Summary
Здесь мы описываем методологию изготовления настраиваемых электродных массивов из углеродного волокна для записи in vivo в нерве и мозге.
Abstract
Обычные зонды периферических нервов в основном изготавливаются в чистой комнате, требующей использования нескольких дорогостоящих и узкоспециализированных инструментов. В этой статье представлен «легкий» процесс изготовления матриц нейронных электродов из углеродного волокна, который может быть быстро изучен неопытным пользователем чистой комнаты. Этот процесс изготовления электродных массивов из углеродного волокна требует только одного инструмента для чистых помещений, машины для осаждения парилена C, которая может быть быстро изучена или передана на аутсорсинг коммерческому перерабатывающему предприятию по предельным ценам. Этот процесс изготовления также включает в себя ручную установку печатных плат, изоляцию и оптимизацию наконечников.
Три различные оптимизации наконечников, рассмотренные здесь (лазер Nd: YAG, паяльная лампа и УФ-лазер), приводят к диапазону геометрии наконечника и импедансам 1 кГц, причем волокна паяльной лампы приводят к наименьшему импедансу. В то время как предыдущие эксперименты доказали эффективность электродов лазера и паяльной лампы, эта статья также показывает, что волокна ультрафиолетовой лазерной резки могут записывать нейронные сигналы in vivo. Существующие массивы из углеродного волокна либо не имеют индивидуализированных электродов в пользу пучков, либо требуют изготовленных в чистых помещениях направляющих для населения и изоляции. Предлагаемые массивы используют только инструменты, которые могут быть использованы на столешнице для популяции волокон. Этот процесс изготовления электродов из углеродного волокна позволяет быстро настраивать объемное изготовление массива по сниженной цене по сравнению с коммерчески доступными зондами.
Introduction
Большая часть исследований в области неврологии опирается на запись нейронных сигналов с использованием электрофизиологии (ePhys). Эти нейронные сигналы имеют решающее значение для понимания функций нейронных сетей и новых медицинских методов лечения, таких как мозговая машина и периферические нервные интерфейсы1,2,3,4,5,6. Исследования, связанные с периферическими нервами, требуют изготовленных на заказ или коммерчески доступных нейронных регистрирующих электродов. Нейронные регистрирующие электроды — уникальные инструменты с микронными размерами и хрупкими материалами — требуют специализированного набора навыков и оборудования для изготовления. Были разработаны различные специализированные зонды для конкретных конечных целей; однако это означает, что эксперименты должны разрабатываться вокруг имеющихся в настоящее время коммерческих зондов, или лаборатория должна инвестировать в разработку специализированного зонда, что является длительным процессом. Из-за широкого разнообразия нейронных исследований в периферических нервах существует высокий спрос на универсальный зонд ePhys4,7,8. Идеальный зонд ePhys должен иметь небольшой сайт записи, низкое сопротивление9 и финансово реалистичную цену для реализации в системе3.
Современные коммерческие электроды, как правило, являются либо вненейронными, либо манжетными электродами (Neural Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff Electrode11), которые находятся вне нерва, либо внутрифасцикулярными, которые проникают в нерв и сидят внутри интересующей фасцикулы. Однако, поскольку манжеты электроды находятся дальше от волокон, они улавливают больше шума от близлежащих мышц и других фасцикул, которые могут не быть мишенью. Эти зонды также имеют тенденцию сжимать нерв, что может привести к биообрастанию - накоплению глиальных клеток и рубцовой ткани - на границе раздела электрода, в то время как ткань заживает. Внутрифасцикулярные электроды (такие как LIFE12, TIME13 и Utah Arrays14) добавляют преимущество селективности фасцикул и имеют хорошее отношение сигнал/шум, что важно для распознавания сигналов для взаимодействия машины. Тем не менее, эти зонды имеют проблемы с биосовместимостью, когда нервы деформируются с течением времени3,15,16. При покупке на коммерческой основе оба этих зонда имеют статические конструкции без возможности настройки для конкретного эксперимента и являются дорогостоящими для новых лабораторий.
В ответ на высокую стоимость и проблемы биосовместимости, представленные другими зондами, электроды из углеродного волокна могут предложить лабораториям неврологии возможность создавать свои собственные зонды без необходимости в специализированном оборудовании. Углеродные волокна являются альтернативным записывающим материалом с небольшим форм-фактором, который позволяет вставлять с низким уровнем повреждения. Углеродные волокна обеспечивают лучшую биосовместимость и значительно более низкий отклик рубцов, чем кремний17,18,19 без интенсивной обработки в чистых помещениях5,13,14. Углеродные волокна являются гибкими, долговечными, легко интегрируются с другими биоматериалами19 и могут проникать и записывать из нерва7,20. Несмотря на многие преимущества углеродных волокон, многие лаборатории считают ручное изготовление этих массивов трудным. Некоторые группы21 объединяют углеродные волокна в пучки, которые в совокупности приводят к большему (~200 мкм) диаметру; однако, насколько нам известно, эти пучки не были проверены в нервах. Другие изготовили индивидуальные электродные решетки из углеродного волокна, хотя их методы требуют изготовленных из чистых помещений направляющих из углеродного волокна22,23,24 и оборудования для заполнения их массивов17,23,24. Чтобы решить эту проблему, мы предлагаем метод изготовления массива из углеродного волокна, который может быть выполнен на лабораторной столешнице, что позволяет проводить импровизированные модификации. Полученный массив поддерживает индивидуальные наконечники электродов без специализированных инструментов для заполнения волокон. Кроме того, представлены несколько геометрий, чтобы соответствовать потребностям исследовательского эксперимента. Основываясь на предыдущих работах8,17,22,25, в этом документе представлены подробные методологии построения и изменения нескольких стилей массивов вручную с минимальным временем обучения в чистых помещениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Мичиганского университета.
1. Выбор массива из углеродного волокна
- Выберите печатную плату (PCB) из одной из трех конструкций, показанных на рисунке 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола в центре внимания будут Flex Arrays.- Обратитесь к дизайну печатных плат на веб-сайте Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), бесплатно и готовых к отправке и заказу для печати через типографию печатных плат.
- В таблице 1 приведена сводка разъемов для каждой системной платы и их спецификаций, чтобы помочь выбрать разъем, который будет работать для конкретной экспериментальной установки.
2. Пайка разъема к печатной плате
- Установите паяльник на 315 °C (600 °F).
- Нанесите флюс на все паяльные прокладки на печатной плате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флюс внутри трубки может быть сжат поперек прокладок, в то время как флюс в горшке может быть нанесен деревянным концом аппликатора с хлопковым наконечником, обильно размазывая флюс по всем прокладкам. - Образуют небольшие насыпи припоя на задних подушечках Flex Array (рисунок 2А).
- Припаяйте нижний ряд контактов разъема к заднему ряду паяльных колодок (рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все конструкции плат, предоставленные лабораторией Chestek, были спроектированы таким образом, чтобы разъемы точно соединялись с обозначенной платой.- Для этого припаяйте контакты по обе стороны от разъема с легким доступом к паяльным насыпям. После закрепления осторожно продвиньте наконечник паяльника между передними штифтами, чтобы припаять оставшиеся соединения сзади.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только задний ряд контактов будет закреплен, остальная часть разъема выровняется с каждым контактом над назначенной паяльной панелью.
- Для этого припаяйте контакты по обе стороны от разъема с легким доступом к паяльным насыпям. После закрепления осторожно продвиньте наконечник паяльника между передними штифтами, чтобы припаять оставшиеся соединения сзади.
- Припаяйте передний ряд штифтов к плате, нанеся небольшое количество припоя на каждый штифт. Нанесите дополнительный слой флюса, если пайка происходит не быстро.
- Очистите лишний флюс 100% изопропиловым спиртом (IPA) и короткой щетиной щеткой.
- Инкапсулируйте спаянные соединения в эпоксидную смолу с замедленным набором (рисунок 2 C, D) с помощью иглы 23 G и шприца 1 мл, размещенного конической стороной вниз на штифтах. Медленно проталкивайте эпоксидную смолу через шприц, чтобы она стекала в соединения и вдоль них.
- Оставьте доску на ночь, чтобы отсроченная эпоксидная смола могла затвердеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как вставка продукта для отложенного набора эпоксидной смолы заявляет, что она отверждается за 30 минут, оставляя ее на ночь, она позволяет сформировать более стабильное соединение.
- Оставьте доску на ночь, чтобы отсроченная эпоксидная смола могла затвердеть.
- Закрепите заднюю сторону платы по бокам разъема, уложив небольшую линию эпоксидной смолы с задержкой поперек задней стороны платы и потянув ее на края разъема.
- Оставьте доску, чтобы вылечиться на ночь снова.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе либо сохраните массивы, либо продолжите сборку. При паузе в сборке храните массивы в чистом сухом ящике при комнатной температуре.
- Оставьте доску, чтобы вылечиться на ночь снова.
3. Популяция волокон
- Вырежьте натянутый стеклянный капилляр так, чтобы его кончик поместился между следами массива (рисунок 3А).
- Используя стеклянный съемник и нить накаливания, сделайте капилляры, используя следующие настройки: Тепло = 900, Тяга = 70, Скорость = 35, Время = 200, Давление = 900.
ПРИМЕЧАНИЕ: Номера не имеют единиц измерения и специфичны для данного устройства (см. Таблицу материалов).
- Используя стеклянный съемник и нить накаливания, сделайте капилляры, используя следующие настройки: Тепло = 900, Тяга = 70, Скорость = 35, Время = 200, Давление = 900.
- Используйте деревянные концы двух аппликаторов с хлопковыми наконечниками (по одному на каждую часть серебряной эпоксидной смолы), чтобы зачерпнуть небольшое соотношение серебряной эпоксидной смолы ~1: 1 в пластиковой посуде и смешать, используя те же палочки, которые использовались для зачерпывания. Выбросьте аппликаторы после перемешивания.
- Отрежьте 2-4 мм от конца пучка углеродного волокна на листе бумаги для принтера лезвием бритвы. Чтобы легко отделить волокна в пучке, которые трудно разделить, аккуратно потяните ламинированный лист бумаги поверх пучка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ламинированный лист бумаги переносит статику в волокна, которые будут отделяться сами по себе. - Нанесите серебряную эпоксидную смолу между каждой другой парой следов на одной стороне доски с помощью стеклянного капилляра (рисунок 3B).
- Возьмите небольшую каплю эпоксидной смолы на конец вытянутого капилляра. Аккуратно нанесите между всеми остальными следами на конце доски, заполняя зазор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зазор должен быть заполнен до верхушки двух следов, не переполняясь, чтобы коснуться соседних следов. Каждая трассировка подключена к одному каналу. Этот метод эпоксидной популяции означает, что каждое волокно будет иметь два канала, подключенных к нему. Это связано с тем, что две трассировки обеспечивают лучшее выравнивание волокон, а избыточность в канале помогает обеспечить электрическое соединение.
- Возьмите небольшую каплю эпоксидной смолы на конец вытянутого капилляра. Аккуратно нанесите между всеми остальными следами на конце доски, заполняя зазор.
- Используйте пинцет с тефлоновым покрытием, чтобы поместить одно углеродное волокно в каждый эпоксидный след (рисунок 3C).
- Используйте чистый вытянутый капилляр для регулировки углеродных волокон, чтобы они были перпендикулярны концу платы Flex Array и похоронены под эпоксидной смолой (рисунок 3D).
- Поместите массивы на деревянный блок с волокнистыми концами, нависающими над краем блока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вес серверной части будет удерживать массив на блоке. - Выпекайте деревянный блок и массивы при 140 °C в течение 20 минут, чтобы вылечить серебряную эпоксидную смолу и зафиксировать волокна на месте.
- Повторите шаги 3.4-3.8 для другой стороны платы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут храниться после любого этапа выпечки; однако статичность из ящиков для хранения может привести к отрыву волокон от платы, если при заполнении платы было применено слишком мало серебряной эпоксидной смолы.- Создайте приподнятую клеевую платформу внутри коробки, чтобы основная часть доски могла быть приклеена к клею, позволяя подвешивать волокнистые концы доски внутри коробки, чтобы предотвратить разрыв волокна. Хранить при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если волокна отрываются от платы во время хранения, соскоблите эпоксидную смолу из следов чистым натянутым стеклянным капилляром и повторите шаги 3.1-3.8 для замены волокон. С этого момента массивы должны храниться с волокнами, взвешенными таким образом, чтобы предотвратить разрыв волокна.
- Создайте приподнятую клеевую платформу внутри коробки, чтобы основная часть доски могла быть приклеена к клею, позволяя подвешивать волокнистые концы доски внутри коробки, чтобы предотвратить разрыв волокна. Хранить при комнатной температуре.
4. Применение ультрафиолетовой (УФ) эпоксидной смолы для изоляции углеродных волокон
- Используйте чистый капилляр и нанесите небольшую каплю (~0,5 мм в диаметре УФ-эпоксидной смолы на открытые следы на одной стороне доски (рисунок 4A). Продолжайте добавлять капли УФ-эпоксидной смолы до тех пор, пока следы не будут полностью покрыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте УФ-эпоксидной смоле проникать на углеродные волокна через конец печатной платы, чтобы обеспечить плавное введение позже. - Отверните УФ-эпоксидную смолу под ультрафиолетовым пером в течение 2 мин (рисунок 4B).
- Повторите шаги 4.1-4.2 для другой стороны платы.
- Разрежьте волокна до 1 мм с помощью стереоскопа сетки и хирургических ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут храниться на этом этапе до тех пор, пока они не будут готовы перейти к следующим шагам. Их следует хранить в коробке, которая поднимет углеродные волокна от самой коробки. Массивы могут храниться при комнатной температуре неограниченное время.
5. Проверка электрических соединений с помощью сканирования импеданса 1 кГц (рисунок 5)
- Погрузите углеродные волокна на 1 мм в 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
- Чтобы завершить схему, используйте серебро-серебристый хлорид (Ag| AgCl) опорный электрод и стержень из нержавеющей стали (встречный электрод).
- Используя зажим для стакана, подвешивайте Ag| Электрод AgCl в 1x PBS и подключите его к эталону используемой импедансной системы.
- Используя зажим стакана, подвешивайте стержень из нержавеющей стали в 1x PBS и подключайте к входу контрэлектрода используемой импедансной системы.
- Запустите сканирование импеданса 1 кГц для каждого волокна с помощью потенциостата, установленного на частоту сканирования 1 кГц при 0,01 Вrms в одной синусоидальной форме сигнала. Установите потенциостат на 0 В в начале каждого сканирования в течение 5 с, чтобы стабилизировать записанный сигнал. Записывайте измерения с помощью программного обеспечения, связанного с потенциостатом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения могут быть сделаны в любой точке сборки; однако они необходимы только перед изоляцией и во время подготовки наконечника. В таблице 2 перечислены типичные диапазоны импедансов после каждого шага сборки на частоте 1 кГц для справки пользователя. - Промойте волокна в деионизированной (DI) воде, окунув их в небольшой стакан три раза и оставьте их сохнуть при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут быть оставлены в хранилище до тех пор, пока пользователь не сможет перейти к следующему шагу.
6. Парилен C Изоляция
ПРИМЕЧАНИЕ: Парилен С был выбран в качестве изоляционного материала для углеродных волокон, поскольку он может быть нанесен при комнатной температуре на партии массивов и обеспечивает высококонформное покрытие.
- Замаскируйте разъем Flex Array с помощью соединяющегося разъема.
- Поместите партию из 8-12 массивов в ящик для хранения с приподнятой клеевой платформой, чтобы их можно было изолировать за один прогон. Поместите массивы так, чтобы соединительный конец массива находился на клеевой платформе с нависающим волокнистым концом массива (рисунок 6), чтобы волокна не прилипали к клею и не отрывались, а также чтобы обеспечить равномерное париленовое покрытие на волокнах.
- Покрытие массивов в системе осаждения Parylene C до толщины 800 нм в чистом помещении с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), как определено в отдельной используемой чистой комнате.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь СИЗ были определены как обувь для чистых помещений, костюм, головной убор, очки, маска и латексные перчатки. Следует отметить, что это стандартные СИЗ для входа в чистое помещение. Этот шаг может быть передан на аутсорсинг компании по нанесению покрытий Parylene за определенную плату; однако коммерческая служба может быть в состоянии покрыть больше массивов за один раз. Каждая система осаждения парилена С может иметь различные меры предосторожности. Свяжитесь с техническим специалистом перед использованием, чтобы обеспечить безопасность пользователя. - Удалите соединительный разъем, используемый в качестве маски, из массива Flex.
- Поместите массивы в новый ящик для хранения до готовности к использованию.
7. Способы приготовления чаевых
ПРИМЕЧАНИЕ: Два наконечника в этом разделе используют лазеры для резки волокон. Правильные СИЗ, такие как очки, устойчивые к используемым длинам волн, всегда следует носить при использовании лазера, и другие лабораторные пользователи в непосредственной близости от лазера также должны быть в СИЗ. Хотя длины волокон, перечисленные в этих шагах, являются рекомендуемыми длинами, пользователи могут попробовать любую длину, которая соответствует их потребностям. Пользователь должен выбрать один из следующих методов подготовки наконечника, так как одной ножничной резки будет недостаточно для повторного обнажения электрода25.
- Неодимовая легированная иттрием алюминиевая гранатовая (Nd:YAG) лазерная резка
- Нарежьте волокна до 550 мкм хирургическими ножницами.
- Используйте импульсный лазер 532 нм Nd: YAG (5 мДж / импульс, длительность 5 нс, 900 мВт), чтобы отрезать 50 мкм от кончика волокон, чтобы повторно обнажить углерод под париленом C (обычно требуется 2-3 импульса).
- Выровняйте наконечники волокон с помощью встроенного стереоскопа, который поставляется с этой лазерной системой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система позволяет пользователю выровнять окно (здесь 50 мкм х 20 мкм (высота х ширина)) использовалось для охвата конца волокна. - Сфокусируйте стереоскоп на конце волокна с 500-кратным увеличением для точного и точного разреза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Парилен С будет слегка удаляться (<10 мкм) от кончика, оставляя тупой цилиндрический наконечник.
- Выровняйте наконечники волокон с помощью встроенного стереоскопа, который поставляется с этой лазерной системой.
- Заточка паяльной лампы25,26,27
- Нарежьте волокна до 300 мкм хирургическими ножницами.
- Погрузите массив в тарелку с деионизированной водой, соедините стороной вниз и закрепите на дне тарелки небольшим количеством шпаклевки.
- Используйте камеру пера, чтобы выровнять волокна с поверхностью воды так, чтобы волокна едва касались поверхности воды.
- Отрегулируйте пламя бутановой паяльной лампы до 3-5 мм и проведите им по верхней части волокон движением вперед-назад для заточки волокон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники волокон будут светиться оранжевым цветом, когда пламя проходит над ними. - Извлеките массив из шпаклевки и осмотрите его под стереоскопом на предмет заостренных наконечников при 50-кратном увеличении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если соблюдаются заостренные наконечники, то дальнейшая паяльная лампа не требуется. Если подсказки кажутся тупыми, повторите шаги 7.2.2-7.2.5.
- УФ лазерная резка28
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время УФ-лазер может использоваться только на конструкциях с нулевой силой вставки (ZIF) и wide Board из-за того, что большая фокусная точка используемого УФ-лазера больше, чем шаг углеродных волокон Flex Array.- Нарежьте углеродные волокна до 1 мм хирургическими ножницами.
- Прикрепите УФ-лазер к трем ортогонально сконфигурированным моторизованным ступеням.
ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-лазер представляет собой многомодовый полупроводник нитрида индия-галлия (InGaN) с выходной мощностью 1,5 Вт и длиной волны 405 нм.- Убедитесь, что лазер имеет непрерывный луч для быстрого и эффективного выравнивания и резки.
- Закрепите массив на месте, чтобы сохранить неподвижную, ровную плоскость электродов для прохождения лазера. Убедитесь, что массив удерживается на соответствующем расстоянии от лазера, чтобы волокна были в свете с фокусной точкой лазера. Для этого обеспечьте меньшую мощность лазера и отрегулируйте расстояние, чтобы наилучшим образом сфокусироваться на волокне28.
- Перемещайте фокусную точку УФ-лазера через плоскость волокна со скоростью 25 мкм/с, чтобы разрезать волокна на нужную длину (здесь все волокна разрезаются до 500 мкм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Волокна будут излучать яркий свет перед разрезанием. Храните волокна после обработки до тех пор, пока они не будут готовы к покрытию проводящим полимером.
8. Поли(3,4-этилендиокситиофен):p-толуолсульфонатное (PEDOT:pTS) проводящее покрытие для пониженного импеданса
- Смешайте растворы 0,01 М 3,4-этилендиокситиофена и 0,1 М п-толуолсульфоната натрия в 50 мл воды DI и перемешивайте в течение ночи на перемешивающей пластине (~450 об/мин) или до тех пор, пока в растворе не будет наблюдаться твердых частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните раствор в светостойком контейнере. Охладите раствор после смешивания, чтобы сохранить раствор пригодным для использования в течение 30 дней. - Запустите сканирование импеданса 1 кГц, используя те же параметры, что и раньше (шаги 5.2-5.3) в 1x PBS. Обратите внимание, какие волокна имеют хорошее соединение (<1 МОм, обычно 14-16 из 16 волокон).
- Гальваническая пластина с PEDOT:pTS для снижения импеданса электродов.
- Погрузите волокнистые наконечники в раствор PEDOT:pTS.
- Выполните действия, описанные в шаге 5.2, переключив решение 1x PBS для PEDOT:pTS и сократьте все подключения к плате в прилагаемый токовый канал.
- Наносите 600 пА на хорошую клетчатку в течение 600 с с использованием потенциостата.
- Выключите ячейку и дайте ей отдохнуть в течение 5 с в конце пробега.
- Удалите волокна из раствора и промойте их в воде DI.
- Переснимайте сопротивление 1 кГц, чтобы убедиться, что волокна были успешно покрыты (используйте те же параметры, которые перечислены в шагах 5.2-5.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошие волокна обозначаются как любое волокно, имеющее сопротивление менее 110 кОм.
9. Подключение заземляющих и опорных проводов
- Аккуратно соскоблите Парилен С с земли и эталонные виазы на доске с помощью пинцета. Короткая земля и эталонные виа виа вместе парами на этой конструкции платы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заземление и опорные проходы находятся рядом с разъемом на массиве Flex и представляют собой четыре небольших золотых круга рядом с разъемами. Пользователям нужно будет только удалить Parylene C из vias, ближайших к углеродным волокнам для измерений. - Вырежьте два 5 см изолированного серебряного провода лезвием бритвы. Деиншуляция концов проводов на 2-3 мм от одного конца, который должен быть прикреплен к Flex Array, и ~ 10 мм от противоположных концов, чтобы облегчить заземление и привязку во время операции.
- Нагрейте паяльник до 600 °F. Нанесите небольшое количество флюса на виасу.
- Вставьте один провод (открытый конец 2-3 мм) в каждую из антенн ePhys на плате. Нанесите припой на верхнюю часть виакса (рисунок 7А). Дайте зонду остыть, затем переверните его, чтобы нанести небольшое количество припоя на заднюю сторону через (рисунок 7A).
- Используя хирургические ножницы, отрежьте любую открытую проволоку, торчащую из задней паяльной насыпи, так как это помогает уменьшить шум, наблюдаемый при записи (рисунок 7B).
- Поместите массивы обратно в ящик для хранения, согнув провода назад и подальше от волокна. Закрепите провода на клейкой ленте, чтобы предотвратить потенциальное взаимодействие волокон и проволоки (рисунок 7C).
10. Хирургическая процедура
ПРИМЕЧАНИЕ: Кора головного мозга крыс использовалась для проверки эффективности волокон, подготовленных УФ-лазером, как это было описано ранее7,20. Эти зонды будут работать в нерве из-за их аналогичной геометрии и уровней импеданса с волокнами, подготовленными паяльной лампой. Эта операция была выполнена с большой осторожностью, чтобы подтвердить, что УФ-лазер не изменил реакцию электродов.
- Обезболить взрослого самца крысы Лонг Эванс, используя комбинацию кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Подтвердите анестезию с помощью теста на щипки пальцев ног. Нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание глаз крысы во время операции.
- Создайте трепанацию краниотомии размером 2 мм x 2 мм над моторной корой правого полушария. Определите нижний левый угол трепанации черепа, измерив 1 мм передней части брегмы и 1 мм боковой средней линии.
- Установите массив в стереотаксический инструмент и обнулите стереотаксический инструмент на твердой мозговой оболочке, осторожно опуская волокна, пока они не коснутся поверхности твердой мозговой оболочки. Поднимите массив подальше от места операции и переместите его в сторону, пока он не будет готов к введению.
- Резецируйте твердую мозговую оболочку, осторожно потянув иглу колючим концом по поверхности ткани. Как только часть твердой мозговой оболочки откроется мозгу, используйте пару тонких щипцов, чтобы еще больше помочь в удалении твердой мозговой оболочки.
- Вставьте волокна в трепанацию черепа и 1,2 мм в мозг с помощью стереотаксического инструмента, медленно опускаясь вручную.
- Записывайте данные ePhys в течение 10 минут с помощью специальной для ePhys головной ступени и предусилителя.
- Установите фильтр высоких частот предусилителя для обработки сигнала на частоте 2,2 Гц, сглаживания на частоте 7,5 кГц и отбора проб на частоте 25 кГц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих измерений регистрируется только спонтанная активность. Стимул не применяется.
- Установите фильтр высоких частот предусилителя для обработки сигнала на частоте 2,2 Гц, сглаживания на частоте 7,5 кГц и отбора проб на частоте 25 кГц.
- Эвтаназия
- Поместите крысу под изофлуран на 5% менее 1 л/мин кислорода до тех пор, пока признаки жизни не прекратятся (20-30 мин). Подтвердите эвтаназию обезглавливанием.
11. Сортировка шипов
- Используйте программное обеспечение для сортировки и анализа данных с использованием ранее сообщенных методов8.
- Используйте фильтр высоких частот на всех каналах (угол 250 Гц, Баттерворт 4-го порядка) и установите уровень обнаружения формы сигнала на -3,5 × порогового значения RMS.
- Используйте модель Гаусса для группировки и пиков с аналогичными характеристиками. Комбинируйте и усредняйте кластеры не менее 10 осциллограмм для включения в дальнейший анализ.
- Удалите или удалите из набора данных все формы сигналов, которые не являются пиками.
- Экспортируйте данные после того, как все каналы были отсортированы, и используйте аналитическое программное обеспечение для построения и дальнейшего анализа форм сигналов.
12. Сканирующая электронно-микроскопическая (SEM) визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сделает массивы непригодными для использования и должен использоваться только для проверки результатов обработки наконечников, чтобы убедиться, что массивы обрабатываются правильно. Этот шаг не нужно выполнять для успешного построения массива. Ниже кратко излагаются общие сведения о процессе СЭМ; однако пользователи, которые ранее не использовали SEM, должны получать помощь от обученного пользователя.
- Отрежьте волокнистый конец печатной платы и установите его на заглушку SEM с углеродной лентой. Поместите массивы на небольшую платформу из уложенной углеродной ленты (4-5 слоев), чтобы углеродные волокна не прилипали к заглушке SEM.
- Напыляйте массивы золотом (100-300 Å) в соответствии с процедурами, изложенными производителем золотого напыляющего слоя.
- Чтобы проверить эффекты обработки наконечника, изобразите массивы в SEM на рабочем расстоянии 15 мм и прочности луча 20 кВ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут быть изображены без напыления при низком вакууме, как показано на рисунке 8D для волокон УФ-лазерной резки. Для такой установки рекомендуется иметь рабочее расстояние 11-12 мм и прочность луча 4 кВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проверка советов: изображения SEM
Предыдущая работа20 показала, что ножничная резка привела к ненадежным импедансам, поскольку Parylene C складывался по всему месту записи. Ножничная резка используется здесь только для резки волокон до нужной длины перед обработкой дополнительным методом финишной резки. SEM-изображения наконечников были использованы для определения длины экспонированного углерода и геометрии наконечника (рисунок 8).
Ранее были рассмотрены волокна лазерной резки Scissor и Nd:YAG17,20. Волокна ножничной резки (рисунок 8А) имеют несогласованную геометрию наконечника, при этом парилен С складывается на конце при разрезании20. Волокна лазерной резки Nd:YAG остаются неизменными в области места записи, формы и импеданса (рисунок 8B). Паяльные волокна20 приводят к наибольшему размеру электрода и изменчивости формы и заточенному наконечнику, что позволяет вставлять в жесткую ткань. В среднем, 140 мкм углерода подвергались повторному воздействию с гладкой переходной зоной между углеродной изоляцией и изоляцией парилена С (рисунок 8C). Волокна УФ-лазерной резки были похожи на волокна паяльной лампы, показывая 120 мкм углерода, подвергающегося воздействию от наконечника (рисунок 8D). Импедансы показали, что либо УФ-лазер, либо методы резки кончика паяльной лампы подходят для ePhys и являются жизнеспособными решениями для лабораторий, не имеющих доступа к лазеру Nd: YAG.
Проверка наконечника: электрическая запись
На рисунке 9 показаны результирующие импедансы от каждого метода подготовки с использованием Flex Arrays. Результирующие значения находятся в соответствующем диапазоне для записи ePhys. Nd:YAG лазерная резка волокон привела к наименьшей площади поверхности, но самым высоким импедансам, даже с покрытием PEDOT:pTS (голый углерод: 4138 ± 110 кОм; с PEDOT:pTS: 27 ± 1,15 кОм; n = 262). За этим следует обратная зависимость в паяльной лампе (голый углерод: 308 ± 7 кОм; с PEDOT: pTS: 16 ± 0,81 кОм; n = 262) и УФ-лазером (голый углерод: 468 ± 85,7 кОм; с PEDOT: pTS: 27 ± 2,83 кОм; n = 7) волокнах, которые имеют большую площадь поверхности и низкие импедансы. Однако во всех случаях волокна с покрытием PEDOT:pTS подпадают под пороговый уровень 110 кОм, установленный ранее для обозначения хорошего электрода с низким импедансом.
Записи острого ePhys были взяты у крысы Long Evans, остро имплантированной массивом ZIF с УФ-лазерной резкой и волокнами, обработанными PEDOT: pTS, чтобы продемонстрировать жизнеспособность этого метода. ePhys ранее был протестирован и проверен с помощью ножничных ножниц20 и Nd:YAG-17 и обработанных паяльной лампой волокон7,8 и поэтому не был повторно подтвержден в этом тексте. Острые записи из четырех волокон лечения УФ-лазером (длиной 2 мм), которые были одновременно имплантированы в моторную кору крыс (n = 1), представлены на рисунке 10. Три единицы были обнаружены во всех волокнах, что говорит о том, что обработка волокон недорогим УФ-лазером аналогична другим методам резки, которые позволяют углеродному волокну регистрировать нейронные единицы, как и следовало ожидать от SEM и импедансов. В то время как массивы из углеродного волокна легко строятся и модифицируются в соответствии с потребностями пользователя, следует отметить, что для некоторых сборок необходима дополнительная проверка (таблица 3), в то время как другие менее подходят для определенных конечных задач.
Парилен коммерческий C
Коммерчески покрытые массивы были определены поставщиком как имеющие толщину парилена C 710 нм, что находится в пределах целевого диапазона изоляции. Массивы были подготовлены для записи ePhys с использованием подготовки наконечника паяльной лампы. Импедансы брали после подготовки наконечников и сравнивали с имеющимися данными. Зонд с паяльной лампой и покрытием PEDOT:pTS имел в среднем 14,5 ± импеданс 1,3 кОм по 16 волокнам. Были сделаны снимки SEM наконечника и хвостовика для сравнения осаждения парилена С (рисунок 11 А, В, соответственно). Эти результаты показывают, что использование коммерческого поставщика не изменило ожидаемых значений импеданса, предполагая, что это будет столь же жизнеспособной заменой осаждения в университетской чистой комнате.
Анализ стоимости устройства
При условии, что все инструменты и сыпучие материалы (например, эпоксидные смолы, припой) доступны для исследователя, плата за использование Parylene C составляет 41 доллар США и партия из 8 зондов, общая стоимость материалов составляет 1168 долларов США (146 долларов США за зонд). Усилия персонала (таблица 4) составляют ~25 ч для партии. При использовании замещаемого этапа изготовления стоимость зондов будет варьироваться в зависимости от коммерческой стоимости покрытия Parylene C (500-800 долларов США). Время выполнения шагов сборки (таблица 4) сгруппировано для всех экземпляров повторяющейся задачи для простоты. Время сборки для проектов с большим шагом (Wide Board и ZIF) значительно сокращается, поскольку шаги с интенсивным использованием вручную (например, размещение углеродного волокна) проще и быстрее выполняются.
Рисунок 1: Разъемы и связанные с ними печатные платы. (A) Широкая плата с одним из шестнадцати необходимых разъемов во вставке (вставка шкалы = 5 мм). (B) ZIF и один из двух разъемов и один кожух. (C) Гибкий массив с 36-контактным разъемом; шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Этапы пайки и изоляции для flex Array. (A) Прокладка припоя для контактов нижнего разъема. (B) Задние штифты закреплены на месте с передними штифтами, готовыми к пайке. (C) Гибкий массив с эпоксидной изоляцией с отложенным набором; Обратите внимание, что эпоксидная смола с задержкой не покрывает опорные и заземляющие виа с обеих сторон. (D) Задняя сторона Flex Array с полосой эпоксидной смолы с задержкой установки через накладки (не на заземление и опорные виа) и обернутая вокруг боковой части платы к краю разъема. Шкала = 0,5 см (B) и 1 см (A, C, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Нанесение серебряной эпоксидной смолы и выравнивание углеродных волокон между следами Flex Array. Капилляры были выделены белым наложением. (A) Конец капилляра помещается между следами, чтобы получить (B) чистое эпоксидное серебро (обозначенное стрелками на конце капилляра и внутри следов) осаждение без распространения за пределы следовых пар. (C) Углеродные волокна помещают в эпоксидную смолу, а затем (D) выпрямляют чистым капилляром. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изоляция с применением УФ-эпоксидной смолы (А) УФ-эпоксидная смола наносится с использованием чистого капилляра и двух капель УФ-эпоксидной смолы (помеченных белыми накладками). УФ-эпоксидная смола наносится в каплях диаметром 0,25-0,75 мм до тех пор, пока УФ-эпоксидная смола не образует гладкий пузырь над верхней частью следов. (B) УФ-эпоксидная смола отверждается под воздействием ультрафиолетового излучения. Flex Array помещается в шпаклевку на деревянном блоке для удобства перемещения и выравнивания под ультрафиолетовым светом. Ультрафиолетовый свет удерживается держателем ~ 1 см над концом Flex Array. Вставка (B) показывает боковой профиль правильно уф-эпоксидной изоляции Flex Array. УФ-эпоксидный пузырь по обе стороны платы имеет высоту примерно 50 мкм. Шкала стержней = 500 мкм (A и вставка B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Настройка для измерения импеданса. Все детали маркированы, а системные разъемы и адаптеры зависят от системы. PBS помечается звездой, когда решение заменяется на PEDOT:pTS позже в сборке; однако в остальном настройка идентична. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PEDOT:pTS = поли(3,4-этилендиокситиофен):p-толуолсульфонат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Flex Array, подготовленный для покрытия Parylene C. Flex Array крепится к приподнятой пенопластовой платформе лентой, клейкой стороной вверх во время процесса нанесения покрытия. Шкала = 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Заземляющие и опорные провода, подключенные к завершенному массиву Flex. Припой был нанесен на каждую сторону через по обе стороны платы (A) для создания надежной связи. ePhys vias помечены на плате как GND и Ref и сопряжены на противоположных сторонах платы друг от друга. Есть два дополнительных vias, также помеченных GND и Ref2. Оба ВИА GND укорочены вместе. Ref2 предназначен для использования в электрохимических экспериментах. Лишний провод в (A) обозначается красным прямоугольником и удаляется (B) с задней стороны зонда (красный квадрат показывает, где раньше был провод), чтобы помочь с шумоподавлением и обработкой зонда. (C) Final Flex Array, хранящийся для будущего использования. Обратите внимание, что парные GND и Ref vias на этой плате делают ее предназначенной для записей ePhys. Шкала стержней = 200 мкм (A, B). Сокращения: ePhys = электрофизиология; GND = земля; Ссылка = ссылка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: SEM-изображения волокон с различными методами резки наконечников. (A) Волокно ножничной резки с очень небольшим количеством открытого углерода. (B) Nd:YAG лазерная резка. (C) Паяльное волокно с ~140 мм углерода, обнаженного от наконечника. (D) УФ-лазером вырезанные волокна с ~120 мм углерода, обнаженного от наконечника. Красными стрелками обозначена переходная зона между parylene C и голым углеродным волокном. Шкала стержней = 5 мкм (A), 10 мкм (B), 50 мкм (C, D). Сокращения: SEM = сканирующий электронный микроскопический; Nd:YAG = легированный неодимом иттрий алюминиевый гранат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Различия в импедансе между применением только обработки (голый углерод подвергается воздействию) и добавлением PEDOT:pTS. Во всех случаях добавление PEDOT:pTS уменьшает импеданс на порядок. Размер выборки: Nd:YAG = 262, Паяльная лампа = 262, UV = 7. Разница в размерах УФ-образца обусловлена новизной способа приготовления; тем не менее, он показывает аналогичный диапазон паяльной лампы, как и ожидалось. Данные об импедансе выражаются как среднее ± стандартной погрешности. Сокращения: PEDOT:pTS = поли(3,4-этилендиокситиофен):p-толуолсульфонат; Неодим-легированный иттрий алюминиевый гранат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Данные об острых электрофизиологических всплесках от четырех электродов УФ-лазерной резки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Коммерческие массивы с париленовым С-покрытием. (A) Заточенный массив демонстрирует равномерную заточку по всем волокнам, что указывает на отсутствие недостатков коммерческого покрытия. (B) После паяльной лампы переход (красная рамка) между голым углеродным волокном и париленом C не показывает заметной разницы между массивами, покрытыми в чистом помещении. Шкала стержней = 200 мкм (А) и 10 мкм (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Название печатной платы | Соединитель | Размер паяльной прокладки (мм) | Открытый размер трассировки (мм) | Тангаж трассировки (мкм) | Каналами | |
| Широкая доска | Милл-Макс 9976-0-00-15-00-00-03-0 | 3,25 х 1,6 | 1,5 х 4,0 | 3000 | 8 | |
| ЗИФ | Хиросе DF30FC-20DS-0.4V, | 0,23 х 0,7 | 0,75 х 0,07 | 152.4 | 16 | |
| Гибкий массив | Омнетика A79024-001 | 0,4 х 0,8 | 0,6 х 0,033 | 132 | 16 | |
Таблица 1: Каждая печатная плата имеет свой разъем и шаг, связанный с ней. Аббревиатура: PCB = печатная плата.
| Шаг сборки | Ожидаемое сопротивление 1 кГц (кОм) |
| Голое волокно | 150-300 |
| Голое волокно с УФ-изоляцией | 400-500 |
| Парилен C Изолированные волокна | >50 000 |
| Nd:YAG Лазерная резка | <15 000 |
| Паяльная лампа | 300-400 |
| УФ-лазерная резка* | 300-500 |
| PEDOT: pTS с покрытием | <110 |
Таблица 2: Типичный диапазон импедансов после каждого этапа сборки (n = 272). *n = 16. PEDOT:PTS-обработанные зонды выше 110 кОм могут по-прежнему записывать сигналы; однако все обработанные электроды обычно подпадают под это значение. Сокращения: PEDOT:pTS = поли(3,4-этилендиокситиофен):p-толуолсульфонат; Неодим-легированный иттрий алюминиевый гранат.
| Способ приготовления | Широкая доска | ЗИФ | Гибкий массив |
| Нд:ЯГ | Импеданс, SEM, острый ePhys | Импеданс, SEM, острый/хронический ePhys | Импеданс, SEM, острый/хронический ePhys |
| Паяльная лампа | Импеданс, SEM, острый ePhys | Импеданс, SEM, острый/хронический ePhys | Импеданс, SEM, острый/хронический ePhys |
| УФ-лазер | Еще не проверено | Импеданс, SEM, острый/хронический ePhys | Нежизнеспособно |
Таблица 3: Проверенное использование каждой плиты с описанными методами резки. Все методы резки включали электроосаждение PEDOT:pTS. «Нежизнеспособный» указывает на то, что форм-фактор конструкции предотвращает тестирование этого наконечника в настоящее время (т. Е. Шаг волокна). Сокращения: легированный неодимом иттрий алюминиевый гранат; SEM = сканирующая электронная микроскопия; ePhys = электрофизиология; ZIF = нулевая сила вставки.
| Активность | Время для 8 устройств (ч) |
| Все Пайка | 5 |
| Изоляционная омнетика | 1 |
| Заполнение углеродных волокон | 10 |
| Изоляционные следы с помощью УФ-эпоксидной смолы | 0.5 |
| Осаждение парилена С | 1.5 |
| Nd:YAG Лазерная резка | 1 |
| Паяльная лампа | 1 |
| УФ-лазерная резка | 1.5 |
| Тестирование всех импедансов | 4.5 |
| ПЕДОТ:осаждение pTS | 1.5 |
| Использованный рецепт | Общее количество часов |
| Nd:YAG Лазерная резка | 25 |
| Паяльная лампа | 25 |
| УФ-лазерная резка | 25.5 |
Таблица 4: Время, необходимое для каждого этапа процесса изготовления. Пайка разъема и заземляющих и опорных проводов была объединена здесь, чтобы упростить список действий. Сокращения: PEDOT:pTS = поли(3,4-этилендиокситиофен):p-толуолсульфонат; Неодим-легированный иттрий алюминиевый гранат.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Замены материалов
Хотя все используемые материалы обобщены в Таблице материалов, очень немногие из материалов должны поступать от конкретных поставщиков. Плата Flex Array должна поступать от указанного поставщика, поскольку они являются единственной компанией, которая может печатать гибкую плату. Разъем Flex Array также должен быть заказан у указанного поставщика, поскольку он является проприетарным разъемом. Parylene C настоятельно рекомендуется в качестве изоляционного материала для волокон, поскольку он обеспечивает конформное покрытие при комнатной температуре надежным способом, который затем может противостоять среде in vivo . Полиимидная плита и эпоксидные смолы на плите не выдерживают высоких температур, необходимых для других методов изоляции. Все остальные материалы могут быть приобретены у других поставщиков или заменены на альтернативы по усмотрению пользователей. Эта сборка должна быть гибкой и настраиваемой в соответствии с экспериментом конечного пользователя. Однако следует отметить, что любые изменения в перечисленных материалах или поставщиках должны быть проверены конечным пользователем.
Устранение неполадок сборки
Эпоксидное осаждение серебра имеет тенденцию терпеть неудачу по нескольким причинам: ширина капилляра слишком широка, чтобы поместиться между следами, ширина капилляра слишком тонкая, чтобы улавливать и откладывать эпоксидную смолу, или избыток эпоксидной смолы находится на капилляре. Первые две проблемы можно решить, разрезав новый капилляр более подходящего размера; последний путем погружения капилляра в эпоксидную смолу более легкой рукой или удаления части эпоксидного сгустка путем осторожного нанесения капилляра на запасную нитриловую перчатку.
Решение о том, как подготовить электрод, часто является трудным решением для многих пользователей. Однако определение того, что необходимо для эксперимента, поможет осветить решение. Для острых операций можно использовать тупые наконечники, если важен размер участка электрода; однако они будут вставляться только в более мягкие ткани (мозг) и только на глубине менее 500 мкм.
Проникновение в более глубокие структуры мозга возможно с помощью стеклянной канюли22; однако это может привести к рубцеванию и связанной с ними ненадежности в записях ePhys. Волокна должны быть менее 300 мкм при заточке, чтобы иметь возможность проникать в более твердые ткани (нерв), поскольку более короткая длина обеспечивает более жесткую основу для введения7,8. В последнее время также наблюдалось, что заостренные волокна проникают на глубину до 1 мм в мозг8.
В то время как массивы, обсуждаемые в этой статье, являются отличной отправной точкой для многих лабораторий, новые зонды, использующие углеродные волокна, также были разработаны для хронического нацеливания на более глубокие области мозга21,22,29. В нерве электроды низкой инвазивности и высокой селективности являются постоянной темой исследований5,8,30. Jiman et al.7 смогли обнаружить многоквартирную активность в нерве с минимальной инвазивностью и повышенной селективностью с помощью силиконовой матрицы из углеродного волокна8, которая отражает конструкцию Flex Array, представленную здесь.
Доступность парилена C
Парилен С представляет собой метод конформного покрытия при комнатной температуре, который использовался в качестве биосовместимого изолятора во многих имплантированных устройствах. Техника требует специализированного инструмента в чистой комнате и занимает около часа для изучения. Для определения доступности осаждения парилена С был проведен беглый опрос учреждений, которые ранее запрашивали массивы углеродного волокна у нашей группы. Мы обнаружили, что из 17 институтов 41% имели доступ к системам покрытия Parylene C в своем кампусе. Для университетов, не имеющих доступа к системе покрытия Parylene C, коммерческие услуги по нанесению покрытий являются жизнеспособной альтернативой, как показано здесь. В качестве альтернативы, аутсорсинг в близлежащую университетскую чистую комнату также может представлять интерес для лабораторий, не имеющих прямого доступа к системе осаждения parylene C. Чтобы снизить стоимость одного устройства, мы советуем отправлять большие партии массивов, поскольку коммерческие системы часто могут вмещать более крупные образцы.
Оптимизация подготовки наконечников
Для этих волокон необходимо исследовать дополнительные препараты наконечников, поскольку текущие препараты наконечников требуют, чтобы конечный пользователь выбирал между проникающей способностью и небольшим местом записи. В то время как волокна лазерной резки Nd:YAG обеспечивают небольшой размер участка20, способность проникать в более жесткую ткань (мышцу, нерв) практически отсутствует, и доступ к лазерной установке, способной использовать эту технику резки, может быть трудным и дорогостоящим. В то время как паяльная лампа позволяет быстро и экономично получить заточенные наконечники, которые могут проникать во многие ткани7, геометрия наконечника велика и может быть непоследовательной от волокна к волокну20. УФ-лазерная резка также обеспечивает низкое сопротивление и большую площадь поверхности, но с дополнительным преимуществом более последовательного воздействия. УФ-лазер более доступен, чем лазер Nd:YAG; однако лабораториям потребуется разработать способ выравнивания лазера с волокнами и они не смогут использовать Flex Array из-за того, что шаг волокон меньше диаметра фокусной точки лазера. Предыдущая работа показала изготовление небольших, заточенных волокон с помощью травления31,32. Такой подход может привести к небольшой, надежной геометрии электрода и сохранить заточенный наконечник, необходимый для проникновения в нерв и мышцы.
Наше текущее покрытие наконечника, PEDOT: pTS, также может потребоваться замена, поскольку оно имеет тенденцию к ухудшению с течением времени, что является нежелательной чертой для хронического зонда17,25,33. Отсутствие долговечности PEDOT:pTS приводит к более высоким импедансам и, следовательно, более низкому качеству сигнала, отчасти из-за повышенного фонового шума. Для увеличения долговечности этих волоконных наконечников проводится исследование целесообразности платино-иридиевых покрытий. Платина-иридий позволил бы увеличить площадь поверхности25,34, сконцентрированную на кончике электрода, сохраняя низкое сопротивление 34,35,36 и обеспечивая более длительную хроническую стабильность34,36. Другие покрытия, такие как PEDOT / оксид графена37 и золото38, были использованы для снижения импеданса электродов углеродного волокна, хотя эти покрытия обычно используются для датчиков химического зондирования, а не для записей ePhys. Благодаря свойствам, присущим углеродным волокнам39, массив углеродного волокна, представленный здесь, может быть преобразован из зонда, оптимизированного для ePhys, в устройство с химическим зондированием с простым изменением подготовки наконечника22,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была финансово поддержана Национальными институтами неврологических расстройств и инсульта (UF1NS107659 и UF1NS115817) и Национальным научным фондом (1707316). Авторы признают финансовую поддержку со стороны Инженерного колледжа Мичиганского университета и техническую поддержку со стороны Мичиганского центра характеристик материалов и Лаборатории бакалавриата Ван Влака. Авторы благодарят д-ра Халила Наджафи за использование его лазера Nd:YAG и nanofabrication Facility Lurie за использование их машины для осаждения parylene C. Мы также хотели бы поблагодарить Specialty Coating Systems (Индианаполис, штат Индиана) за помощь в сравнительном исследовании коммерческих покрытий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 prong clams | 05-769-6Q | Fisher | Qty: 2 Unit Cost (USD): 20 |
| 3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT) |
96618 | Sigma-Aldrich | Qty: 1 Unit Cost (USD): 102 |
| 353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only) |
353ND-T/8OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 48 |
| Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3) | 50-854-570 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 100 |
| Autolab | PGSTAT12 | Metrohm | |
| Blowtorch | 1WG61 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 36 |
| Carbon Fibers | T-650/35 3K | Cytec Thornel | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Carbon tape | NC1784521 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 27 |
| Cotton Tipped Applicator | WOD1002 | MediChoice | Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57 |
| Delayed Set Epoxy++ | 1FBG8 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| DI Water | n/a | n/a | Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a |
| Dumont Tweezers #5 | 50-822-409 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 73 |
| Flex Array** | n/a | MicroConnex | Qty: 1 Unit Cost (USD): 68 |
| Flux | SMD291ST8CC | DigiKey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 13 |
| Glass Capillaries (pack of 350) | 50-821-986 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 60 |
| Glass Dish | n/a | n/a | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Hirose Connector (ZIF Only) |
H3859CT-ND | DigiKey | Qty: 2 Unit Cost (USD): 2 |
| Light-resistant Glass Bottle | n/a | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Micropipette Heating Filiment | FB315B | Sutter Instrument Co | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Micropipette Puller | P-97 | Sutter Instrument Co | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Nitrile Gloves (pack of 200) | 19-041-171C | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 47 |
| Offline Sorter software | n/a | Plexon | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Omnetics Connector* (Flex Array Only) |
A79025-001 | Omnetics Inc | Qty: 1 Unit Cost (USD): 35 |
| Omnetics Connector* (Flex Array Only) |
A79024-001 | Omnetics Inc | Qty: 1 Unit Cost (USD): 35 |
| Omnetics to ZIF connector | ZCA-OMN16 | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Pin Terminal Connector (Wide Board Only) |
ED11523-ND | DigiKey | Qty: 16 Unit Cost (USD): 10 |
| Probe storage box | G2085 | Melmat | Qty: 1 Unit Cost (USD): 2 |
| Razor Blade | 4A807 | Grainger | Qty: 1 Unit Cost (USD): 2 |
| SEM post | 16327 | lnf | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| Silver Epoxy (1oz)++ | H20E/1OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 125 |
| Silver GND REF wires | 50-822-122 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2 |
| Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g | 152536 | Sigma-Aldrich | Qty: 1 Unit Cost (USD): 59 |
| Solder | 24-6337-9703 | DigiKey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 60 |
| Soldering Iron Tip | T0054449899N-ND | Digikey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 13 |
| Soldering Station | WD1002N-ND | Digikey | Qty: 1 Unit Cost (USD): 374 |
| SpotCure-B UV LED Cure System | n/a | FusionNet LLC | Qty: 1 Unit Cost (USD): 895 |
| Stainless steel rod | n/a | n/a | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Stir Plate | n/a | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a |
| Surgical Scissors | 08-953-1B | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 100 |
| TDT Shroud (ZIF Only) |
Z3_ZC16SHRD_RSN | TDT | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5 |
| Teflon Tweezers | 50-380-043 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 47 |
| UV & Visible Light Safety Glassees | 92522 | Loctite | Qty: 1 Unit Cost (USD): 45 |
| UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only) |
OG142-87/8OZ | Epoxy Technology | Qty: 1 Unit Cost (USD): 83 |
| UV Laser | n/a | WER | Qty: 1 Unit Cost (USD): 30 |
| Weigh boat (pack of 500) |
08-732-112 | Fisher | Qty: 1 Unit Cost (USD): 58 |
| Wide Board+ | n/a | Advanced Circuits | Qty: 1 Unit Cost (USD): 3 |
| ZIF Active Headstage | ZC16 | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): 925 |
| ZIF Passive Headstage | ZC16-P | Tucker-Davis Technologies | Qty: 1 Unit Cost (USD): 625 |
| ZIF* | n/a | Coast to Coast Circuits | Qty: 1 Unit Cost (USD): 9 |
References
- Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: Requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
- Cunningham, J. P., et al. A closed-loop human simulator for investigating the role of feedback control in brain-machine interfaces. Journal of Neurophysiology. 105 (4), 1932-1949 (2011).
- Yoshida, K., Bertram, M. J., Hunter Cox, T. G., Riso, R. R. Peripheral nerve recording electrodes and techniques. Neuroprosthetics: Theory and Practice. Horch, K., Kipke, D. , World Scientific. 377-466 (2017).
- Dweiri, Y. M., Stone, M. A., Tyler, D. J., McCallum, G. A., Durand, D. M. Fabrication of high contact-density, flat-interface nerve electrodes for recording and stimulation applications. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54388 (2016).
- Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. 336, 108602 (2020).
- Ciancio, A. L., et al. Control of prosthetic hands via the peripheral nervous system. Frontiers in Neuroscience. 10, 116 (2016).
- Jiman, A. A., et al. Multi-channel intraneural vagus nerve recordings with a novel high-density carbon fiber microelectrode array. Scientific Reports. 10 (1), 15501 (2020).
- Welle, E. J., et al. Sharpened and mechanically robust carbon fiber electrode arrays for neural interfacing. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 29, 993-1003 (2021).
- Moffitt, M. A., McIntyre, C. C. Model-based analysis of cortical recording with silicon microelectrodes. Clinical Neurophysiology. 116 (9), 2240-2250 (2005).
- Neural cuff. Ardiem Medical. , Available from: http://www.ardiemmedical.com/neural-cuff/ (2021).
- Nerve-cuff electrodes. Micro-Leads Neuro. , Available from: https://www.microleadsneuro.com/research-products/?jumpto=nerve-cuff (2021).
- Mortimer, J. T., et al. Perspectives on new electrode technology for stimulating peripheral nerves with implantable motor prostheses. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 3 (2), 145-154 (1995).
- Boretius, T., et al. A transverse intrafascicular multichannel electrode (TIME) to interface with the peripheral nerve. Biosensors & Bioelectronics. 26 (1), 62-69 (2010).
- Grill, W. M., Norman, S. E., Bellamkonda, R. V. Implanted neural interfaces biochallenges and engineered solutions. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 1-24 (2009).
- Larson, C. E., Meng, E. A review for the peripheral nerve interface designer. Journal of Neuroscience Methods. 332, 108523 (2020).
- Christensen, M. B., et al. The foreign body response to the Utah Slant Electrode Array in the cat sciatic nerve. Acta Biomaterialia. 10 (11), 4650-4660 (2014).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Yoshida Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
- Saito, N., et al. Application of carbon fibers to biomaterials: A new era of nano-level control of carbon fibers after 30-years of development. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3824-3834 (2011).
- Welle, E. J., et al. Fabrication and characterization of a carbon fiber peripheral nerve electrode appropriate for chronic recording. FASEB Journal. 34 (1), 1 (2020).
- Guitchounts, G., Cox, D. 64-Channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
- Patel, P. R., et al. High density carbon fiber arrays for chronic electrophysiology, fast scan cyclic voltammetry, and correlative anatomy. Journal of Neural Engineering. 17 (5), 056029 (2020).
- Massey, T. L., et al. Open-source automated system for assembling a high-density microwire neural recording array. 2016 International Conference on Manipulation, Automation and Robotics at Small Scales (MARSS). , 1-7 (2016).
- Schwerdt, H. N., et al. Subcellular probes for neurochemical recording from multiple brain sites. Lab Chip. 17, 1104-1115 (2017).
- Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
- Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
- Gillis, W. F., et al. Carbon fiber on polyimide ultra-microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (1), 016010 (2018).
- Dong, T., Chen, L., Shih, A. Laser sharpening of carbon fiber microelectrode arrays for brain recording. Journal of Micro and Nano-Manufacturing. 8 (4), 041013 (2020).
- Massey, T. L., et al. A high-density carbon fiber neural recording array technology. Journal of Neural Engineering. 16 (1), 016024 (2019).
- Romeni, S., Valle, G., Mazzoni, A., Micera, S. Tutorial: a computational framework for the design and optimization of peripheral neural interfaces. Nature Protocols. 15 (10), 3129-3153 (2020).
- Khani, H., Wipf, D. O. Fabrication of tip-protected polymer-coated carbon-fiber ultramicroelectrodes and pH ultramicroelectrodes. Journal of The Electrochemical Society. 166 (8), 673-679 (2019).
- El-Giar, E. E. D. M., Wipf, D. O. Preparation of tip-protected poly(oxyphenylene) coated carbon-fiber ultramicroelectrodes. Electroanalysis. 18 (23), 2281-2289 (2006).
- Venkatraman, S., et al. In vitro and in vivo evaluation of PEDOT microelectrodes for neural stimulation and recording. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (3), 307-316 (2011).
- Petrossians, A., et al. Electrodeposition and Characterization of Thin-Film Platinum-Iridium Alloys for Biological Interfaces. Journal of the Electrochemical Society. 158 (6), 269-276 (2011).
- Lee, C. D., Hudak, E. M., Whalen, J. J., Petrossians, A., Weiland, J. D. Low-impedance, high surface area Pt-Ir electrodeposited on cochlear implant electrodes. Journal of The Electrochemical Society. 165 (12), 3015-3017 (2018).
- Cassar, I. R., et al. Electrodeposited platinum-iridium coating improves in vivo recording performance of chronically implanted microelectrode arrays. Biomaterials. 205, 120-132 (2019).
- Taylor, I. M., et al. Enhanced dopamine detection sensitivity by PEDOT/graphene oxide coating on in vivo carbon fiber electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 89, 400-410 (2017).
- Mohanaraj, S., et al. Gold nanoparticle modified carbon fiber microelectrodes for enhanced neurochemical detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59552 (2019).
- Pusch, J., Wohlmann, B. Chapter 2 - Carbon fibers. Inorganic and composite fibers. Production, properties, and applications. , Woodhead Publishing. 31-51 (2019).
- Budai, D., Hernádi, I., Mészáros, B., Bali, Z. K., Gulya, K. Electrochemical responses of carbon fiber microelectrodes to dopamine in vitro and in vivo. Acta Biologica Szegediensis. 54 (2), 155-160 (2010).
