Summary
Diabetisk retinopati er en af de førende årsager til blindhed. Histologi, blod-retinal barriere nedbrydning assay og fluorescens angiografi er værdifulde teknikker til at forstå nethinden patofysiologi, hvilket yderligere kan forbedre den effektive lægemiddelscreening mod diabetisk retinopati.
Abstract
En bageste segment øjensygdom som diabetisk retinopati ændrer nethindens fysiologi. Diabetisk retinopati er kendetegnet ved en retinal løsrivelse, nedbrydning af blod-retinal barrieren (BRB) og retinal angiogenese. En in vivo rottemodel er et værdifuldt eksperimentelt værktøj til at undersøge ændringerne i nethindens struktur og funktion. Vi foreslår tre forskellige eksperimentelle teknikker i rottemodellen til at identificere morfologiske ændringer af retinale celler, retinal vaskulatur og kompromitteret BRB. Retinal histologi bruges til at studere morfologien af forskellige retinale celler. Kvantitativ måling udføres også ved retinal celletælling og tykkelsesmåling af forskellige retinale lag. Et BRB-nedbrydningsassay bruges til at bestemme lækage af ekstraokulære proteiner fra plasmaet til glasagtigt væv på grund af nedbrydning af BRB. Fluorescensangiografi bruges til at studere angiogenese og lækage af blodkar ved at visualisere retinal vaskulatur ved hjælp af FITC-dextran farvestof.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) er en af de mest komplekse sekundære komplikationer af diabetes mellitus. Det er også den førende årsag til forebyggelig blindhed i befolkningen i den erhvervsaktive alder verden over. I en nylig metaanalyse af 32,4 millioner blinde var 830.000 (2,6 %) blinde på grund af DR1. Andelen af synstab, der tilskrives diabetes, rangerede syvende i 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnosticeres ved vaskulære abnormiteter i det bageste okulære væv. Klinisk er det opdelt i to faser - Ikke-proliferativ DR (NPDR) og Proliferativ DR (PDR), baseret på vaskularisering i nethinden. Hyperglykæmi betragtes som den potente regulator af DR, da det implicerer flere veje involveret i neurodegeneration4,5, inflammation6,7 og mikrovaskulatur8 i nethinden. Flere metaboliske komplikationer induceret på grund af hyperglykæmi omfatter akkumulering af avancerede glykationsslutprodukter (AGE'er), polyolvej, hexosaminvej og proteinkinase-C-vej. Disse veje er ansvarlige for celleproliferation (endotelceller), migration (pericytter) og apoptose (neurale retinale celler, pericytter og endotelceller) baseret på forskellige stadier af diabetisk retinopati. Disse metaboliske ændringer kan føre til fysiologiske ændringer såsom nethindeløsning, tab af retinale celler, nedbrydning af blod-retinal barrieren (BRB), aneurismer og angiogenese9.
Streptozotocin (STZ) induceret type 1-diabetes er en veletableret og velaccepteret praksis hos rotter til evaluering af diabetespatogenese og dens komplikationer. Diabetogene virkninger af STZ skyldes selektiv destruktion af bugspytkirteløen β-celler10. Som følge heraf vil dyrene gennemgå insulinmangel, hyperglykæmi, polydipsi og polyuri, som alle er karakteristiske for human type 1-diabetes mellitus11. Ved svær diabetesinduktion administreres STZ ved 40-65 mg/kg legemsvægt intravenøst eller intraperitonealt i voksenalderen. Efter ca. 72 timer har disse dyr et blodsukkerniveau på over 250 mg/dL10,12.
For at forstå de fysiologiske ændringer i nethinden på grund af neurodegeneration, betændelse og angiogenese bør forskellige teknikker optimeres i eksperimentelle dyremodeller. Strukturelle og funktionelle ændringer i retinale celler og retinale kar kan studeres ved forskellige teknikker såsom histologi, BRB nedbrydning assay, og fluorescens angiografi.
Histologi indebærer undersøgelse af anatomien af celler, væv og organer på mikroskopisk niveau. Det etablerer en sammenhæng mellem strukturen og funktionen af celler / væv. Der udføres flere trin for at visualisere og identificere de mikroskopiske ændringer i vævsstrukturen og derved sammenligne sunde og syge modstykker13. Derfor er det vigtigt at standardisere hvert trin i histologi omhyggeligt. Forskellige trin involveret i retinal histologi er fiksering af prøven, trimning af prøven, dehydrering, clearing, imprægnering med paraffin, paraffinindlejring, sektionering og farvning (Hæmatoxylin og Eosin farvning)13,14.
I en sund nethinde styres transporten af molekyler over nethinden af BRB, der består af endotelceller og pericytter på indersiden og retinale pigmentepitelceller på ydersiden. Imidlertid begynder indre BRB-endotelceller og pericytter at degenerere under den syge tilstand, og BRB kompromitteres også15. På grund af denne BRB-nedbrydning lækker mange molekyler med lav molekylvægt ind i glasagtigt og retinalt væv16. Efterhånden som sygdommen skrider frem, lækker mange andre proteinmolekyler (lav og høj molekylvægt) også ind i glas- og retinalvæv på grund af homeostaseforstyrrelse17. Det fører til forskellige andre komplikationer og i sidste ende makulært ødem og blindhed. Derfor, kvantificere proteinniveauerne i glaslegemet og sammenligne sunde og diabetiske tilstande foranstaltninger kompromitteret BRB.
Fluorescensangiografi er en teknik, der bruges til at studere blodcirkulationen i nethinden og choroid ved hjælp af fluorescerende farvestof. Det bruges til at visualisere vaskulatur i nethinden og choroid ved at injicere fluoresceinfarvestof via intravenøs vej eller hjerteinjektion18. Når farvestoffet er injiceret, når det først retinale arterier, efterfulgt af retinale vener. Denne cirkulation af farvestof afsluttes normalt inden for 5 til 10 minutter fra injektionen af farvestof19. Det er en vigtig teknik til at diagnosticere forskellige posterior segment okulære sygdomme, herunder diabetisk retinopati og choroidal neovaskularisering20. Det hjælper med at opdage større og mindre vaskulaturændringer i normale og syge forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger alle retningslinjerne for dyrepleje fra Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinal histologi
- Enukleation og fiksering af øjet
- Aflive en 2 til 3 måneder gammel diabetisk Wistar hanrotte sammen med den aldersmatchede kontrol (14 til 15 uger gammel) ved hjælp af en høj dosis pentobarbital (150 mg / kg) injiceret gennem intraperitonealvejen. Intet påviseligt hjerteslag bekræfter dødsfaldet inden for 2-5 minutter.
- Enukleere øjet ved at lave snit ved hjælp af et skalpelblad på øjets nasale og tidsmæssige områder. Skær derefter langs kanterne ved hjælp af tang og mikrosaks for at fjerne øjet fra orbitalstikket.
BEMÆRK: Før du ofrer rotter, skal du holde de fikserende opløsninger klar.
FORSIGTIG: Formaldehyd irriterer hud, øje, næse og luftveje. Det kan også forårsage kræft, da det er en potent hudsensibiliserende. Brug handsker og håndter det under hætten21. - Vask øjet grundigt med 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS) opløsning i en petriskål for at fjerne blod. Fjern det overskydende fedt, der omgiver øjet for nem indtrængning af den fikserende opløsning.
- Placer straks øjet i 5 ml fikseringsopløsning ved hjælp af tang, og sørg for, at det ikke sidder fast på vægge af glashætteglas. Rør forsigtigt i et par sekunder og udskift hætten med korrekt mærkning. Inkuber øjet i fiksativ opløsning i 24 til 48 timer under mørke forhold ved stuetemperatur.
- Trimning af væv
- Efter fiksering fjernes øjet fra den fikserende opløsning, vaskes med 10 ml PBS, og det anbringes i en petriskål indeholdende 10 ml PBS kølet ved 4 °C.
- Brug mikro tang til at holde øjet med synsnerven og lave et nick på pars plana ved hjælp af mikrosaks. Skær gennem hele hornhindens margen for at adskille den forreste kop af et øje. Brug tang til at vælge linsen forsigtigt, kassere den og skære synsnerven.
- Brug buet mikrosaks til at lave en langsgående del af den bageste øjenkop, der passerer gennem den optiske skive, der deler den i to halvdele. Placer det i bunden af kassetten, og luk låget ordentligt uden forstyrrelse af vævet. Mærk kassetterne med vævsprøvens navn og dato.
- Dehydrering, rydning og paraffinimprægnering af væv
- Dehydrer det trimmede væv ved gradvis overførsel i 80 ml på 50%, 70%, 90% og 100% ethanol. Mens du overfører kassetterne fra en koncentration til en anden, skal du sørge for at duppe dem på rent silkepapir for at minimere forurening.
BEMÆRK: Lad vævet stå i hver overførsel i 30 minutter (to gange). Den samlede tid, der forbruges for dette trin, er ca. 4 timer. - Ved dehydrering overføres kassetterne til 80 ml xylen i 30 minutter (to gange) for at erstatte ethanolen med xylen.
BEMÆRK: Efter inkubation med xylen bliver vævet gennemskinneligt.
FORSIGTIG: Xylen er en aromatisk forbindelse med en benzenring. Det irriterer øjet og slimhinden og kan også forårsage depressioner. - Til sidst imprægneres vævet med forvarmet paraffin ved 60 °C for at erstatte xylen i vævet. Dup kassetterne flere gange på silkepapir for at minimere xylenindholdet, og anbring dem i 200 ml paraffin (væske ved 60 °C) i 2 timer (1 time x 2).
FORSIGTIG: Undgå at indånde smeltet paraffin, da det producerer små lipiddråber, som kan forårsage åndedrætsbesvær.
- Dehydrer det trimmede væv ved gradvis overførsel i 80 ml på 50%, 70%, 90% og 100% ethanol. Mens du overfører kassetterne fra en koncentration til en anden, skal du sørge for at duppe dem på rent silkepapir for at minimere forurening.
- Indlejring af paraffin
- Tænd paraffinindlejringsmaskinen mindst 1 time før brug for at smelte paraffinen, og for at stationerne kan nå de ønskede temperaturer. Fyld en stålform med smeltet paraffinvoks ved at placere den på en varm overflade, og fjern derefter en kassette ad gangen fra paraffinbeholderen.
- Flyt stålformen fra en varm til en kold overflade (4 °C). På dette tidspunkt begynder voksen i formen at størkne. Før det størkner helt, skal du placere vævet i voks ved hjælp af tang og orientere vævet, så den optiske skivedel af den bageste kop vender mod bunden af formen.
BEMÆRK: Sørg for, at vævet ikke bevæger sig, og hold den ønskede orientering. Hvis ikke, skal du sætte formen tilbage på den varme arbejdsflade, indtil hele paraffinen flyder, og start derefter igen med trin 1.4.2. - Når voksen i formen begynder at størkne, skal du straks placere kassettebunden oven på formen. Fyld forsigtigt formen med paraffin over kassettens overkant og overfør den langsomt til en kold overflade (nær -20 °C) for hurtig størkning. Indtil den størkner, gentages processen med andre kassetter fra trin 1.4.2.
- Når alle forme er størknet, adskilles stålformen fra kassetten. Hvis det er svært, skal du vente lidt længere og prøve igen (fjern det ikke kraftigt). Adskillelse bliver lettere ved fuldstændig størkning. Nu bliver kassetten bunden af paraffinblokken, der skal holdes under sektionering med mikrotome.
BEMÆRK: Denne blok kan opbevares ved stuetemperatur til videre brug. På dette tidspunkt kan processen stoppes og fortsættes senere (hvis nødvendigt).
- Skæring
- Installer et engangsmikrotomerblad i klingeholderen. Fjern overskydende paraffinvoks omkring kassetter, så både de øvre og nedre dele af blokkene forbliver parallelle med kniven. Sæt blokken på kassetteholderen.
- Lås håndhjulet op for at fremme det, indtil blokkens overflade er i kontakt med knivens kant. Trim overskydende paraffinvoks på blokken, indtil vævet er visualiseret på overfladen af blokken. Indstil sektionstykkelsen til 5 μm og skær et bånd på fem til seks sektioner.
- Brug tang til forsigtigt at overføre båndet til overfladen af det forvarmede vandbad (ca. 50 °C) for at folde båndet ud. Saml sektioner på en glasrutsjebane belagt med Mayers albumin ved at holde diaset under sektionen. Løft forsigtigt sektionerne, og lad gliderne tørre vandret natten over ved 37 °C.
BEMÆRK: Dias kan opbevares ved stuetemperatur i tørre kasser i flere måneder. På dette trin kan processen stoppes og fortsættes senere.
- Farvning
- Opvarm de dias, der skal farves i en varmluftsovn ved 60 °C i 1 time før brug, så paraffinen kan smelte, og følg trinnene som nævnt i tabel 1.
FORSIGTIG: Hæmatoxylin og Eosin pletter er giftige, når de indåndes eller indtages. De er blevet rapporteret at være kræftfremkaldende.
- Opvarm de dias, der skal farves i en varmluftsovn ved 60 °C i 1 time før brug, så paraffinen kan smelte, og følg trinnene som nævnt i tabel 1.
| Reagens | Ståtid | Gentagelse (antal gange) |
| Xylen | 5 minutter | 2 |
| 100% ethanol | 5 minutter | 2 |
| 90% ethanol | 5 minutter | 2 |
| 70% ethanol | 5 minutter | 2 |
| 50% ethanol | 5 minutter | 2 |
| Vand | 5 minutter | 2 |
| Hæmatoxylin | 4 minutter | 1 |
| Vand vask | ||
| 1% Syrealkohol i 70% ethanol | 30 s | 1 |
| Vand vask | ||
| Scotts vand | 1 minut | 1 |
| Vand vask | ||
| 50% ethanol | 1 minut | 1 |
| 95% ethanol | 1 minut | 1 |
| 0,25% Eosin | 5 s | 1 |
| Vand vask | ||
| Vand | 2 minutter | 1 |
| 95% ethanol | 1 minut | 1 |
| 100% ethanol | 1 minut | 1 |
| Xylen | 5 minutter | 2 |
| Mountant og coverslip | ||
Tabel 1. Hematoxylin og Eosin farvning procedure
2. Blod-hjerne barriere nedbrydning assay
- Blod og glasagtig indsamling
- Anæstesi en 2 til 3 måneder gammel diabetisk Wistar hanrotte sammen med aldersmatchet kontrol (14 til 15 uger) ved hjælp af ketamin (80 mg / kg) og xylazin (8 mg / kg). Bekræft bedøvelsestilstanden ved hjælp af pedal tilbagetrækningsrefleks (tåklemme). Opsaml straks 1 ml blod ved hjertepunktering i et ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) belagt rør for at adskille plasma fra fuldblod.
- Aflive rotten ved hjælp af en høj dosis pentobarbital (150 mg/kg), injiceret gennem intraperitoneal vej. Intet påviseligt hjerteslag bekræfter dødsfaldet inden for 2-5 minutter. Enukleere øjet og straks placere det på tøris.
- Læg øjet i en ren petriskål over tøris (anbefales) og begynd at dissekere øjet som nævnt i trin 1.2.2.
- Fjern linsen, træk glaslegemet forsigtigt fra den bageste kop ved hjælp af mikrobik og læg det i et homogeniseringsrør indeholdende tre til fire glasperler (2-4 mm).
BEMÆRK: Dissektion på tøris anbefales, da det er lettere at fjerne linsen, og glaslegemet er lettere under fryseforhold.
- Forberedelse af prøver
- Homogeniser glasagtig humor i en perlehomogenisator ved medium hastighed i 10 s.
- Blod (1 ml) og glasagtige prøver (10-20 μL) overføres til mikrocentrifugerørene og centrifugerer begge prøver ved 5200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: I tilfælde af vellykket homogenisering har glaslegeme ensartet konsistens efter centrifugering. I tilfælde af ikke-ensartet konsistens af glaslegeme gentages imidlertid fra trin 2.2.1 med øget homogeniseringstid. - Saml supernatant fra begge prøver, og fortynd glasagtig humor og plasmaprøver i henholdsvis 1:10 og 1:20 forhold med PBS.
- Proteinkvantificering og glas-plasmaproteinforhold
- For at kvantificere proteinkoncentrationen i glasagtige humor- og plasmaprøver tilsættes 5 μL fortyndede prøver til 250 μL Bradford-reagens, blandes godt og læses absorbansen ved 590 nm inden for 40 minutter.
BEMÆRK: Hvis absorptionsværdien af prøverne er over 1,0, fortyndes prøverne yderligere, og proceduren gentages fra trin 2.2.3. - Normaliser glasproteinniveauet til plasmaproteinniveau fra den samme rotte og mål foldforskellen mellem raske vs. diabetiske rotter.
- For at kvantificere proteinkoncentrationen i glasagtige humor- og plasmaprøver tilsættes 5 μL fortyndede prøver til 250 μL Bradford-reagens, blandes godt og læses absorbansen ved 590 nm inden for 40 minutter.
3. Fluorescensangiografi
- FITC-dextran70000 farvestofinjektion
- Anæstesi en 2 til 3 måneder gammel diabetisk Wistar hanrotte sammen med den aldersmatchede kontrol (14 til 15 uger) ved hjælp af 3% isofluran og bekræft pedaludtagningsrefleksen (tåklemme). Dyp halen i et bægerglas indeholdende varmt vand (37-40 °C). Rengør halen med 70% ethanol, inden farvestoffet injiceres. Find halens laterale vene og markér injektionspositionen i den nederste del af halen.
BEMÆRK: Hvis indsættelsen af nålen mislykkes, skal du prøve at indsætte et andet sted over den aktuelle position (spids til bunden af halen). Det anbefales dog at injicere en gang, da gentagen prikken kan føre til stressudvikling hos rotten, hvilket kan forårsage vasokonstriktion. - 1 ml 50 mg/ml FITC-dextran70000 farvestofopløsning injiceres gennem halevenen, og farvestoffet cirkulerer i 5 minutter. Afliv rotten med en høj dosis pentobarbital (150 mg / kg), injiceret gennem intraperitonealvejen. Intet påviseligt hjerteslag bekræfter dødsfaldet inden for 2-5 minutter. Enukleere øjet som nævnt i trin 1.1.1.
BEMÆRK: Om nødvendigt kan øjet fastgøres i 4% formaldehydopløsning i højst 30 minutter.
- Anæstesi en 2 til 3 måneder gammel diabetisk Wistar hanrotte sammen med den aldersmatchede kontrol (14 til 15 uger) ved hjælp af 3% isofluran og bekræft pedaludtagningsrefleksen (tåklemme). Dyp halen i et bægerglas indeholdende varmt vand (37-40 °C). Rengør halen med 70% ethanol, inden farvestoffet injiceres. Find halens laterale vene og markér injektionspositionen i den nederste del af halen.
- Klargøring af flad montering
- For at forberede flade monteringer skal du holde dissekeringsværktøjerne klar sammen med dias og dæksedler. Læg øjet i en petriskål fyldt med kølet PBS, og begynd at dissekere øjet som nævnt i trin 1.2.2.
- Placer nu spidsen af en spids tang mellem sclera og nethinden. Flyt den forsigtigt langs koppens kant, og sørg for, at nethinden ikke er fastgjort til scleraen på noget tidspunkt. Hvis der er nogen hindring, skal du langsomt skære den del langs fælgen ved hjælp af buet mikrosaks.
- Når det er bekræftet, at nethinden ikke er fastgjort til sclera fra nogen side, skæres nær den optiske skive, hvilket gør et lille hul, således at nethinden helt løsner sig fra scleraen. Skub langsomt nethinden ind i PBS-opløsningen og læg den på et rent fladt dias ved hjælp af en spatel eller tang.
- Brug mikrosaks eller skalpelblade til at foretage mindre snit i retinalvævet og opdele det i fire kvadranter. Sørg for, at snittene er mindst 2 mm væk fra det hul, der efterlades af den optiske skive i midten, som vist i figur 1.
- Fjern overskydende PBS fra vævets sider ved hjælp af 0,2 ml spidser uden at forstyrre den flade montering.
- Anbring en dråbe anti-fading monteringsmedium (50 μL til 100 μL) på en flad montering, dæk med et dækslips, og visualiser straks under et konfokalmikroskop.
BEMÆRK: Oprethold et minimum af lys under hele proceduren.
- Visualisering af fladt beslag
- Visualiser det flade beslag under 10x mål for et konfokalt mikroskop. Udfør feltscanning for at fange hele den flade montering som et enkelt billede. Antallet af fliser afhænger af størrelsen på det retinale flade beslag. Udfør også Z-stabling for at visualisere venerne og arterierne i forskellige foci (foretrukken størrelse for Z-stack er 5 μm, afhængigt af hvilken, antallet af Z-stack trin varierer).
- Brug PMT- og HyD-detektor ved % forstærkning som henholdsvis 700-900 og 100-150. Vælg emissionsområde mellem 510-530 nm for FITC-dextran farvestof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal histologi
I diabetisk nethinden gennemgår retinale celler degeneration. Derudover øges tykkelsen af nethindelagene på grund af ødem22. De billeder, der er opnået efter hematoxylin- og Eosinfarvning, kan bruges til celletal og måling af tykkelsen af forskellige lag, som vist i figur 2 ved hjælp af ImageJ.
Blod-retinal barriere nedbrydning assay
Da BRB er kompromitteret hos diabetiske rotter, bliver lækage fremtrædende, hvilket fører til akkumulering af biomolekyler fra plasma til nethinden og glaslegemet. Hos diabetiske rotter er proteinlækage fra plasma til glaslegeme omkring tre gange højere sammenlignet med raske rotter (figur 3). Protein kan estimeres ved hjælp af en hvilken som helst kit-metode, såsom Lowry-metoden, BCA-metoden (Bicinchoninsyre) eller Bradford-metoden (nævnt i dette papir, afsnit 2.3). Det anbefales at dissekere øjet frisk, da en forsinkelse i behandlingen kan føre til stærk glasagtig vedhæftning med nethinden, hvilket gør det vanskeligt at adskille. Forkert adskillelse af glaslegeme fra nethinden kan føre til falsk-positive resultater.
Fluorescensangiografi
Denne teknik bruges til at visualisere nethindens lækage og vaskulatur, herunder mikro- og makrovaskulatur. Udvælgelsen af størrelsen af FITC-dextran er baseret på dens anvendelse til forskellige undersøgelser. Lavmolekylær FITC-dextran, der spænder fra 4-6 kDa, bruges til at visualisere lækage i vaskulaturen. I modsætning hertil anvendes FITC-dextranmolekyler med høj molekylvægt, der spænder fra 70 kDa til 2 millioner Da, til at visualisere angiogenese. Vellykket injektion af farvestof resulterer i visualisering af hele vaskulaturen af den retinale flade montering, som vist i figur 4. De opnåede billeder efter konfokal mikroskopi kan bruges til at bestemme det areal af vaskulatur, der er optaget i hele nethinden ved hjælp af ImageJ-software til at sammenligne sunde og syge grupper.
Figur 1. Retinal fladmonteret forberedelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Histologi billeder af sund vs. diabetisk nethinden. (A) og (B) repræsenterer H&E-farvede nethindebilleder af kontrol (A) og diabetisk rotte (B) under 40x. Den samlede tykkelse af nethinden og hvert lag øges i diabetiske tilstande (C). Forkortelser: PRL = fotoreceptorlag, ONL = ydre nukleart lag, OPL = ydre plexiformlag, INL = indre nukleart lag, IPL = indre plexiformlag og GCL = Ganglion cellelag. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD. * repræsenterer en signifikant forskel fra kontrolgruppen (P < 0,0001), mens # repræsenterer en signifikant forskel fra kontrolgruppen ved P < 0,05, opnået ved ANOVA-testen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Nedbrydning af blod-retinal barriere hos raske vs. diabetiske rotter. Grafen repræsenterer det glasagtige plasmaproteinforhold mellem raske og diabetiske rotter. Data er repræsenteret som gennemsnitlig ± SEM. * repræsenterer en signifikant forskel fra kontrolgruppen (P < 0,01) opnået ved uparret t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Fluorescensangiografi af retinal vaskulatur. (A) og (B) repræsenterer en flad montering af nethinden visualiseret ved flisescanning og syning af billederne under 10x. (A) repræsenterer kontrol nethinden, (B) repræsenterer diabetisk nethinden. Den hvide pil indikerer lækage. Alle billeder blev opnået ved Z-stack (5 μm tykkelse). Skalabjælkerne i (A) og (B) er 0,5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologi
Retinal histologi udføres for at visualisere de morfologiske ændringer af retinale celler og lag. Forskellige trin, herunder valg af fikseringsopløsning, fikseringsvarighed, dehydrering og paraffinimprægnering, skal optimeres. Vævsstørrelsen må ikke overstige 3 mm, da den fikserende penetration bliver langsom. Det almindeligt anvendte 4% paraformaldehyd fører til nethindeløsning selv i det sunde øje på grund af opløsningens relativt høje osmolaritet sammenlignet med vandig humor og glasagtig humor, hvilket fører til falsk-positive resultater23. Opløsningens høje osmolaritet resulterer i volumenkontraktion og fører til krympning af væv. Den fikserende opløsning, der anvendes i denne protokol, er 1% formaldehyd med 1,25% glutaraldehyd, som har relativt mindre osmolaritet, reducerer vævsforvrængningen, minimerer nethindeløsningen fra retinalpigmentepitellaget og bevarer også strukturen i sin oprindelige tilstand. Et andet valg af fikseringsopløsning er eddikesyre og ethanol med formaldehyd. Sur tilstand af fiksativ opløsning kan hjælpe med hurtig fiksering af væv, mens ethanol forbedrer penetrationen af den fikserende opløsning. Optimering af forholdet mellem ethanol og eddikesyre er imidlertid afgørende, da overskydende koncentration kan føre til henholdsvis krympning eller hævelse af vævet24. Evalueringsparametre for vellykket vævsfiksering omfatter løsrivelse af nethinden, intakte retinale lag og vævskrympning. En anden kritisk faktor under udførelse af fiksering er mængden af fikseringsopløsning, som skal være mindst 20 til 25 gange øjets størrelse for korrekt fiksering25. Derudover er det vigtigt at hvirvle øjeæblet eller vævet, når det overføres fra en opløsning til en anden, så det ikke klæber til bunden eller væggene i beholderen.
Ufuldstændig vævsbehandling, herunder dehydrering og imprægnering med paraffin, kan krympe og tørre væv, som kan visualiseres, når depression opstår på overfladen af blokken. Derudover vil dårlig vævsbehandling også resultere i farvning af sektioner til hvidt, når de udsættes for vand25. Hvis vævet ikke behandles korrekt, kan det tages tilbage gennem xylen for at fjerne paraffin efterfulgt af rehydrering i nedgradering af ethanol (dvs. 100% ethanol, 90% ethanol og 70% ethanol). Gentag igen trinnene fra 1,3 til 1,4 for at forberede paraffinblokke med succes.
Under forberedelsen af paraffinblokke er det vigtigt at sikre, at vævet er omgivet fra alle sider af paraffin, og at der ikke ses luftbobler. Enhver fejl ved forberedelsen af blokken vil føre til mislykket sektionering af væv. Nogle gange bliver den bageste kop foldet under behandlingen; på dette tidspunkt kan det trækkes forsigtigt fra hinanden ved hjælp af tang (i opvarmet paraffin), men ikke i det omfang, det beskadiger vævet. Antag, at vævsorienteringen i stålform ikke er som ønsket, mens paraffinen begynder at størkne; i så fald kan det sættes tilbage til smeltet paraffin og væv for at omorientere vævet for at forberede paraffinblokke. Når du overfører vævet til indlejringsformen, skal du også sikre, at paraffinen omkring vævet ikke størkner. Det skaber en hårlinjeadskillelse mellem vævet og indlejringsmediet (paraffin) i blokken25. Hvis det sker, smeltes paraffinen rundt om vævet ved at placere den i varm paraffin og placere den i stålformen igen.
Under sektionering skal bladet være skarpt nok til at give udfoldede bånd af væv. Brug ikke en bestemt del af bladet mere end 30 gange. Hvis blokken ikke sektioneres korrekt, skal du antage, at bladet er stumpt, og derfor udskifte det eller skærpe det igen. Hvis sektionerne ikke er korrekte, kan det også skyldes forkert paraffinimprægnering eller brugen af gammel paraffin til at imprægnere og forberede blokke. Paraffinen i blokken kan smeltes ned, og frisk paraffin kan bruges til at forberede blokken. For at undgå de ujævne sektioner skal du dreje mikrotomets hjul langsomt med jævne sving i stedet for hurtige, rykkende bevægelser.
Under udførelse af hæmatoxylin og Eosin farvning, optimering af tiden for hæmatoxylin og Eosin plet er kritisk, da det kan føre til under- eller overfarvning væv. Forkert smeltning af paraffin eller rehydrering af vævet vil føre til ujævn farvning. Det kan visualiseres som de hvide sektioner på diaset. Dehydrer vævet, og smelt igen paraffin i en varmluftsovn efterfulgt af de trin, der er nævnt i tabel 1. Desuden er en af de almindelige fejl, der udføres under H & E-farvning, brugen af alkohol som dehydrant efter Eosin-plet. Overdreven brug af alkohol kan føre til underfarvning af cytoplasma og inklusionsorganer, hvilket kan føre til dårligt farvede sektioner25. Brug af mountant medium skal ske umiddelbart efter fjernelse af overskydende xylen og undgå tørring af xylen, da det kan føre til forvrængning af vævet. Vandbaseret monteringsmiddel (såsom glycerol i PBS) skal også undgås, da vævet er i dehydreret tilstand. Vandig baseret mountant trænger ikke ind i vævet og resulterer i uklare billeder.
Efter optimering af alle ovennævnte trin vil forskere være i stand til at udføre histologi med succes. Det tager omkring tre at fice forsøg på at vælge den ønskede fikseringsløsning og optimere andre procesparametre.
Nedbrydning af blod-retinal barriere
Det mest delikate trin i denne teknik er isoleringen af glaslegemet fra øjet. Det udføres bedst på et frisk øje. Brug af tøris anbefales til nem isolering af glaslegeme, især hvis glaslegemet forbliver fastgjort til nethinden. Ofte kan linse eller nethindeblanding med glaslegeme identificeres ved turbiditet af glaslegeme på grund af nethinden. Disse problemer kan normalt undgås ved hjælp af fryseforhold. Men hvis glaslegemerne er ved siden af linsen, kan de adskilles ved at skære i skæringspunktet mellem linsen og glaslegeme ved hjælp af mikrosaks. Hvis nethinden trækker sig ud sammen med glaslegemet, kan nethinden fjernes stykke for stykke ved hjælp af mikropincet. Brugen af filtercentrifugering foreslås også for nem isolering af glaslegemet fra linsen og nethinden26. Da glasagtig er en gelignende struktur, har den brug for homogenisering for en homogen blanding af proteiner. Normalt, som nævnt i trin 2.2.1, er en enkelt homogeniseringscyklus tilstrækkelig til korrekt homogenisering, som kan identificeres ved flydende glasagtig humor ved centrifugering. Hvis glaslegemets gelart observeres efter centrifugering, gentages homogeniseringen (trin 2.2.1). Proteinkvantificering kan udføres ved hjælp af en hvilken som helst kitmetode, men bør være følsom over for påvisning af de lave proteinniveauer i glaslegeme op til 2 μg / μL.
Fluorescensangiografi
Denne teknik har til formål at visualisere nethindens vaskulære netværk, og derfor skal farvestoffet nå jævnt i retinale mikrofartøjer. Forskellige trin kan optimeres for at sikre dette, såsom injektionsstedet og cirkulationstiden. Et farvestof kan injiceres via haleveneinjektion eller hjerteinjektion. Hjerteinjektion risikerer at injicere farvestoffet på et andet sted end hjertet, hvis det ikke er veluddannet; derfor foretrækkes haleveneinjektion. Det er dog let at identificere den laterale vene, når den dyppes i varmt vand (37-40 ° C) og rengøres med 70% ethanol. Ethanol hjælper med at udvide blodkarrene, hvilket kan hjælpe med at få adgang til venens placering. Det er også vigtigt, at farvestoffet kun injiceres i venen. Manglende injektion af farvestof i halevenen kan mærkes ved modstand, mens farvestoffet injiceres eller udbules i det nærliggende område på grund af subkutan injektion. Nålen kan fjernes og genindsættes på et andet sted i halen. Vellykket haleveneinjektion kan også visualiseres ved tvungen vandladning af rotten; farven på farvestoffet er synlig i rotteurin inden for 30 til 40 s.
Cirkulationstiden er også afgørende; normalt er 5 til 10 minutter tilstrækkelige til at cirkulere farvestof i retinale kar med succes. En flad montering kan tilberedes i et frisk øje eller et fast øje. Det kan være en udfordring at forberede et fladt beslag med friske øjne, men når teknikken først er mestret, foretrækkes den mest, da farvestoffet under fiksering begynder at lække i fikseringsopløsning27. Derfor bør fiksering ikke forlænges i mere end 30 minutter for hele øjet. I tilfælde af vanskeligheder med at adskille frisk nethinden kan den endda fastgøres i en fikseringsopløsning (4% formaldehyd) efter adskillelse af den bageste kop fra den forreste kop i 15 til 20 minutter. Det ses ofte, at farvestoffet lækker fra blodkarrene ind i det omgivende væv, selv i sund nethinden. Dette kan skyldes overskydende fiksering; derfor bør den tid, der er nødvendig til fiksering, optimeres. Det forbedrer kun den lette isolering af nethinden og bevarer strukturen til fremtidig brug. Desuden kan øget cirkulationstid for farvestof i dyret også føre til farvestoflækage fra retinale kar til omgivende væv, hvilket skal optimeres.
Størrelsen af FITC-dextran er afgørende, da farvestof med højere molekylvægt ikke kommer ind i mikrovaskulaturer. I modsætning hertil vil farvestof med lavere molekylvægt lække fra nye kar i den sunde nethinde28. Derfor foretrækkes FITC-dextran med en molekylvægt på 70 kD at udføre fluorescensangiografi for at visualisere lækage og vaskulatur i nethinden. En væsentlig begrænsning af denne teknik er imidlertid varigheden af udviklingen af neovaskularisering hos diabetiske rotter og den invasive procedure i undersøgelsen, som i fremtiden kan erstattes af ikke-invasive teknikker såsom elektroretinogram, fundus og andre ikke-invasive optiske instrumenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfattere vil gerne anerkende Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) til finansiering af støtte til Dr. Nirmal J. Vi vil også gerne takke University Grant of Commission for at give Junior Research Fellowship til Manisha Malani og Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus for at levere infrastrukturelle faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
