Summary
Hier beschrijven we de fabricagemethodologie voor aanpasbare koolstofvezelelektrode-arrays voor het opnemen in vivo in zenuwen en hersenen.
Abstract
Conventionele perifere zenuwsondes worden voornamelijk vervaardigd in een cleanroom, waarvoor meerdere dure en zeer gespecialiseerde gereedschappen nodig zijn. Dit artikel presenteert een cleanroom "licht" fabricageproces van koolstofvezel neurale elektrode arrays die snel kunnen worden geleerd door een onervaren cleanroomgebruiker. Dit fabricageproces van koolstofvezelelektrode-arrays vereist slechts één cleanroomtool, een Parylene C-afzettingsmachine, die snel kan worden geleerd of tegen marginale kosten kan worden uitbesteed aan een commerciële verwerkingsfaciliteit. Dit fabricageproces omvat ook het met de hand vullen van printplaten, isolatie en tipoptimalisatie.
De drie verschillende tipoptimalisaties die hier worden onderzocht (Nd: YAG-laser, blowtorch en UV-laser) resulteren in een reeks tipgeometrieën en 1 kHz-impedanties, waarbij blowtorched vezels resulteren in de laagste impedantie. Hoewel eerdere experimenten de werkzaamheid van laser- en blowtorch-elektroden hebben bewezen, toont dit artikel ook aan dat UV-lasergesneden vezels neurale signalen in vivo kunnen opnemen. Bestaande koolstofvezelarrays hebben ofwel geen geïndividualiseerde elektroden ten gunste van bundels of vereisen door cleanroom gefabriceerde gidsen voor populatie en isolatie. De voorgestelde arrays gebruiken alleen hulpmiddelen die op een tafelblad kunnen worden gebruikt voor vezelpopulatie. Dit koolstofvezel elektrode array fabricageproces maakt het mogelijk om de fabricage van bulkarrays snel aan te passen tegen een gereduceerde prijs in vergelijking met commercieel verkrijgbare sondes.
Introduction
Veel van neurowetenschappelijk onderzoek is gebaseerd op het opnemen van neurale signalen met behulp van elektrofysiologie (ePhys). Deze neurale signalen zijn cruciaal voor het begrijpen van de functies van neurale netwerken en nieuwe medische behandelingen zoals hersenmachine en perifere zenuwinterfaces1,2,3,4,5,6. Onderzoek rond perifere zenuwen vereist op maat gemaakte of commercieel beschikbare neurale opname-elektroden. Neurale opname-elektroden - unieke gereedschappen met afmetingen op micronschaal en fragiele materialen - vereisen een gespecialiseerde set vaardigheden en apparatuur om te fabriceren. Een verscheidenheid aan gespecialiseerde sondes zijn ontwikkeld voor specifieke eindtoepassingen; dit houdt echter in dat experimenten moeten worden ontworpen rond momenteel beschikbare commerciële sondes, of dat een laboratorium moet investeren in de ontwikkeling van een gespecialiseerde sonde, wat een langdurig proces is. Vanwege de grote verscheidenheid aan neuraal onderzoek in perifere zenuwen, is er veel vraag naar een veelzijdige ePhys-sonde4,7,8. Een ideale ePhys-sonde zou een kleine opnamelocatie, lage impedantie9 en een financieel realistisch prijspunt voor implementatie in een systeem3 hebben.
Huidige commerciële elektroden hebben de neiging om extraneurale of manchetelektroden te zijn (Neural Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff Electrode11), die buiten de zenuw zitten, of intrafascicular, die de zenuw binnendringen en in de fascikel van belang zitten. Naarmate manchetelektroden echter verder van de vezels zitten, vangen ze meer geluid op van nabijgelegen spieren en andere fascikels die mogelijk niet het doelwit zijn. Deze sondes hebben ook de neiging om de zenuw te vernauwen, wat kan leiden tot biofouling - een opeenhoping van gliacellen en littekenweefsel - op het elektrode-interface terwijl het weefsel geneest. Intrafascicular elektroden (zoals LIFE12, TIME13 en Utah Arrays14) voegen het voordeel van fascikelselectiviteit toe en hebben goede signaal-ruisverhoudingen, wat belangrijk is bij het onderscheiden van signalen voor machine-interfacing. Deze sondes hebben echter problemen met biocompatibiliteit, waarbij zenuwen in de loop van de tijd vervormd raken3,15,16. Wanneer ze commercieel worden gekocht, hebben beide sondes statische ontwerpen zonder optie voor experimentspecifieke aanpassing en zijn ze duur voor nieuwere laboratoria.
Als reactie op de hoge kosten en biocompatibiliteitsproblemen van andere sondes, kunnen koolstofvezelelektroden een mogelijkheid bieden voor neurowetenschappelijke laboratoria om hun eigen sondes te bouwen zonder de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur. Koolstofvezels zijn een alternatief opnamemateriaal met een kleine vormfactor die het mogelijk maakt om weinig schade in te brengen. Koolstofvezels zorgen voor een betere biocompatibiliteit en aanzienlijk lagere littekenrespons dan silicium17,18,19 zonder de intensieve cleanroomverwerking5,13,14. Koolstofvezels zijn flexibel, duurzaam, gemakkelijk te integreren met andere biomaterialen19 en kunnen doordringen en opnemen vanuit zenuw7,20. Ondanks de vele voordelen van koolstofvezels, vinden veel laboratoria de handmatige fabricage van deze arrays moeilijk. Sommige groepen21 combineren koolstofvezels tot bundels die gezamenlijk resulteren in een grotere (~ 200 μm) diameter; voor zover wij weten, zijn deze bundels echter niet geverifieerd in zenuwen. Anderen hebben geïndividualiseerde koolstofvezelelektrode-arrays gefabriceerd, hoewel hun methoden cleanroom-gefabriceerde koolstofvezelgidsen22,23,24 en apparatuur vereisen om hun arrays te vullen17,23,24. Om dit aan te pakken, stellen we een methode voor voor het fabriceren van een koolstofvezelarray die kan worden uitgevoerd op het laboratoriumbankblad dat geïmproviseerde wijzigingen mogelijk maakt. De resulterende array onderhoudt geïndividualiseerde elektrodepunten zonder gespecialiseerde vezelbevolkingsgereedschappen. Bovendien worden meerdere geometrieën gepresenteerd om aan de behoeften van het onderzoeksexperiment te voldoen. Voortbouwend op eerder werk8,17,22,25, biedt dit artikel gedetailleerde methodologieën om verschillende stijlen van arrays handmatig te bouwen en aan te passen met minimale cleanroom-trainingstijd die nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Een koolstofvezel array kiezen
- Kies een printplaat (PCB) uit een van de drie ontwerpen in figuur 1.
OPMERKING: Voor dit protocol staat Flex Arrays centraal.- Raadpleeg PCB-ontwerpen op de Chestek Lab-website (https://chestekresearch.engin.umich.edu), gratis en klaar om te worden verzonden naar en besteld voor afdrukken via een PCB-drukkerij.
- Zie tabel 1 voor een overzicht van connectoren voor elk bord en hun specificaties om te helpen bij het kiezen van de connector die werkt voor de specifieke experimentele opstelling.
2. Solderen van de connector aan de printplaat
- Stel een soldeerbout in op 315 °C (600 °F).
- Breng flux aan op alle soldeerpads op de printplaat.
OPMERKING: Flux in een buis kan over de pads worden geperst, terwijl flux in een pot kan worden aangebracht met het houten uiteinde van een applicator met katoenen punt door de flux royaal over alle pads te smeren. - Vorm kleine hoopjes soldeer op de achterste pads van de Flex Array (figuur 2A).
- Soldeer de onderste rij connectorpennen aan de achterste rij soldeerkussens (figuur 2B).
OPMERKING: Alle bordontwerpen van het Chestek-lab zijn zo ontworpen dat de connectoren precies zouden worden gekoppeld aan hun aangewezen bord.- Soldeer hiervoor de pinnen aan weerszijden van de connector met gemakkelijke toegang tot de soldeerheuvels. Eenmaal veilig, duwt u de soldeerbout tussen de voorste pinnen om de resterende verbindingen aan de achterkant te solderen.
OPMERKING: Zodra de achterste rij pinnen is bevestigd, wordt de rest van de connector uitgelijnd met elke pin boven het toegewezen soldeerkussen.
- Soldeer hiervoor de pinnen aan weerszijden van de connector met gemakkelijke toegang tot de soldeerheuvels. Eenmaal veilig, duwt u de soldeerbout tussen de voorste pinnen om de resterende verbindingen aan de achterkant te solderen.
- Soldeer de voorste rij pinnen op het bord door een kleine hoeveelheid soldeer op elke pin aan te brengen. Breng een extra laag flux aan als het solderen niet snel gebeurt.
- Reinig overtollige flux met 100% isopropylalcohol (IPA) en een korte borstel.
- Kaps de gesoldeerde verbindingen in vertraagde epoxy (figuur 2 C,D) in met behulp van een naald van 23 G en een spuit van 1 ml die met de schuine kant naar beneden op de pinnen is geplaatst. Duw epoxy langzaam door de spuit zodat deze in en langs de aansluitingen stroomt.
- Laat het bord een nacht staan zodat de vertraagde set epoxy kan uitharden.
OPMERKING: Terwijl het productinzetstuk voor de vertraagde set epoxy aangeeft dat het in 30 minuten uithardt, zorgt het 's nachts laten staan voor een stabielere verbinding.
- Laat het bord een nacht staan zodat de vertraagde set epoxy kan uitharden.
- Bevestig de achterkant van het bord aan de zijkanten van de connector door een kleine lijn vertraagde epoxy over de achterkant van het bord te leggen en die op de randen van de connector te trekken.
- Laat het bord weer een nacht uitharden.
OPMERKING: Sla op dit punt de arrays op of ga door met bouwen. Als u pauzeert in de build, bewaart u de arrays in een schone, droge doos bij kamertemperatuur.
- Laat het bord weer een nacht uitharden.
3. Vezelpopulatie
- Snijd een getrokken glazen capillair zodat de punt tussen de sporen van de array past (figuur 3A).
- Maak met behulp van een glazen trekker en filament haarvaten met behulp van de volgende instellingen: Warmte = 900, Trek = 70, Snelheid = 35, Tijd = 200, Druk = 900.
OPMERKING: Nummers zijn eenheidloos en specifiek voor dit apparaat (zie de tabel met materialen).
- Maak met behulp van een glazen trekker en filament haarvaten met behulp van de volgende instellingen: Warmte = 900, Trek = 70, Snelheid = 35, Tijd = 200, Druk = 900.
- Gebruik de houten uiteinden van twee applicators met katoenen punt (één per deel zilver epoxy) om een kleine, ~ 1: 1 verhouding van zilveren epoxy in een plastic schaal te scheppen en meng met dezelfde stokjes die worden gebruikt om te scheppen. Gooi de applicators na het mengen weg.
- Snijd 2-4 mm van het uiteinde van de koolstofvezelbundel af op een stuk printerpapier met een scheermesje. Om de vezels in de bundel, die moeilijk uit elkaar te halen zijn, gemakkelijk te scheiden, trekt u een gelamineerd stuk papier voorzichtig over de bovenkant van de bundel.
OPMERKING: Het gelamineerde stuk papier wordt statisch overgebracht naar de vezels, die vanzelf zullen scheiden. - Breng zilver epoxy aan tussen elk ander paar sporen aan één kant van het bord met het glazen capillair (figuur 3B).
- Neem een klein druppeltje epoxy op het uiteinde van een getrokken capillair. Voorzichtig aanbrengen tussen elk ander spoor aan het uiteinde van het bord en de opening vullen.
OPMERKING: De opening moet worden opgevuld tot de bovenkant van de twee sporen zonder over te lopen om naburige sporen aan te raken. Elk spoor is verbonden met één kanaal. Deze methode van epoxypopulatie betekent dat elke vezel twee kanalen heeft die ermee verbonden zijn. Dit komt omdat twee sporen zorgen voor een betere vezeluitlijning en redundantie in het kanaal helpt de elektrische verbinding te garanderen.
- Neem een klein druppeltje epoxy op het uiteinde van een getrokken capillair. Voorzichtig aanbrengen tussen elk ander spoor aan het uiteinde van het bord en de opening vullen.
- Gebruik een teflon-gecoat pincet om één koolstofvezel in elk epoxyspoor te plaatsen (figuur 3C).
- Gebruik een schoon getrokken capillair om de koolstofvezels aan te passen, zodat ze loodrecht op het uiteinde van het Flex Array-bord staan en onder de epoxy zijn begraven (figuur 3D).
- Plaats de arrays op een houten blok met vezelige uiteinden die over de rand van het blok hangen.
OPMERKING: Het gewicht van de achterkant houdt de array op het blok. - Bak het houten blok en de arrays gedurende 20 minuten op 140 °C om de zilveren epoxy uit te harden en de vezels op hun plaats te houden.
- Herhaal stap 3.4-3.8 voor de andere kant van het bord.
OPMERKING: Arrays kunnen na elke bakstap worden opgeslagen; statische elektriciteit uit de opslagdozen kan er echter voor zorgen dat de vezels van het bord wegtrekken als er te weinig zilveren epoxy is aangebracht bij het vullen van het bord.- Maak een verhoogd lijmplatform in een doos, zodat het grootste deel van het bord aan de lijm kan worden geplakt, zodat de vezelige uiteinden van het bord in de doos kunnen worden opgehangen om vezelbreuk te voorkomen. Bewaren bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als vezels tijdens opslag van het bord wegtrekken, schraap dan de epoxy uit de sporen met een schoon getrokken glazen capillair en herhaal stap 3.1-3.8 om de vezels te vervangen. Vanaf dit punt moeten arrays worden opgeslagen met de vezels op deze manier opgehangen om vezelbreuk te voorkomen.
- Maak een verhoogd lijmplatform in een doos, zodat het grootste deel van het bord aan de lijm kan worden geplakt, zodat de vezelige uiteinden van het bord in de doos kunnen worden opgehangen om vezelbreuk te voorkomen. Bewaren bij kamertemperatuur.
4. Het aanbrengen van ultraviolette (UV) epoxy om de koolstofvezels te isoleren
- Gebruik een schoon capillair en breng een klein druppeltje (~ 0,5 mm diameter van UV-epoxy aan op de blootgestelde sporen aan één kant van het bord (figuur 4A). Blijf UV-epoxydruppeltjes toevoegen totdat de sporen volledig bedekt zijn.
OPMERKING: Laat de UV-epoxy niet op de koolstofvezels voorbij het uiteinde van de pcb komen om later een soepele inbrenging te garanderen. - Laat de UV-epoxy onder een UV-penlamp gedurende 2 minuten uitharden (figuur 4B).
- Herhaal stap 4.1-4.2 voor de andere kant van het bord.
- Knip de vezels tot 1 mm met behulp van een stereoscoop dradenkruis en chirurgische schaar.
OPMERKING: Arrays kunnen op dit punt worden opgeslagen totdat ze klaar zijn om door te gaan naar de volgende stappen. Ze moeten worden opgeslagen in een doos die de koolstofvezels uit de buurt van de doos zelf zal verheffen. Arrays kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
5. Elektrische aansluitingen controleren met 1 kHz impedantiescans (figuur 5)
- Dompel koolstofvezels 1 mm onder in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Gebruik een zilver-zilverchloride (Ag| om het circuit te voltooien AgCl) referentie-elektrode en een roestvrijstalen staaf (tegenelektrode).
- Hang met behulp van een bekerklem de Ag op| AgCl-elektrode in de 1x PBS en sluit deze aan op de referentie van het gebruikte impedantiesysteem.
- Hang met behulp van een bekerklem de roestvrijstalen staaf in de 1x PBS en sluit aan op de tegenelektrode-ingang van het gebruikte impedantiesysteem.
- Voer een impedantiescan van 1 kHz uit voor elke vezel met behulp van een potentiostaat die is ingesteld op een scanfrequentie van 1 kHz bij 0,01 Vrms in een enkele sinusgolfvorm. Stel de potentiostaat in op 0 V aan het begin van elke scan gedurende 5 s om het opgenomen signaal te stabiliseren. Leg de metingen vast via de bij potentiostaat behorende software.
OPMERKING: Metingen kunnen op elk punt in de build worden uitgevoerd; ze zijn echter alleen nodig vóór isolatie en tijdens de tipvoorbereiding. Tabel 2 geeft een overzicht van typische impedanties na elke bouwstap op 1 kHz voor de referentie van de gebruiker. - Spoel de vezels in gedeïoniseerd (DI) water door ze drie keer in een klein bekerglas te dompelen en laat ze bij kamertemperatuur drogen.
OPMERKING: Arrays kunnen in de opslag worden gelaten totdat de gebruiker kan doorgaan met de volgende stap.
6. Parylene C Isolatie
OPMERKING: Paryleen C werd gekozen als isolatiemateriaal voor de koolstofvezels, omdat het bij kamertemperatuur kan worden afgezet over batches arrays en een zeer conforme coating biedt.
- Maskeer de Flex Array-connector met behulp van de koppelingsconnector.
- Plaats een batch van 8-12 arrays in een opbergdoos met een verhoogd lijmplatform, zodat ze in één keer kunnen worden geïsoleerd. Plaats de arrays zo dat het connectoruiteinde van de array zich op het lijmplatform bevindt met het vezelige uiteinde van de array overhangend (figuur 6) om te voorkomen dat de vezels aan de lijm blijven plakken en eraf trekken en om een uniforme Paryleen-coating op de vezels te garanderen.
- Coat de arrays in een Parylene C-depositiesysteem tot een dikte van 800 nm in een cleanroom en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) zoals gedefinieerd door de individuele cleanroom die wordt gebruikt.
OPMERKING: Hier werd PBM gedefinieerd als cleanroomschoenen, pak, hoofdbedekking, bril, masker en latex handschoenen. Opgemerkt moet worden dat dit standaard PBM's zijn voor het betreden van een cleanroom. Deze stap kan tegen betaling worden uitbesteed aan een Parylene coatingbedrijf; Een commerciële service kan echter mogelijk meer arrays tegelijk coaten. Elk Parylene C-depositiesysteem kan verschillende veiligheidsmaatregelen hebben. Neem voor gebruik contact op met de technicus om de veiligheid van de gebruiker te garanderen. - Verwijder de koppelingsconnector die als masker wordt gebruikt uit de Flex Array.
- Plaats de arrays in een nieuwe doos voor opslag totdat ze klaar zijn voor gebruik.
7. Tip bereidingsmethoden
OPMERKING: Twee tippreparaten in deze sectie gebruiken lasers om vezels te snijden. Goede PBM's, zoals brillen die bestand zijn tegen de gebruikte golflengten, moeten altijd worden gedragen bij het gebruik van de laser, en andere laboratoriumgebruikers in de buurt van de laser moeten ook in PBM's zijn. Hoewel vezellengtes die in deze stappen worden vermeld, aanbevolen lengtes zijn, kunnen gebruikers elke lengte proberen die bij hun behoeften past. De gebruiker moet een van de volgende tipvoorbereidingsmethoden kiezen, omdat het knippen van een schaar alleen niet voldoende is om de elektrode opnieuw bloot te leggen25.
- Neodymium-gedopeerde yttrium aluminium granaat (Nd:YAG) laser gesneden
- Knip de vezels tot 550 μm met een chirurgische schaar.
- Gebruik een 532nm Nd:YAG gepulseerde laser (5 mJ/puls, 5 ns duur, 900 mW) om 50 μm van de punt van de vezels af te snijden om de koolstof onder de Paryleen C opnieuw bloot te leggen (duurt meestal 2-3 pulsen).
- Lijn de vezeltips uit met behulp van de ingebouwde stereoscoop die bij dit lasersysteem wordt geleverd.
OPMERKING: Met dit systeem kan de gebruiker een venster uitlijnen (hier werd 50 μm x 20 μm (hoogte x breedte)) gebruikt om het uiteinde van de vezel te omvatten. - Richt de stereoscoop op het uiteinde van de vezel met een vergroting van 500x voor een nauwkeurige en nauwkeurige snede.
OPMERKING: Paryleen C zal iets (<10 μm) van de punt aborteren en een stompe, cilindrische punt achterlaten.
- Lijn de vezeltips uit met behulp van de ingebouwde stereoscoop die bij dit lasersysteem wordt geleverd.
- Blowtorch Slijpen25,26,27
- Knip de vezels tot 300 μm met een chirurgische schaar.
- Dompel de array onder in een schaal met gedeïoniseerd water, sluit de connector met de zijkant naar beneden en bevestig deze aan de bodem van de schaal met een kleine hoeveelheid stopverf.
- Gebruik een pencamera om de vezels uit te lijnen met het oppervlak van het water, zodat de vezels het oppervlak van het water nauwelijks raken.
- Stel een butaanblowervlam in op 3-5 mm en laat deze in een heen-en-weer beweging over de bovenkant van de vezels lopen om vezels te slijpen.
OPMERKING: Vezelpunten zullen oranje gloeien wanneer de vlam eroverheen gaat. - Verwijder de array uit de stopverf en inspecteer deze onder een stereoscoop op puntige uiteinden onder 50x vergroting.
OPMERKING: Als puntige punten worden waargenomen, is verder blazen niet nodig. Als de tips bot lijken, herhaalt u stap 7.2.2-7.2.5.
- UV laser gesneden28
OPMERKING: UV-laser kan momenteel alleen worden gebruikt op zero insertion force (ZIF) en Wide Board-ontwerpen omdat het grote brandpunt van de gebruikte UV-laser groter is dan de toonhoogte van de Flex Array-koolstofvezels.- Knip de koolstofvezels tot 1 mm met een chirurgische schaar.
- Breng een UV-laser aan op drie orthogonaal geconfigureerde gemotoriseerde trappen.
OPMERKING: De UV-laser is een multimode Indium Gallium Nitride (InGaN) halfgeleider met een uitgangsvermogen van 1,5 W en een golflengte van 405 nm.- Zorg ervoor dat de laser een continue straal heeft voor een snelle en effectieve uitlijning en snijden.
- Zet de array op zijn plaats om een stil, vlak vlak van elektroden te houden waar de laser overheen kan. Zorg ervoor dat de array op de juiste afstand van de laser wordt gehouden, zodat de vezels in het licht komen met het brandpunt van de laser. Om dit te doen, geeft u een lager vermogen aan de laser en past u de afstand aan om de beste focus op de vezel te richten28.
- Beweeg het UV-laserbrandpunt over het vezelvlak met een snelheid van 25 μm / s om de vezels op de gewenste lengte te snijden (hier worden alle vezels tot 500 μm gesneden).
OPMERKING: Vezels zullen een helder licht uitstralen voordat ze worden gesneden. Bewaar de vezels na de behandeling totdat ze klaar zijn om te worden gecoat met een geleidend polymeer.
8. Poly(3,4-ethyleendioxythiofeen):p-tolueensulfaat (PEDOT:pTS) geleidende coating voor verlaagde impedantie
- Meng oplossingen van 0,01 M 3,4-ethyleendioxythiofeen en 0,1 M natrium p-tolueensulfaat in 50 ml DI-water en roer een nacht op een roerplaat (~ 450 rpm) of totdat er geen deeltjes in de oplossing kunnen worden waargenomen.
OPMERKING: Bewaar de oplossing in een lichtbestendige container. Koel de oplossing na het mengen om de oplossing tot 30 dagen bruikbaar te houden. - Voer een impedantiescan van 1 kHz uit met dezelfde parameters als voorheen (stappen 5.2-5.3) in 1x PBS. Merk op welke vezels een goede verbinding hebben (<1 MΩ, meestal 14-16 van de 16 vezels).
- Galvanisch fornuis met PEDOT:pTS om de impedantie van de elektroden te verlagen.
- Dompel de vezelpunten onder in pedot:pTS-oplossing.
- Volg de stappen in stap 5.2, schakel de 1x PBS-oplossing uit voor PEDOT:pTS en kort alle verbindingen naar het bord naar het toegepaste stroomkanaal.
- Breng 600 pA per goede vezel gedurende 600 s aan met behulp van een potentiostaat.
- Schakel de cel uit en laat hem aan het einde van de run 5 s rusten.
- Verwijder de vezels uit de oplossing en spoel ze af in DI-water.
- Herneem 1 kHz-impedanties om te controleren of de vezels met succes zijn gecoat (gebruik dezelfde parameters die worden vermeld in stappen 5.2-5.3).
OPMERKING: Goede vezels worden aangeduid als elke vezel met een impedantie van minder dan 110 kΩ.
9. Aardings- en referentiedraden aansluiten
- Schraap Parylene C voorzichtig van de grond en verwijs met een pincet naar vias op het bord. Kort de grond en referentie vias samen in paren op dit bordontwerp.
OPMERKING: Aarde en referentie-vias zijn te vinden in de buurt van de connector op de Flex-array en zijn de vier kleine gouden cirkels in de buurt van de connectoren. Gebruikers hoeven Parylene C alleen te verwijderen uit de vias die het dichtst bij de koolstofvezels liggen voor metingen. - Knip twee lengtes van 5 cm geïsoleerd zilverdraad met een scheermesje. Deinsuleer de uiteinden van de draden 2-3 mm van het ene uiteinde om aan de Flex Array te worden bevestigd en ~ 10 mm van de tegenovergestelde uiteinden om gemakkelijker te aarden en te verwijzen tijdens de operatie.
- Verwarm de soldeerbout terug tot 600 °F. Breng een kleine hoeveelheid flux aan op de vias.
- Steek één draad (2-3 mm blootgesteld uiteinde) in elk van de ePhys-vias op het bord. Breng soldeer aan op de bovenkant van de vias (figuur 7A). Laat de sonde afkoelen en draai hem om om een kleine hoeveelheid soldeer aan te brengen op de achterkant van de via (figuur 7A).
- Knip met behulp van een chirurgische schaar alle blootgestelde draad af die uit de achterste soldeerheuvel steekt, omdat dit helpt het geluid bij de opname te verminderen (figuur 7B).
- Plaats de arrays terug in de opslagdoos en buig de draden naar achteren en weg van de vezel. Bevestig de draden op de plakband om mogelijke vezel-draadinteracties te voorkomen (figuur 7C).
10. Chirurgische ingreep
OPMERKING: Rat cortex werd gebruikt om de werkzaamheid van de UV-laser-geprepareerde vezels te testen, zoals dit eerder is beschreven7,20. Deze sondes zullen in zenuwen werken vanwege hun vergelijkbare geometrie en impedantieniveaus om voorbereide vezels te blazen. Deze operatie werd met een overvloed aan voorzichtigheid uitgevoerd om te valideren dat de UV-laser de reactie van de elektroden niet veranderde.
- Anesthetiseer een volwassen mannelijke Long Evans rat met een combinatie van ketamine (90 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). Bevestig de anesthesie met een teenknijptest. Breng zalf aan op de ogen om te voorkomen dat de ogen van de rat uitdrogen tijdens de operatie.
- Maak een craniotomie van 2 mm x 2 mm boven de motorische cortex van de rechterhersenhelft. Identificeer de linkerbenedenhoek van de craniotomie door 1 mm voorste bregma en 1 mm laterale van de middellijn te meten.
- Monteer de array in een stereotaxisch instrument en zet het stereotaxische instrument op nul bij de dura door de vezels voorzichtig te laten zakken totdat ze het oppervlak van de dura raken. Til de array uit de buurt van de operatieplaats en verplaats deze naar de zijkant totdat deze klaar is om te worden ingebracht.
- Reseceer de dura door voorzichtig een naald met een prikkeldraaduiteinde over het oppervlak van het weefsel te trekken. Zodra een deel van de dura zich opent naar de hersenen, gebruik dan een paar fijne tangen om verder te helpen bij het wegtrekken van de dura.
- Breng de vezels in de craniotomie en 1,2 mm in de hersenen met behulp van een stereotaxisch instrument en laat langzaam met de hand zakken.
- Neem ePhys-gegevens gedurende 10 minuten op met een ePhys-specifieke headstage en voorversterker.
- Stel het voorversterker high-pass filter in om het signaal te verwerken op 2,2 Hz, antialias op 7,5 kHz en sample op 25 kHz.
OPMERKING: Voor deze metingen wordt alleen spontane activiteit geregistreerd. Er wordt geen prikkel toegepast.
- Stel het voorversterker high-pass filter in om het signaal te verwerken op 2,2 Hz, antialias op 7,5 kHz en sample op 25 kHz.
- Euthanasie
- Plaats de rat onder isofluraan met 5% onder 1 l/min zuurstof totdat de tekenen van leven zijn opgehouden (20-30 min). Bevestig euthanasie met onthoofding.
11. Spike sorteren
- Gebruik spike-sorteersoftware om de gegevens te sorteren en te analyseren met behulp van eerder gerapporteerde methoden8.
- Gebruik een hoogdoorlaatfilter op alle kanalen (hoek van 250 Hz, Butterworth van de 4e orde) en stel het detectieniveau van de golfvorm in op -3,5 × RMS-drempel.
- Gebruik een Gauss-model om clusters en spikes met vergelijkbare kenmerken te clusteren. Combineer en gemiddelde clusters van ten minste 10 golfvormen om in verdere analyse op te nemen.
- Verwijder of verwijder alle golfvormen die geen pieken zijn uit de gegevensset.
- Exporteer gegevens zodra alle kanalen zijn gesorteerd en gebruik analysesoftware om de golfvormen te plotten en verder te analyseren.
12. Scanning elektronenmicroscopische (SEM) beeldvorming
OPMERKING: Deze stap maakt arrays onbruikbaar en mag alleen worden gebruikt om de resultaten van tipbehandeling te inspecteren om te controleren of de arrays correct worden verwerkt. Deze stap hoeft niet te worden uitgevoerd om een succesvolle array te bouwen. Hieronder samengevat is een algemene schets van het SEM-proces; Gebruikers die SEM nog niet eerder hebben gebruikt, moeten echter hulp krijgen van een getrainde gebruiker.
- Knip het vezelige uiteinde van de printplaat af en monteer het op een sem-stub met carbontapemasker. Plaats de arrays op een klein platform van gestapelde koolstoftape (4-5 lagen) om te voorkomen dat de koolstofvezels aan de SEM-stub blijven plakken.
- Sputter-coat de arrays met goud (100-300 Å) volgens procedures die zijn uiteengezet door de fabrikant van de gouden sputtercoater.
- Om de tipbehandelingseffecten te inspecteren, stelt u de arrays in een SEM in beeld op een werkafstand van 15 mm en 20 kV bundelsterkte.
OPMERKING: Arrays kunnen worden afgebeeld zonder sputtercoating onder een laag vacuüm, zoals weergegeven in figuur 8D voor UV-lasergesneden vezels. Voor deze opstelling wordt aanbevolen om een werkafstand van 11-12 mm en een bundelsterkte van 4 kV te hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tip validatie: SEM images
Eerder werk20 toonde aan dat het knippen van scharen resulteerde in onbetrouwbare impedanties omdat Parylene C over de opnameplaats vouwde. Schaarsnijden wordt hier alleen gebruikt om vezels op de gewenste lengte te snijden voordat ze worden verwerkt met een extra afwerkingsmethode. SEM-afbeeldingen van de tips werden gebruikt om de blootgestelde koolstoflengte en tipgeometrie te bepalen (figuur 8).
Schaar- en Nd:YAG-lasergesneden vezels werden eerder beoordeeld17,20. Schaargesneden vezels (figuur 8A) hebben inconsistente tipgeometrieën, waarbij Parylene C over het uiteinde vouwt wanneer het wordt gesneden20. De Nd:YAG lasergesneden vezels blijven consistent in het opnamegebied, de vorm en de impedantie (figuur 8B). Geblazen vezels20 leiden tot de grootste elektrodegrootte en vormvariabiliteit en een geslepen punt, waardoor het inbrengen in taai weefsel mogelijk is. Gemiddeld werd 140 μm koolstof opnieuw blootgesteld, met een soepel overgangsgebied tussen de koolstof- en Paryleen C-isolatie (figuur 8C). UV-lasergesneden vezels waren vergelijkbaar met blowtorched vezels, met 120 μm koolstof blootgesteld vanaf de punt (figuur 8D). Impedanties gaven aan dat de UV-laser of blowtorch tip snijmethoden geschikt zijn voor ePhys en haalbare oplossingen zijn voor laboratoria zonder toegang tot een Nd:YAG laser.
Tip validatie: elektrische opname
Figuur 9 toont de resulterende impedanties van elke bereidingsmethode met behulp van Flex Arrays. De resulterende waarden liggen binnen een geschikt bereik voor ePhys-opname. Nd:YAG lasergesneden vezels resulteerden in het kleinste oppervlak maar de hoogste impedanties, zelfs met de PEDOT:pTS coating (kale koolstof: 4138 ± 110 kΩ; met PEDOT:pTS: 27 ± 1,15 kΩ; n = 262). Dit wordt gevolgd door de omgekeerde relatie in blowtorched (bare carbon: 308 ± 7 kΩ; met PEDOT:pTS: 16 ± 0,81 kΩ; n = 262) en UV laser-cut (468 ± 85,7 kΩ; met PEDOT:pTS: 27 ± 2,83 kΩ; n = 7) vezels met een groot oppervlak en lage impedanties. In alle gevallen vallen de PEDOT:pTS-gecoate vezels echter onder de eerder ingestelde drempel van 110 kΩ om een goede, lage impedantie-elektrode aan te geven.
Acute ePhys-opnames werden genomen van een Long Evans-rat die acuut was geïmplanteerd met een ZIF-array met UV-lasergesneden en PEDOT: pTS-behandelde vezels om de levensvatbaarheid van deze methode aan te tonen. ePhys is eerder getest en bewezen met schaar-cut20 en Nd:YAG-17 en blowtorch-behandelde vezels7,8 en is dus niet opnieuw gevalideerd in deze tekst. Acute opnames van vier UV-laserbehandelingsvezels (2 mm lang) die gelijktijdig werden geïmplanteerd in de motorische cortex van ratten (n = 1) zijn weergegeven in figuur 10. Drie eenheden werden gevonden in alle vezels, wat suggereert dat de behandeling van de vezels met de goedkope UV-laser vergelijkbaar is met andere snijmethoden die de koolstofvezel in staat stellen neurale eenheden op te nemen, zoals zou worden verwacht door de SEMs en impedanties. Hoewel koolstofvezelarrays eenvoudig kunnen worden gebouwd en aangepast aan de behoeften van de gebruiker, moet worden opgemerkt dat extra validatie nodig is voor sommige builds (tabel 3), terwijl andere minder geschikt zijn voor bepaalde eindtaken.
Commercieel Parylene C
Commercieel gecoate arrays werden door de leverancier bepaald met een Paryleen C-dikte van 710 nm, ruim binnen het doelbereik van isolatie. De arrays werden voorbereid voor ePhys-opnames met behulp van de blowtorch tip-voorbereiding. Impedanties werden genomen na het opstellen van de tips en vergeleken met bestaande gegevens. Een blowtorched en PEDOT:pTS-gecoate sonde had een gemiddelde van 14,5 ± 1,3 kΩ impedantie over 16 vezels. Van de punt en schacht werden SEM-beelden gemaakt om paryleen C-afzetting te vergelijken (respectievelijk figuur 11 A,B). Deze resultaten tonen aan dat het gebruik van een commerciële leverancier de verwachte impedantiewaarden niet heeft veranderd, wat suggereert dat dit een even haalbare vervanging zal zijn voor depositie in de cleanroom van de universiteit.
Analyse van apparaatkosten
Op voorwaarde dat alle gereedschappen en bulkmaterialen (bijv. Epoxies, soldeer) toegankelijk zijn voor de onderzoeker, een Parylene C-gebruikersvergoeding van $ 41 en een batch van 8 sondes, zijn de totale materiaalkosten $ 1168 ($ 146 per sonde). De personele inspanning (tabel 4) bedraagt ~25 uur voor de partij. Als u een vervangende fabricagestap gebruikt, zullen de kosten van de sondes variëren op basis van commerciële Parylene C-coatingkosten ($ 500-800 vermeld). De tijd voor de bouwstappen (tabel 4) is voor de eenvoud gegroepeerd voor alle instanties van een herhaalde taak. De bouwtijden voor ontwerpen met een grotere pitch (Wide Board en ZIF) worden drastisch verkort omdat de handmatig intensieve stappen (bijv. Koolstofvezelplaatsing) gemakkelijker en sneller te voltooien zijn.
Figuur 1: Connectoren en bijbehorende printplaten. (A) Wide Board met een van de zestien benodigde connectoren in inzet (inzetschaalbalk = 5 mm). B) ZIF en een van de twee connectoren en een lijkwade. (C) Flex Array met een 36-pins connector; schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Soldeer- en isolatiestappen voor de Flex Array. (A) Het leggen van het soldeer voor de onderste connectorpennen. (B) Achterste pinnen op hun plaats bevestigd met de voorste pinnen klaar voor solderen. (C) Vertraagde set epoxy geïsoleerde Flex Array; merk op dat de vertraagd ingestelde epoxy de referentie- en geslepen vias aan weerszijden niet bedekt. (D) Achterkant van de Flex Array met een band van vertraagde set epoxy over de pad vias (niet de grond en referentie vias) en gewikkeld rond de zijkant van het bord naar de rand van de connector. Schaalbalk = 0,5 cm (B) en 1 cm (A, C, D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het aanbrengen van zilver epoxy en het uitlijnen van koolstofvezels tussen de sporen van de Flex Array. Haarvaten zijn gemarkeerd met een witte overlay. (A) Het uiteinde van het capillair past tussen de sporen om (B) schone zilveren epoxy (aangeduid met pijlen aan het einde van het capillair en binnen de sporen) afzetting te krijgen zonder overloop buiten de sporenparen. (C) Koolstofvezels worden in de epoxy geplaatst en vervolgens (D) rechtgetrokken met een schoon capillair. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Isolatie met UV Epoxy Application (A) UV epoxy wordt aangebracht met behulp van een schoon capillair en twee druppels UV epoxy (gemarkeerd met witte overlays). UV-epoxy wordt aangebracht in druppels met een diameter van 0,25-0,75 mm totdat de UV-epoxy een gladde bel vormt over de bovenkant van de sporen. (B) UV-epoxy wordt uitgehard onder UV-licht. De Flex Array wordt in stopverf op een houten blok geplaatst voor bewegingsgemak en uitlijning onder het UV-licht. Het UV-licht wordt vastgehouden met een houder ~ 1 cm boven het uiteinde van de Flex Array. Inzet (B) toont het zijprofiel van een goed UV epoxy geïsoleerde Flex Array. De UV-epoxybel aan weerszijden van het bord is ongeveer 50 μm hoog. Schaalbalken = 500 μm (A en inzet B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Opstelling voor impedantiemetingen. Alle onderdelen zijn gelabeld en systeemconnectoren en adapters zijn systeemafhankelijk. PBS krijgt een ster als de oplossing later in de build wordt verwisseld voor PEDOT:pTS; de setup is echter verder identiek. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PEDOT:pTS = poly(3,4-ethyleendioxythiofeen):p-tolueensulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Flex Array voorbereid voor Parylene C coating. De Flex Array wordt bevestigd aan een verhoogd schuimplatform met tape, met de zijkant naar boven tijdens het coatingproces. Schaalbalk =10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Aardings- en referentiedraden die aan de voltooide Flex Array zijn bevestigd. Soldeer werd aangebracht op elke kant van de via aan weerszijden van het bord (A) om een veilige verbinding te creëren. ePhys vias zijn op het bord gelabeld als GND en Ref en aan weerszijden van het bord van elkaar gekoppeld. Er zijn twee extra vias ook gelabeld GND en Ref2. Beide GND-vias worden samen ingekort. Ref2 is bedoeld om te worden gebruikt in elektrochemische experimenten. Overtollige draad in (A) wordt aangeduid met een rode doos en wordt verwijderd (B) van de achterkant van de sonde (rode doos geeft aan waar draad vroeger was) om te helpen bij ruisonderdrukking en het hanteren van de sonde. (C) Final Flex Array opgeslagen voor toekomstig gebruik. Merk op dat de gepaarde GND en Ref vias op dit bord het aangewezen maken voor ePhys-opnames. Schaalbalken = 200 μm (A, B). Afkortingen: ePhys = elektrofysiologie; GND = grond; Ref = referentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: SEM-afbeeldingen van vezels met verschillende tip-cutting technieken. (A) Schaargesneden vezel met zeer weinig blootgestelde koolstof. (B) Nd: YAG laser gesneden. (C) Geblazen vezel met ~ 140 mm koolstof blootgesteld vanaf de punt. (D) UV-lasergesneden vezels met ~ 120 mm koolstof blootgesteld vanaf de punt. Rode pijlen geven het overgangsgebied aan tussen Paryleen C en kale koolstofvezel. Schaalbalken = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Afkortingen: SEM = scanning electron microscopic; Nd:YAG = Neodymium-gedopeerde yttrium aluminium granaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Impedantieverschillen tussen alleen het toepassen van de behandeling (blootgesteld aan kale koolstof) en met de toevoeging van PEDOT:pTS. In alle gevallen vermindert de toevoeging van PEDOT:pTS de impedantie met een orde van grootte. Steekproefgrootte: Nd:YAG = 262, Blowtorch = 262, UV = 7. Het verschil in uv-monstergrootte is te wijten aan de nieuwheid van de bereidingsmethode; het toont echter een vergelijkbaar bereik als blowtorch, zoals verwacht. Impedantiegegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout. Afkortingen: PEDOT:pTS = poly(3,4-ethyleendioxythiofeen):p-toluenesulfonate; Neodymium-gedopeerde yttrium aluminium granaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Acute elektrofysiologische spikinggegevens van vier UV-lasergesneden elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Commerciële Parylene C-gecoate arrays. (A) De geslepen array vertoont een uniforme verscherping over alle vezels, wat aangeeft dat er geen nadelen zijn aan commerciële coating. (B) Na het blowtoren vertoont de overgang (rode doos) tussen kale koolstofvezel en Paryleen C geen waarneembaar verschil tussen arrays die in een cleanroomfaciliteit zijn gecoat. Schaalbalken = 200 μm (A) en 10 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| PCB Naam | Connector | Soldeerpad Grootte (mm) | Zichtbare spoorgrootte (mm) | Spoorhoogte (μm) | Kanalen | |
| Breed board | Mill-Max 9976-0-00-15-00-00-03-0 | 3,25 x 1,6 | 1,5 x 4,0 | 3000 | 8 | |
| ZIF | Hirose DF30FC-20DS-0.4V, | 0,23 x 0,7 | 0,75 x 0,07 | 152.4 | 16 | |
| Flex-array | Omnetics A79024-001 | 0,4 x 0,8 | 0,6 x 0,033 | 132 | 16 | |
Tabel 1: Elke PCB heeft een andere connector en toonhoogte die eraan is gekoppeld. Afkorting: PCB = printed circuit board.
| Bouw stap | Verwachte 1 kHz impedantie (kΩ) |
| Kale vezel | 150-300 |
| Kale vezel met UV-isolatie | 400-500 |
| Parylene C Geïsoleerde Vezels | > 50.000 |
| Nd: YAG Laser gesneden | < 15.000 |
| Geblazen | 300-400 |
| UV-laser gesneden* | 300-500 |
| PEDOT: pTS gecoat | <110 |
Tabel 2: Typisch bereik van impedanties na elke bouwfase (n = 272). *n = 16. PEDOT:pTS-behandelde sondes boven 110 kΩ kunnen nog steeds signalen registreren; alle behandelde elektroden vallen echter meestal onder deze waarde. Afkortingen: PEDOT:pTS = poly(3,4-ethyleendioxythiofeen):p-toluenesulfonate; Neodymium-gedopeerde yttrium aluminium granaat.
| Bereidingswijze | Breed board | ZIF | Flex-array |
| Nd: YAG | Impedantie, SEM, acute ePhys | Impedantie, SEM, acute/chronische ePhys | Impedantie, SEM, acute/chronische ePhys |
| Steekvlam | Impedantie, SEM, acute ePhys | Impedantie, SEM, acute/chronische ePhys | Impedantie, SEM, acute/chronische ePhys |
| UV-laser | Nog niet gevalideerd | Impedantie, SEM, acute/chronische ePhys | Niet levensvatbaar |
Tabel 3: Gevalideerd gebruik van elke plank met de beschreven snijmethoden. Alle snijmethoden omvatten elektrodepositie van PEDOT:pTS. 'Niet levensvatbaar' geeft aan dat een vormfactor van het ontwerp voorkomt dat deze tipbehandeling op dit moment wordt getest (d.w.z. vezelhoogte). Afkortingen: Neodymium-gedopeerde yttrium aluminium granaat; SEM = scanning elektronenmicroscopie; ePhys = elektrofysiologie; ZIF = nul invoegkracht.
| Activiteit | Tijd voor 8 apparaten (h) |
| Alle Solderen | 5 |
| Isolerende Omnetiek | 1 |
| Koolstofvezels vullen | 10 |
| Isolerende sporen met UV Epoxy | 0.5 |
| Parylene C Depositie | 1.5 |
| Nd: YAG lasersnijden | 1 |
| Blowtorching | 1 |
| UV-lasersnijden | 1.5 |
| Alle impedantie testen | 4.5 |
| PEDOT:pTS Depositie | 1.5 |
| Gebruikt recept | Totaal aantal uren |
| Nd: YAG Laser gesneden | 25 |
| Steekvlam | 25 |
| UV-laser gesneden | 25.5 |
Tabel 4: Benodigde tijd voor elke stap van een fabricageproces. Solderen van de connector en aardings- en referentiedraden zijn hier gecombineerd om de activiteitenlijst te vereenvoudigen. Afkortingen: PEDOT:pTS = poly(3,4-ethyleendioxythiofeen):p-toluenesulfonate; Neodymium-gedopeerde yttrium aluminium granaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Materiaalvervangingen
Hoewel alle gebruikte materialen zijn samengevat in de tabel met materialen, zijn er maar heel weinig materialen nodig om van specifieke leveranciers te komen. Het Flex Array-bord moet afkomstig zijn van de vermelde leverancier, omdat zij het enige bedrijf zijn dat het flexibele bord kan afdrukken. De Flex Array-connector moet ook worden besteld bij de vermelde leverancier, omdat het een eigen connector is. Paryleen C wordt ten zeerste aanbevolen als isolatiemateriaal voor de vezels, omdat het op een betrouwbare manier een conformale coating bij kamertemperatuur biedt die vervolgens bestand is tegen de in vivo omgeving. De polyimideplaat en epoxies op het bord kunnen de hoge temperaturen die nodig zijn voor andere isolatietechnieken niet verdragen. Alle andere materialen kunnen worden gekocht bij andere leveranciers of worden geruild voor alternatieven naar goeddunken van de gebruikers. Deze build is bedoeld om flexibel en aanpasbaar te zijn aan het experiment van de eindgebruiker. Er moet echter worden opgemerkt dat eventuele wijzigingen van de vermelde materialen of leveranciers door de eindgebruiker moeten worden gevalideerd.
Buildproblemen oplossen
Zilver epoxy afzetting heeft de neiging om te falen om verschillende redenen: de breedte van het capillair is te breed om tussen sporen te passen, de breedte van het capillair is te dun om epoxy op te nemen en af te zetten, of een teveel aan epoxy zit op het capillair. De eerste twee problemen kunnen worden opgelost door een nieuw capillair van een meer geschikte grootte te snijden; dit laatste door het capillair met een lichtere hand in de epoxy te dompelen of een deel van de epoxy klodder te verwijderen door het capillair voorzichtig op een reserve nitrilhandschoen te deppen.
Beslissen hoe de elektrode te bereiden is vaak een moeilijke beslissing voor veel gebruikers. Het bepalen van wat nodig is voor het experiment zal echter helpen de beslissing te verlichten. Voor acute operaties kunnen stompe uiteinden worden gebruikt als de plaatsgrootte van de elektrode belangrijk is; ze zullen echter alleen in zachter weefsel (hersenen) worden ingebracht en alleen op doeldiepten van minder dan 500 μm.
Diepere hersenstructuren in gaan is mogelijk met behulp van een glazen canule22; dit kan echter littekens en bijbehorende onbetrouwbaarheid in ePhys-opnames veroorzaken. Vezels moeten minder dan 300 μm zijn wanneer ze worden geslepen om hardere weefsels (zenuwen) te kunnen binnendringen, omdat de kortere lengte een stijvere ruggengraat biedt voor het inbrengen7,8. Onlangs is ook waargenomen dat geslepen vezels doordringen tot 1 mm diepte in de hersenen8.
Hoewel de arrays die in dit artikel worden besproken een uitstekend startpunt zijn voor veel laboratoria, zijn nieuwere sondes met koolstofvezels ook ontwikkeld om zich chronisch te richten op diepere gebieden in de hersenen21,22,29. In zenuwen zijn elektroden met een lage invasiviteit en hoge selectiviteit een doorlopend onderzoeksonderwerp5,8,30. Jiman et al.7 waren in staat om multiunit-activiteit in de zenuw te detecteren met minimale invasiviteit en verhoogde selectiviteit met behulp van een koolstofvezel siliconen array8, die het ontwerp van de Flex Array weerspiegelt die hier wordt gepresenteerd.
Parylene C toegankelijkheid
Paryleen C is een methode van conformale coating bij kamertemperatuur die is gebruikt als een biocompatibele isolator in veel geïmplanteerde apparaten. De techniek vereist een gespecialiseerde tool in een cleanroom en duurt ongeveer een uur om te leren. Een vluchtig onderzoek van instellingen die eerder koolstofvezelarrays van onze groep hebben aangevraagd, werd uitgevoerd om de toegankelijkheid van Parylene C-depositie te bepalen. We ontdekten dat van de 17 instituten 41% toegang had tot Parylene C-coatingsystemen op hun campus. Voor universiteiten die geen toegang hebben tot een Parylene C-coatingsysteem, zijn commerciële coatingdiensten een haalbaar alternatief, zoals hier wordt aangetoond. Als alternatief kan outsourcing naar een nabijgelegen universitaire cleanroom ook interessant zijn voor laboratoria zonder directe toegang tot een Parylene C-depositiesysteem. Om de kosten per apparaat te verlagen, raden we aan om grotere batches arrays te verzenden, omdat commerciële systemen vaak grotere monsters kunnen verwerken.
Tipvoorbereidingen optimaliseren
Aanvullende tippreparaten moeten worden onderzocht voor deze vezels, omdat de huidige tippreparaten vereisen dat de eindgebruiker moet kiezen tussen doordringend vermogen en een kleine opnameplaats. Hoewel de Nd: YAG lasergesneden vezels een kleine sitegrootte bieden20, is het vermogen om stijver weefsel (spier, zenuw) te penetreren bijna onbestaande en toegang tot een laseropstelling die in staat is tot deze snijtechniek kan moeilijk en duur zijn. Hoewel blowtorching een snelle en economische manier biedt om geslepen tips te krijgen die veel weefsels kunnen binnendringen7, is de tipgeometrie groot en kan deze inconsistent zijn van vezel tot vezel20. UV-lasersnijden biedt ook lage impedanties en grote oppervlakken, maar met het extra voordeel van een meer consistente blootstelling. De UV-laser is toegankelijker dan de Nd:YAG laser; laboratoria zouden echter een manier moeten ontwikkelen om de laser uit te lijnen met vezels en zouden de Flex Array niet kunnen gebruiken omdat de toonhoogte van de vezels kleiner is dan de brandpuntdiameter van de laser. Eerder werk toonde de fabricage van kleine, geslepen vezels via etsen31,32. Deze aanpak kan resulteren in een kleine, betrouwbare elektrodegeometrie en de geslepen punt behouden die nodig is voor het binnendringen van zenuwen en spieren.
Onze huidige tipcoating, PEDOT:pTS, moet mogelijk ook worden vervangen omdat deze de neiging heeft om na verloop van tijd af te breken, wat een ongewenste eigenschap is voor een chronische sonde17,25,33. Een gebrek aan PEDOT:pTS-levensduur leidt tot hogere impedanties en dus een lagere signaalkwaliteit, deels als gevolg van verhoogde achtergrondruis. Om de levensduur van deze vezeltips te verlengen, wordt onderzoek gedaan naar de haalbaarheid van platina-iridiumcoatings. Platina-iridium zou een groter oppervlak mogelijk maken25,34 geconcentreerd op de punt van de elektrode, met een lage impedantie34,35,36 en een langere, chronische stabiliteit34,36. Andere coatings, zoals PEDOT / grafeenoxide37 en gold38, zijn gebruikt om koolstofvezelelektrode-impedanties te verlagen, hoewel deze coatings meestal worden gebruikt voor sondes met chemische detectie in plaats van voor ePhys-opnames. Vanwege de inherente eigenschappen van koolstofvezels39 kan de koolstofvezelarray die hier wordt gepresenteerd, worden omgezet van een sonde die is geoptimaliseerd voor ePhys naar een chemisch detectieapparaat met een eenvoudige verandering van tipvoorbereiding22,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door de National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (UF1NS107659 en UF1NS115817) en de National Science Foundation (1707316). De auteurs erkennen financiële steun van het University of Michigan College of Engineering en technische ondersteuning van het Michigan Center for Materials Characterization en het Van Vlack Undergraduate Laboratory. De auteurs bedanken Dr. Khalil Najafi voor het gebruik van zijn Nd:YAG laser en de Lurie Nanofabrication Facility voor het gebruik van hun Parylene C depositie machine. We willen ook Specialty Coating Systems (Indianapolis, IN) bedanken voor hun hulp bij de commerciële coatingvergelijkingsstudie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 prong clams | 05-769-6Q | Fisher | Qty: 2 Unit Cost (USD): 20 |
| 3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT) |
96618 | Sigma-Aldrich | Qty: 1 Unit Cost (USD): 102 |
| 353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only) |
353ND-T/8OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 48 |
| Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3) | 50-854-570 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 100 |
| Autolab | PGSTAT12 | Metrohm | |
| Blowtorch | 1WG61 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 36 |
| Carbon Fibers | T-650/35 3K | Cytec Thornel | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Carbon tape | NC1784521 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 27 |
| Cotton Tipped Applicator | WOD1002 | MediChoice | Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57 |
| Delayed Set Epoxy++ | 1FBG8 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| DI Water | n/a | n/a | Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a |
| Dumont Tweezers #5 | 50-822-409 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 73 |
| Flex Array** | n/a | MicroConnex | Qty: 1 Unit Cost (USD): 68 |
| Flux | SMD291ST8CC | DigiKey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 13 |
| Glass Capillaries (pack of 350) | 50-821-986 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 60 |
| Glass Dish | n/a | n/a | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Hirose Connector (ZIF Only) |
H3859CT-ND | DigiKey | Qty: 2 Unit Cost (USD): 2 |
| Light-resistant Glass Bottle | n/a | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Micropipette Heating Filiment | FB315B | Sutter Instrument Co | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Micropipette Puller | P-97 | Sutter Instrument Co | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Nitrile Gloves (pack of 200) | 19-041-171C | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 47 |
| Offline Sorter software | n/a | Plexon | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Omnetics Connector* (Flex Array Only) |
A79025-001 | Omnetics Inc | Qty: 1 Unit Cost (USD): 35 |
| Omnetics Connector* (Flex Array Only) |
A79024-001 | Omnetics Inc | Qty: 1 Unit Cost (USD): 35 |
| Omnetics to ZIF connector | ZCA-OMN16 | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Pin Terminal Connector (Wide Board Only) |
ED11523-ND | DigiKey | Qty: 16 Unit Cost (USD): 10 |
| Probe storage box | G2085 | Melmat | Qty: 1 Unit Cost (USD): 2 |
| Razor Blade | 4A807 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 2 |
| SEM post | 16327 | lnf | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| Silver Epoxy (1oz)++ | H20E/1OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 125 |
| Silver GND REF wires | 50-822-122 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2 |
| Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g | 152536 | Sigma-Aldrich | Qty: 1 Unit Cost (USD): 59 |
| Solder | 24-6337-9703 | DigiKey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 60 |
| Soldering Iron Tip | T0054449899N-ND | Digikey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 13 |
| Soldering Station | WD1002N-ND | Digikey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 374 |
| SpotCure-B UV LED Cure System | n/a | FusionNet LLC | Qty: 1 Unit Cost (USD): 895 |
| Stainless steel rod | n/a | n/a | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Stir Plate | n/a | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Surgical Scissors | 08-953-1B | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 100 |
| TDT Shroud (ZIF Only) |
Z3_ZC16SHRD_RSN | TDT | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5 |
| Teflon Tweezers | 50-380-043 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 47 |
| UV & Visible Light Safety Glassees | 92522 | Loctite | Qty: 1 Unit Cost (USD): 45 |
| UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only) |
OG142-87/8OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 83 |
| UV Laser | n/a | WER | Qty: 1 Unit Cost (USD): 30 |
| Weigh boat (pack of 500) |
08-732-112 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 58 |
| Wide Board+ | n/a | Advanced Circuits | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| ZIF Active Headstage | ZC16 | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): 925 |
| ZIF Passive Headstage | ZC16-P | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): 625 |
| ZIF* | n/a | Coast to Coast Circuits | Qty: 1 Unit Cost (USD): 9 |
References
- Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: Requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
- Cunningham, J. P., et al. A closed-loop human simulator for investigating the role of feedback control in brain-machine interfaces. Journal of Neurophysiology. 105 (4), 1932-1949 (2011).
- Yoshida, K., Bertram, M. J., Hunter Cox, T. G., Riso, R. R. Peripheral nerve recording electrodes and techniques. Neuroprosthetics: Theory and Practice. Horch, K., Kipke, D. , World Scientific. 377-466 (2017).
- Dweiri, Y. M., Stone, M. A., Tyler, D. J., McCallum, G. A., Durand, D. M. Fabrication of high contact-density, flat-interface nerve electrodes for recording and stimulation applications. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54388 (2016).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. 336, 108602 (2020).
- Ciancio, A. L., et al. Control of prosthetic hands via the peripheral nervous system. Frontiers in Neuroscience. 10, 116 (2016).
- Jiman, A. A., et al. Multi-channel intraneural vagus nerve recordings with a novel high-density carbon fiber microelectrode array. Scientific Reports. 10 (1), 15501 (2020).
- Welle, E. J., et al. Sharpened and mechanically robust carbon fiber electrode arrays for neural interfacing. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 29, 993-1003 (2021).
- Moffitt, M. A., McIntyre, C. C. Model-based analysis of cortical recording with silicon microelectrodes. Clinical Neurophysiology. 116 (9), 2240-2250 (2005).
- Neural cuff. Ardiem Medical. , Available from: http://www.ardiemmedical.com/neural-cuff/ (2021).
- Nerve-cuff electrodes. Micro-Leads Neuro. , Available from: https://www.microleadsneuro.com/research-products/?jumpto=nerve-cuff (2021).
- Mortimer, J. T., et al. Perspectives on new electrode technology for stimulating peripheral nerves with implantable motor prostheses. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 3 (2), 145-154 (1995).
- Boretius, T., et al. A transverse intrafascicular multichannel electrode (TIME) to interface with the peripheral nerve. Biosensors & Bioelectronics. 26 (1), 62-69 (2010).
- Grill, W. M., Norman, S. E., Bellamkonda, R. V. Implanted neural interfaces biochallenges and engineered solutions. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 1-24 (2009).
- Larson, C. E., Meng, E. A review for the peripheral nerve interface designer. Journal of Neuroscience Methods. 332, 108523 (2020).
- Christensen, M. B., et al. The foreign body response to the Utah Slant Electrode Array in the cat sciatic nerve. Acta Biomaterialia. 10 (11), 4650-4660 (2014).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Yoshida Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
- Saito, N., et al. Application of carbon fibers to biomaterials: A new era of nano-level control of carbon fibers after 30-years of development. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3824-3834 (2011).
- Welle, E. J., et al. Fabrication and characterization of a carbon fiber peripheral nerve electrode appropriate for chronic recording. FASEB Journal. 34 (1), 1 (2020).
- Guitchounts, G., Cox, D. 64-Channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
- Patel, P. R., et al. High density carbon fiber arrays for chronic electrophysiology, fast scan cyclic voltammetry, and correlative anatomy. Journal of Neural Engineering. 17 (5), 056029 (2020).
- Massey, T. L., et al. Open-source automated system for assembling a high-density microwire neural recording array. 2016 International Conference on Manipulation, Automation and Robotics at Small Scales (MARSS). , 1-7 (2016).
- Schwerdt, H. N., et al. Subcellular probes for neurochemical recording from multiple brain sites. Lab Chip. 17, 1104-1115 (2017).
- Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
- Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
- Gillis, W. F., et al. Carbon fiber on polyimide ultra-microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (1), 016010 (2018).
- Dong, T., Chen, L., Shih, A. Laser sharpening of carbon fiber microelectrode arrays for brain recording. Journal of Micro and Nano-Manufacturing. 8 (4), 041013 (2020).
- Massey, T. L., et al. A high-density carbon fiber neural recording array technology. Journal of Neural Engineering. 16 (1), 016024 (2019).
- Romeni, S., Valle, G., Mazzoni, A., Micera, S. Tutorial: a computational framework for the design and optimization of peripheral neural interfaces. Nature Protocols. 15 (10), 3129-3153 (2020).
- Khani, H., Wipf, D. O. Fabrication of tip-protected polymer-coated carbon-fiber ultramicroelectrodes and pH ultramicroelectrodes. Journal of The Electrochemical Society. 166 (8), 673-679 (2019).
- El-Giar, E. E. D. M., Wipf, D. O. Preparation of tip-protected poly(oxyphenylene) coated carbon-fiber ultramicroelectrodes. Electroanalysis. 18 (23), 2281-2289 (2006).
- Venkatraman, S., et al. In vitro and in vivo evaluation of PEDOT microelectrodes for neural stimulation and recording. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (3), 307-316 (2011).
- Petrossians, A., et al. Electrodeposition and Characterization of Thin-Film Platinum-Iridium Alloys for Biological Interfaces. Journal of the Electrochemical Society. 158 (6), 269-276 (2011).
- Lee, C. D., Hudak, E. M., Whalen, J. J., Petrossians, A., Weiland, J. D. Low-impedance, high surface area Pt-Ir electrodeposited on cochlear implant electrodes. Journal of The Electrochemical Society. 165 (12), 3015-3017 (2018).
- Cassar, I. R., et al. Electrodeposited platinum-iridium coating improves in vivo recording performance of chronically implanted microelectrode arrays. Biomaterials. 205, 120-132 (2019).
- Taylor, I. M., et al. Enhanced dopamine detection sensitivity by PEDOT/graphene oxide coating on in vivo carbon fiber electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 89, 400-410 (2017).
- Mohanaraj, S., et al. Gold nanoparticle modified carbon fiber microelectrodes for enhanced neurochemical detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59552 (2019).
- Pusch, J., Wohlmann, B. Chapter 2 - Carbon fibers. Inorganic and composite fibers. Production, properties, and applications. , Woodhead Publishing. 31-51 (2019).
- Budai, D., Hernádi, I., Mészáros, B., Bali, Z. K., Gulya, K. Electrochemical responses of carbon fiber microelectrodes to dopamine in vitro and in vivo. Acta Biologica Szegediensis. 54 (2), 155-160 (2010).
