Summary
A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.
Abstract
Uma doença ocular do segmento posterior como a retinopatia diabética altera a fisiologia da retina. A retinopatia diabética é caracterizada por um descolamento da retina, quebra da barreira hemistê-retinária (BRB) e angiogênese da retina. Um modelo de rato in vivo é uma ferramenta experimental valiosa para examinar as mudanças na estrutura e função da retina. Propomos três técnicas experimentais diferentes no modelo de ratos para identificar alterações morfológicas das células da retina, vasculatura da retina e BRB comprometido. A histologia da retina é usada para estudar a morfologia de várias células da retina. Além disso, a medição quantitativa é realizada pela contagem de células da retina e medição da espessura de diferentes camadas de retina. Um ensaio de avaria brb é usado para determinar o vazamento de proteínas extraoculares do plasma para tecido vítreo devido à quebra do BRB. A angiografia da fluorescência é usada para estudar angiogênese e vazamento de vasos sanguíneos visualizando vasculatura de retina usando corante FITC-dextran.
Introduction
A retinopatia diabética (DR) é uma das complicações secundárias mais complexas do diabetes mellitus. É também a principal causa de cegueira evitável na população em idade de trabalhar em todo o mundo. Em uma meta-análise recente de 32,4 milhões de pessoas cegas, 830.000 (2,6%) pessoas ficaram cegas devido ao DR1. A proporção de perda de visão atribuída ao diabetes ficou em sétimo lugar em 2015, com 1,06% (0,15-2,38) globalmente 2,3.
A retinopatia diabética é diagnosticada por anormalidades vasculares nos tecidos oculares posteriores. Clinicamente, é dividido em duas etapas - DR não proliferativa (NPDR) e DR Proliferativa (PDR), com base na vascularização na retina. A hiperglicemia é considerada o potente regulador da DR, pois implica várias vias envolvidas na neurodegeneração4,5, inflamação6,7 e microvasculatura8 na retina. Múltiplas complicações metabólicas induzidas devido à hiperglicemia incluem o acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs), via poliol, via hexosamina e via proteína quinase-C. Essas vias são responsáveis pela proliferação celular (células endoteliais), migração (pericítos) e apoptose (células neurais da retina, pericítes e células endoteliais) com base em diferentes estágios de retinopatia diabética. Essas alterações metabólicas podem levar a alterações fisiológicas como descolamento da retina, perda de células da retina, quebra da barreira sanguínea-retina (BRB), aneurismas e angiogênese9.
A estreptozotocina (STZ) induzida pelo diabetes tipo 1 é uma prática bem estabelecida e bem aceita em ratos para avaliar a patogênese do diabetes e suas complicações. Os efeitos diabetogênicos da STZ são devido à destruição seletiva da ilhota pancreática β células10. Como resultado, os animais sofrerão deficiência de insulina, hiperglicemia, polidipsia e poliuria, todas características do diabetes mellitus11 humano. Para indução grave de diabetes, a STZ é administrada a 40-65 mg/kg de peso corporal por via intravenosa ou intraperitoneal durante a idade adulta. Após aproximadamente 72 h, esses animais apresentam níveis de glicemia superiores a 250 mg/dL10,12.
Para entender as alterações fisiológicas da retina devido à neurodegeneração, inflamação e angiogênese, diferentes técnicas devem ser otimizadas em modelos animais experimentais. Alterações estruturais e funcionais nas células da retina e vasos da retina podem ser estudadas por várias técnicas como histologia, ensaio de quebra de BRB e angiografia de fluorescência.
A histologia envolve o estudo da anatomia de células, tecidos e órgãos a um nível microscópico. Estabelece uma correlação entre a estrutura e a função das células/tecidos. Várias etapas são realizadas para visualizar e identificar as alterações microscópicas na estrutura tecidual, comparando assim contrapartidas saudáveis e doentes13. Por isso, é essencial padronizar meticulosamente cada passo da histologia. Várias etapas envolvidas na histologia da retina são a fixação do espécime, aparação do espécime, desidratação, clareamento, impregnação com parafina, incorporação, secção e coloração (hemaoxílina e eosina coloração)13,14.
Em uma retina saudável, o transporte de moléculas através da retina é controlado pelo BRB, composto por células endoteliais e pericílitos no lado interno, e células epiteliais de pigmento da retina no lado externo. No entanto, as células endoteliais internas do BRB e os pericítos começam a se degenerar durante a condição doente, e o BRB também está comprometido15. Devido a este colapso do BRB, muitas moléculas de baixo peso molecular vazam em tecido vítreo e retiniano16. À medida que a doença progride, muitas outras moléculas de proteínas (baixo e alto peso molecular) também vazam em tecido vítreo e retiniano devido à perturbação da homeostase17. Leva a várias outras complicações e, em última instância, edema macular e cegueira. Assim, quantificar os níveis de proteína nos estados vítreos e comparar os estados saudáveis e diabéticos comprometeu o BRB.
A angiografia da fluorescência é uma técnica usada para estudar a circulação sanguínea da retina e coroide usando corante fluorescente. É usado para visualizar vasculatura da retina e coroide injetando corante de fluoresceína via rota intravenosa ou injeção cardíaca18. Uma vez que o corante é injetado, ele atinge primeiro as artérias da retina, seguido por veias da retina. Esta circulação de corante é geralmente concluída dentro de 5 a 10 minutos a partir da injeção de corante19. É uma técnica importante para diagnosticar várias doenças oculares posteriores, incluindo retinopatia diabética e neovascularização choroidal20. Ajuda a detectar grandes e pequenas mudanças de vasculatura em condições normais e doentes.
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Protocol
Este protocolo segue todas as diretrizes de cuidados com animais fornecidas pelo Comitê de Ética Animal Institucional, BITS-Pilani, campus Hyderabad.
1. Histologia da retina
- Enucleação e fixação do olho
- Eutanize um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas de idade) usando uma alta dose de pentobarbital (150 mg/kg) injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos.
- Enuclear o olho fazendo incisões usando uma lâmina de bisturi nas regiões nasais e temporais do olho. Em seguida, corte ao longo de suas bordas usando fórceps e micro tesouras para remover o olho da tomada orbital.
NOTA: Antes de sacrificar ratos, mantenha as soluções fixativas prontas.
ATENÇÃO: O formaldeído irrita a pele, o olho, o nariz e o trato respiratório. Também pode causar câncer, pois é um potente sensibilizador da pele. Use luvas e manuseie-o sob o capô21. - Lave bem o olho com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma placa de Petri para remover sangue. Remova o excesso de gordura ao redor do olho para facilitar a penetração da solução fixativa.
- Coloque imediatamente o olho em 5 mL de solução fixa com a ajuda de fórceps, e certifique-se de que ele não está preso às paredes de frascos de vidro. Mexa delicadamente por alguns segundos e substitua a tampa por uma etiqueta adequada. Incubar o olho em solução fixa por 24 a 48 h em condições escuras à temperatura ambiente.
- Corte de tecido
- Após a fixação, retire o olho da solução fixativa, lave com 10 mL de PBS e coloque-o em uma placa de Petri contendo 10 mL de PBS refrigerado a 4 °C.
- Usando micro fórceps, segure o olho com o nervo óptico e faça um corte no pars plana com a ajuda de micro tesouras. Corte toda a margem da córnea para separar a xícara anterior de um olho. Usando fórceps, escolha a lente suavemente, descarte-a e corte o nervo óptico.
- Usando micro tesouras curvas, faça uma seção longitudinal da mandíbula posterior, passando pelo disco óptico dividindo-o em duas metades. Coloque-o na base do e feche a tampa corretamente sem qualquer perturbação ao tecido. Rotule as fitas com o nome e data da amostra de tecido.
- Desidratação, limpeza e impregnação de tecido
- Desidratar o tecido aparado por transferência gradual em 80 mL de 50%, 70%, 90% e 100% etanol. Ao transferir as fitas de uma concentração para outra, certifique-se de desarmá-las em papel de tecido limpo para minimizar a contaminação.
NOTA: Deixe o tecido ficar em cada transferência por 30 minutos (duas vezes). O tempo total consumido para esta etapa é de aproximadamente 4 h. - Após a desidratação, transfira as fitas para 80 mL de xileno por 30 minutos (duas vezes) para substituir o etanol por xileno.
NOTA: Após a incubação com xileno, o tecido se torna translúcido.
ATENÇÃO: O xileno é um composto aromático com um anel de benzeno. Irrita o olho e a membrana mucosa e também pode causar depressões. - Por fim, impregnar o tecido com parafina pré-aquecida a 60 °C para substituir o xileno no tecido. Dab as fitas várias vezes em papel de tecido para minimizar o teor de xileno e colocar em 200 mL de parafina (líquido a 60 °C) por 2 h (1 h x 2).
ATENÇÃO: Evite inalar parafina derretida, pois produz pequenas gotículas lipídicas que podem causar desconforto respiratório.
- Desidratar o tecido aparado por transferência gradual em 80 mL de 50%, 70%, 90% e 100% etanol. Ao transferir as fitas de uma concentração para outra, certifique-se de desarmá-las em papel de tecido limpo para minimizar a contaminação.
- Incorporação de parafina
- Ligue a máquina de incorporação de parafinas pelo menos 1h antes de usar para derreter a parafina e para as estações atingirem as temperaturas desejadas. Encha um molde de aço com cera de parafina derretida colocando-a em uma superfície quente, em seguida, remova uma fita de cada vez do recipiente de parafina.
- Mova o molde de aço de uma superfície quente para uma superfície fria (4 °C). Neste ponto, a cera no molde começará a se solidificar. Antes de solidificar completamente, coloque o tecido na cera com a ajuda de fórceps e oriente o tecido para que a porção do disco óptico do copo posterior esteja voltada para a base do molde.
NOTA: Certifique-se de que o tecido não se move e mantenha a orientação desejada. Se não, coloque o molde de volta na superfície quente de trabalho até que toda a parafina liquefaz, em seguida, comece novamente com o passo 1.4.2. - À medida que a cera no molde começa a se solidificar, coloque imediatamente a base do em cima do molde. Encha cuidadosamente o molde com parafina acima da borda superior do e transfira-o lentamente para uma superfície fria (perto de -20 °C) para solidificação rápida. Até solidificar, repita o processo com outras fitas da etapa 1.4.2.
- Uma vez que todos os moldes são solidificados, separe o molde de aço do. Se for difícil, espere um pouco mais e tente novamente (não remova com força). A separação torna-se mais fácil após a solidificação completa. Agora o se torna a base do bloco de parafina a ser mantido durante a secção por microtome.
NOTA: Este bloco pode ser armazenado à temperatura ambiente para uso posterior. Neste ponto, o processo pode ser interrompido e continuado posteriormente (se necessário).
- Corte
- Instale uma lâmina de microtome descartável no suporte da lâmina. Remova o excesso de cera de parafina em torno de fitas para que as porções superior e inferior dos blocos permaneçam paralelas à faca. Coloque o bloco no porta-fitas.
- Desbloqueie a roda de mão para avançar até que a superfície do bloco esteja em contato com a borda da faca. Corte o excesso de cera de parafina no bloco até que o tecido seja visualizado na superfície do bloco. Coloque a espessura da seção em 5 μm e corte uma fita de cinco a seis seções.
- Com fórceps, transfira suavemente a fita para a superfície do banho de água pré-aquecido (cerca de 50 °C) para desdobrar a fita. Colete seções em um slide de vidro revestido com a albumina de Mayer segurando o slide sob a seção. Levante suavemente as seções e deixe que os slides sequem horizontalmente durante a noite a 37 °C.
NOTA: Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente em caixas secas por vários meses. Nesta etapa, o processo pode ser interrompido e continuado mais tarde.
- Mancha
- Aqueça as lâminas para serem manchadas em um forno de ar quente a 60 °C por 1 h antes de usar para a parafina derreter, e siga os passos mencionados na Tabela 1.
ATENÇÃO: As manchas de hematoxilina e eosina são tóxicas quando inaladas ou ingeridas. Dizem que são cancerígenos.
- Aqueça as lâminas para serem manchadas em um forno de ar quente a 60 °C por 1 h antes de usar para a parafina derreter, e siga os passos mencionados na Tabela 1.
| Reagente | Tempo de parada | Repetição (Número de vezes) |
| Xileno | 5 min. | 2 |
| 100% Etanol | 5 min. | 2 |
| 90% etanol | 5 min. | 2 |
| 70% etanol | 5 min. | 2 |
| 50% etanol | 5 min. | 2 |
| Água | 5 min. | 2 |
| Hematoxilina | 4 min. | 1 |
| Lavagem de água | ||
| 1% Álcool ácido em 70% Etanol | 30 s | 1 |
| Lavagem de água | ||
| Água de Scott | 1 min. | 1 |
| Lavagem de água | ||
| 50% etanol | 1 min. | 1 |
| 95% Etanol | 1 min. | 1 |
| 0,25% Eosin | 5 s | 1 |
| Lavagem de água | ||
| Água | 2 min. | 1 |
| 95% Etanol | 1 min. | 1 |
| 100% Etanol | 1 min. | 1 |
| Xileno | 5 min. | 2 |
| Mountant e deslizamento de cobertura | ||
Mesa 1. Procedimento de coloração de hematoxilina e eosina
2. Ensaio de quebra da barreira hemencefálica
- Coleta de sangue e vítreos
- Anestesia um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas) usando cetamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg). Confirme o estado anestésico por reflexo de retirada de pedal (pinça do dedo do pé). Colete imediatamente 1 mL de sangue por punção cardíaca em um tubo revestido de ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) para separar o plasma do sangue inteiro.
- Eutanize o rato usando uma alta dose de pentobarbital (150 mg/kg), injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos. Enuclear o olho e colocá-lo imediatamente em gelo seco.
- Coloque o olho em uma placa de Petri limpa acima do gelo seco (recomendado) e comece a dissecar o olho como mencionado na etapa 1.2.2.
- Retire a lente, puxe o vítreo cuidadosamente do copo posterior usando micro fórceps e coloque-o em um tubo de homogeneização contendo três a quatro contas de vidro (2-4 mm).
NOTA: Recomenda-se a dissecção em gelo seco, pois a remoção da lente e o vítreo é mais fácil em condições de congelamento.
- Preparação de amostras
- Homogeneize o humor vítreo em um homogeneizador de contas a velocidade média para 10 s.
- Transfira o sangue (1 mL) e amostras vítreas (10-20 μL) para os tubos de microcentrifuuge e centrífuga ambas as amostras a 5200 x g por 10 min a 4 °C.
NOTA: No caso da homogeneização bem sucedida, o vítreo tem consistência uniforme após centrifugação. No entanto, no caso de consistência não uniforme de vítreo, repita a partir da etapa 2.2.1 com maior tempo de homogeneização. - Colecione supernante de ambas as amostras, e diluir amostras de humor vítreo e plasma na razão 1:10 e 1:20, respectivamente, com PBS.
- Quantificação proteica e proporção de proteínas vítreas-plasma
- Para quantificar a concentração de proteínas em amostras de humor vítreo e plasma, adicione 5 μL de amostras diluídas a 250 μL de reagente bradford, misture bem e leia a absorvência em 590 nm dentro de 40 min.
NOTA: Se o valor de absorção das amostras for acima de 1,0, diluir ainda mais as amostras e repetir o procedimento a partir da etapa 2.2.3. - Normalize o nível de proteína vítreo para o nível de proteína plasmática do mesmo rato e meça a diferença de dobra entre ratos saudáveis versus diabéticos.
- Para quantificar a concentração de proteínas em amostras de humor vítreo e plasma, adicione 5 μL de amostras diluídas a 250 μL de reagente bradford, misture bem e leia a absorvência em 590 nm dentro de 40 min.
3. Angiografia da fluorescência
- Injeção de corante FITC-dextran70000
- Anestesia um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas) usando isoflurane de 3% e confirme o reflexo de retirada do pedal (pinça do dedo do pé). Mergulhe a cauda em um béquer contendo água morna (37-40 °C). Limpe a cauda com 70% de etanol antes de injetar o corante. Localize a veia lateral da cauda e marque a posição de injeção na porção inferior da cauda.
NOTA: Se a inserção da agulha falhar, tente inserir em outro local acima da posição atual (ponta para a base da cauda). No entanto, é aconselhável injetar uma vez, pois picadas repetidas podem levar ao desenvolvimento do estresse no rato, o que poderia causar vasoconstrição. - Injete 1 mL de 50 mg/mL FITC-dextran70000 solução de corante através da veia traseira e deixe que o corante circule por 5 minutos. Eutanize o rato com uma alta dose de pentobarbital (150mg/kg), injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detectável confirma a morte dentro de 2-5 minutos. Enuclear o olho como mencionado na etapa 1.1.1.
NOTA: Se necessário, o olho pode ser fixado em solução de formaldeído de 4%, por no máximo 30 min.
- Anestesia um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas) usando isoflurane de 3% e confirme o reflexo de retirada do pedal (pinça do dedo do pé). Mergulhe a cauda em um béquer contendo água morna (37-40 °C). Limpe a cauda com 70% de etanol antes de injetar o corante. Localize a veia lateral da cauda e marque a posição de injeção na porção inferior da cauda.
- Preparação de montagem plana
- Para preparar montagens planas, mantenha as ferramentas de dissecação prontas junto com os slides e tampas. Coloque o olho em uma placa de Petri cheia de PBS refrigerado e comece a dissecar o olho como mencionado na etapa 1.2.2.
- Agora coloque a ponta de um forcep pontiagudo entre a esclera e a retina. Mova-o suavemente ao longo da borda do copo, certificando-se de que a retina não está presa à esclera em nenhum momento. Se houver alguma obstrução, corte lentamente essa porção ao longo da borda usando micro tesouras curvas.
- Uma vez confirmado que a retina não está presa à esclera de qualquer lado, cortada perto do disco óptico, fazendo um pequeno orifício de tal forma que a retina se desprende completamente da esclera. Empurre lentamente a retina para a solução PBS e coloque-a em um escorregador plano limpo com a ajuda de uma espátula ou fórceps.
- Usando micro tesouras ou lâminas de bisturi, faça pequenos cortes no tecido da retina, dividindo-o em quatro quadrantes. Certifique-se de que os cortes estão a pelo menos 2 mm de distância do orifício deixado pelo disco óptico no centro, como mostrado na Figura 1.
- Remova o excesso de PBS das laterais do tecido usando pontas de 0,2 mL sem perturbar o suporte plano.
- Coloque uma gota de meio de montagem anti-desbotamento (50 μL a 100 μL) em uma montagem plana, cubra com um deslizamento de tampa e visualize imediatamente sob um microscópio confocal.
NOTA: Mantenha a luz mínima durante todo o procedimento.
- Visualização da montagem plana
- Visualize a montagem plana sob o objetivo de 10x de um microscópio confocal. Realize a varredura de ladrilhos para capturar toda a montagem plana como uma única imagem. O número de telhas depende do tamanho do suporte plano da retina. Além disso, realize o empilhamento Z para visualizar as veias e artérias em diferentes focos (o tamanho preferido para z-stack é de 5 μm, dependendo do qual, o número de passos de pilha Z varia).
- Use pmt e detector de hd a % ganho como 700-900 e 100-150, respectivamente. Escolha a faixa de emissão entre 510-530 nm para corante FITC-dextran.
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Representative Results
Histologia da retina
Na retina diabética, as células da retina sofrem degeneração. Além disso, a espessura das camadas de retina aumenta devido ao edema22. As imagens obtidas após a coloração de Hematoxilina e Eosina podem ser usadas para contagem de células e medição da espessura de diferentes camadas, como mostrado na Figura 2 usando ImageJ.
Ensaio de quebra da barreira de retina sanguínea
À medida que o BRB é comprometido em ratos diabéticos, o vazamento torna-se proeminente, levando ao acúmulo de biomoléculas do plasma para a retina e vítreos. Em ratos diabéticos, o vazamento de proteínas do plasma para o vítreo é cerca de três vezes maior quando comparado a ratos saudáveis (Figura 3). A proteína pode ser estimada usando qualquer método de kit, como o método Lowry, o método ácido bicinchonínico (BCA) ou o método Bradford (mencionado neste artigo, seção 2.3). Recomenda-se dissecar o olho recentemente, pois um atraso no processamento pode levar a forte adesão vítrea com a retina, dificultando a separação. A separação imprópria de vítreos da retina pode levar a resultados falso-positivos.
Angiografia da fluorescência
Esta técnica é usada para visualizar o vazamento e vasculatura da retina, incluindo micro e macro vasculatura. A seleção do tamanho do FITC-dextran baseia-se em sua aplicação para diversos estudos. O fitc-dextran de baixo peso molecular, variando de 4 a 6 kDa, é usado para visualizar vazamentos na vasculatura. Em contraste, moléculas fitc-dextran de alto peso molecular, variando de 70 kDa a 2 milhões de Da, são usadas para visualizar angiogênese. A injeção bem sucedida de corante resulta na visualização de toda a vasculatura do suporte plano da retina, como mostrado na Figura 4. As imagens obtidas após microscopia confocal podem ser usadas para determinar a área de vasculatura ocupada em toda a retina usando o software ImageJ para comparar grupos saudáveis e doentes.
Figura 1. Preparação de montagem plana da retina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens histologias de retina saudável versus diabética. (A) e (B) representam as imagens de retina manchadas de H&E de controle (A) e rato diabético (B) abaixo de 40x. A espessura geral da retina e cada camada aumenta em condições diabéticas (C). Abreviaturas: PRL = camada fotorreceptora, ONL = camada nuclear externa, OPL = camada plexiforme externa, INL = camada nuclear interna, IPL = camada plexiforme interna e camada celular GCL = Ganglion. Os dados são representados como média ± SD. * representa uma diferença significativa do grupo controle (P < 0,0001), enquanto # representa uma diferença significativa do grupo controle em P < 0,05, obtido pelo teste ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Quebra da barreira de retina sanguínea em ratos saudáveis versus diabéticos. O gráfico representa a proporção de proteína plasmática vítrea de ratos saudáveis versus diabéticos. Os dados são representados como ± SEM. * representa uma diferença significativa em parte do grupo controle (P < 0,01) obtido pelo t-test não verificado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Angiografia de fluorescência da vasculatura da retina. (A) e (B) representam um suporte plano de retina visualizado pela tomografia e costura das imagens abaixo de 10x. (A) representa a retina de controle, (B) representa a retina diabética. A seta branca indica vazamento. Todas as imagens foram obtidas pela pilha Z (5 μm de espessura). As barras de escala em (A) e (B) são de 0,5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Histologia
A histologia retinária é realizada para visualizar as alterações morfológicas das células e camadas da retina. Várias etapas, incluindo escolha de solução fixativa, duração de fixação, desidratação e impregnação de parafina, precisam ser otimizadas. O tamanho do tecido não deve exceder 3 mm, pois a penetração fixa torna-se lenta. O paraformaldeído de 4% comumente utilizado leva ao descolamento da retina mesmo no olho saudável devido à osmolaridade relativamente alta da solução em comparação com o humor aquoso e humor vítreo, o que leva a resultados falso-positivos23. A alta osmolaridade da solução resulta em contração de volume e leva ao encolhimento dos tecidos. A solução fixativa utilizada neste protocolo é 1% formaldeído com glutaraldeído de 1,25%, que tem relativamente menos osmolaridade, reduz a distorção tecidual, minimiza o descolamento da retina da camada epitelial do pigmento da retina e também preserva a estrutura em seu estado natal. Outra opção de solução fixa é o ácido acético e o etanol com formaldeído. A condição ácida de solução fixa pode ajudar na rápida fixação do tecido, enquanto o etanol melhora a penetração da solução fixativa. No entanto, a otimização da razão de etanol e ácido acético é essencial, pois o excesso de concentração pode levar ao encolhimento ou inchaço do tecido, respectivamente24. Os parâmetros de avaliação para fixação bem sucedida do tecido incluem descolamento da retina, camadas intactas da retina e encolhimento tecidual. Outro fator crítico ao realizar a fixação é o volume de solução fixativa, que deve ser pelo menos 20 a 25 vezes o tamanho do olho para fixação adequada25. Além disso, é importante girar o globo ocular ou tecido sempre que transferido de uma solução para outra, para que ele não grude no fundo ou nas paredes do recipiente.
O processamento incompleto do tecido, incluindo desidratação e impregnação com parafina, pode encolher e tecido seco, que pode ser visualizado quando ocorre depressão na superfície do bloco. Além disso, o mau processamento tecidual também resultará na coloração das seções em branco quando expostas à água25. Se o tecido não for processado corretamente, pode ser retirado através do xileno para remover a parafina, seguida de reidratação no downgradient do etanol, (ou seja, 100% etanol, 90% etanol e 70% etanol). Novamente, repita os passos de 1,3 a 1,4 para preparar com sucesso blocos de parafina.
Ao preparar blocos de parafina, é essencial garantir que o tecido seja cercado de todos os lados por parafina e que não sejam vistas bolhas de ar. Qualquer erro na preparação do bloco levará a uma secção mal sucedida do tecido. Às vezes, o copo posterior é dobrado durante o processamento; neste ponto, ele pode ser puxado suavemente separado usando fórceps (em parafina aquecida), mas não na medida em que danifica o tecido. Suponha que a orientação tecidual no molde de aço não seja tão desejada enquanto a parafina começa a se solidificar; nesse caso, pode ser colocado de volta à parafina derretida e tecido para reoientar o tecido para preparar blocos de parafina. Além disso, ao transferir o tecido para o molde de incorporação, certifique-se de que a parafina ao redor do tecido não se solidificar. Cria uma separação entre o tecido e o meio de incorporação (parafina) no bloco25. Se isso acontecer, derreta a parafina ao redor do tecido colocando-a em parafina quente e colocando-a no molde de aço novamente.
Durante a secção, a lâmina deve ser afiada o suficiente para dar fitas desdobradas de tecido. Não utilize uma determinada porção da lâmina mais de 30 vezes. Se o bloco não se forcionar corretamente, assuma que a lâmina está cega e, portanto, substitua-a ou afie-a de refiação. Se as seções não forem adequadas, também pode ser devido à impregnação inadequada de parafina ou ao uso de parafina velha para impregnar e preparar blocos. A parafina no bloco pode ser derretida, e a parafina fresca pode ser usada para preparar o bloco. Para evitar as seções irregulares, gire a roda do microtome lentamente com até mesmo voltas ao invés de movimentos rápidos e irregulares.
Ao realizar a coloração de Hematoxilina e Eosina, a otimização do tempo da hematoxilina e da mancha de Eosin é fundamental, pois pode levar a tecidos sub-ou sobre-manchas. O derretimento inadequado da parafina ou reidratação do tecido levará a coloração desigual. Pode ser visualizado como as seções brancas no slide. Desidratar o tecido e novamente derreter a parafina em um forno de ar quente, seguido pelos passos mencionados na Tabela 1. Além disso, um dos erros comuns cometidos durante a coloração da H&E é o uso de álcool como desidra após a mancha de Eosin. O uso excessivo de álcool pode levar à sub coloração de citoplasma e corpos de inclusão que podem levar a seções mal manchadas25. O uso do meio de montaria deve ser feito imediatamente após a remoção do excesso de xileno, e evitar a secagem do xileno, pois pode levar à distorção do tecido. Além disso, o montador aquoso (como o glicerol na PBS) deve ser evitado, pois o tecido está em estado desidratado. O montador à base de aquoso não penetra no tecido e resulta em imagens nebulosas.
Ao otimizar todas as etapas mencionadas acima, os pesquisadores poderão realizar a histologia com sucesso. São necessárias cerca de três tentativas para escolher a solução fixativa desejada e otimizar outros parâmetros de processo.
Quebra da barreira de retina sanguínea
O passo mais delicado nesta técnica é o isolamento do vítreo do olho. É melhor realizado em um novo olho. Recomenda-se o uso de gelo seco para fácil isolamento de vítreos, especialmente se o vítreo permanecer preso à retina. Muitas vezes, a mistura de lente ou retina com vítreo pode ser identificada pela turbidez do vítreo devido à retina. Esses problemas geralmente podem ser evitados usando condições de congelamento. No entanto, se as etiquetas vítreas estiverem ao lado da lente, elas podem ser separadas cortando na intersecção da lente e vítreas usando micro tesouras. Se a retina sair junto com a vítrea, a retina pode ser removida peça por peça usando micro fórceps. O uso da centrifugação do filtro também é sugerido para fácil isolamento do vítreo da lente e retina26. Como o vítreo é uma estrutura semelhante a gel, precisa de homogeneização para uma mistura homogênea de proteínas. Normalmente, como mencionado na etapa 2.2.1, um único ciclo de homogeneização é suficiente para a homogeneização adequada, que pode ser identificada por liqueficação de humor vítreo após centrifugação. Se a natureza gel do vítreo for observada após a centrifugação, repita a homogeneização (etapa 2.2.1). A quantificação proteica pode ser realizada usando qualquer método de kit, mas deve ser sensível à detecção dos baixos níveis de proteína em vítreos até 2 μg/μL.
Angiografia da fluorescência
Esta técnica visa visualizar a rede vascular da retina e, portanto, o corante deve atingir uniformemente nos microvessels da retina. Várias etapas podem ser otimizadas para garantir isso, como o local de injeção e o tempo de circulação. Um corante pode ser injetado por injeção de veia da cauda ou injeção cardíaca. A injeção cardíaca corre o risco de injetar o corante em um local diferente do coração, se não bem treinado; portanto, a injeção da veia da cauda é preferida. No entanto, identificar a veia lateral é fácil quando mergulhado em água morna (37-40 °C) e limpo com 70% de etanol. O etanol ajuda a dilatar os vasos sanguíneos, o que pode ajudar no acesso à localização da veia. Também é essencial que o corante seja injetado apenas na veia. A não injeção de corante na veia da cauda pode ser sentida pela resistência ao injetar o corante ou abarrotamento da área próxima devido à injeção subcutânea. A agulha pode ser removida e reinserida em outro local da cauda. A injeção bem sucedida da veia da cauda também pode ser visualizada pela urinação forçada do rato; a corante é visível na urina de rato dentro de 30 a 40 s.
Além disso, o tempo de circulação é essencial; geralmente, 5 a 10 min são suficientes para circular corante em vasos de retina com sucesso. Um suporte plano pode ser preparado em um olho fresco ou um olho fixo. Preparar um suporte plano em um olho fresco pode ser desafiador, mas uma vez dominada, a técnica é mais preferida como durante a fixação, o corante começa a vazar em solução fixativa27. Portanto, a fixação não deve ser prolongada por mais de 30 minutos para todo o olho. Em caso de dificuldade em separar a retina fresca, pode até ser fixada em uma solução fixa (4% de formaldeído) depois de separar o copo posterior da xícara anterior por 15 a 20 minutos. É frequentemente visto que o corante vaza dos vasos sanguíneos para o tecido circundante, mesmo em retina saudável. Isso pode ser devido ao excesso de fixação; portanto, o tempo necessário para fixação deve ser otimizado. Ele só aumenta o isolamento fácil da retina e preserva a estrutura para uso futuro. Além disso, o aumento do tempo de circulação de corante no animal também pode levar ao vazamento de corante dos vasos da retina para o tecido circundante, que precisa ser otimizado.
O tamanho do FITC-dextran é essencial, pois o corante de peso molecular mais alto não entrará em micro vasculaturas. Em contraste, o corante de peso molecular mais baixo vazará de novos vasos da retina saudável28. Portanto, fitc-dextran com um peso molecular de 70 kD é preferido para realizar angiografia fluorescência, para visualizar vazamento e vasculatura na retina. No entanto, uma limitação significativa dessa técnica é a duração do desenvolvimento da neovascularização em ratos diabéticos e o procedimento invasivo do estudo, que poderia ser substituído no futuro por técnicas não invasivas como eletroretinograma, fundus e outros instrumentos ópticos não invasivos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer o Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR; ITR-2020-2882) para apoio de financiamento ao Dr. Nirmal J. Gostaríamos também de agradecer à University Grant of Commission por fornecer bolsa de pesquisa júnior a Manisha Malani e ao Centro de Laboratórios Analíticos Centrais, BITS-Pilani, campus hyderabad por fornecer instalações de infraestrutura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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