Summary
רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.
Abstract
מחלת עיניים אחורית כמו רטינופתיה סוכרתית משנה את הפיזיולוגיה של הרשתית. רטינופתיה סוכרתית מאופיינת על ידי ניתוק רשתית, פירוק של מחסום רשתית הדם (BRB), ו אנגיוגנזה ברשתית. מודל חולדת in vivo הוא כלי ניסיוני בעל ערך כדי לבחון את השינויים במבנה ובתפקוד של הרשתית. אנו מציעים שלוש טכניקות ניסיוניות שונות במודל החולדה כדי לזהות שינויים מורפולוגיים של תאי רשתית, כלי רשתית, ו BRB נפגע. היסטולוגיה רשתית משמשת לחקר המורפולוגיה של תאי רשתית שונים. כמו כן, מדידה כמותית מבוצעת על ידי ספירת תאי רשתית ומדידת עובי של שכבות רשתית שונות. בדיקת פירוק BRB משמשת כדי לקבוע את הדליפה של חלבונים חוץ-עיניים מהפלזמה לרקמה הזגוגית עקב התמוטטות של BRB. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית משמשת לחקר אנגיוגנזה ודליפת כלי דם על ידי הדמיית כלי דם ברשתית באמצעות צבע FITC-dextran.
Introduction
רטינופתיה סוכרתית (DR) היא אחד הסיבוכים המשניים המורכבים ביותר של סוכרת. זהו גם הגורם המוביל לעיוורון ניתן למניעה באוכלוסייה בגיל העבודה ברחבי העולם. במטא-אנליזה שנערכה לאחרונה בקרב 32.4 מיליון עיוורים, 830,000 (2.6%) אנשים היו עיוורים עקב DR1. שיעור אובדן הראייה המיוחס לסוכרת דורג במקום השביעי בשנת 2015 עם 1.06% (0.15-2.38) ברחבי העולם 2,3.
רטינופתיה סוכרתית מאובחנת על ידי חריגות בכלי הדם ברקמות העין האחוריות. מבחינה קלינית, הוא מחולק לשני שלבים - DR לא שגשוג (NPDR) ו DR שגשוג (PDR), המבוסס על כלי הדם ברשתית. היפרגליקמיה נחשבת הרגולטור החזק של DR כפי שהוא מסבך מספר מסלולים המעורבים neurodegeneration4,5, דלקת6,7, ו microvasculature8 ברשתית. סיבוכים מטבוליים מרובים הנגרמים עקב היפרגליקמיה כוללים הצטברות של מוצרי קצה גליקציה מתקדמים (AGEs), מסלול פוליאול, מסלול הקסוסמין, מסלול קינאז-C חלבון. מסלולים אלה אחראים על התפשטות התאים (תאי אנדותל), הגירה (pericytes) ואפופטוזיס (תאי רשתית עצבית, pericytes, ותאי אנדותל) המבוססים על שלבים שונים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מטבוליים אלה יכולים להוביל לשינויים פיזיולוגיים כגון ניתוק רשתית, אובדן תאי רשתית, פירוק מחסום רשתית הדם (BRB), מפרצות, ו אנגיוגנזה9.
סטרפטוזוטוצין (STZ) הנגרמת על ידי סוכרת מסוג 1 היא פרקטיקה מבוססת ומקובלת בחולדות להערכת סוכרת פתוגנזה וסיבוכיה. ההשפעות Diabetogenic של STZ נובעים הרס סלקטיבי של אי הלבלב β תאים10. כתוצאה מכך, בעלי החיים יעברו מחסור באינסולין, היפרגליקמיה, פולידיפסיה ופוליאוריה, שכולם אופייניים לסוכרת מסוג 1 אנושית11. עבור אינדוקציה סוכרת חמורה, STZ מנוהל ב 40-65 מ"ג /ק"ג משקל גוף תוך ורידי או תוך-פריטוני במהלך הבגרות. לאחר כ 72 שעות, בעלי חיים אלה מציגים רמות הגלוקוז בדם גדול מ 250 מ"ג / dL10,12.
כדי להבין את השינויים הפיזיולוגיים של הרשתית עקב ניוון עצבי, דלקת, אנגיוגנזה, טכניקות שונות צריך להיות אופטימיזציה במודלים בעלי חיים ניסיוניים. שינויים מבניים ותפקודיים בתאי רשתית וכלי רשתית ניתן ללמוד על ידי טכניקות שונות כגון היסטולוגיה, בדיקת התמוטטות BRB, אנגיוגרפיה פלואורסצנטית.
היסטולוגיה כוללת את חקר האנטומיה של תאים, רקמות ואיברים ברמה מיקרוסקופית. זה יוצר מתאם בין המבנה והתפקוד של תאים / רקמה. מספר שלבים מבוצעים כדי לדמיין ולזהות את השינויים המיקרוסקופיים במבנה הרקמה, ובכך להשוות עמיתים בריאים וחולים13. לפיכך, חיוני לתקנן כל שלב של היסטולוגיה בקפדנות. שלבים שונים המעורבים בהיסטולוגיה של הרשתית הם קיבוע הדגימה, חיתוך הדגימה, התייבשות, ניקוי, הספגה עם פרפין, הטמעת פרפין, חתך וכתמים (כתמי המטוקסילין ואאוזין)13,14.
ברשתית בריאה, הובלת מולקולות על פני הרשתית נשלטת על ידי BRB, המורכב מתאי אנדותל ופריקים בצד הפנימי, ותאי אפיתל פיגמנט רשתית בצד החיצוני. עם זאת, תאי אנדותל BRB פנימיים ו pericytes להתחיל ניוון במהלך המצב החולה, ו BRB נפגע גם 15. עקב התמוטטות BRB זו, מולקולות משקל מולקולרי נמוך רבות דולפות לתוך רקמת הזגוגית והרשתית16. ככל שהמחלה מתקדמת, מולקולות חלבון רבות אחרות (משקל מולקולרי נמוך וגבוה) דולפות גם הן לרקמת הזגוגית והרשתית עקב הפרעות הומאוסטזיס17. זה מוביל לסיבוכים שונים אחרים ובסופו של דבר בצקת מקולרית ועיוורון. לפיכך, כימות רמות החלבון בזגוגית והשוואת מצבים בריאים וסוכרתיים מדדים נפגע BRB.
אנגיוגרפיה פלואורסצנטית היא טכניקה המשמשת לחקר זרימת הדם של הרשתית והכורואיד באמצעות צבע פלואורסצנטי. הוא משמש כדי לדמיין vasculature של הרשתית choroid על ידי הזרקת צבע פלואורסצ'ין באמצעות מסלול תוך ורידי או הזרקת לב18. ברגע שהצבע מוזרק, הוא מגיע תחילה לעורקי הרשתית, ואחריו ורידים ברשתית. מחזור זה של צבע הושלם בדרך כלל בתוך 5 עד 10 דקות מן הזרקת צבע19. זוהי טכניקה חשובה לאבחון מחלות עיניים שונות בחלק האחורי, כולל רטינופתיה סוכרתית וניאווסקולריזציה choroidal20. זה עוזר לזהות שינויים כלליים וקטנים בכלי דם גדולים וקטנים בתנאים נורמליים וחולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה פועל על פי כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים המסופקות על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד.
1. היסטולוגיה רשתית
- עידוד וקיבעון של העין
- המתת חסד של חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (בת 14 עד 15 שבועות) באמצעות מינון גבוה של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג) המוזרק דרך המסלול התוך-אפריטוני. אין דופק לגילוי מאשר את המוות בתוך 2-5 דקות.
- Enucleate העין על ידי ביצוע חתכים באמצעות להב אזמל על האף ואזורי הזמן של העין. לאחר מכן לחתוך לאורך הקצוות שלה באמצעות מלקחיים ומספריים מיקרו כדי להסיר את העין משקע מסלולית.
הערה: לפני הקרבת חולדות, שמור על פתרונות קבועים מוכנים.
אזהרה: פורמלדהיד מגרה את העור, העין, האף ודרכי הנשימה. זה יכול גם לגרום לסרטן כפי שהוא רגיש לעור חזק. ללבוש כפפות ולטפל בו מתחת למכסה המנוע21. - לשטוף את העין ביסודיות עם 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) בצלחת פטרי כדי להסיר דם. הסר את עודף השומן המקיף את העין לחדירה קלה של הפתרון הקיבולנטי.
- מיד למקם את העין ב 5 מ"ל של פתרון קבוע בעזרת מלקחיים, ולוודא שהוא לא תקוע לקירות של בקבוקוני זכוכית. מערבבים בעדינות במשך כמה שניות ומחליפים את המכסה בתיוג מתאים. עין דגירה בתמיסה קבועה עבור 24 עד 48 שעות בתנאים כהים בטמפרטורת החדר.
- חיתוך רקמות
- לאחר קיבעון, להסיר את העין מן הפתרון הקבוע, לשטוף עם 10 מ"ל של PBS, ומניחים אותו בצלחת פטרי המכיל 10 מ"ל של PBS מקורר ב 4 °C (60 °F).
- באמצעות מיקרו מלקחיים, להחזיק את העין עם עצב הראייה ולעשות ניק ב pars plana בעזרת מספריים מיקרו. חותכים את כל השוליים של הקרנית כדי להפריד את הכוס הקדמית של העין. בעזרת מלקחיים, בחרו את העדשה בעדינות, השליכו אותה וחתכו את עצב הראייה.
- באמצעות מספריים מיקרו מעוקלים, לעשות קטע אורך של eyecup האחורי, עובר דרך הדיסק האופטי מחלק אותו לשני חצאים. מניחים אותו בבסיס הקלטת וסוגרים את המכסה כראוי ללא כל הפרעה לרקמה. סמן את הקלטות עם השם והתאריך של דגימת הרקמה.
- התייבשות, ניקוי, פרפין הספגה של רקמות
- לייבש את הרקמה החתוך על ידי העברה הדרגתית ב 80 מ"ל של 50%, 70%, 90%, ו 100% אתנול. בעת העברת הקלטות מריכוז אחד למשנהו, הקפד לטפטף אותן על נייר טישו נקי כדי למזער את הזיהום.
הערה: אפשר לרקמה לעמוד בכל העברה למשך 30 דקות (פעמיים). הזמן הכולל הנצרך עבור שלב זה הוא כ 4 שעות. - לאחר התייבשות, להעביר את הקלטות לתוך 80 מ"ל של קסילן במשך 30 דקות (פעמיים) כדי להחליף את האתנול עם קסילן.
הערה: לאחר הדגירה עם קסילן, הרקמה הופכת שקופה.
זהירות: קסילן היא תרכובת ארומטית עם טבעת בנזן. זה מגרה את העין ואת הרירית קרום ועלול גם לגרום לדיכאון. - לבסוף, להפרות את הרקמה עם פרפין מחומם מראש ב 60 °C (60 °F) כדי להחליף קסילן ברקמה. מטפטפים את הקלטות מספר פעמים על נייר טישו כדי למזער את תכולת הקסילן ומניחים ב-200 מ"ל של פרפין (נוזל בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס) למשך 2 שעות (1 שעה x 2).
אזהרה: הימנע משאיפת פרפין מומס, כפי שהוא מייצר טיפות שומנים זעירים אשר עלול לגרום אי נוחות בדרכי הנשימה.
- לייבש את הרקמה החתוך על ידי העברה הדרגתית ב 80 מ"ל של 50%, 70%, 90%, ו 100% אתנול. בעת העברת הקלטות מריכוז אחד למשנהו, הקפד לטפטף אותן על נייר טישו נקי כדי למזער את הזיהום.
- הטבעת פרפין
- הפעל את מכונת הטבעת פרפין לפחות 1 שעות לפני השימוש כדי להמיס את הפרפין וכדי שהתחנות יגיעו לטמפרטורות הרצויות. מלאו תבנית פלדה בשעווה פרפין מומסת על ידי הנחתה על משטח חם, ולאחר מכן הסירו קלטת אחת בכל פעם ממיכל הפרפין.
- מעבירים את תבנית הפלדה ממשטח חם למשטח קר (4 מעלות צלזיוס). בשלב זה, השעווה בתבנית תתחיל להתמצק. לפני שהוא מתמצק לחלוטין, מניחים את הרקמה בשעווה בעזרת מלקחיים ומכוונות את הרקמה כך שחלק הדיסק האופטי של הכוס האחורית פונה לבסיס התבנית.
הערה: ודא שהרקמה אינה זזה ושמור על הכיוון הרצוי. אם לא, החזירו את התבנית למשטח העבודה החם עד שכל הפרפין נמס, ואז התחילו שוב בשלב 1.4.2. - כאשר השעווה בתבנית מתחילה להתמצק, מניחים מיד את בסיס הקסטה על גבי התבנית. מלאו בזהירות את התבנית בפרפין מעל הקצה העליון של הקלטת והעבירו אותה באיטיות למשטח קר (קרוב למינוס 20 מעלות צלזיוס) להתמצקות מהירה. עד שהוא מתמצק, חזור על התהליך עם קלטות אחרות משלב 1.4.2.
- לאחר שכל התבניות מתמצקות, מפרידות את תבנית הפלדה מהקלטת. אם זה קשה, לחכות עוד קצת ולנסות שוב (לא להסיר אותו בכוח). ההפרדה הופכת לקלה יותר עם התגבשות מלאה. עכשיו הקלטת הופכת לבסיס של בלוק הפרפין שיוחזק במהלך חתך על ידי מיקרוטומיה.
הערה: ניתן לאחסן בלוק זה בטמפרטורת החדר לשימוש נוסף. בשלב זה, ניתן לעצור את התהליך ולהמשיך מאוחר יותר (במידת הצורך).
- חלוקה לרמות
- התקן להב מיקרו-אטומי חד פעמי במחזיק הלהב. הסר שעוות פרפין עודפת סביב קלטות, כך שגם החלק העליון וגם החלק התחתון של הבלוקים יישארו מקבילים לסכין. התאם את החסימה למחזיק קלטות.
- לפתוח את גלגל היד כדי לקדם אותו עד פני השטח של הבלוק הוא במגע עם קצה הסכין. חותכים את שעוות הפרפין העודפת על הבלוק עד שהרקמה מדמיינת על פני השטח של הבלוק. הגדר את עובי המקטע ל -5 מיקרומטר וגזור סרט של חמישה עד שישה חלקים.
- באמצעות מלקחיים, העבר בעדינות את הרצועה על פני השטח של אמבט המים שחומם מראש (בסביבות 50 °C (סביב 50 °F) כדי לפתוח את הסרט. אסוף קטעים על מגלשת זכוכית מצופה אלבומין של מאייר על ידי החזקת השקופית מתחת למקטע. הרם בעדינות את המקטעים ואפשר למגלשות להתייבש אופקית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורת החדר בקופסאות יבשות למשך מספר חודשים. בשלב זה, ניתן לעצור את התהליך ולהמשיך מאוחר יותר.
- כתמים
- מחממים את השקופיות כדי להיות מוכתמות בתנור אוויר חם ב 60 °C (60 °F) במשך 1 שעות לפני השימוש עבור פרפין להמיס, ובצע את השלבים כאמור בטבלה 1.
אזהרה: כתמי המטוקסילין ואאוזין רעילים כאשר הם נשאפים או נבלעים. הם דווחו כמסרטנים.
- מחממים את השקופיות כדי להיות מוכתמות בתנור אוויר חם ב 60 °C (60 °F) במשך 1 שעות לפני השימוש עבור פרפין להמיס, ובצע את השלבים כאמור בטבלה 1.
| מגיב | זמן עמידה | חזרה (מספר פעמים) |
| קסילן | 5 דקות | 2 |
| 100% אתנול | 5 דקות | 2 |
| 90% אתנול | 5 דקות | 2 |
| 70% אתנול | 5 דקות | 2 |
| 50% אתנול | 5 דקות | 2 |
| מים | 5 דקות | 2 |
| המטוקסילין | 4 דקות | 1 |
| שטיפת מים | ||
| 1% אלכוהול חומצי ב-70% אתנול | 30 שניות | 1 |
| שטיפת מים | ||
| המים של סקוט | 1 דקות | 1 |
| שטיפת מים | ||
| 50% אתנול | 1 דקות | 1 |
| 95% אתנול | 1 דקות | 1 |
| 0.25% אאוזין | 5 שניות | 1 |
| שטיפת מים | ||
| מים | 2 דקות | 1 |
| 95% אתנול | 1 דקות | 1 |
| 100% אתנול | 1 דקות | 1 |
| קסילן | 5 דקות | 2 |
| Mountant וכיסוי | ||
טבלה 1. הליך הכתמת המטוקסילן ואאוזין
2. בדיקת התמוטטות מחסום דם - מוח
- איסוף דם וזגוגית
- מרדים חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (14 עד 15 שבועות) באמצעות קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (8 מ"ג/ק"ג). אשר את מצב ההרדמה על ידי רפלקס משיכת דוושה (צביטת בוהן). לאסוף מיד 1 מ"ל של דם על ידי ניקוב לב לתוך חומצה אתילנדימינטטראצטטית (EDTA) צינור מצופה להפריד פלזמה מדם שלם.
- המתת חסד החולדה באמצעות מינון גבוה של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג), מוזרק דרך המסלול התוך-אפריטוני. אין דופק לגילוי מאשר את המוות בתוך 2-5 דקות. מסננים את העין ומניחים אותה מיד על קרח יבש.
- מניחים את העין בצלחת פטרי נקייה מעל קרח יבש (מומלץ) ומתחילים לנתח את העין כאמור בשלב 1.2.2.
- הסר את העדשה, למשוך את הזגוגית בזהירות מן הכוס האחורית באמצעות מלקחיים מיקרו ומניחים אותו בצינור הומוגניזציה המכיל שלושה עד ארבעה חרוזי זכוכית (2-4 מ"מ).
הערה: מומלץ לבצע ניתוח על קרח יבש מכיוון שהסרת העדשה והזגוגית קלה יותר בתנאי הקפאה.
- הכנת דגימות
- הומור זגוגי הומוגני בהומוגניזר חרוזים במהירות בינונית במשך 10 שניות.
- להעביר את הדם (1 מ"ל) ודגימות זגוגית (10-20 μL) לתוך צינורות microcentrifuge וצנטריפוגה שתי הדגימות ב 5200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F).
הערה: במקרה של הומוגניזציה מוצלחת, לזגוגית יש עקביות אחידה לאחר צנטריפוגה. עם זאת, במקרה של עקביות לא אחידה של זגוגית, חזור משלב 2.2.1 עם זמן הומוגניזציה מוגברת. - לאסוף supernatant משתי הדגימות, ולדלל הומור זגוגית ודגימות פלזמה ביחס 1:10 ו 1:20, בהתאמה, עם PBS.
- כימות חלבונים ויחס חלבון זגוגית-פלזמה
- כדי כמות ריכוז חלבון הומור זגוגית ודגימות פלזמה, להוסיף 5 μL של דגימות מדוללות ל 250 μL של ריאגנט ברדפורד, לערבב היטב, ולקרוא את הספיגה ב 590 ננומטר בתוך 40 דקות.
הערה: אם ערך הספיגה של הדגימות הוא מעל 1.0, לדלל את הדגימות עוד יותר ולחזור על ההליך משלב 2.2.3. - לנרמל את רמת החלבון הזגוגית לרמת חלבון פלזמה מאותו חולדה ולמדוד את ההבדל לקפל בין חולדות בריאות לעומת חולי סוכרת.
- כדי כמות ריכוז חלבון הומור זגוגית ודגימות פלזמה, להוסיף 5 μL של דגימות מדוללות ל 250 μL של ריאגנט ברדפורד, לערבב היטב, ולקרוא את הספיגה ב 590 ננומטר בתוך 40 דקות.
3. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית
- FITC-dextran70000 הזרקת צבע
- להרדים חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (14 עד 15 שבועות) באמצעות 3% איזופלוראן ולאשר את רפלקס גמילה מהדוושה (צביטת בוהן). טובלים את הזנב בכוס המכילה מים חמים (37-40 מעלות צלזיוס). נקה את הזנב עם 70% אתנול לפני הזרקת הצבע. אתר את הווריד הצדדי של הזנב וסמן את מיקום ההזרקה בחלק התחתון של הזנב.
הערה: אם החדרת המחט נכשלת, נסה להכניס למיקום אחר מעל המיקום הנוכחי (קצה לבסיס הזנב). עם זאת, מומלץ להזריק פעם אחת כמו דקירה חוזרת עלולה להוביל להתפתחות מתח בחולדה, אשר יכול לגרום vasoconstriction. - להזריק 1 מ"ל של 50 מ"ג / מ"ל FITC-dextran70000 פתרון צבע דרך הווריד הזנב ולאפשר את הצבע להסתובב במשך 5 דקות. המתת חסד החולדה עם מינון גבוה של pentobarbital (150mg/kg), מוזרק דרך המסלול התוך-אפריטוני. אין דופק לגילוי מאשר את המוות בתוך 2-5 דקות. Enucleate העין כאמור בשלב 1.1.1.
הערה: במידת הצורך, ניתן לתקן את העין בתמיסת פורמלדהיד של 4%, למשך לא יותר מ-30 דקות.
- להרדים חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (14 עד 15 שבועות) באמצעות 3% איזופלוראן ולאשר את רפלקס גמילה מהדוושה (צביטת בוהן). טובלים את הזנב בכוס המכילה מים חמים (37-40 מעלות צלזיוס). נקה את הזנב עם 70% אתנול לפני הזרקת הצבע. אתר את הווריד הצדדי של הזנב וסמן את מיקום ההזרקה בחלק התחתון של הזנב.
- הכנת הרכבה שטוחה
- להכנת תושבות שטוחות, שמרו על כלי הניתוח מוכנים יחד עם השקופיות והכיסויים. מניחים את העין בצלחת פטרי מלאה PBS צונן ולהתחיל לנתח את העין כאמור בשלב 1.2.2.2.
- עכשיו למקם את הקצה של מלקחיים מחודדים בין הסקלרה והרשתית. הזיזו אותו בעדינות לאורך כל שפת הכוס, וודאו שהרשתית אינה מחוברת לסקלרה בשום שלב. אם יש חסימה כלשהי, לחתוך לאט את החלק לאורך השפה באמצעות מספריים מיקרו מעוקלים.
- ברגע שהוא אישר כי הרשתית אינה מחוברת sclera מכל צד, לחתוך ליד הדיסק האופטי, מה שהופך חור קטן, כך הרשתית מתנתק לחלוטין מן הסקלרה. לאט לדחוף את הרשתית לתוך פתרון PBS ולהניח אותו על שקופית שטוחה נקייה בעזרת מרית או מלקחיים.
- באמצעות מיקרו מספריים או להבי אזמל, לעשות חתכים קלים ברקמת הרשתית, חלוקת אותו לארבעה רבעים. ודאו שהחתכים נמצאים במרחק של לפחות 2 מ"מ מהחור שהותיר הדיסק האופטי במרכז, כפי שמוצג באיור 1.
- הסר PBS עודף מצדי הרקמה באמצעות 0.2 מ"ל טיפים מבלי להפריע להרכבה השטוחה.
- מניחים טיפה של מדיום הרכבה נגד דהייה (50 μL עד 100 μL) על הרכבה שטוחה, לכסות עם כיסוי, ולדמיין מיד תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: שמור על אור מינימלי במהלך כל ההליך.
- תצוגה חזותית של הרכבה שטוחה
- דמיינו את ההרכבה השטוחה מתחת למטרה של פי 10 של מיקרוסקופ קונפוקלי. בצע סריקת אריחים כדי ללכוד את כל ההרכבה השטוחה כתמונה אחת. מספר האריחים תלוי בגודל של הרכבה שטוחה ברשתית. כמו כן, לבצע Z-stacking כדי לדמיין את הוורידים והעורקים במוקדי שונים (גודל מועדף עבור Z-מחסנית הוא 5 מיקרומטר, תלוי באיזה, מספר צעדי Z-מחסנית משתנה).
- השתמש בגלאי PMT ו- HyD ב% רווח כמו 700-900 ו 100-150, בהתאמה. בחר טווח פליטה בין 510-530 ננומטר עבור צבע FITC-dextran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היסטולוגיה רשתית
ברשתית הסוכרתית, תאי הרשתית עוברים ניוון. בנוסף, עובי שכבות הרשתית להגדיל עקב בצקת22. התמונות המתקבלות לאחר כתמי המטוקסילין ואאוזין יכולות לשמש לספירת תאים ומדידה של עובי שכבות שונות, כפי שמוצג באיור 2 באמצעות ImageJ.
בדיקת פירוק מחסום רשתית דם
כמו BRB נפגע בחולדות סוכרת, דליפה הופכת בולטת, המוביל הצטברות של ביומולקולות מפלזמה לרשתית וזגוגית. בחולדות סוכרתיות, דליפת חלבון מפלזמה לזגוגית גבוהה פי שלושה בהשוואה לחולדות בריאות (איור 3). חלבון ניתן להעריך באמצעות כל שיטת ערכה כגון שיטת לאורי, שיטת חומצה Bicinchoninic (BCA) או שיטת ברדפורד (המוזכר במאמר זה, סעיף 2.3). מומלץ לנתח את העין באופן טרי, שכן עיכוב בעיבוד עלול להוביל להידבקות זגוגית חזקה עם הרשתית, מה שמקשה על הפרדה. הפרדה לא נכונה של זגוגית מהרשתית עלולה להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות.
אנגיוגרפיה פלואורסצנטית
טכניקה זו משמשת כדי לדמיין את הדליפה והכלנוי של הרשתית, כולל כלי דם מיקרו מאקרו. הבחירה בגודל של FITC-dextran מבוססת על היישום שלה למחקרים שונים. משקל מולקולרי נמוך FITC-dextran, החל 4-6 kDa, משמש כדי לדמיין דליפה בכלי הדם. לעומת זאת, מולקולות FITC-dextran במשקל מולקולרי גבוה, הנעות בין 70 kDa ל -2 מיליון Da, משמשות להדמיית אנגיוגנזה. הזרקה מוצלחת של צבע גורמת להדמיית כל כלי הדם של הרכבה שטוחה ברשתית, כפי שמוצג באיור 4. התמונות שהושגו לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית ניתן להשתמש כדי לקבוע את האזור של כלי הדם הכבושים ברשתית כולה באמצעות תוכנת ImageJ כדי להשוות קבוצות בריאות וחולים.
איור 1. הכנת הרכבה שטוחה של רשתית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. תמונות היסטולוגיות של רשתית בריאה לעומת סוכרתית. (A) ו-(B) מייצגים את תמונות הרשתית המוכתמות ב-H&E של שליטה (A) וחולדה סוכרתית (B) מתחת ל-40x. העובי הכולל של הרשתית וכל שכבה עולה במצבים סוכרתיים (C). קיצורים: PRL = שכבת קולטן אור, ONL = שכבה גרעינית חיצונית, OPL = שכבת plexiform חיצונית, INL = שכבה גרעינית פנימית, IPL = שכבת plexiform פנימית, ו- GCL = שכבת תא גנגליון. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. * מייצג הבדל משמעותי מקבוצת הביקורת (P < 0.0001), ואילו # מייצג הבדל משמעותי מקבוצת הביקורת ב- P < 0.05, שהתקבלה על ידי מבחן ANOVA. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. התמוטטות מחסום רשתית דם בחולדות בריאות לעומת חולי סוכרת. הגרף מייצג את יחס חלבון הפלזמה הזגוגי של חולדות בריאות לעומת סוכרתיות. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. * מייצג הבדל משמעותי מקבוצת הביקורת (P < 0.01) המתקבלת על-ידי בדיקת t לא מזווגת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של כלי רשתית. (A) ו- (B) מייצגים הרכבה שטוחה של רשתית המודמית על-ידי סריקת אריחים ותפירת התמונות מתחת ל- 10x. (A) מייצגת רשתית בקרה, (ב) מייצגת רשתית סוכרתית. החץ הלבן מציין דליפה. כל התמונות הושגו על ידי Z-stack (עובי 5 מיקרומטר). סרגלי קנה המידה ב- (A) ו- (B) הם 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היסטולוגיה
היסטולוגיה רשתית מבוצעת כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים של תאי רשתית ושכבות. צעדים שונים, כולל בחירה של פתרון קבוע, משך קיבעון, התייבשות, והספגת פרפין, צריך להיות ממוטב. גודל הרקמה לא יעלה על 3 מ"מ, כמו חדירה קבועה הופכת איטית. 4% paraformaldehyde נפוץ מוביל ניתוק רשתית אפילו בעין בריאה בשל osmolarity גבוה יחסית של הפתרון לעומת הומור מימי הומור זגוגית, מה שמוביל לתוצאות חיוביות שווא23. osmolarity גבוה של הפתרון גורם התכווצות נפח ומוביל התכווצות של רקמות. הפתרון הקיבוצי המשמש בפרוטוקול זה הוא 1% פורמלדהיד עם 1.25% גלוטרלדהיד, שיש לו יחסית פחות אוסמולריות, מפחית את עיוות הרקמה, ממזער את ניתוק הרשתית משכבת האפיתל של הפיגמנט הרשתית, וגם משמר את המבנה במצבו הטבעי. בחירה נוספת של פתרון קבוע היא חומצה אצטית ואתנול עם פורמלדהיד. מצב חומצי של פתרון קבוע יכול לעזור בקיבוע מהיר של רקמות, בעוד אתנול משפר את החדירה של הפתרון הקיבוצי. עם זאת, אופטימיזציה של היחס של אתנול וחומצה אצטית הוא חיוני כמו ריכוז עודף עלול להוביל התכווצות או נפיחות של הרקמה, בהתאמה24. פרמטרי הערכה לקיבוע רקמות מוצלח כוללים ניתוק של הרשתית, שכבות רשתית שלמות והתכווצות רקמות. גורם קריטי נוסף בעת ביצוע קיבעון הוא נפח הפתרון הקיבוצי, שאמור להיות לפחות פי 20 עד 25 מגודל העין לקיבעון נכון25. בנוסף, חשוב לסובב את גלגל העין או הרקמה בכל פעם מועבר מפתרון אחד למשנהו, כך שהוא לא מקל על החלק התחתון או הקירות של המיכל.
עיבוד רקמות לא שלם, כולל התייבשות והספגה עם פרפין, יכול להתכווץ ולייבש רקמות, אשר ניתן לדמיין כאשר דיכאון מתרחש על פני השטח של הבלוק. בנוסף, עיבוד רקמות לקוי יגרום גם לצביעת חלקים ללבן כאשר הם נחשפים למים25. אם הרקמה אינה מעובדת כראוי, ניתן לקחת אותה בחזרה דרך קסילן כדי להסיר פרפין, ואחריו rehydration ב downgradient של אתנול, (כלומר, 100% אתנול, 90% אתנול, ו 70% אתנול). שוב, חזור על השלבים מ 1.3 עד 1.4 כדי להכין בהצלחה בלוקים פרפין.
בעת הכנת בלוקים פרפין, זה חיוני כדי לוודא כי הרקמה מוקפת מכל הצדדים על ידי פרפין ולא בועות אוויר נראים. כל טעות בהכנת הבלוק תוביל לחתך לא מוצלח של רקמות. לפעמים הכוס האחורית מקופלת במהלך העיבוד; בשלב זה, זה יכול להיות משך בעדינות לגזרים באמצעות מלקחיים (בפרפין מחומם) אבל לא במידה שזה פוגע ברקמה. נניח שכיוון הרקמה בעובש פלדה אינו רצוי בזמן שהפרפין מתחיל להתמצק; במקרה זה, זה יכול להיות לשים בחזרה פרפין מומס ורקמות כדי לכוון מחדש את הרקמה כדי להכין בלוקים פרפין. כמו כן, בעת העברת הרקמה לתבנית המטביעה, ודא כי פרפין סביב הרקמה אינו מתמצק. זה יוצר הפרדת קו שיער בין הרקמה מדיום מוטבע (פרפין) בבלוק25. אם זה קורה, להמיס את הפרפין סביב הרקמה על ידי הצבתו בפרפין חם והניח אותו בתבנית הפלדה שוב.
במהלך חתך, הלהב חייב להיות חד מספיק כדי לתת רצועות נפרשות של רקמות. אין להשתמש בחלק מסוים של הלהב יותר מ-30 פעמים. אם הבלוק אינו מקטע כראוי, להניח כי הלהב הוא בוטה, ולכן, להחליף אותו או לחדד אותו מחדש. אם הסעיפים אינם נכונים, זה יכול להיות גם בגלל ספיגת פרפין לא נכונה או שימוש בפרפין ישן כדי להפרות ולהכין בלוקים. ניתן להמיס את הפרפין בבלוק, וניתן להשתמש בפרפין טרי להכנת הבלוק. כדי להימנע מהמקטעים הלא אחידים, סובבו את גלגל המיקרוטומיה באיטיות עם סיבובים זוגיים ולא עם תנועות קופצניות ומהירות.
בעת ביצוע כתמי המטוקסילין ואאוזין, אופטימיזציה של הזמן של כתמי המטוקסילין ואאוזין היא קריטית מכיוון שהיא עלולה להוביל לרקמות מתחת או מכתימות יתר על המידה. המסה לא נכונה של פרפין או התייבשות של הרקמה תוביל להכתמה לא אחידה. ניתן להציג אותו באופן חזותי כמקטעים הלבנים בשקופית. מייבשים את הרקמה ושוב ממיסים פרפין בתנור אוויר חם, ואחריו את השלבים המוזכרים בטבלה 1. יתר על כן, אחת השגיאות הנפוצות שבוצעו במהלך כתמי H&E היא השימוש באלכוהול כהתייבשות לאחר כתם אאוזין. שימוש מופרז באלכוהול עלול להוביל להכתמה נמוכה של ציטופלסמה וגופי הכללה שעלולים להוביל לחלקים מוכתמים בצורה גרועה25. השימוש במדיום הראנט צריך להיעשות מיד לאחר הסרת עודף קסילן, ולהימנע ייבוש של קסילן כפי שהוא עלול להוביל עיוות של הרקמה. כמו כן, הראנט על בסיס מימית (כגון גליצרול ב- PBS) יש להימנע כמו הרקמה נמצאת במצב מיובש. הראנט מימית אינו חודר לרקמה ומביא לתמונות מעורפלות.
לאחר אופטימיזציה של כל השלבים שהוזכרו לעיל, החוקרים יוכלו לבצע היסטולוגיה בהצלחה. זה לוקח בערך שלושה כדי fice ניסיונות לבחור את הפתרון הקיבוצי הרצוי ולמטב פרמטרי תהליך אחרים.
התמוטטות מחסום רשתית הדם
הצעד העדין ביותר בטכניקה זו הוא בידוד הזגוגית מהעין. זה מבוצע בצורה הטובה ביותר על עין רעננה. השימוש בקרח יבש מומלץ לבידוד קל של זגוגית, במיוחד אם שרידי הזגוגית מחוברים לרשתית. לעתים קרובות, עדשה או רשתית לערבב עם זגוגית ניתן לזהות על ידי עכירות של זגוגית עקב רשתית. בעיות אלה ניתן להימנע בדרך כלל באמצעות תנאי הקפאה. עם זאת, אם התגים הזגוגיים נמצאים ליד העדשה, הם יכולים להיות מופרדים על ידי חיתוך בצומת של העדשה זגוגית באמצעות מספריים מיקרו. אם הרשתית נשלפת יחד עם הזגוגית, ניתן להסיר את הרשתית חתיכה אחר חתיכה באמצעות מיקרו מלקחיים. השימוש בצנטריפוגת מסנן מוצע גם לבידוד קל של הזגוגית מהעדשה והרשתית26. כמו זגוגית היא מבנה דמוי ג'ל, זה צריך הומוגניזציה לתערובת הומוגנית של חלבונים. בדרך כלל, כאמור בשלב 2.2.1, מחזור הומוגניזציה יחיד מספיק להומוגניזציה נכונה, אשר ניתן לזהות על ידי הנזלה של הומור זגוגי על צנטריפוגציה. אם טבע הג'ל של הזגוגית נצפה לאחר צנטריפוגציה, חזור על הומוגניזציה (שלב 2.2.1). כימות חלבונים יכול להתבצע בכל שיטת ערכה, אך צריך להיות רגיש לזיהוי רמות החלבון הנמוכות בזגוגית עד 2 מיקרוגרם / μL.
אנגיוגרפיה פלואורסצנטית
טכניקה זו שואפת לדמיין את רשת כלי הדם של הרשתית, ולכן, הצבע חייב להגיע באופן שווה ב microvesselsels הרשתית. ניתן למטב שלבים שונים כדי להבטיח זאת, כגון אתר ההזרקה וזמן מחזור הדם. צבע יכול להיות מוזרק באמצעות הזרקת וריד הזנב או הזרקת לב. הזרקת לב סיכונים הזרקת צבע באתר אחר מאשר הלב אם לא מאומן היטב; לכן, הזרקת וריד הזנב עדיפה. עם זאת, זיהוי הווריד לרוחב קל כאשר טבול במים חמים (37-40 מעלות צלזיוס) ומנקה עם 70% אתנול. אתנול מסייע להרחיב את כלי הדם, אשר יכול לעזור בגישה למיקום של הווריד. זה גם חיוני כי הצבע מוזרק לתוך הווריד בלבד. כישלון להזריק צבע לתוך וריד הזנב יכול להיות מורגש על ידי התנגדות בעת הזרקת הצבע או בליטה באזור הסמוך עקב הזרקה תת עורית. המחט ניתן להסיר ולהכניס מחדש באתר אחר של הזנב. הזרקת וריד זנב מוצלחת ניתן גם לדמיין על ידי השתנה כפויה של החולדה; צבע הצבע נראה בשתן חולדה בתוך 30 עד 40 s.
כמו כן, זמן המחזור הוא חיוני; בדרך כלל, 5 עד 10 דקות מספיקים כדי להפיץ צבע בכלי רשתית בהצלחה. הרכבה שטוחה יכולה להיות מוכנה בעין רעננה או בעין קבועה. הכנת הרכבה שטוחה בעין רעננה יכולה להיות מאתגרת, אבל ברגע שליטה, הטכניקה עדיפה ביותר כמו במהלך קיבעון, הצבע מתחיל לדלוף פתרון קבוע27. לכן, קיבעון לא צריך להיות ממושך במשך יותר מ 30 דקות עבור העין כולה. במקרה של קושי להפריד רשתית טרייה, זה יכול אפילו להיות קבוע לתוך פתרון קבוע (4% פורמלדהיד) לאחר הפרדת הכוס האחורית מן הכוס הקדמית במשך 15 עד 20 דקות. לעתים קרובות נראה כי הצבע דולף מכלי הדם לתוך הרקמה שמסביב, אפילו ברשתית בריאה. זה יכול להיות בגלל קיבעון עודף; לפיכך, הזמן הדרוש לקיבעון צריך להיות ממוטב. זה רק משפר את הבידוד הקל של הרשתית ושומר על המבנה לשימוש עתידי. יתר על כן, זמן מחזור מוגבר של צבע אצל החיה עשוי גם להוביל דליפת צבע מכלי רשתית לרקמה שמסביב, אשר צריך להיות אופטימיזציה.
גודל של FITC-dextran הוא חיוני כמו צבע משקל מולקולרי גבוה יותר לא ייכנסו vasculatures מיקרו. לעומת זאת, צבע משקל מולקולרי נמוך יותר ידלוף מכלים חדשים של הרשתית הבריאה28. לכן, FITC-dextran עם משקל מולקולרי של 70 kD עדיף לבצע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית, כדי לדמיין דליפה וכלי דם ברשתית. עם זאת, מגבלה משמעותית של טכניקה זו היא משך ההתפתחות של neovascularization בחולדות סוכרת ואת ההליך הפולשני של המחקר, אשר יכול להיות מוחלף בעתיד על ידי טכניקות לא פולשניות כגון אלקטרורטינוגרמה, פונדוס, ומכשירים אופטיים לא פולשניים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
מחברים רוצים להכיר המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR; ITR-2020-2882) למימון תמיכה לד"ר נירמל ג'יי. ברצוננו גם להודות למענק האוניברסיטה של הנציבות על מתן מלגת מחקר זוטרה למנשה מלאני ולמתקן המעבדה האנליטית המרכזית, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד על אספקת מתקן תשתיתי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
