сердца плода человека как в составе33, так и в транскриптомном профиле23,34. Таким образом, они могут способствовать взаимодействию тканей и тканей и клеток и клеток высшего порядка, напоминающих взаимодействие in vivo сердца. Этот протокол был высокоэффективным и воспроизводимым в экспериментах и клеточных линиях, давая органоиды, которые состоят в основном из кардиомиоцитов и включают немиоцитарные сердечные клетки, такие как эпикардиальные клетки, клетки эндокарда, сердечные фибробласты и эндотелиальные клетки, представляющие физиологический состав23,33,35.
Анализ ультраструктуры формирующихся кардиомиоцитов с помощью просвечивающей электронной микроскопии и развитие камер и сосудистой сети с помощью оптической когерентной томографии и конфокальной визуализации подробно обсуждались в предыдущей работе23. Большим преимуществом этого сердечного органоидного протокола по сравнению с другими существующими протоколами, недавно опубликованными17,18,19,20,36,37, является надежное формирование эндотелиальной сети по всему органоиду, что позволяет исследовать развитие сосудов и заболевания в раннем сердце человека без необходимости дальнейших внешних индукции к протоколу. Наконец, функциональный анализ сердечных органоидов достижим с помощью различных подходов, включая использование чувствительного к кальцию красителя для отслеживания переходных процессов кальция в кардиомиоцитах по всему органоиду. Используя микроскопию с высоким разрешением, мы регистрировали интенсивность флуоресценции кальция, поступающего и выходящего из клеток, и наблюдали высокорепрезентативные потенциалы действия. Другие возможные методы функционального анализа включают использование трансгенной линии с кальциечувствительным индикатором или прямую запись с использованием микроэлектродной матрицы23.
Сердечные органоиды, описанные здесь, являются рекапитуляторами развивающегося сердца плода человека, но ограничены в демонстрации более зрелых, взрослых черт. Будущие протоколы могут основываться на описанном здесь протоколе, чтобы вызвать созревание в этих органоидах и дать конструкции, которые лучше моделируют сердце взрослого человека. Кроме того, этот протокол предназначен для создания миниатюрных моделей сердца человека и ограничен исследованиями развития сердца и заболеваний или для скрининга фармацевтических препаратов и может не подходить в качестве средства клинического вмешательства, такого как замена сердечной ткани путем трансплантации. В целом, мы описываем здесь простой в использовании и экономически эффективный протокол для создания высоковоспроизводимых и сложных органоидов сердца человека, которые могут облегчить научные исследования в области развития сердца человека, этиологии заболеваний и фармакологического скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номерами K01HL135464 и R01HL151505 и Американской кардиологической ассоциацией под номером 19IPLOI34660342. Мы хотим поблагодарить MSU Advanced Microscopy Core и доктора Уильяма Джексона на кафедре фармакологии и токсикологии МГУ за доступ к конфокальным микроскопам, IQ Microscopy Core и MSU Genomics Core за услуги секвенирования. Мы также хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Агирре за их ценные замечания и советы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| Other | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermal Mixer | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al.
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al.
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
