Summary
La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L'istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l'angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l'efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.
Abstract
Una malattia dell'occhio del segmento posteriore come la retinopatia diabetica altera la fisiologia della retina. La retinopatia diabetica è caratterizzata da un distacco di retina, dalla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e dall'angiogenesi retinica. Un modello di ratto in vivo è un prezioso strumento sperimentale per esaminare i cambiamenti nella struttura e nella funzione della retina. Proponiamo tre diverse tecniche sperimentali nel modello di ratto per identificare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche, della vascolarizzazione retinica e della BRB compromessa. L'istologia retinica viene utilizzata per studiare la morfologia di varie cellule retiniche. Inoltre, la misurazione quantitativa viene eseguita mediante conteggio delle cellule retiniche e misurazione dello spessore di diversi strati retinici. Un test di degradazione BRB viene utilizzato per determinare la perdita di proteine extraoculari dal plasma al tessuto vitreo a causa della rottura di BRB. L'angiografia a fluorescenza viene utilizzata per studiare l'angiogenesi e la perdita dei vasi sanguigni visualizzando la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano.
Introduction
La retinopatia diabetica (DR) è una delle complicanze secondarie più complesse del diabete mellito. È anche la principale causa di cecità prevenibile nella popolazione in età lavorativa in tutto il mondo. In una recente meta-analisi di 32,4 milioni di persone non vedenti, 830.000 (2,6%) persone erano cieche a causa di DR1. La percentuale di perdita della vista attribuita al diabete si è classificata settima nel 2015 all'1,06% (0,15-2,38) a livello globale2,3.
La retinopatia diabetica è diagnosticata da anomalie vascolari nei tessuti oculari posteriori. Clinicamente, è diviso in due fasi: DR non proliferativo (NPDR) e DR proliferativo (PDR), basato sulla vascolarizzazione nella retina. L'iperglicemia è considerata il potente regolatore della DR in quanto coinvolge diversi percorsi coinvolti nella neurodegenerazione4,5, nell'infiammazione6,7 e nella microvascolarizzazione8 nella retina. Molteplici complicanze metaboliche indotte a causa dell'iperglicemia includono l'accumulo di prodotti finali avanzati di glicazione (AGE), la via poliolica, la via esosamina e la via proteina chinasi-C. Queste vie sono responsabili della proliferazione cellulare (cellule endoteliali), della migrazione (periciti) e dell'apoptosi (cellule retiniche neurali, periciti e cellule endoteliali) basate su diversi stadi della retinopatia diabetica. Queste alterazioni metaboliche possono portare a cambiamenti fisiologici come il distacco della retina, la perdita di cellule retiniche, la rottura della barriera emato-retinica (BRB), gli aneurismi e l'angiogenesi9.
Il diabete di tipo 1 indotto da streptozotocina (STZ) è una pratica ben consolidata e ben accettata nei ratti per valutare la patogenesi del diabete e le sue complicanze. Gli effetti diabetogeni della STZ sono dovuti alla distruzione selettiva delle cellule β delle isole pancreatiche10. Di conseguenza, gli animali subiranno carenza di insulina, iperglicemia, polidipsia e poliuria, che sono tutti caratteristici del diabete mellito di tipo 1 umano11. Per l'induzione del diabete grave, STZ viene somministrato a 40-65 mg / kg di peso corporeo per via endovenosa o intraperitoneale durante l'età adulta. Dopo circa 72 ore, questi animali presentano livelli di glucosio nel sangue superiori a 250 mg/dL10,12.
Per comprendere le alterazioni fisiologiche della retina dovute alla neurodegenerazione, all'infiammazione e all'angiogenesi, diverse tecniche dovrebbero essere ottimizzate in modelli animali sperimentali. I cambiamenti strutturali e funzionali nelle cellule retiniche e nei vasi retinici possono essere studiati con varie tecniche come l'istologia, il saggio di degradazione BRB e l'angiografia a fluorescenza.
L'istologia comporta lo studio dell'anatomia di cellule, tessuti e organi a livello microscopico. Stabilisce una correlazione tra la struttura e la funzione delle cellule/tessuti. Vengono eseguiti diversi passaggi per visualizzare e identificare le alterazioni microscopiche nella struttura dei tessuti, confrontando così le controparti sane e malate13. Quindi, è essenziale standardizzare meticolosamente ogni fase dell'istologia. Vari passaggi coinvolti nell'istologia retinica sono la fissazione del campione, il taglio del campione, la disidratazione, la pulizia, l'impregnazione con paraffina, l'incorporamento di paraffina, il sezionamento e la colorazione (colorazione di ematossilina ed eosina)13,14.
In una retina sana, il trasporto di molecole attraverso la retina è controllato da BRB, composto da cellule endoteliali e periciti sul lato interno e cellule epiteliali pigmentate retiniche sul lato esterno. Tuttavia, le cellule endoteliali BRB interne e i periciti iniziano a degenerare durante la condizione di malattia e anche la BRB è compromessa15. A causa di questa rottura del BRB, molte molecole a basso peso molecolare fuoriescono nel tessuto vitreo e retinico16. Con il progredire della malattia, molte altre molecole proteiche (a basso e alto peso molecolare) fuoriescono anche nel tessuto vitreo e retinico a causa di disturbi dell'omeostasi17. Porta a varie altre complicazioni e, infine, edema maculare e cecità. Quindi, quantificare i livelli di proteine nel vitreo e confrontare le misure degli stati sani e diabetici ha compromesso il BRB.
L'angiografia a fluorescenza è una tecnica utilizzata per studiare la circolazione sanguigna della retina e della coroide utilizzando colorante fluorescente. Viene utilizzato per visualizzare la vascolarizzazione della retina e della coroide iniettando colorante alla fluoresceina per via endovenosa o iniezione cardiaca18. Una volta iniettato, il colorante raggiunge prima le arterie retiniche, seguite dalle vene retiniche. Questa circolazione del colorante viene solitamente completata entro 5-10 minuti dall'iniezione del colorante19. È una tecnica importante per diagnosticare varie malattie oculari del segmento posteriore, tra cui la retinopatia diabetica e la neovascolarizzazione coroidale20. Aiuta a rilevare i cambiamenti vascolari maggiori e minori in condizioni normali e malate.
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Protocol
Questo protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali fornite dal Comitato etico istituzionale degli animali, BITS-Pilani, campus di Hyderabad.
1. Istologia retinica
- Enucleazione e fissazione dell'occhio
- Eutanasia di un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo di pari età (da 14 a 15 settimane) utilizzando un'alta dose di pentobarbital (150 mg / kg) iniettato attraverso la via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti.
- Enucleare l'occhio facendo incisioni usando una lama di bisturi sulle regioni nasali e temporali dell'occhio. Quindi tagliare lungo i bordi usando pinze e micro forbici per rimuovere l'occhio dalla cavità orbitale.
NOTA: Prima di sacrificare i ratti, tenere pronte le soluzioni fissative.
ATTENZIONE: La formaldeide irrita la pelle, gli occhi, il naso e le vie respiratorie. Può anche causare il cancro in quanto è un potente sensibilizzante della pelle. Indossare guanti e maneggiarli sotto il cofano21. - Lavare accuratamente l'occhio con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in una capsula di Petri per rimuovere il sangue. Rimuovere il grasso in eccesso che circonda l'occhio per una facile penetrazione della soluzione fissativa.
- Posizionare immediatamente l'occhio in 5 ml di soluzione fissativa con l'aiuto di una pinza e assicurarsi che non sia attaccato alle pareti delle fiale di vetro. Mescolare delicatamente per alcuni secondi e sostituire il tappo con un'etichettatura adeguata. Incubare l'occhio in soluzione fissativa per 24-48 ore in condizioni di buio a temperatura ambiente.
- Taglio del tessuto
- Dopo la fissazione, rimuovere l'occhio dalla soluzione fissativa, lavare con 10 ml di PBS e metterlo in una capsula di Petri contenente 10 ml di PBS refrigerato a 4 °C.
- Usando micro pinze, tieni l'occhio con il nervo ottico e fai un nick a pars plana con l'aiuto di micro forbici. Tagliare l'intero margine della cornea per separare la coppa anteriore di un occhio. Usando la pinza, scegli delicatamente la lente, scartala e taglia il nervo ottico.
- Usando micro forbici curve, crea una sezione longitudinale della oculare posteriore, passando attraverso il disco ottico dividendolo in due metà. Posizionarlo nella base della cassetta e chiudere correttamente il coperchio senza alcun disturbo al tessuto. Etichettare le cassette con il nome e la data del campione di tessuto.
- Disidratazione, pulizia e impregnazione di paraffina del tessuto
- Disidratare il tessuto tagliato mediante trasferimento graduale in 80 ml di etanolo al 50%, 70%, 90% e 100%. Durante il trasferimento delle cassette da una concentrazione all'altra, assicurarsi di tamponarle su carta velina pulita per ridurre al minimo la contaminazione.
NOTA: Lasciare riposare il tessuto in ogni trasferimento per 30 minuti (due volte). Il tempo totale impiegato per questo passaggio è di circa 4 ore. - Dopo la disidratazione, trasferire le cassette in 80 ml di xilene per 30 minuti (due volte) per sostituire l'etanolo con xilene.
NOTA: Dopo l'incubazione con xilene, il tessuto diventa traslucido.
ATTENZIONE: Lo xilene è un composto aromatico con un anello benzenico. Irrita l'occhio e le mucose e può anche causare depressioni. - Infine, impregnare il tessuto con paraffina preriscaldata a 60 °C per sostituire lo xilene nel tessuto. Tamponare le cassette più volte su carta velina per ridurre al minimo il contenuto di xilene e inserire 200 mL di paraffina (liquido a 60 °C) per 2 ore (1 ora x 2).
ATTENZIONE: Evitare di inalare paraffina fusa, in quanto produce minuscole goccioline lipidiche che possono causare disagio respiratorio.
- Disidratare il tessuto tagliato mediante trasferimento graduale in 80 ml di etanolo al 50%, 70%, 90% e 100%. Durante il trasferimento delle cassette da una concentrazione all'altra, assicurarsi di tamponarle su carta velina pulita per ridurre al minimo la contaminazione.
- Incorporamento di paraffina
- Accendere la macchina incorporatrice di paraffina almeno 1 ora prima dell'uso per fondere la paraffina e per le stazioni per raggiungere le temperature desiderate. Riempire uno stampo in acciaio con cera di paraffina fusa posizionandolo su una superficie calda, quindi rimuovere una cassetta alla volta dal contenitore di paraffina.
- Spostare lo stampo in acciaio da una superficie calda a una fredda (4 °C). A questo punto, la cera nello stampo inizierà a solidificarsi. Prima che si solidifichi completamente, posizionare il tessuto in cera con l'aiuto di una pinza e orientare il tessuto in modo che la porzione del disco ottico della coppa posteriore sia rivolta verso la base dello stampo.
NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si muova e mantenere l'orientamento desiderato. In caso contrario, rimettere lo stampo sul piano di lavoro caldo fino a quando l'intera paraffina non si liquefa, quindi ricominciare con il passaggio 1.4.2. - Quando la cera nello stampo inizia a solidificarsi, posizionare immediatamente la base della cassetta sopra lo stampo. Riempire con cura lo stampo con paraffina sopra il bordo superiore della cassetta e trasferirlo lentamente su una superficie fredda (vicino a -20 °C) per una rapida solidificazione. Fino a quando non si solidifica, ripetere il processo con altre cassette dal passaggio 1.4.2.
- Una volta solidificati tutti gli stampi, separare lo stampo in acciaio dalla cassetta. Se è difficile, attendi un po 'più a lungo e riprova (non rimuoverlo con forza). La separazione diventa più facile con la completa solidificazione. Ora la cassetta diventa la base del blocco di paraffina da tenere durante il sezionamento per microtomo.
NOTA: questo blocco può essere conservato a temperatura ambiente per un ulteriore utilizzo. A questo punto, il processo può essere interrotto e continuato in seguito (se necessario).
- Taglio
- Installare una lama microtomatica monouso nel supporto della lama. Rimuovere la cera di paraffina in eccesso intorno alle cassette in modo che sia la parte superiore che quella inferiore dei blocchi rimangano parallele al coltello. Montare il blocco sul supporto della cassetta.
- Sblocca il volantino per farlo avanzare fino a quando la superficie del blocco è a contatto con il bordo del coltello. Tagliare la cera di paraffina in eccesso sul blocco fino a quando il tessuto non viene visualizzato sulla superficie del blocco. Impostare lo spessore della sezione a 5 μm e tagliare un nastro da cinque a sei sezioni.
- Utilizzando una pinza, trasferire delicatamente il nastro sulla superficie del bagno d'acqua preriscaldato (circa 50 °C) per aprire il nastro. Raccogli sezioni su una diapositiva di vetro rivestita con l'albumina di Mayer tenendo la diapositiva sotto la sezione. Sollevare delicatamente le sezioni e lasciare asciugare orizzontalmente le diapositive durante la notte a 37 °C.
NOTA: le diapositive possono essere conservate a temperatura ambiente in scatole asciutte per diversi mesi. In questa fase, il processo può essere interrotto e continuato in un secondo momento.
- Macchiatura
- Riscaldare i vetrini da colorare in un forno ad aria calda a 60 °C per 1 ora prima dell'uso per la fusione della paraffina e seguire i passaggi indicati nella tabella 1.
ATTENZIONE: Le macchie di ematossilina ed eosina sono tossiche se inalate o ingerite. Sono stati segnalati come cancerogeni.
- Riscaldare i vetrini da colorare in un forno ad aria calda a 60 °C per 1 ora prima dell'uso per la fusione della paraffina e seguire i passaggi indicati nella tabella 1.
| Reagente | Tempo in piedi | Ripetizione (numero di volte) |
| Xilene | 5 minuti | 2 |
| 100% Etanolo | 5 minuti | 2 |
| 90% Etanolo | 5 minuti | 2 |
| 70% Etanolo | 5 minuti | 2 |
| 50% Etanolo | 5 minuti | 2 |
| Acqua | 5 minuti | 2 |
| Ematossilina | 4 minuti | 1 |
| Lavaggio ad acqua | ||
| 1% Di alcol acido in etanolo al 70% | 30 anni | 1 |
| Lavaggio ad acqua | ||
| L'acqua di Scott | 1 min | 1 |
| Lavaggio ad acqua | ||
| 50% Etanolo | 1 min | 1 |
| 95% Etanolo | 1 min | 1 |
| 0,25% Eosina | 5 s | 1 |
| Lavaggio ad acqua | ||
| Acqua | 2 minuti | 1 |
| 95% Etanolo | 1 min | 1 |
| 100% Etanolo | 1 min | 1 |
| Xilene | 5 minuti | 2 |
| Mountant e coverslip | ||
Tabella 1. Procedura di colorazione di ematossilina ed eosina
2. Analisi della rottura della barriera emato-encefalica
- Raccolta di sangue e vitreo
- Anestetizzare un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo di pari età (da 14 a 15 settimane) usando ketamina (80 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg). Confermare lo stato anestetico mediante riflesso di prelievo del pedale (pizzicamento della punta). Raccogliere immediatamente 1 mL di sangue mediante puntura cardiaca in un tubo rivestito di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per separare il plasma dal sangue intero.
- Eutanasia del ratto utilizzando una dose elevata di pentobarbital (150 mg/kg), iniettata per via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti. Enucleare l'occhio e metterlo immediatamente sul ghiaccio secco.
- Posizionare l'occhio in una capsula di Petri pulita sopra il ghiaccio secco (consigliato) e iniziare a sezionare l'occhio come indicato al punto 1.2.2.
- Rimuovere la lente, estrarre con attenzione il vitreo dalla tazza posteriore usando una micro pinza e posizionarlo in un tubo di omogeneizzazione contenente da tre a quattro perle di vetro (2-4 mm).
NOTA: Si consiglia la dissezione su ghiaccio secco in quanto la rimozione della lente e del vitreo è più facile in condizioni di congelamento.
- Preparazione dei campioni
- Omogeneizzare l'umore vitreo in un omogeneizzatore di perline a velocità media per 10 s.
- Trasferire il sangue (1 mL) e i campioni vitrei (10-20 μL) nelle provette microcentrifuga e centrifugare entrambi i campioni a 5200 x g per 10 min a 4 °C.
NOTA: In caso di omogeneizzazione riuscita, il vitreo ha una consistenza uniforme dopo la centrifugazione. Tuttavia, in caso di consistenza non uniforme del vitreo, ripetere dal punto 2.2.1 con un aumento del tempo di omogeneizzazione. - Raccogliere il surnatante da entrambi i campioni e diluire l'umore vitreo e i campioni di plasma in rapporto 1:10 e 1:20, rispettivamente, con PBS.
- Quantificazione delle proteine e rapporto proteine vitreo-plasmatiche
- Per quantificare la concentrazione proteica nei campioni di umore vitreo e plasma, aggiungere 5 μL di campioni diluiti a 250 μL di reagente bradford, mescolare bene e leggere l'assorbanza a 590 nm entro 40 minuti.
NOTA: se il valore di assorbimento dei campioni è superiore a 1,0, diluire ulteriormente i campioni e ripetere la procedura dal punto 2.2.3. - Normalizzare il livello di proteine vitree a livello di proteine plasmatiche dallo stesso ratto e misurare la differenza di piega tra ratti sani e diabetici.
- Per quantificare la concentrazione proteica nei campioni di umore vitreo e plasma, aggiungere 5 μL di campioni diluiti a 250 μL di reagente bradford, mescolare bene e leggere l'assorbanza a 590 nm entro 40 minuti.
3. Angiografia a fluorescenza
- FITC-dextran70000 iniezione di colorante
- Anestetizzare un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo abbinato all'età (da 14 a 15 settimane) usando il 3% di isoflurano e confermare il riflesso di astinenza del pedale (pizzicamento della punta). Immergere la coda in un becher contenente acqua tiepida (37-40 °C). Pulire la coda con etanolo al 70% prima di iniettare il colorante. Individuare la vena laterale della coda e contrassegnare la posizione di iniezione nella parte inferiore della coda.
NOTA: se l'inserimento dell'ago fallisce, provare a inserire in un'altra posizione sopra la posizione corrente (punta alla base della coda). Tuttavia, si consiglia di iniettare una volta poiché la puntura ripetuta può portare allo sviluppo di stress nel ratto, che potrebbe causare vasocostrizione. - Iniettare 1 mL di 50 mg/mL di soluzione colorante FITC-dextran70000 attraverso la vena della coda e lasciare circolare il colorante per 5 minuti. Eutanasia del ratto con una dose elevata di pentobarbital (150 mg/kg), iniettato per via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco rilevabile conferma la morte entro 2-5 minuti. Enucleare l'occhio come indicato al punto 1.1.1.
NOTA: Se necessario, l'occhio può essere fissato in soluzione di formaldeide al 4%, per non più di 30 minuti.
- Anestetizzare un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo abbinato all'età (da 14 a 15 settimane) usando il 3% di isoflurano e confermare il riflesso di astinenza del pedale (pizzicamento della punta). Immergere la coda in un becher contenente acqua tiepida (37-40 °C). Pulire la coda con etanolo al 70% prima di iniettare il colorante. Individuare la vena laterale della coda e contrassegnare la posizione di iniezione nella parte inferiore della coda.
- Preparazione a montaggio piatto
- Per la preparazione di supporti piatti, tenere pronti gli strumenti di dissezione insieme alle diapositive e alle coperture. Posizionare l'occhio in una capsula di Petri riempita con PBS refrigerato e iniziare a sezionare l'occhio come indicato al punto 1.2.2.
- Ora posiziona la punta di un procipite appuntito tra la sclera e la retina. Spostalo delicatamente lungo tutto il bordo della tazza, assicurandoti che la retina non sia attaccata alla sclera in nessun punto. Se c'è qualche ostruzione, tagliare lentamente quella porzione lungo il bordo usando micro forbici curve.
- Una volta confermato che la retina non è attaccata alla sclera da nessun lato, tagliare vicino al disco ottico, facendo un piccolo foro in modo tale che la retina si stacchi completamente dalla sclera. Spingere lentamente la retina nella soluzione PBS e posizionarla su un vetrino piatto pulito con l'aiuto di una spatola o di una pinza.
- Usando micro forbici o lame di bisturi, fai piccoli tagli nel tessuto retinico, dividendolo in quattro quadranti. Assicurarsi che i tagli siano ad almeno 2 mm di distanza dal foro lasciato dal disco ottico al centro, come mostrato nella Figura 1.
- Rimuovere il PBS in eccesso dai lati del tessuto utilizzando punte da 0,2 ml senza disturbare il supporto piatto.
- Posizionare una goccia di mezzo di montaggio anti-sbiadimento (da 50 μL a 100 μL) su un supporto piatto, coprire con un coperchio e visualizzare immediatamente al microscopio confocale.
NOTA: Mantenere la luce minima durante l'intera procedura.
- Visualizzazione del montaggio piatto
- Visualizza il supporto piatto sotto l'obiettivo 10x di un microscopio confocale. Eseguire la scansione dei riquadri per acquisire l'intero supporto piatto come una singola immagine. Il numero di piastrelle dipende dalle dimensioni del supporto piatto retinico. Inoltre, eseguire Z-stacking per visualizzare le vene e le arterie in diversi focolai (la dimensione preferita per Z-stack è 5 μm, a seconda di quale, il numero di passi Z-stack varia).
- Utilizzare il rilevatore PMT e HyD con guadagno percentuale rispettivamente come 700-900 e 100-150. Scegli l'intervallo di emissione tra 510-530 nm per il colorante FITC-destrano.
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Representative Results
Istologia retinica
Nella retina diabetica, le cellule retiniche subiscono una degenerazione. Inoltre, lo spessore degli strati retinici aumenta a causa dell'edema22. Le immagini ottenute dopo la colorazione di ematossilina ed eosina possono essere utilizzate per il conteggio delle cellule e la misurazione dello spessore di diversi strati, come mostrato nella Figura 2 utilizzando ImageJ.
Analisi di degradazione della barriera emato-retinica
Poiché il BRB è compromesso nei ratti diabetici, la perdita diventa prominente, portando all'accumulo di biomolecole dal plasma alla retina e al vitreo. Nei ratti diabetici, la perdita di proteine dal plasma al vitreo è circa tre volte superiore rispetto ai ratti sani (Figura 3). Le proteine possono essere stimate utilizzando qualsiasi metodo kit come il metodo Lowry, il metodo dell'acido bicinchoninico (BCA) o il metodo Bradford (menzionato in questo articolo, sezione 2.3). Si raccomanda di sezionare nuovamente l'occhio, poiché un ritardo nella lavorazione potrebbe portare a una forte adesione vitrea con la retina, rendendo difficile la separazione. La separazione impropria del vitreo dalla retina può portare a risultati falsi positivi.
Angiografia a fluorescenza
Questa tecnica viene utilizzata per visualizzare la perdita e la vascolarizzazione della retina, compresa la vascolarizzazione micro e macro. La selezione delle dimensioni del FITC-destrano si basa sulla sua applicazione per vari studi. Il FITC-destrano a basso peso molecolare, che va da 4-6 kDa, viene utilizzato per visualizzare le perdite nella vascolarizzazione. Al contrario, le molecole FITC-destrano ad alto peso molecolare, che vanno da 70 kDa a 2 milioni di Da, vengono utilizzate per visualizzare l'angiogenesi. L'iniezione riuscita di colorante si traduce nella visualizzazione dell'intera vascolarizzazione del supporto piatto retinico, come mostrato nella Figura 4. Le immagini ottenute dopo la microscopia confocale possono essere utilizzate per determinare l'area di vascolarizzazione occupata nell'intera retina utilizzando il software ImageJ per confrontare gruppi sani e malati.
Figura 1. Preparazione retinica a montaggio piatto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini istologiche della retina sana vs diabetica. (A) e (B) rappresentano le immagini retiniche colorate di H&E del controllo (A) e del ratto diabetico (B) sotto 40x. Lo spessore complessivo della retina e di ogni strato aumenta nelle condizioni diabetiche (C). Abbreviazioni: PRL = strato fotorecettore, ONL = strato nucleare esterno, OPL = strato plessiforme esterno, INL = strato nucleare interno, IPL = strato plessiforme interno e GCL = strato di cellule gangliari. I dati sono rappresentati come ± SD. * rappresenta una differenza significativa dal gruppo di controllo (P < 0,0001), mentre # rappresenta una differenza significativa dal gruppo di controllo a P < 0,05, ottenuto dal test ANOVA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rottura della barriera emato-retinica in ratti sani vs diabetici. Il grafico rappresenta il rapporto tra proteine plasmatiche vitreali di ratti sani e diabetici. I dati sono rappresentati come ± SEM. * rappresenta una differenza significativa rispetto al gruppo di controllo (P < 0,01) ottenuto mediante t-test spaiato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Angiografia a fluorescenza della vascolarizzazione retinica. (A) e (B) rappresentano un supporto piatto della retina visualizzato dalla scansione delle piastrelle e cucendo le immagini sotto 10x. (A) rappresenta la retina di controllo, (B) rappresenta la retina diabetica. La freccia bianca indica la perdita. Tutte le immagini sono state ottenute da Z-stack (spessore 5 μm). Le barre della scala in (A) e (B) sono di 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Istologia
L'istologia retinica viene eseguita per visualizzare i cambiamenti morfologici delle cellule e degli strati retinici. Vari passaggi, tra cui la scelta della soluzione fissativa, la durata della fissazione, la disidratazione e l'impregnazione di paraffina, devono essere ottimizzati. La dimensione del tessuto non deve superare i 3 mm, poiché la penetrazione fissativa diventa lenta. La paraformaldeide al 4% comunemente usata porta al distacco della retina anche nell'occhio sano a causa dell'osmolarità relativamente elevata della soluzione rispetto all'umore acqueo e all'umore vitreo, che porta a risultati falsi positivi23. L'elevata osmolarità della soluzione provoca una contrazione del volume e porta al restringimento dei tessuti. La soluzione fissativa utilizzata in questo protocollo è l'1% di formaldeide con l'1,25% di glutaraldeide, che ha relativamente meno osmolarità, riduce la distorsione dei tessuti, minimizza il distacco della retina dallo strato epiteliale pigmentato retinico e preserva anche la struttura nel suo stato nativo. Un'altra scelta di soluzione fissativa è l'acido acetico e l'etanolo con formaldeide. La condizione acida della soluzione fissativa può aiutare nella rapida fissazione del tessuto, mentre l'etanolo migliora la penetrazione della soluzione fissativa. Tuttavia, l'ottimizzazione del rapporto tra etanolo e acido acetico è essenziale in quanto l'eccesso di concentrazione può portare a restringimento o gonfiore del tessuto, rispettivamente24. I parametri di valutazione per una corretta fissazione dei tessuti includono il distacco della retina, gli strati retinici intatti e il restringimento dei tessuti. Un altro fattore critico durante l'esecuzione della fissazione è il volume della soluzione fissativa, che dovrebbe essere almeno da 20 a 25 volte la dimensione dell'occhio per una corretta fissazione25. Inoltre, è importante ruotare il bulbo oculare o il tessuto ogni volta che viene trasferito da una soluzione all'altra, in modo che non si attacchi al fondo o alle pareti del contenitore.
L'elaborazione incompleta dei tessuti, compresa la disidratazione e l'impregnazione con paraffina, può restringersi e asciugare il tessuto, che può essere visualizzato quando si verifica la depressione sulla superficie del blocco. Inoltre, una scarsa lavorazione dei tessuti comporterà anche la colorazione delle sezioni in bianco se esposte all'acqua25. Se il tessuto non viene elaborato correttamente, può essere ripreso attraverso lo xilene per rimuovere la paraffina, seguito dalla reidratazione nel downgradient di etanolo (cioè 100% etanolo, 90% etanolo e 70% etanolo). Ancora una volta, ripetere i passaggi da 1,3 a 1,4 per preparare con successo i blocchi di paraffina.
Durante la preparazione dei blocchi di paraffina, è essenziale assicurarsi che il tessuto sia circondato da tutti i lati dalla paraffina e che non si vedano bolle d'aria. Qualsiasi errore nella preparazione del blocco porterà al sezionamento infruttuoso del tessuto. A volte la tazza posteriore viene piegata durante la lavorazione; a questo punto, può essere smontato delicatamente usando una pinza (in paraffina riscaldata) ma non nella misura in cui danneggia il tessuto. Supponiamo che l'orientamento del tessuto nello stampo in acciaio non sia come desiderato mentre la paraffina inizia a solidificarsi; in tal caso, può essere rimesso in paraffina fusa e tessuto per riorientare il tessuto per preparare blocchi di paraffina. Inoltre, durante il trasferimento del tessuto allo stampo incorporante, assicurarsi che la paraffina attorno al tessuto non si solidifichi. Crea una separazione dell'attaccatura dei capelli tra il tessuto e il mezzo incorporante (paraffina) nel blocco25. Se succede, sciogliere la paraffina attorno al tessuto mettendola in paraffina calda e ripostandola nello stampo in acciaio.
Durante il sezionamento, la lama deve essere abbastanza affilata da dare nastri di tessuto spiegati. Non utilizzare una particolare porzione della lama più di 30 volte. Se il blocco non si seziona correttamente, supponiamo che la lama sia smussata e, pertanto, sostituirla o riaffilarla. Se le sezioni non sono corrette, potrebbe anche essere dovuto all'impregnazione impropria della paraffina o all'uso della vecchia paraffina per impregnare e preparare i blocchi. La paraffina nel blocco può essere fusa e la paraffina fresca può essere utilizzata per preparare il blocco. Per evitare le sezioni irregolari, ruotare lentamente la ruota del microtomo con curve uniformi piuttosto che movimenti rapidi e a scatti.
Durante l'esecuzione della colorazione di ematossilina ed eosina, l'ottimizzazione del tempo di colorazione di ematossilina ed eosina è fondamentale in quanto può portare a sotto- o sovra-colorazione dei tessuti. La fusione impropria della paraffina o la reidratazione del tessuto porteranno a una colorazione irregolare. Può essere visualizzato come le sezioni bianche sulla diapositiva. Disidratare il tessuto e sciogliere nuovamente la paraffina in un forno ad aria calda, seguito dai passaggi menzionati nella Tabella 1. Inoltre, uno degli errori comuni eseguiti durante la colorazione H & E è l'uso di alcol come deidrante dopo la colorazione di Eosin. L'uso eccessivo di alcol potrebbe portare a una sottocolorazione del citoplasma e di corpi di inclusione che possono portare a sezioni scarsamente macchiate25. L'uso del mezzo di montaggio deve essere fatto immediatamente dopo aver rimosso lo xilene in eccesso ed evitare l'essiccazione dello xilene in quanto potrebbe portare alla distorsione del tessuto. Inoltre, il montante a base acquosa (come il glicerolo in PBS) deve essere evitato in quanto il tessuto è in uno stato disidratato. Il montante a base acquosa non penetra nel tessuto e si traduce in immagini nebbiose.
Dopo aver ottimizzato tutti i passaggi sopra menzionati, i ricercatori saranno in grado di eseguire con successo l'istologia. Ci vogliono circa tre tentativi per scegliere la soluzione fissativa desiderata e ottimizzare altri parametri di processo.
Rottura della barriera emato-retinica
Il passo più delicato in questa tecnica è l'isolamento del vitreo dall'occhio. È meglio eseguirlo su un occhio fresco. L'uso di ghiaccio secco è raccomandato per un facile isolamento del vitreo, soprattutto se il vitreo rimane attaccato alla retina. Spesso, la lente o la retina si mescolano con il vitreo possono essere identificate dalla torbidità del vitreo dovuta alla retina. Questi problemi di solito possono essere evitati usando condizioni di congelamento. Tuttavia, se i tag vitrei sono accanto alla lente, possono essere separati tagliando all'intersezione tra lente e vitreo usando micro forbici. Se la retina si estrae insieme al vitreo, la retina può essere rimossa pezzo per pezzo usando micro pinze. L'uso della centrifugazione con filtro è consigliato anche per un facile isolamento del vitreo dal cristallino e dalla retina26. Poiché il vitreo è una struttura gelatinosa, ha bisogno di omogeneizzazione per una miscela omogenea di proteine. Di solito, come menzionato nel passaggio 2.2.1, un singolo ciclo di omogeneizzazione è sufficiente per una corretta omogeneizzazione, che può essere identificata dalla liqueficazione dell'umore vitreo alla centrifugazione. Se la natura gelsa del vitreo si osserva dopo la centrifugazione, ripetere l'omogeneizzazione (fase 2.2.1). La quantificazione delle proteine può essere eseguita utilizzando qualsiasi metodo kit, ma dovrebbe essere sensibile al rilevamento dei bassi livelli proteici in vitreo fino a 2 μg / μL.
Angiografia a fluorescenza
Questa tecnica mira a visualizzare la rete vascolare della retina e, quindi, il colorante deve raggiungere uniformemente i microvasi retinici. Vari passaggi possono essere ottimizzati per garantire questo, come il sito di iniezione e il tempo di circolazione. Un colorante può essere iniettato tramite iniezione della vena della coda o iniezione cardiaca. L'iniezione cardiaca rischia di iniettare il colorante in un sito diverso dal cuore se non ben addestrato; pertanto, l'iniezione della vena della coda è preferita. Tuttavia, identificare la vena laterale è facile se immerso in acqua tiepida (37-40 °C) e pulito con etanolo al 70%. L'etanolo aiuta a dilatare i vasi sanguigni, che può aiutare ad accedere alla posizione della vena. È anche essenziale che il colorante venga iniettato solo nella vena. La mancata iniezione di colorante nella vena della coda può essere avvertita dalla resistenza durante l'iniezione del colorante o dal rigonfiamento dell'area vicina a causa dell'iniezione sottocutanea. L'ago può essere rimosso e reinserito in un altro sito della coda. L'iniezione di vena della coda di successo può anche essere visualizzata dalla minzione forzata del ratto; il colore del colorante è visibile nelle urine di ratto entro 30-40 s.
Inoltre, il tempo di circolazione è essenziale; di solito, da 5 a 10 minuti sono sufficienti per far circolare con successo il colorante nei vasi retinici. Una montatura piatta può essere preparata in un occhio fresco o in un occhio fisso. Preparare un supporto piatto in un occhio nuovo può essere impegnativo, ma una volta padroneggiato, la tecnica è la più preferita in quanto durante la fissazione, il colorante inizia a fuoriuscire in soluzione fissativa27. Pertanto, la fissazione non deve essere prolungata per più di 30 minuti per l'intero occhio. In caso di difficoltà a separare la retina fresca, può anche essere fissata in una soluzione fissativa (formaldeide al 4%) dopo aver separato la tazza posteriore dalla tazza anteriore per 15-20 minuti. Si vede spesso che il colorante fuoriesce dai vasi sanguigni nel tessuto circostante, anche nella retina sana. Ciò potrebbe essere dovuto a un eccesso di fissazione; quindi, il tempo necessario per la fissazione dovrebbe essere ottimizzato. Migliora solo il facile isolamento della retina e preserva la struttura per un uso futuro. Inoltre, l'aumento del tempo di circolazione del colorante nell'animale può anche portare a perdite di colorante dai vasi retinici al tessuto circostante, che deve essere ottimizzato.
La dimensione del FITC-destrano è essenziale in quanto il colorante a peso molecolare più elevato non entrerà nelle micro vascolarizzazioni. Al contrario, il colorante a basso peso molecolare fuoriuscirà dai nuovi vasi della retina sana28. Pertanto, FITC-destrano con un peso molecolare di 70 kD è preferito per eseguire angiografia a fluorescenza, per visualizzare perdite e vascolarizzazione nella retina. Tuttavia, una limitazione significativa di questa tecnica è la durata dello sviluppo della neovascolarizzazione nei ratti diabetici e la procedura invasiva dello studio, che potrebbe essere sostituita in futuro da tecniche non invasive come l'elettroretinogramma, il fondo oculare e altri strumenti ottici non invasivi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere l'Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) per il sostegno finanziario al Dr. Nirmal J. Vorremmo anche ringraziare la university grant of Commission per aver fornito una junior research fellowship a Manisha Malani e central analytical laboratory facility, BITS-Pilani, hyderabad campus per aver fornito strutture infrastrutturali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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