Summary
在这里，我们描述了用于记录神经和大脑 体内 的可定制碳纤维电极阵列的制造方法。
Abstract
传统的周围神经探头主要在洁净室中制造，需要使用多种昂贵且高度专业化的工具。本文介绍了一种碳纤维神经电极阵列的洁净室"轻"制造工艺，经验不足的洁净室用户可以快速学习。这种碳纤维电极阵列制造工艺只需要一个洁净室工具，一台Parylene C沉积机，可以快速学习或以边际成本外包给商业加工设施。该制造工艺还包括手工填充印刷电路板，绝缘和尖端优化。
这里探讨的三种不同的烙铁头优化（Nd：YAG激光器、喷灯和紫外激光器）产生了一系列尖端几何形状和1 kHz阻抗，喷灯光纤产生了最低的阻抗。虽然先前的实验已经证明了激光和喷灯电极的功效，但本文还表明，紫外激光切割光纤可以在 体内记录神经信号。现有的碳纤维阵列要么没有单独的电极，而有利于束，要么需要洁净室制造的填充和绝缘导轨。建议的阵列仅使用可在台式设备上用于光纤群体的工具。这种碳纤维电极阵列制造工艺允许以比市售探头更低的价格快速定制体阵列制造。
Introduction
许多神经科学研究依赖于使用电生理学（ePhys）记录神经信号。这些神经信号对于理解神经网络和新型医学治疗（如脑机和周围神经接口）的功能至关重要1，2，3，4，5，6。围绕周围神经的研究需要定制或市售的神经记录电极。神经记录电极 - 具有微米级尺寸和易碎材料的独特工具和 - 需要一套专门的技能和设备来制造。已经为特定的最终用途开发了各种专用探头;然而，这意味着实验必须围绕当前可用的商业探针进行设计，或者实验室必须投资开发专用探针，这是一个漫长的过程。由于周围神经研究种类繁多，因此对多功能ePhys探针的需求很高4，7，8。理想的 ePhys 探头应具有小型记录站点、低阻抗9 和财务上切合实际的价格点，以便在系统中实施3。
目前的商业电极往往是位于神经外的神经外或袖带电极（神经袖带10，MicroProbes神经袖带电极11），其位于神经外，或囊内，穿透神经并位于感兴趣的分册内。然而，当袖带电极离纤维更远时，它们会从附近的肌肉和其他可能不是目标的束中拾取更多的噪音。这些探针还倾向于收缩神经，这可能导致生物污染 - 神经胶质细胞和疤痕组织的积聚 - 在电极界面处，而组织愈合。囊内电极（如 LIFE12、TIME13 和 Utah Arrays14）增加了分形选择性的优势，并具有良好的信噪比，这对于区分机器接口的信号非常重要。然而，这些探针确实存在生物相容性问题，神经会随着时间的推移而变形3，15，16。当以商业方式购买时，这两种探头都具有静态设计，没有特定于实验的定制选项，并且对于较新的实验室来说成本很高。
为了应对其他探针带来的高成本和生物相容性问题，碳纤维电极可以为神经科学实验室提供一条无需专用设备即可构建自己的探针的途径。碳纤维是一种替代记录材料，外形小巧，可以低损伤插入。碳纤维具有更好的生物相容性，并且比硅的疤痕反应要低得多17，18，19 ，而无需密集的洁净室处理5，13，14。碳纤维具有柔韧性、耐用性，易于与其他生物材料集成19，并且可以穿透和记录神经7，20。尽管碳纤维具有许多优点，但许多实验室发现手动制造这些阵列非常艰巨。一些group21 将碳纤维组合成束，共同产生更大的（约200μm）直径;然而，据我们所知，这些束尚未在神经中得到验证。其他人已经制造了个性化的碳纤维电极阵列，尽管他们的方法需要洁净室制造的碳纤维导轨22，23，24 和设备来填充其阵列17，23，24。为了解决这个问题，我们提出了一种制造碳纤维阵列的方法，该阵列可以在实验室台面上进行，允许即兴修改。由此产生的阵列保持个性化电极头，无需专门的光纤填充工具。此外，还提供了多种几何形状，以满足研究实验的需求。本文以先前的工作为基础8，17，22，25，提供了详细的方法，以最少的洁净室培训时间手动构建和修改多种样式的阵列。
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Protocol
所有动物程序均由密歇根大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 选择碳纤维阵列
- 从 图1所示的三种设计之一中选择印刷电路板（PCB）。
注意：对于此协议，Flex 阵列将是重点。- 请参阅 Chestek Lab 网站 （https://chestekresearch.engin.umich.edu） 上的 PCB 设计，免费，可随时寄往 PCB 印刷厂订购印刷。
- 有关每个板的连接器及其规格的摘要，请参阅 表 1 ，以帮助选择适用于特定实验设置的连接器。
2. 将连接器焊接到电路板上
- 将烙铁设置为 315 °C （600 °F）。
- 将助焊剂涂在PCB上的所有焊盘上。
注意：管内的助焊剂可以挤过垫子，而锅中的助焊剂可以通过在所有垫子上自由涂抹助焊剂来用棉头涂药器的木制端施加。 - 在 Flex 阵列的背板上形成小堆焊料（图 2A）。
- 将底部一排连接器引脚焊接到焊盘的后排（图2B）。
注：Chestek实验室提供的所有电路板设计都经过精心设计，使连接器能够与指定的电路板精确配对。- 为此，请将连接器两侧的引脚焊接在易于接近焊料堆的地方。固定后，轻轻推动前引脚之间的烙铁头，以焊接背面的其余连接。
注：一旦后排引脚固定，连接器的其余部分将与其指定的焊盘上方的每个引脚对齐。
- 为此，请将连接器两侧的引脚焊接在易于接近焊料堆的地方。固定后，轻轻推动前引脚之间的烙铁头，以焊接背面的其余连接。
- 通过在每个引脚上施加少量焊料，将前排引脚焊接到电路板上。如果焊接不迅速，请再涂上一层助焊剂。
- 用100%异丙醇（IPA）和短刷毛刷清洁多余的助焊剂。
- 使用23 G针头和1 mL注射器将焊接连接封装在延迟设置的环氧树脂中（图2 C，D），注射器将斜面朝下放置在引脚上。缓慢地将环氧树脂推入注射器，使其流入并沿着连接。
- 将电路板放置过夜，以便延迟的环氧树脂可以固化。
注意：虽然延迟设置环氧树脂的产品插入物表明它可以在30分钟内固化，但过夜可以形成更稳定的连接。
- 将电路板放置过夜，以便延迟的环氧树脂可以固化。
- 通过在电路板背面铺设一小排延迟设置的环氧树脂并将其拉到连接器的边缘，将电路板的背面固定到连接器的侧面。
- 让板子再次在一夜之间治愈。
注意：此时，请存储数组或继续生成。如果在构建中暂停，请将阵列存放在室温下干净干燥的盒子中。
- 让板子再次在一夜之间治愈。
3. 纤维种群
- 切割拉动的玻璃毛细管，使其尖端适合阵列的痕迹（图3A）。
- 使用玻璃拉拔器和细丝，使用以下设置制作毛细管：热量 = 900，拉力 = 70，速度 = 35，时间 = 200，压力 = 900。
注：编号为无单位，特定于此设备（请参阅 材料表）。
- 使用玻璃拉拔器和细丝，使用以下设置制作毛细管：热量 = 900，拉力 = 70，速度 = 35，时间 = 200，压力 = 900。
- 使用两个棉头涂抹器的木制末端（每份银环氧树脂一个）在塑料盘中舀取一小块约1：1比例的银环氧树脂，并使用用于舀的相同棍子混合。混合后丢弃涂抹器。
- 使用剃须刀片将碳纤维束的末端切割2-4毫米到一张打印机纸上。为了轻松分离束中难以梳理的纤维，请在束的顶部轻轻拉一张层压纸。
注：层压纸片将静电转移到纤维中，纤维会自行分离。 - 用玻璃毛细管在电路板一侧的每隔一对迹线之间涂上银环氧树脂（图3B）。
- 取一小滴环氧树脂到拉动的毛细管的末端。轻轻地涂抹在电路板末端的每隔一条迹线之间，以填充间隙。
注意：间隙应填充到两条迹线的顶部，而不会溢出以接触相邻迹线。每个跟踪都连接到一个通道。这种环氧树脂聚集方法意味着每根光纤将有两个通道连接到它。这是因为两条走线允许更好的光纤对准，并且通道中的冗余有助于确保电气连接。
- 取一小滴环氧树脂到拉动的毛细管的末端。轻轻地涂抹在电路板末端的每隔一条迹线之间，以填充间隙。
- 使用特氟龙涂层的镊子在每个环氧树脂痕迹中放置一根碳纤维（图3C）。
- 使用干净的拉毛细管来调整碳纤维，使它们垂直于Flex Array板的末端并埋在环氧树脂下方（图3D）。
- 将阵列放在木块上，纤维末端悬在块的边缘。
注意：后端的权重将使阵列保持在块上。 - 在140°C下烘烤木块和阵列20分钟，以固化银环氧树脂并将纤维锁定到位。
- 对主板的另一侧重复步骤 3.4-3.8。
注意：数组可以在任何烘焙步骤后存储;但是，如果在填充电路板时应用的银环氧树脂太少，则存储盒中的静电可能会导致纤维从电路板上拉开。- 在盒子内创建一个凸起的粘合剂平台，以便可以将大部分电路板粘在粘合剂上，从而使电路板的纤维末端悬挂在盒子内以防止纤维断裂。在室温下储存。
注：如果纤维在储存过程中从电路板上拉开，请用干净的拉动的玻璃毛细管将环氧树脂从痕迹中刮出，然后重复步骤3.1-3.8以更换纤维。从这一点开始，阵列必须与以这种方式悬挂的光纤一起存储，以防止光纤断裂。
- 在盒子内创建一个凸起的粘合剂平台，以便可以将大部分电路板粘在粘合剂上，从而使电路板的纤维末端悬挂在盒子内以防止纤维断裂。在室温下储存。
4. 应用紫外线（UV）环氧树脂对碳纤维进行绝缘
- 使用干净的毛细管，并在电路板一侧暴露的走线上涂抹一个小液滴（直径约0.5毫米的UV环氧树脂（图4A）。继续添加UV环氧树脂液滴，直到痕量完全覆盖。
注意：不要让紫外线环氧树脂通过PCB末端进入碳纤维，以确保以后顺利插入。 - 在UV笔光下固化UV环氧树脂2分钟（图4B）。
- 对主板的另一侧重复步骤 4.1-4.2。
- 使用立体镜标线和手术剪刀将纤维切割至1毫米。
注意：此时可以存储数组，直到准备好继续执行后续步骤。它们应该储存在一个盒子里，这个盒子会把碳纤维从盒子本身抬高。阵列可以在室温下无限期地存储。
5. 使用 1 kHz 阻抗扫描检查电气连接（图 5）
- 将 1 mm 的碳纤维浸入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
- 要完成电路，请使用氯化银-银 （Ag|AgCl）参比电极和不锈钢棒（对电极）。
- 使用烧杯夹，悬挂Ag|AgCl 电极位于 1x PBS 中，并将其连接到所用阻抗系统的基准电压源。
- 使用烧杯夹，将不锈钢杆悬挂在1x PBS中，并连接到所用阻抗系统的反电极输入。
- 使用在单个正弦波形中设置为 0.01 Vrms 的 1 kHz 扫描频率的恒电位仪，对每根光纤运行 1 kHz 阻抗扫描。在每次扫描开始时将恒电位仪设置为0 V，持续5秒，以稳定记录的信号。通过恒电位仪相关软件记录测量结果。
注意：测量可以在构建中的任何一点进行;但是，它们仅在绝缘前和尖端准备期间才需要。 表 2 列出了每个构建步骤后的典型阻抗范围，频率为 1 kHz，供用户参考。 - 将纤维浸入小烧杯中三次，然后在去离子（DI）水中冲洗纤维，并在室温下晾干。
注意：阵列可以保留在存储中，直到用户可以继续执行下一步。
6. 聚对二甲苯C绝缘
注：聚对二甲苯C被选为碳纤维的绝缘材料，因为它可以在室温下沉积在成批的阵列上，并提供高度保形的涂层。
- 使用配接连接器屏蔽 Flex Array 连接器。
- 将一批8-12个阵列放入带有凸起粘合剂平台的存储盒中，以便它们可以在一次运行中绝缘。放置阵列，使阵列的连接器端位于胶粘性平台上，阵列的光纤端悬垂（图6），以防止光纤粘附在胶粘剂上并拉出，并确保纤维上有均匀的Parylene涂层。
- 在洁净室中，将Parylene C沉积系统中的阵列涂覆至800nm的厚度，并佩戴所使用的单个洁净室定义的适当的个人防护设备（PPE）。
注意：在这里，PPE被定义为洁净室的鞋子，西装，头套，护目镜，口罩和乳胶手套。应该注意的是，这是进入洁净室的标准PPE。此步骤可以外包给Parylene涂层公司，但需要付费;但是，商业服务可能能够一次涂覆更多阵列。每个Parylene C沉积系统可能具有不同的安全预防措施。使用前请与技术人员联系，以确保用户安全。 - 从 Flex 阵列中卸下用作掩模的配接连接器。
- 将阵列放入新盒子中进行存储，直到准备就绪。
7. 笔尖制备方法
注：本节中的两个尖端准备工作使用激光切割光纤。使用激光时，应始终佩戴合适的个人防护用品，例如耐所用波长的护目镜，激光附近的其他实验室用户也应穿着PPE。虽然这些步骤中列出的光纤长度是推荐的长度，但用户可以尝试适合其需求的任何长度。用户必须选择以下尖端准备方法之一，因为仅靠剪刀切割不足以重新暴露电极25。
- 钕掺杂钇铝柘榴石（Nd：YAG）激光切割
- 用手术剪刀将纤维切成550μm。
- 使用532nm Nd：YAG脉冲激光器（5 mJ /脉冲，5 ns持续时间，900 mW）从纤维尖端切除50μm，以重新暴露Parylene C下方的碳（通常需要2-3个脉冲）。
- 使用此激光系统随附的内置立体镜对齐光纤尖端。
注：该系统允许用户对齐一个窗口（此处为50 μm x 20 μm（高度x宽度））以包含光纤的末端。 - 将立体镜聚焦在光纤末端，放大倍率为500倍，以实现准确和精确的切割。
注意：聚对二甲苯C将从尖端略微消融（<10μm），留下钝的圆柱形尖端。
- 使用此激光系统随附的内置立体镜对齐光纤尖端。
- 喷灯磨刀25，26，27
- 用手术剪刀将纤维切成300μm。
- 将阵列浸入去离子水皿中，连接器面朝下，并用少量腻子固定在盘子的底部。
- 使用笔式相机将纤维与水面对齐，使纤维几乎接触水面。
- 将丁烷喷灯火焰调节到3-5毫米，然后以来回运动将其放在纤维顶部以锐化纤维。
注意：当火焰经过纤维尖端时，它们会发出橙色的光芒。 - 从腻子上取下阵列，然后在立体镜下检查其在50倍放大倍率下是否有尖尖的尖端。
注意：如果观察到尖头，则无需进一步喷灯。如果吸头变钝，请重复步骤 7.2.2-7.2.5。
- 紫外激光切割28
注：由于紫外激光器的大焦点大于柔性阵列碳纤维的间距，目前紫外激光只能用于零插入力（ZIF）和宽板设计。- 用手术剪刀将碳纤维切成1毫米。
- 将紫外激光器固定在三个正交配置的电动载物台上。
注：紫外激光器是一种多模氮化铟镓（InGaN）半导体，输出功率为1.5 W，波长为405 nm。- 确保激光具有连续光束，以便快速有效地对准和切割。
- 将阵列固定到位，以保持电极的静止水平平面，以便激光通过。确保阵列与激光器保持适当的距离，以便光纤与激光的焦点一起发光。为此，请为激光器提供较低的功率，并调整距离以最佳方式聚焦在光纤上28。
- 以25μm/s的速度将紫外激光焦点移动到光纤平面上，将光纤切割到所需的长度（在这里，所有光纤都被切割成500μm）。
注意：光纤在切割前会发出明亮的光。处理后储存纤维，直到它们准备好涂覆导电聚合物。
8. 聚（3，4-乙烯二氧噻吩）:p甲苯磺酸盐（PEDOT：pTS）导电涂层，用于降低阻抗
- 将0.01 M 3，4-乙烯二氧基噻吩和0.1M对甲苯磺酸钠在50mL去离子水中混合溶液，并在搅拌板上搅拌过夜（〜450rpm）或直到溶液中未观察到颗粒。
注意：将溶液存放在耐光容器中。混合后冷藏溶液，使溶液最多可使用30天。 - 在 1 个 PBS 中使用与之前相同的参数（步骤 5.2-5.3）运行 1 kHz 阻抗扫描。请注意哪些光纤具有良好的连接（<1 MΩ，通常是 16 根光纤中的 14-16 根）。
- 使用PEDOT：pTS电镀以降低电极的阻抗。
- 将光纤尖端浸没在PEDOT：pTS溶液中。
- 按照步骤 5.2 中列出的步骤操作，将 1 个 PBS 解决方案切换出 PEDOT：pTS，并缩短电路板与所应用电流通道的所有连接。
- 使用恒电位仪对每根优质纤维应用600 pA，持续600秒。
- 关闭单元格，并在运行结束时让它休息5秒。
- 从溶液中取出纤维，并在去离子水中冲洗。
- 重新测量 1 kHz 阻抗以检查光纤是否已成功涂覆（使用步骤 5.2-5.3 中列出的相同参数）。
注：良好的光纤被指定为阻抗小于 110 kΩ 的任何光纤。
9. 连接接地线和参考线
- 使用镊子从地面上轻轻刮掉Parylene C和板上的参考通孔。在此电路板设计中，接地和参考通孔成对地短路。
注：接地和参考通孔位于 Flex 阵列连接器附近，是连接器附近的四个小金圆。用户只需从最靠近碳纤维的通孔中取出Parylene C即可进行测量。 - 用剃须刀片切下两根5厘米长的绝缘银线。将电线的两端从一端断开绝缘2-3 mm以连接到Flex Array，从另一端断开约10 mm，以便在手术过程中更容易接地和参考。
- 将烙铁加热回 600 °F。 在通孔上涂抹少量助焊剂。
- 将一根导线（2-3 mm 外露端）插入电路板上的每个 ePhys 通孔。将焊料涂在过孔的顶部（图7A）。让探头冷却，然后将其翻转以在通孔的背面施加少量焊料（图7A）。
- 使用手术剪刀剪掉从背面焊料堆中伸出的任何裸露电线，因为这有助于减少记录中看到的噪音（图7B）。
- 将阵列放回储物盒中，使电线向后弯曲并远离光纤。将电线固定在胶带上，以防止潜在的光纤-电线相互作用（图7C）。
10. 外科手术
注意：大鼠皮层用于测试紫外激光制备的纤维的功效，如前所述7，20。这些探头将在神经中工作，因为它们的几何形状和阻抗水平与喷灯制备的纤维相似。该手术非常谨慎地进行，以验证紫外激光不会改变电极的响应。
- 使用氯胺酮（90mg / kg）和木拉嗪（10mg / kg）的组合麻醉成年雄性Long Evans大鼠。通过脚趾捏测试确认麻醉。在眼睛上涂抹软膏，以防止大鼠的眼睛在手术过程中变干。
- 在右半球的运动皮层上方创建一个2 mm x 2 mm的开颅手术。通过测量胸前 1 mm 和中线外侧 1 mm 来识别开颅术的左下角。
- 将阵列安装到立体定位仪器中，通过轻轻降低纤维直到它们接触到硬脑膜表面，将立体定位器器在硬脑膜处归零。将阵列抬离手术部位，然后将其移动到一侧，直到它准备好插入。
- 通过轻轻拉动针头，在组织表面用倒刺的末端切除硬脑膜。一旦硬脑膜的一部分向大脑开放，使用一对细镊子进一步帮助拉开硬脑膜。
- 使用立体定位器将纤维插入开颅术，将1.2毫米插入大脑，用手缓慢下降。
- 使用特定于 ePhys 的头台和前置放大器记录 ePhys 数据 10 分钟。
- 设置前置放大器高通滤波器，以处理2.2 Hz的信号，7.5 kHz的抗混叠，并在25 kHz时进行采样。
注意：对于这些测量，仅记录自发活动。不应用任何刺激。
- 设置前置放大器高通滤波器，以处理2.2 Hz的信号，7.5 kHz的抗混叠，并在25 kHz时进行采样。
- 安乐死
- 将大鼠置于异氟醚下，在1升/分钟的氧气下以5%的速度放置，直到生命迹象停止（20-30分钟）。用斩首确认安乐死。
11. 尖峰排序
- 使用尖峰排序软件，使用以前报告的方法对数据进行排序和分析8。
- 在所有通道（250 Hz角，4阶 巴特沃斯）上使用高通滤波器，并将波形检测电平设置为-3.5×RMS阈值。
- 使用高斯模型对具有相似特征的峰值进行聚类和峰值。组合并平均至少 10 个波形的簇，以纳入进一步分析。
- 消除或删除数据集中所有不是尖峰的波形。
- 对所有通道进行排序后导出数据，并使用分析软件绘制并进一步分析波形。
12. 扫描电子显微镜成像
注意：此步骤将使数组不可用，应仅用于检查尖端处理结果，以检查数组是否得到正确处理。无需执行此步骤即可生成成功的阵列。下面总结了SEM过程的一般概述;但是，以前未使用过SEM的用户应从经过培训的用户那里获得帮助。
- 剪下PCB的光纤端，并将其安装在碳带屏蔽的SEM短截线上。将阵列放在堆叠碳带（4-5层）的小平台上，以防止碳纤维粘在SEM短截线上。
- 按照溅射镀膜机制造商概述的程序，用金（100-300 Å）溅射镀膜阵列。
- 要检查烙铁头处理效果，请在SEM中以15 mm的工作距离和20 kV光束强度对阵列进行成像。
注：阵列可以在低真空下进行无溅射镀膜成像，如图 8D 所示，用于紫外激光切割光纤。对于此设置，建议工作距离为11-12 mm，光束强度为4 kV。
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Representative Results
提示验证：扫描电镜图像
先前的工作20 表明，剪刀切割导致不可靠的阻抗，因为Parylene C在记录站点上折叠。剪刀式切割在这里仅用于在使用额外的精加工方法进行加工之前将纤维切割到所需的长度。使用吸头的扫描电镜图像来确定暴露的碳长度和吸头几何形状（图8）。
Scissor和Nd：YAG激光切割光纤之前已经过审查17，20。剪刀切割的纤维（图8A）的尖端几何形状不一致，切割时Parylene C在末端折叠20。Nd：YAG激光切割光纤在记录场地面积、形状和阻抗方面保持一致（图8B）。喷灯纤维20 具有最大的电极尺寸和形状变化，尖端锐化，允许插入坚韧的组织中。平均而言，140μm的碳被重新暴露，碳和Parylene C绝缘层之间具有平滑的过渡区域（图8C）。紫外激光切割的纤维类似于喷灯纤维，显示从尖端暴露的120μm碳（图8D）。阻抗表明，紫外激光或喷灯尖端切割方法适用于电子物理，并且是无法获得Nd：YAG激光器的实验室的可行解决方案。
提示验证：电气记录
图9显示了使用Flex阵列的每种制备方法产生的阻抗。生成的值在 ePhys 记录的适当范围内。Nd：YAG激光切割光纤的表面积最小，但阻抗最高，即使使用PEDOT：pTS涂层（裸碳：4138±110 kΩ;PEDOT：pTS：27 ±1.15 kΩ;n = 262）。其次是喷灯（裸碳：308±7 kΩ;PEDOT：pTS：16 ±0.81 kΩ;n = 262）和紫外激光切割（裸碳：468 ±85.7 kΩ;PEDOT：pTS：27 ±2.83 kΩ;n = 7）光纤中的反比关系，这些光纤具有较大的表面积和低阻抗。然而，在所有情况下，PEDOT：pTS涂层的光纤都低于之前设定的110 kΩ阈值，以表明电极的良好、低阻抗。
急性ePhys记录来自一只长埃文斯大鼠，该大鼠急性植入ZIF阵列，具有紫外激光切割和PEDOT：pTS处理的光纤，以证明该方法的可行性。ePhys之前已经用剪刀切割20和Nd：YAG-17以及喷灯处理的纤维7，8进行了测试和验证，因此在本文中没有重新验证。图10显示了同时植入大鼠运动皮层（n = 1）的四根紫外激光治疗光纤（长度为2 mm）的急性记录。在所有光纤上发现了三个单元，这表明使用廉价的紫外激光器对纤维的处理类似于其他切割方法，这些方法使碳纤维能够记录神经单元，正如SEM和阻抗所期望的那样。虽然碳纤维阵列易于构建和修改以满足用户的需求，但应该注意的是，对于某些构建，需要额外的验证（表3），而其他构建则不太适合某些最终任务。
商用聚对二甲苯C
供应商确定商业涂层阵列的Parylene C厚度为710 nm，完全在绝缘的目标范围内。这些阵列是使用喷灯尖端准备为ePhys记录准备的。在准备尖端后取阻抗并与现有数据进行比较。喷灯和PEDOT：pTS涂层探头在16根光纤上的平均阻抗为14.5±1.3 kΩ。拍摄尖端和柄的SEM图像以比较Parylene C沉积（分别为图11 A，B）。这些结果表明，使用商业供应商并没有改变预期的阻抗值，这表明这将是大学洁净室中沉积的同样可行的替代品。
设备成本分析
如果研究人员可以使用所有工具和散装材料（例如环氧树脂，焊料），Parylene C用户费用为41美元，一批8个探头，总材料成本为1168美元（每个探头146美元）。该批次的人员努力（表4）约为25小时。如果使用替代的制造步骤，探头的成本将根据商业Parylene C涂层成本（报价500-800美元）而有所不同。为简单起见，构建步骤的时间（表 4）针对重复任务的所有实例进行了分组。由于手动密集型步骤（例如，碳纤维放置）更容易、更快地完成，因此具有较大间距（宽板和 ZIF）的设计的构建时间大大缩短。
图 1：连接器和相关印刷电路板。 （A） 宽板，带 16 个必要连接器之一的内嵌（插入比例尺 = 5 mm）。（B） ZIF 和两个连接器之一和一个护罩。（C） 带36针连接器的柔性阵列;比例尺 = 1 cm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 2：Flex 阵列的焊接和绝缘步骤。 （A） 为底部连接器引脚铺设焊料。（B） 后部引脚固定到位，前引脚准备焊接。（C） 延迟设置环氧树脂绝缘柔性阵列;请注意，延迟设置环氧树脂不覆盖两侧的参考和接地通孔。（D） Flex 阵列的背面，在焊盘通孔（不是接地和参考通孔）上带有一段延迟设置的环氧树脂，并缠绕在电路板的侧面，朝向连接器的边缘。比例尺 = 0.5 厘米 （B） 和 1 厘米（A、C、D）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：应用银环氧树脂并在 Flex 阵列的痕迹之间对齐碳纤维。 毛细管用白色覆盖层突出显示。（A）毛细管的末端在迹线之间拟合，以获得（B）干净的银环氧树脂（在毛细管末端和迹线内用箭头表示）沉积，而不会溢出迹线对之外。（C）将碳纤维放入环氧树脂中，然后（D）用干净的毛细管拉直。比例尺 = 500 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 4：使用 UV 环氧树脂应用的绝缘材料 （A） 使用干净的毛细管和两滴 UV 环氧树脂（用白色覆盖物标记）应用 UV 环氧树脂。UV环氧树脂涂在直径为0.25-0.75 mm的液滴中，直到UV环氧树脂在痕量顶部形成光滑的气泡。（B）紫外线环氧树脂在紫外线下固化。Flex阵列以腻子形式放置在木块上，便于在紫外线下移动和对准。紫外光用支架固定在 Flex 阵列末端上方约 1 厘米处。插图 （B） 显示了正确 UV 环氧树脂绝缘的 Flex 阵列的侧面轮廓。电路板两侧的UV环氧气泡高度约为50μm。比例尺 = 500 μm（A 和插图 B）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：阻抗测量的设置。 所有部件都已标记，系统连接器和适配器取决于系统。PBS被加星标，因为解决方案稍后在构建中交换为PEDOT：pTS;但是，否则设置是相同的。缩写： PBS = 磷酸盐缓冲盐水;PEDOT：pTS = 聚（3，4-乙烯二氧噻吩）:p-甲苯磺酸酯。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：为聚对二甲苯 C 涂层准备的柔性阵列。 在涂覆过程中，Flex阵列用胶带固定在凸起的泡沫平台上，胶粘剂面朝上。比例尺 = 10 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图 7：连接到最终确定的 Flex 阵列的接地线和参考线。 焊料应用于电路板（A）两侧过孔的每一侧，以形成牢固的粘合。ePhys过孔在电路板上标记为 GND 和 Ref ，并在电路板的相对两侧相互配对。还有两个附加的通孔也标记为 GND 和 Ref2。两个 GND 过孔一起短路。 Ref2 旨在用于电化学实验。（A）中多余的导线用红色框表示，并从探头背面取出（B）（红色框显示导线曾经的位置），以帮助降低噪声和处理探头。（C） 存储的最终 Flex 阵列以备将来使用。请注意，此板上配对的 GND 和 Ref 过孔使其指定用于ePhys录制。比例尺 = 200 μm （A， B）。缩写： ePhys = 电生理学;GND = 地面;引用 = 引用。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 8：采用不同尖端切割技术的纤维的扫描电镜图像。 （A） 暴露碳极少的剪刀式纤维。（二）Nd：YAG激光切割。（C）从尖端暴露约140毫米碳的喷灯纤维。（D） 紫外激光切割纤维，从尖端暴露约120毫米的碳。红色箭头表示聚对二甲苯C和裸碳纤维之间的过渡区域。比例尺 = 5 μm （A），10 μm （B），50 μm （C，D）。缩写：SEM =扫描电子显微镜;Nd：YAG = 掺钕钇铝柘榴石。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 9：仅应用处理（裸露的碳暴露）和添加 PEDOT：pTS 之间的阻抗差异。 在所有情况下，PEDOT：pTS的添加都会使阻抗降低一个数量级。样品尺寸：Nd：YAG = 262，喷灯= 262，紫外线= 7。UV样品大小的差异是由于制备方法的新颖性;但是，正如预期的那样，它显示出与喷灯相似的范围。阻抗数据表示为标准误差±平均值。缩写： PEDOT：pTS = 聚（3，4-乙烯二氧基噻吩）:p-甲苯磺酸盐;掺钕钇铝柘榴石。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 10：来自四个紫外激光切割电极的急性电生理峰值数据。请单击此处查看此图的放大图。
图 11：商用聚对二甲苯 C 涂层阵列。 （A） 锐化阵列在所有光纤上显示出均匀的锐化，表明商业涂层没有缺点。（B）喷灯后，裸碳纤维和Parylene C之间的过渡（红色盒子）在洁净室设施中涂覆的阵列之间没有明显的差异。比例尺 = 200 μm （A） 和 10 μm （B）。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 线路板名称 | 连接器 | 焊盘尺寸（毫米） | 暴露的迹线尺寸（毫米） | 迹线间距（μm） | 渠道 | |
| 宽板 | 轧机 Max 9976-0-00-15-00-00-03-0 | 约3.25 x 1.6 | 约1.5 x 4.0 | 3000 | 8 | |
| 济菲 | 广濑DF30FC-20DS-0.4V， | 约0.23 x 0.7 | 约0.75 x 0.07 | 152.4 | 16 | |
| 柔性阵列 | 奥姆尼特斯 A79024-001 | 约0.4 x 0.8 | 约0.6 x 0.033 | 132 | 16 | |
表1：每个PCB都有一个不同的连接器和与之相关的间距。 缩写：PCB =印刷电路板。
| 构建步骤 | 预期 1 kHz 阻抗 （kΩ） |
| 裸光纤 | 150-300 |
| 裸纤维，带紫外线绝缘 | 400-500 |
| 聚对二甲苯 C 绝缘纤维 | >50，000 |
| Nd：YAG激光切割 | <15，000 |
| 喷灯 | 300-400 |
| 紫外激光切割* | 300-500 |
| 附注：pTS涂层 | <110 |
表 2：每个构建阶段后的典型阻抗范围 （n = 272）。 *n = 16。PEDOT：pTS处理的探头高于110 kΩ仍可记录信号;然而，所有经过处理的电极通常都低于此值。缩写： PEDOT：pTS = 聚（3，4-乙烯二氧基噻吩）:p-甲苯磺酸盐;掺钕钇铝柘榴石。
| 制备方法 | 宽板 | 济菲 | 柔性阵列 |
| Nd：YAG | 阻抗、扫描电镜、急性电生理 | 阻抗、扫描电镜、急性/慢性电子物理 | 阻抗、扫描电镜、急性/慢性电子物理 |
| 喷灯 | 阻抗、扫描电镜、急性电生理 | 阻抗、扫描电镜、急性/慢性电子物理 | 阻抗、扫描电镜、急性/慢性电子物理 |
| 紫外激光 | 尚未验证 | 阻抗、扫描电镜、急性/慢性电子物理 | 不可行 |
表3：每块板的验证用途以及所述的切割方法。 所有切割方法都包括PEDOT：pTS的电沉积。"不可行"表示设计的外形尺寸阻止了此时测试此尖端处理（即纤维间距）。缩写：掺钕钇铝柘榴石;扫描电镜=扫描电子显微镜;电子生理学=电生理学;ZIF = 零插入力。
| 活动 | 8 台设备的时间 （h） |
| 所有焊接 | 5 |
| 绝缘聚合物 | 1 |
| 填充碳纤维 | 10 |
| UV环氧树脂绝缘走线 | 0.5 |
| 聚对二甲苯C沉积 | 1.5 |
| Nd：YAG激光切割 | 1 |
| 喷灯 | 1 |
| 紫外激光切割 | 1.5 |
| 所有阻抗测试 | 4.5 |
| PEDOT：pTS 沉积 | 1.5 |
| 使用的配方 | 总小时数 |
| Nd：YAG激光切割 | 25 |
| 喷灯 | 25 |
| 紫外激光切割 | 25.5 |
表 4：制造过程的每个步骤所需的时间。 连接器与接地和参考线的焊接在这里已经结合在一起，以简化活动列表。缩写： PEDOT：pTS = 聚（3，4-乙烯二氧基噻吩）:p-甲苯磺酸盐;掺钕钇铝柘榴石。
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Discussion
材料替代
虽然所有使用的材料都在 材料表中进行了总结，但很少有材料需要来自特定的供应商。Flex 阵列板必须来自列出的供应商，因为他们是唯一可以打印柔性板的公司。Flex 阵列连接器也必须从列出的供应商处订购，因为它是专有连接器。强烈建议将Parylene C作为纤维的绝缘材料，因为它在室温下以可靠的方式提供保形涂层，然后可以承受 体内 环境。聚酰亚胺板和板上的环氧树脂不能承受其他绝缘技术所需的高温。所有其他材料都可以从其他供应商处购买，也可以由用户自行决定换成替代品。此版本旨在灵活且可自定义，以适应最终用户的实验。但是，应该注意的是，列出的材料或供应商的任何更改都必须由最终用户进行验证。
生成问题疑难解答
银环氧树脂沉积往往会失败，原因有几个：毛细管的宽度太宽而无法在迹线之间拟合，毛细管的宽度太薄而无法拾取和沉积环氧树脂，或者毛细管上含有过量的环氧树脂。前两个问题可以通过切割更合适尺寸的新毛细管来解决;后者是用较轻的手将毛细管浸入环氧树脂中，或者通过将毛细管轻轻拍打到备用丁腈手套上来去除环氧树脂斑点的一部分。
对于许多用户来说，决定如何准备电极通常是一个艰难的决定。但是，确定实验所需的内容将有助于阐明决策。对于急性手术，如果电极的部位大小很重要，可以使用钝头;然而，它们只会插入较软的组织（大脑），并且仅在低于500μm的目标深度。
使用玻璃套管可以进入更深的大脑结构22;但是，这可能会导致ePhys记录中的疤痕和相关不可靠性。纤维在锐化时必须小于300μm，以便能够穿透较硬的组织（神经），因为较短的长度为插入提供了更硬的骨架7，8。最近还观察到锐化纤维穿透到大脑中1毫米深8。
虽然本文中讨论的阵列是许多实验室的绝佳起点，但也开发了使用碳纤维的新型探针，以长期靶向大脑的更深部区域21，22，29。在神经中，低侵入性和高选择性的电极是一个正在进行的研究课题5，8，30。Jiman等人使用碳纤维有机硅阵列8能够以最小的侵入性和更高的选择性检测神经内的多单元活动，这反映了这里介绍的Flex阵列的设计。
聚对二甲苯 C 的可及性
聚对二甲苯C是一种在室温下敷形涂覆的方法，已在许多植入装置中用作生物相容性绝缘体。该技术需要在洁净室中使用专用工具，大约需要一个小时才能学习。对以前要求我们小组提供碳纤维阵列的机构进行了粗略的调查，以确定Parylene C沉积的可及性。我们发现，在17个研究所中，41%的研究所在其校园内可以使用Parylene C涂层系统。对于无法获得Parylene C涂层系统的大学，商业涂层服务是一种可行的替代方案，如此处所示。或者，外包给附近的大学洁净室也可能引起无法直接使用Parylene C沉积系统的实验室的兴趣。为了降低每个设备的成本，我们建议发送更大批量的阵列，因为商业系统通常可以容纳更大的样品。
优化吸头准备
需要研究这些纤维的其他尖端准备，因为当前的尖端准备要求最终用户在穿透能力和小型记录点之间进行选择。虽然Nd：YAG激光切割光纤提供较小的场地尺寸20，但穿透较硬组织（肌肉，神经）的能力几乎不存在，并且能够获得能够采用这种切割技术的激光装置可能既困难又昂贵。虽然喷灯可以快速、经济地获得可以穿透许多组织的锋利尖端7，但尖端几何形状很大，并且可能在纤维之间不一致20。紫外激光切割还具有低阻抗和大表面积，但具有更一致的曝光的额外好处。紫外激光比Nd：YAG激光更容易获得;然而，实验室需要设计一种方法来使激光器与光纤对齐，并且由于光纤的间距小于激光的焦点直径，因此无法使用Flex阵列。先前的工作表明，通过蚀刻31，32制造了小型，锐化的纤维。这种方法可以产生小而可靠的电极几何形状，并保持穿透神经和肌肉所需的锋利尖端。
我们目前的尖端涂层PEDOT：pTS可能也需要更换，因为它会随着时间的推移而降解，这是慢性探针的不良特征17，25，33。缺乏PEDOT：pTS的使用寿命会导致更高的阻抗，因此信号质量降低，部分原因是背景噪声增加。为了延长这些纤维尖端的使用寿命，正在研究铂铱涂层的可行性。铂铱将允许更大的表面积25，34 集中在电极的尖端，保持低阻抗34，35，36 并允许更长的长期稳定性34，36。其他涂层，如PEDOT/氧化石墨烯37 和gold38，已被用于降低碳纤维电极阻抗，尽管这些涂层通常用于化学传感探头而不是ePhys记录。由于碳纤维的固有特性39，这里介绍的碳纤维阵列可以从针对ePhys优化的探头转换为化学传感设备，只需简单地更换尖端准备22，40。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（UF1NS107659和UF1NS115817）和美国国家科学基金会（1707316）的财政支持。作者感谢密歇根大学工程学院的财政支持以及密歇根材料表征中心和范弗拉克本科实验室的技术支持。作者感谢Khalil Najafi博士使用他的Nd：YAG激光器和Lurie纳米制造设施使用他们的Parylene C沉积机。我们还要感谢特种涂料系统公司（印第安纳州印第安纳波利斯）在商业涂料比较研究中的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 prong clams | 05-769-6Q | Fisher | Qty: 2 Unit Cost (USD): 20 |
| 3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT) |
96618 | Sigma-Aldrich | Qty: 1 Unit Cost (USD): 102 |
| 353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only) |
353ND-T/8OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 48 |
| Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3) | 50-854-570 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 100 |
| Autolab | PGSTAT12 | Metrohm | |
| Blowtorch | 1WG61 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 36 |
| Carbon Fibers | T-650/35 3K | Cytec Thornel | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Carbon tape | NC1784521 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 27 |
| Cotton Tipped Applicator | WOD1002 | MediChoice | Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57 |
| Delayed Set Epoxy++ | 1FBG8 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| DI Water | n/a | n/a | Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a |
| Dumont Tweezers #5 | 50-822-409 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 73 |
| Flex Array** | n/a | MicroConnex | Qty: 1 Unit Cost (USD): 68 |
| Flux | SMD291ST8CC | DigiKey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 13 |
| Glass Capillaries (pack of 350) | 50-821-986 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 60 |
| Glass Dish | n/a | n/a | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Hirose Connector (ZIF Only) |
H3859CT-ND | DigiKey | Qty: 2 Unit Cost (USD): 2 |
| Light-resistant Glass Bottle | n/a | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Micropipette Heating Filiment | FB315B | Sutter Instrument Co | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Micropipette Puller | P-97 | Sutter Instrument Co | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Nitrile Gloves (pack of 200) | 19-041-171C | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 47 |
| Offline Sorter software | n/a | Plexon | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Omnetics Connector* (Flex Array Only) |
A79025-001 | Omnetics Inc | Qty: 1 Unit Cost (USD): 35 |
| Omnetics Connector* (Flex Array Only) |
A79024-001 | Omnetics Inc | Qty: 1 Unit Cost (USD): 35 |
| Omnetics to ZIF connector | ZCA-OMN16 | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Pin Terminal Connector (Wide Board Only) |
ED11523-ND | DigiKey | Qty: 16 Unit Cost (USD): 10 |
| Probe storage box | G2085 | Melmat | Qty: 1 Unit Cost (USD): 2 |
| Razor Blade | 4A807 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 2 |
| SEM post | 16327 | lnf | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| Silver Epoxy (1oz)++ | H20E/1OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 125 |
| Silver GND REF wires | 50-822-122 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2 |
| Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g | 152536 | Sigma-Aldrich | Qty: 1 Unit Cost (USD): 59 |
| Solder | 24-6337-9703 | DigiKey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 60 |
| Soldering Iron Tip | T0054449899N-ND | Digikey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 13 |
| Soldering Station | WD1002N-ND | Digikey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 374 |
| SpotCure-B UV LED Cure System | n/a | FusionNet LLC | Qty: 1 Unit Cost (USD): 895 |
| Stainless steel rod | n/a | n/a | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Stir Plate | n/a | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Surgical Scissors | 08-953-1B | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 100 |
| TDT Shroud (ZIF Only) |
Z3_ZC16SHRD_RSN | TDT | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5 |
| Teflon Tweezers | 50-380-043 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 47 |
| UV & Visible Light Safety Glassees | 92522 | Loctite | Qty: 1 Unit Cost (USD): 45 |
| UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only) |
OG142-87/8OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 83 |
| UV Laser | n/a | WER | Qty: 1 Unit Cost (USD): 30 |
| Weigh boat (pack of 500) |
08-732-112 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 58 |
| Wide Board+ | n/a | Advanced Circuits | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| ZIF Active Headstage | ZC16 | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): 925 |
| ZIF Passive Headstage | ZC16-P | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): 625 |
| ZIF* | n/a | Coast to Coast Circuits | Qty: 1 Unit Cost (USD): 9 |
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