Summary
Her beskriver vi en protokol til at skabe udviklingsrelevante menneskelige hjerteorganoider (hHOs) effektivt ved hjælp af menneskelige pluripotente stamceller fra selvorganisering. Protokollen er afhængig af sekventiel aktivering af udviklingsmæssige signaler og producerer meget komplekse, funktionelt relevante menneskelige hjertevæv.
Abstract
Evnen til at studere menneskets hjerteudvikling i sundhed og sygdom er meget begrænset af evnen til at modellere kompleksiteten af det menneskelige hjerte in vitro. Udvikling af mere effektive organlignende platforme, der kan modellere komplekse in vivo-fænotyper , såsom organoider og organer-on-a-chip, vil forbedre evnen til at studere menneskelig hjerteudvikling og sygdom. Dette papir beskriver en protokol til at generere meget komplekse menneskelige hjerteorganoider (hHOs) af selvorganisering ved hjælp af menneskelige pluripotente stamceller og trinvis udviklingsforløb aktivering ved hjælp af små molekylehæmmere. Embryoid organer (EBs) er genereret i en 96-brønd plade med runde-bund, ultra-lav vedhæftet fil brønde, lette suspension kultur individualiserede konstruktioner.
EBs gennemgå differentiering i hHOs ved en tre-trins Wnt signalering graduering strategi, som indebærer en indledende Wnt vej aktivering for at fremkalde hjerte mesoderm skæbne, et andet trin af Wnt hæmning for at skabe endelige hjerte slægter, og en tredje Wnt aktivering skridt til at fremkalde proepicardial organvæv. Disse trin, udført i et 96-brønds format, er meget effektive, reproducerbare og producerer store mængder organoider pr. Løb. Analyse af immunofluorescence imaging fra dag 3 til dag 11 af differentiering afslører første og andet hjertefelt specifikationer og meget komplekse væv inde hHOs på dag 15, herunder myokardievæv med regioner af atrie og ventrikulære kardiomyocytter, samt interne kamre foret med endocardial væv. Organoiderne udviser også et indviklet vaskulært netværk gennem hele strukturen og en ekstern foring af epicardialt væv. Fra et funktionelt synspunkt slår hHOs robust og præsenterer normal calciumaktivitet som bestemt af Fluo-4 live imaging. Samlet set udgør denne protokol en solid platform for in vitro-studier i humane organlignende hjertevæv.
Introduction
Medfødte hjertefejl (CHD'er) er den mest almindelige type medfødt defekt hos mennesker og påvirker ca. 1% af alle levendefødte1,2,3. Under de fleste omstændigheder er årsagerne til CHD'er fortsat ukendte. Evnen til at skabe menneskelige hjertemodeller i laboratoriet, der ligner det udviklende menneskelige hjerte, udgør et betydeligt skridt fremad for direkte at studere de underliggende årsager til CHD'er hos mennesker snarere end i surrogatdyrmodeller.
Indbegrebet af laboratoriedyrkede vævsmodeller er organoider, 3D-cellekonstruktioner, der ligner et organ af interesse for cellesammensætning og fysiologisk funktion. Organoider er ofte afledt af stamceller eller stamceller og er blevet anvendt med succes til at modellere mange organer såsom hjernen4,5, nyre6,7, tarm8,9, lung10,11, liver12,13, og bugspytkirtel14,15 , bare for at nævne nogle få. Nylige undersøgelser er dukket op, der viser muligheden for at skabe selvmontering af hjerteorganoider til at studere hjerteudvikling in vitro. Disse modeller omfatter brug af mus embryonale stamceller (mESCs) til at modellere tidlig hjerte udvikling16,17 op til atrioventrikulær specifikation18 og human pluripotente stamceller (hPSCs) til at generere multi-kim lag hjerte-endoderm organoider19 og chambered cardioider20 med meget kompleks cellulær sammensætning.
Dette papir præsenterer en ny 3-trins WNT graduering protokol til at generere meget komplekse hHOs på en effektiv og omkostningseffektiv måde. Organoider genereres i 96-brønd plader, hvilket resulterer i et skalerbart, high-throughput system, der let kan automatiseres. Denne metode er afhængig af at skabe hPSC aggregater og udløse udviklingsmæssige trin af kardiogenese, herunder mesoderm og hjerte mesoderm dannelse, første og andet hjerte felt specifikation, proepicardial organ dannelse, og atrioventricular specifikation. Efter 15 dages differentiering indeholder hHOs alle større celle slægter findes i hjertet, veldefinerede indre kamre, atrie og ventrikulære kamre, og et vaskulært netværk i hele organoid. Dette meget sofistikerede og reproducerbare hjerteorganoidsystem er modtageligt for at undersøge strukturelle, funktionelle, molekylære og transskriptomiske analyser i studiet af hjerteudvikling og sygdomme og farmakologisk screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hPSC kultur og vedligeholdelse
BEMÆRK: De humant inducerede PSC'er (hiPSC'er) eller menneskelige embryonale stamceller (hESC'er) skal dyrkes i mindst 2 på hinanden følgende passager efter optøning, før de bruges til at generere EBs til differentiering eller yderligere kryopræservering. hPSCs er kultiveret i PSC medium (se tabellen over materialer) på kælder-membran-ekstracellulære matrix (BM-ECM)-belagt 6-brønd kultur plader. Når du udfører medium ændringer på hPSCs i 6-brønd plader, tilføje medium direkte til indersiden af brønden i stedet for direkte på toppen af cellerne for at forhindre uønsket celle løsrivelse eller stress. Brugere bør være på vagt over for PSC-medier, der er under opvarmning, og som ikke bør opvarmes ved 37 °C; alle PSC-medier, der anvendes i denne protokol, kunne termotabel.
- For at belægge brøndpladerne med BM-ECM optøs en aliquot af BM-ECM (opbevaret ved -20 °C i henhold til fabrikantens anvisninger) på is og blandes 0,5 mg BM-ECM med 12 mL kold Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM)/F12 medium (opbevaret ved 4 °C). 2 mL af DMEM/F12-BM-ECM-blandingen fordeles på hver brønd af en 6-brønds plade og inkuberes ved 37 °C i mindst 2 timer.
- For at optø cellerne optøs hPSC-cryovial i en 37 °C perle eller vandbad i 1-2 min, indtil kun en lille mængde is er synlig. Overfør de optøede celler til et centrifugerør, og tilsæt langsomt 8-9 mL af PSC-mediet suppleret med 2 μM af ROCK-hæmmeren, thiazovivin (Thiaz) og centrifuge ved 300 × g i 5 min. Fjern supernatanten, og brug cellepillen i PSC-mediet suppleret med 2 μM Thiaz. Fordel cellerne i kulturmediet i 1-2 brønde afhængigt af kryovial cellekoncentration og kultur ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer, før PSC-mediet skiftes.
- Skift mediet på cellerne med 48 timers mellemrum. Udfør vask og medium ændringer ved hjælp af DMEM/F12 (1 mL/well) og PSC medium (2 mL/well), henholdsvis.
BEMÆRK: Vaske hjælper med at fjerne celleaffald og snavs, mens nye medieændringer giver cellerne en fornyet kilde til næringsstoffer. - Passage cellerne på subconfluency (60-80% sammenløb) ved at aspirere mediet, derefter vaske hver brønd med 1 mL af 1x Dulbecco's fosfat-buffered opløsning (ingen calcium, ingen magnesium; DPBS). Aspirer DPBS og tilsæt 1 mL af dissociation reagenset til hPSCs (se tabellen over materialer), efterfulgt af aspiration af alle, men en tynd film af reagenset efter 10 s.
- Inkubér i 2-5 min med den tynde film af dissociation reagens til hPSCs indtil huller dannes mellem cellerne.
BEMÆRK: Tiden til at stoppe dissociationen er cellelinjeafhængig. - Der tilsættes 1 mL af PSC-mediet suppleret med 2 μM Thiaz (PSC medium+Thiaz) til brønden, og tryk forsigtigt på pladen for at fremkalde cellefordeling. Pipette de løsrevne celler i mediet 1-2 gange for at bryde op nogen store kolonier, og genbruge cellerne i PSC medium + Thiaz i en 1:6 godt forhold (celler fra 1 godt re suspenderet i 12 mL af kultur medium). Omplade cellerne på BM-ECM-coatede brønde.
2. Generation af 3D selv-samle menneskelige hjerte organoider
- Embryoid krop (EB) dannelse:
BEMÆRK: Det er bydende nødvendigt at begrænse observerbare differentierede celler før embryoid kropsdannelse. To til tre brønde af en 6-brønd plade på en 60-80% sammenløb vil give nok celler til en enkelt 96-brønd plade af organoider. Alle medier skal aliquoted og opvarmes i en 37 °C perle eller vandbad, før eventuelle medium ændringer for at minimere temperaturchok til EBs eller organoider (dette omfatter ikke celle dissociation reagenser). Se figur 1A, B.- Dag -2
- For at oprette EBs skal du på dag -2 vaske subkonfluent hPSCs (60-80% sammenløb) med DPBS i mindst 10 s for at vaske celleaffald og aspirere DPBS.
- Hvis du vil frigøre cellerne og frigive dem i en enkeltcellet tilstand, skal du tilføje 1 mL rumtemperaturcelle dissociationsreagens (se materialetabellen) til hver brønd i 3-6 min. Tryk forsigtigt på pladen ~ 5 gange hvert minut for at fremkalde løsrivelse, mens du kontrollerer under mikroskopet. Tilføj 1 mL PSC medium +Thiaz for at stoppe reaktionen.
- For at indsamle cellerne og opdele eventuelle resterende aggregater, pipette medierne op og ned i brønden 2-3 gange for at generere en enkeltcellet suspension. Encelleophænget overføres til et centrifugerør og spin i 5 min ved 300 × g.
- For at opnå den ønskede cellekoncentration skal supernatanten kasseres og genbruge cellerne i 1 mL PSC medium+Thiaz. Tæl cellerne ved hjælp af en celletæller eller et hæmocytometer, og fortynd cellerne i PSC medium+Thiaz til en koncentration på 100.000 celler/mL.
- Hvis du vil fordele cellerne til EB-dannelse, skal du bruge en multikanalpipette til at tilføje 100 μL (10.000 celler) til hver brønd af en rundbundet ultralav fastgørelsesplade på 96 brønd. Centrifuge pladen ved 100 × g i 3 min og inkuberes i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag -1
- Fjern forsigtigt 50 μL medium fra hver brønd og tilsæt 200 μL frisk PSC-medium opvarmet til 37 °C for at opnå et endeligt volumen på 250 μL pr. Brønd. Inkuberes cellerne i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
BEMÆRK: Fjern og tilsæt medium forsigtigt på siden af brønden for at undgå at forstyrre EBs i bunden af brønden. På grund af EBs' delikate karakter og suspensionskulturen er det nødvendigt at efterlade en lille mængde væske i hver brønd, når du skifter mediet for at undgå at forstyrre EBs.
- Fjern forsigtigt 50 μL medium fra hver brønd og tilsæt 200 μL frisk PSC-medium opvarmet til 37 °C for at opnå et endeligt volumen på 250 μL pr. Brønd. Inkuberes cellerne i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag -2
- Human Heart Organoid (hHO) Differentiering:
BEMÆRK: Alle medier skal opvarmes i en 37 °C perle eller vandbad forud for eventuelle medieændringer. Fjern og tilsæt medium forsigtigt på siden af brønden for at undgå at forstyrre de udviklende organoider i bunden af brønden. Vask er ikke nødvendig mellem medieændringer for at minimere agitation og tillade gradvis fjernelse af hæmmere og vækstfaktorer. RPMI med 2% B-27 supplement (Tabel over materialer) blev brugt i hele differentieringsprotokollen. B-27 supplement indeholder insulin, medmindre det er angivet (insulinfri i dag 0-5). Se figur 1C.- Dag 0
- For at indlede differentiering i retning af en mesoderm afstamning skal du fjerne 166 μL medium fra hver brønd (~2/3rd af det samlede brøndvolumen) og tilsætte 166 μL RPMI 1640 indeholdende insulinfrit B-27-tillæg, 6 μM CHIR99021, 1.875 ng/mL knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP4) og 1,5 ng/mL Activin A for en endelig brøndkoncentration på 4 μM CHIR99021 1,25 ng/mL BMP4 og 1 ng/mL Activin A. Inkubation i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag 1
- 166 μL medium fra hver brønd og tilsæt 166 μL frisk RPMI 1640 med insulinfri B-27-tilskud. Inkuberes i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag 2
- For at fremkalde hjertemesodermspecifikation skal 166 μL medium fjernes fra hver brønd og tilsættes 166 μL RPMI 1640 indeholdende insulinfrit B-27-tilskud og 3 μM Wnt-C59 for en endelig brøndkoncentration på 2 μM Wnt-C59. Inkubation i 48 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag 4
- 166 μL medium fra hver brønd og tilsæt 166 μL frisk RPMI 1640 med insulinfri B-27-tilskud. Inkuberes i 48 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag 6
- 166 μL medium fra hver brønd og tilsæt 166 μL RPMI 1640 med B-27 supplement. Inkuberes i 24 timer ved 37 °C, 5% CO2.
- Dag 7
- For at fremkalde proepicardial differentiering skal 166 μL medium fjernes fra hver brønd og tilsættes 166 μL frisk RPMI 1640 indeholdende B-27-tillæg og 3 μM CHIR99021 for en endelig brøndkoncentration på 2 μM CHIR99021. Inkuberes i 1 time ved 37 °C, 5% CO2.
- 166 μL medium fra hver brønd og tilsæt 166 μL frisk RPMI 1640 indeholdende B-27 supplement. Inkuberes i 48 timer ved 37 °C, 5% CO2.
BEMÆRK: Ekstra forsigtighed anbefales ved denne anden medium ændring på dag 7, da organoiderne er mere tilbøjelige til bevægelse på grund af medieændringerne. - Fra dag 7 og fremefter til indsamling eller overførsel til analyser eller forsøg, udføre medium ændringer hver 48 h ved at fjerne 166 μL medium fra hver brønd og tilsæt 166 μL frisk RPMI 1640 indeholdende B-27 supplement.
BEMÆRK: Organoider er klar til analyser og eksperimenter på dag 15, medmindre tidligere udviklingsstadier er af interesse. De kan dyrkes forbi dag 15 for langsigtede kultur- eller modningseksperimenter.
- Dag 0
3. Organoidanalyse
- Overførsel af hele organoider (levende eller faste)
BEMÆRK: Ved overførsel af levende organoid skal du sikre dig, at de anvendte pipettespidser er sterile.- Skær spidsen af en P200 pipettespids 5-10 mm fra spidsåbningen, hvilket resulterer i en bred åbning på ~ 2-3 mm diameter.
- Sæt spidsen lige ind i den runde bund brønd, der indeholder organoiden, så pipetten er helt lodret (vinkelret på pladen). Sørg for, at pipettestemt allerede er trykket helt igennem, før spidsen sættes ind i mediet.
- Slip langsomt pipettekaster, idet der optager nok medium (100-200 μL) til at opsamle organoiden.
- Overfør organoiden i medium til måldestinationen (f.eks. til fastgørelse, levende billeddannelse, elektrofysiologioptagelse, ny pladekultur).
- Fastsættelse af organoider
BEMÆRK: Fastgørelse og farvning af organoider kan gøres enten i 96-brønds kulturpladen eller mikrocentrifugerørene. Paraformaldehyd (PFA) må kun håndteres i en røghætte.- Til fiksering i mikrocentrifugerør overføres levende organoider til separate rør med 1-8 organoider pr. Rør.
BEMÆRK: Må ikke overstige 8 organoider pr. rør. - Fjern forsigtigt og kassér så meget medium fra røret som muligt uden at røre organoiderne.
- Der tilsættes 4% PFA til hvert rør eller brønd (300-400 μL pr. mikrocentrifugerør og 100-200 μL pr. brønd af en 96-brønds plade). Inkuber ved stuetemperatur i 30-45 min.
BEMÆRK: Inkubationstiderne over 1 time kan kræve antigenudtagningstrin og anbefales ikke. - Kassér PFA sikkert uden at forstyrre organoiderne. Udfør 3 vaske med DPBS suppleret med 1,5 g/L glycin (DPBS/Gly), ved hjælp af den samme volumen, der anvendes til 4% PFA, venter 5 min mellem vaske. Fjern DPBS/Gly og fortsæt til immunstainning eller andre analyser, eller tilsættes DPBS og opbevares ved 4 °C til fremtidig brug i op til 2 uger.
BEMÆRK: Opbevaring af faste organoider i mere end 2 uger kan resultere i vævsforringelse og -forurening og anbefales ikke.
- Til fiksering i mikrocentrifugerør overføres levende organoider til separate rør med 1-8 organoider pr. Rør.
- Hele mount immunofluorescent farvning
- Der tilsættes 100 μL blokerings-/permeabiliseringsopløsning (10% normalt æselserum + 0,5% kvægserum albumin (BSA) + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) til hver brønd eller rør, der indeholder de faste organoider. Inkuber ved stuetemperatur natten over på en shaker.
BEMÆRK: Må ikke overstige 8 organoider pr. rør. - Fjern og kassér forsigtigt så meget af blokeringsopløsningen som muligt uden at røre organoiderne. Udfør 3 vasker med DPBS, venter 5 minutter mellem vaske.
- Den primære antistofopløsning (1 % normalt æselserum + 0,5 % BSA + 0,5 % Triton X-100 i 1x DPBS) med de ønskede primære antistoffer ved de anbefalede koncentrationer. Inkuberes ved 4 °C i 24 timer på en shaker.
- Fjern og kassér forsigtigt så meget af antistofopløsningen som muligt uden at røre organoiderne. Udfør 3 vasker med DPBS, venter 5 minutter mellem vaske.
- Tilbered sekundær antistofopløsning (1% normalt æselserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) med de ønskede sekundære antistoffer ved de anbefalede koncentrationer. Hvis antistofferne er fluorescerende mærket, inkuberes ved 4 °C i mørke (f.eks. dækket af aluminiumsfolie) i 24 timer på en shaker.
- Fjern og kassér forsigtigt så meget af antistofopløsningen som muligt uden at røre organoiderne. Udfør 3 vasker med DPBS, venter 5 minutter mellem vaske.
- Forbered dias med perler (90-300 μm i diameter) monteret i et monteringsmedium (se materialetabellen) nær kanterne af diaset, hvor coverlip med organoiderne vil blive placeret.
BEMÆRK: Det anbefales at lade monteringsmediet omkring perlerne tørre, før du fortsætter; dette vil forhindre perlerne i at bevæge sig rundt. Se figur 2. - Overfør de farvede organoider ved hjælp af en skåret pipettespids på diaset mellem perlerne, hvilket sikrer afstand for at undgå kontakt mellem organoiderne en gang på diaset. Brug hjørnet af en sammenrullet laboratoriestørk til forsigtigt at fjerne overskydende væske omkring organoiden.
- Dæk organoiderne med monteringsklaringsmedium (fructose-glycerol clearingopløsning er 60% (vol/vol) glycerol og 2,5 M fructose)37 ved hjælp af 120-150 μL af monteringsklaringsmediet pr. dias.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge en skåret pipettespids, når der arbejdes med monteringsklaringsmediet, da det er meget tyktflydende. - Hold dækslet over rutsjebanen med organoiderne dækket med monteringsklaringsopløsning, og tryk langsomt dækslet over rutsjebanen, så organoiderne er mellem de monterede perler.
- Forsegl omkredsen af coverlip på diaset ved hjælp af top coat neglelak. Lad rutsjebanen tørre i mørke ved stuetemperatur i 1 time. Opbevares ved 4 °C i mørke til langtidsopbevaring.
- Der tilsættes 100 μL blokerings-/permeabiliseringsopløsning (10% normalt æselserum + 0,5% kvægserum albumin (BSA) + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) til hver brønd eller rør, der indeholder de faste organoider. Inkuber ved stuetemperatur natten over på en shaker.
- Calcium forbigående billeddannelse i levende hjerte organoider
BEMÆRK: Ifølge producentens anvisninger blev Fluo4-AM rekonstitueret i dimethylsulfoxid (DMSO) til en endelig lageropløsningskoncentration på 0,5 mM. Fluo4-AM blev tilføjet direkte til organoiden godt i 96-brøndspladen.- Udfør 2 vasker på organoider ved hjælp af RPMI 1640 medium.
- Fjern 166 μL af det brugte medium fra brønden.
- Tilsæt 166 μL opvarmet RPMI 1640 medium, fjern 166 μL medium, og tilsæt 166 μL frisk RPMI 1640 medium.
BEMÆRK: Vaskerne udføres for at fjerne affaldsmateriale og celleaffald. To tredjedele af mediet fjernes fra brøndene under vaskerne for at undgå at forstyrre organoiderne i bunden af brønden før den funktionelle analyse.
- Tilsæt Fluo4-AM medium til organoiderne.
- Der tilsættes Fluo4-AM rekonstitueret i DMSO til RPMI 1640 indeholdende B-27 supplement til at forberede en 1,5 μM opløsning.
- Fjern 166 μL medium fra brønden.
- Der tilsættes 166 μL på 1,5 μM Fluo4-AM i RPMI 1640 indeholdende B-27-tillæg for en endelig brøndkoncentration på 1 μM. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 i 30 min.
- Udfør 2 vasker som i trin 3.4.1.
- Der tilsættes 166 μL RPMI 1640, der indeholder B-27-tillæg til brønden.
- Ved hjælp af en skåret spids af en P200 pipettespids overføres organoiden til en glasbundet petriskål (f.eks. 8-godt chambered coverglas med # 1,5 højtydende coverglas) med 100-200 μL medium.
BEMÆRK: Se punkt 3.1 om overførsel af hele organoider. - Billede organoiderne lever under et mikroskop med et temperatur- og CO2-kontrolleret kammer ved 37 °C, 5% CO2.
- Optag flere 10-20 s videoer på forskellige steder på tværs af organoid, der viser stigningen og faldet i fluorescensintensitet niveauer som calcium ind og ud af cellerne.
BEMÆRK: For optagelser i høj opløsning anbefales det at optage med en hastighed på 10 fps eller hurtigere; 50 fps anbefales. - Analyser videoerne ved hjælp af billedanalysesoftware (f.eks. ImageJ) ved at vælge områder af interesse og måle intensitetsniveauer over tid.
- Normaliser intensitetsoptagelserne ved hjælp af ΔF/F0 vs. tid i millisekunder og plot.
- Udfør 2 vasker på organoider ved hjælp af RPMI 1640 medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå selvorganiserende hHO in vitro ændrede vi og kombinerede differentieringsprotokoller, der tidligere var beskrevet for 2D monolayerdifferentiering af kardiomyocytter21 og epicardiale celler22 ved hjælp af Wnt-vejmodulatorer og til 3D præcardiac organoider16 ved hjælp af vækstfaktorerne BMP4 og Activin A. Ved hjælp af 96-brøndspladen EB og hHO differentiering protokol beskrevet her og vist i figur 1 blev koncentrationerne og eksponeringsvarighederne for Wnt-stiaktivatoren CHIR99021 optimeret til at give meget reproducerbare og komplekse hHOs, der stammer fra menneskelige PSC'er.
EBs fik lov til at inkubere i 48 timer med en medium ændring efter 24 timer, før de begyndte at differentiere sig på dag 0. På dag 0 skal EB'erne fremstå som et mørkt sfærisk aggregat i midten af hver brønd under et let mikroskop (figur 1B). Differentieringsprotokollen starter på dag 0 med Wnt-vejaktivering og vækstfaktortilføjelse på præcis 24 timer. Denne mesoderm induktion efterfulgt af en hjerte mesoderm induktion på dag 2 ved hjælp af Wnt vej hæmmer Wnt-C59 vil resultere i en betydelig udvidelse af organoid fra ~ 200 μm i diameter til 500-800 μm i diameter på dag 4 og til så meget som 1 mm (organoider kan opleve en lille reduktion i størrelse ved dag 15 (Figur 1C)). HHO vil begynde at slå så tidligt som dag 6 (Video 1), med 100% af organoider viser synlige slå af dag 10 (Video 2) (medmindre der gennemgås narkotikabehandling, eller hvis utilstrækkelige hPSCs blev brugt til at generere EBs). Dette er blevet observeret i 5 forskellige hPSC cellelinjer23.
For at evaluere hHOs evne til at repræsentere forskellige trin i hjertets fysiologiske udvikling indsamlede vi organoider på forskellige tidspunkter i hele differentieringsprotokollen og ledte efter tilstedeværelsen og transcriptomisk udtryk for hjertefeltmarkører. Immunofluorescent farvning til den første hjertefeltmarkør (FHF), HAND1, og det andet hjertefelt (SHF) markør, HAND2, afslørede deres nukleare tilstedeværelse i disse hjerte stamfaderceller, der opstår omkring henholdsvis dag 3 og dag 5 (figur 3A).
Udtrykket af begge markører sker i områder af organoider, der aftager i størrelse efter dag 7 for FHF og efter dag 9 for SHF. Interessant, høj forstørrelse billeder af dag 7 organoider afslørede, at de fleste HAND1-udtrykkende celler var kardiomyocyt i oprindelse (som vist ved kardiomyocyt-specifikke markør TNNT2). I modsætning hertil udtrykte mange af de HAND2-udtrykkende celler ikke kardiomyocytmarkøren (Figur 3B). Denne observation er i overensstemmelse med de præcardiac organoider afledt af mus ESCs demonstrere udviklingen af ikke-myocyt celler fra SHF stamfader celler16. Det er vigtigt at bemærke, at RNA-Sekventeringsdataene viser, at RNA-udskrifterne for både HAND1 og HAND2 blev udtrykt fra dag 3 og fremefter, idet FHF-markøren var mere udtalt mellem dag 3 og 11, og shf-markøren var mere udtalt efter dag 13 (figur 3C).
Immunofluorescence farvning afslørede tilstedeværelsen af markører af forskellige celle-type slægter, der udgør det menneskelige hjerte. Myokardievæv (kan identificeres ved hjælp af den kardiomyocytspecifikke markør TNNT2) ved siden af epicardialvæv (markeret med den nukleare transskriptionsfaktor WT1 og epitelmembranmarkøren TJP1) (Figur 4A). Endocardial celler, der udtrykker NFATC1 blev opdaget foring væggene i interne kammer-lignende strukturer i organoider (Figur 4B). Endotelceller i et fartøjslignende netværk kan ses allerede dag 13 i differentiering (figur 4C). Endelig rapporterer vi tilstedeværelsen af hjertefibroblaster blandet i hele organoiden (Figur 4D). Disse cellelignende markører blev også observeret i RNA-Seq-genekspressionsprofilerne (Figur 4E). Sammensætningen af celletyper i organoiderne, målt efter område af den organoid, de indtager, viste sig at være ~ 58% kardiomyocytter, mens resten bestod af ikke-myocyt hjerteceller, herunder epicardiale celler (~ 15%), endocardialceller (~ 13%), hjertefibroblaster (~ 12%) og endotelceller (~ 1%) (Figur 4F).
Organoidernes elektrofysiologiske funktion blev målt ved levende calciumbilleddannelse af individuelle celler i hele organoider. Fluo-4 fluorescensintensitet varierer over tid på grund af calciumindtastning og udgang fra cellen, hvilket afslører regelmæssige handlingspotentialer (Figur 5A). Varmekort, der viser calciumintensiteter over et område med høj forstørrelse af organoiden, viser den øgede intensitet på grund af calciumtransienter i de enkelte celler (figur 5B og video 3).
Figur 1: Embryoid kropsgenerering og hjerteorganoid differentiering trin. (A) (1-2) Dissocierede celler er seedet i brønde af en 96-godt ultra-lav vedhæftet fil plade via en multikanal pipette. (3) 96-brøndspladen centrifugeres derefter, hvilket gør det muligt for cellerne at samle sig i midten. (4) Med tiden begynder embryomorkroppen efter tilsætning af vækstfaktorer og vejmodulatorer at differentiere sig til flere hjerteforinger og danne rumligt og fysiologisk relevante forskellige cellepopulationer omkring interne mikrokamre. B) Repræsentative billeder af udviklingen af embryonale kropsproduktion, begyndende med 2-dimensionel iPSC-kultur (venstre) og slutter med en dag 0 embryoid krop (højre); skalabar = 500 μm. (C) Resumé af protokollen for differentierelse af menneskelige hjerteorganoider, herunder kemiske vejmodulatorer og hæmmere med respektive tidspunkter, varigheder og udvikling af organoidbilleder under let mikroskopi fra dag 1 til dag 15 skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hele organoidmontering på dias til billeddannelse. Trin til forberedelse af dias og montering af organoider til billeddannelse. A) Placering af mikroperler i periferien af en glasrutschebane. B) Dækker mikroperlerne med monteringsmedium. (C) Overførsel af organoider på diaset mellem perlerne og fjernelse af overskydende væske omkring organoiderne. D) Dækker organoiderne med clearing/monteringsmedium. (E) Placering af dækslet oven på rutsjebanen med organoider og perler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Første hjertefelt og anden hjertefeltspecifikation i hHOs opsummerer fysiologisk udvikling af menneskers hjerte. (A) Sammenfødt immunfluorescencebilleder af dag 3 til dag 11 hHOs, der viser dannelsen af FHF (HAND1, top) og SHF (HAND2, bund) og kardiomyocytter (TNNT2) og nukleart farvestof DAPI; skalastænger = 500 μm. (B) Billeder med høj forstørrelse af dag 7-organoider, der viser co-lokalisering af HAND1 og HAND2 med kardiomyocytmarkøren TNNT2 skalastænger = 50 μm. (C) RNA-Seq genekspressionsprofiler af FHF-markør HAND1 (rød) og SHF-markør HAND2 (blå) fra dag 0 til dag 19. Forkortelser: hHOs = menneskelige hjerteorganoider; FHF = første hjertefelt; SHF = andet hjertefelt; HAND = hjerte og neurale crest derivater udtrykt; TNNT2 = hjerte troponin T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HHOs udviklermultiple hjerte slægter. (A-D) Confocal immunofluorescence billeder af dag 15 hHOs viser dannelsen af kardiomyocytter (TNNT2) og farvning med nukleart farvestof DAPI i ikke-myocyt hjerteceller. (A) Hele organoid og høj forstørrelse af epicardial markør WT1 (grøn) og epitelmembran markør TJP1 (hvid), der viser epicardial celler af epitel oprindelse på toppen og støder op til myokardievæv; skalastang = 500 μm, indsat = 50 μm. (B) Endocardial markør NFATC1 (grøn) udtryk på foring af kamre; skalastang = 500 μm. (C) Endotelbeholdernetværk i hHOs vist af PECAM1 (grøn). Skalastang = 500 μm. (D) Hjertefibroblaster markører THY1 og VIM vist i henholdsvis grøn og hvid fordelt over hele organoiden. Skalalinje = 500 μm. (E) RNA-Seq genekspressionsprofiler af de vigtigste celletyper, der findes i hHOs fra dag 0 til 19 af differentiering. Forkortelser: hHOs = menneskelige hjerteorganoider; TNNT2 = hjerte troponin T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; WT1 = Wilms tumor-1 transskription faktor; NFATC1 = cytoplasmisk nuklear faktor af aktiveret T-celle; PECAM1 = blodplade endotelcelle vedhæsion molekyle-1; VIM = vimentin. (F) Cirkeldiagram over den gennemsnitlige vævstypesammensætning i hHOs, beregnet som det procentvise område med den respektive cellemarkør over en hel organoid ved atomfarvning på tværs af tre z-planer i hele organoiden ved hjælp af ImageJ. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Fluo-4 levende calcium forbigående optagelser i levende menneskelige hjerte organoider. A) Repræsentative transienterede calciumoptagelser af individuelle kardiomyocytter i hele organoider. B) Varmekort, der viser lave og maksimale calciumniveauer mellem handlingspotentialer som bestemt af Fluo-4-intensitet skalalinjer = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Livebilleddannelse af repræsentativ organoid afledt af hPSC'er på dag 6 af differentiering under lysmikroskopi ved stuetemperatur. Forkortelse: hPSC = human pluripotente stamcelle. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Live billeddannelse af repræsentativ organoid afledt af hPSCs på dag 15 af differentiering under lysmikroskopi ved stuetemperatur. Forkortelse: hPSC = human pluripotente stamcelle. Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Live optagelse af dag 10 organoid viser heatmap af calcium transienter under et fluorescens mikroskop. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylige fremskridt inden for human stamcelle-afledte kardiomyocytter og andre celler af hjerteoprindelse er blevet brugt til at modellere menneskets hjerteudvikling22,24,25 og sygdom26,27,28 og som værktøjer til at screene terapeutiske 29,30 og giftige agens31,32 . Her rapporterer vi en let at implementere, meget reproducerbar protokol til at generere og differentiere EBs i meget komplekse hHOs. Denne protokol har haft succes i flere cellelinjer, herunder hPSCs og hESCs23, der viser konsekvente slå frekvenser og celle type organisation. Denne protokol trækker aspekter fra tidligere beskrevne protokoller for kardiomyocyt differentiering24, epicardial celledifferentiering22, og præcardiac organoider stammer fra mus ECS16 og optimerer trinvis graduering af kanoniske WNT signalering ved hjælp af kemiske hæmmere og vækstfaktorer i et fuldt defineret medium. Flere optimeringsmetoder blev anvendt i oprettelsen af denne protokol.
For det første er de kemiske hæmmerkoncentrationer og eksponeringsvarigheder samt tilsætning af vækstfaktorer blevet optimeret til 3D-miljøet og diskuteres i tidligere arbejde23. Disse blev optimeret til at belyse strukturer med fysiologisk kompleksitet og repræsentation af in vivo menneskelige hjerte, med fysiologisk sammensætning og forholdet mellem kardiomyocytter til ikke-myocyt hjertecelletyper (epicardial celler, hjerte fibroblaster). For det andet giver to tredjedele medium forandringsstrategien mulighed for minimal agitation af EBs /organoids, da de sidder i suspension nær bunden af brønden, samtidig med at det letter en gradienteksponering for kemiske hæmmere og vækstfaktorer, når mediet opdateres. Kombinationen af hjerte mesoderm differentiering gennem Wnt pathway aktivering, efterfulgt af hæmning24, og den efterfølgende induktion af proepicardial specifikation via en anden Wnt vej aktivering22, giver mulighed for en enkelt protokol til at give meget komplekse hHOs. Organoiderne vokser op til 1 mm efter 15 dages differentiering og kan let overføres til levende eller faste analyser og analyser. For det tredje, i betragtning af organoidernes store størrelse, blev brugen af mikroperler eller andre lignende strukturer for at opretholde rummet mellem diaset og coverslip fundet for bedre at bevare organoidernes 3D-struktur og forbedre billeddannelsesprocessen.
Denne udviklende menneskelige hjerte model giver adgang til ellers utilgængelige stadier af hjerte udvikling, såsom tidlig første og andet hjertefelt specifikation-observeret mellem dag 3 og 9 af differentiering-og organisation i hjerte stamfader celler, der giver anledning til hjertevæv, herunder myokardiet, endocardium, epicardium, endothelial vaskulatur, og støtte hjerte fibroblaster, som blev observeret på dag 15 af differentiering. Vævstyperne, der findes i hjertet organoider stammer fra denne protokol er meget repræsentative for det menneskelige foster hjerte i både sammensætning33 og transcriptom profil23,34. De kan derfor lette væv-væv og celle-celle højere orden interaktioner, der ligner in vivo hjerte. Denne protokol var meget effektiv og reproducerbar på tværs af eksperimenter og cellelinjer, hvilket giver organoider, der hovedsagelig består af kardiomyocytter og omfatter ikke-myocyt hjerteceller, såsom epicardial celler, endocardial celler, hjerte fibroblaster, og endotelceller, der repræsenterer den fysiologiske sammensætning23,33,35.
Analyser af de dannende kardiomyocytters ultrastruktur via transmissionselektronmikroskopi og udvikling af kamre og et vaskulært netværk via optisk sammenhængstomografi og konfokal billeddannelse diskuteres i detaljer i tidligere arbejde23. En stor fordel ved denne hjerteorganoid protokol i forhold til andre eksisterende protokoller for nylig offentliggjort17,18,19,20,36,37 er den robuste dannelse af et endotelnetværk i hele organoid, så evnen til at undersøge vaskulær udvikling og sygdom i det tidlige menneskelige hjerte, uden behov for yderligere eksterne induktioner til protokollen. Endelig er funktionel analyse af hjerteorganoiderne opnåelig gennem forskellige tilgange, herunder brugen af et calciumfølsomt farvestof til at spore calciumtransienterne i kardiomyocytterne på tværs af organoiden. Ved hjælp af mikroskopi i høj opløsning registrerede vi fluorescensintensiteten af calcium, der kom ind og ud af celler og observerede meget repræsentative handlingspotentialer. Andre mulige funktionelle analysemetoder omfatter anvendelse af en transgen linje med en calciumfølsom indikator eller direkte registrering ved hjælp af et mikroelektrodesystem23.
Hjertet organoider beskrevet her er recapitulative af den udviklende menneskelige fosterhjerte, men er begrænset i at demonstrere mere modne, voksen-lignende funktioner. Fremtidige protokoller kan bygge videre på den protokol, der er beskrevet her for at fremkalde modning i disse organoider og udbyttekonstruktioner, der bedre modellerer det voksne hjerte. Desuden er denne protokol designet til at skabe miniaturemodeller af det menneskelige hjerte og er begrænset til forskningsundersøgelser af hjerteudvikling og sygdom eller til lægemiddelscreening og er muligvis ikke egnet som et middel til klinisk intervention, såsom udskiftning af hjertevæv via transplantation. Samlet set beskriver vi her en let at følge og omkostningseffektiv protokol til at generere meget reproducerbare og sofistikerede menneskelige hjerteorganoider, der kan lette forskningsundersøgelser i menneskelig hjerteudvikling, sygdomsetiologi og farmakologisk screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Heart, Lung, and Blood Institute of National Institutes of Health under tildeling numre K01HL135464 og R01HL151505 og af American Heart Association under tildeling nummer 19IPLOI34660342. Vi vil gerne takke MSU Advanced Microscopy Core og Dr. William Jackson på MSU Department of Pharmacology and Toxicology for adgang til konfokale mikroskoper, IQ Microscopy Core og MSU Genomics Core til sekventeringstjenester. Vi vil også gerne takke alle medlemmer af Aguirre Lab for deres værdifulde kommentarer og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| Other | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermal Mixer | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al.
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al.
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
