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Medicine

एक चूहे मॉडल में रेटिना Pathophysiological मूल्यांकन

Published: May 6, 2022 doi: 10.3791/63111
Automatic Translation
1, 1
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

Summary

डायबिटिक रेटिनोपैथी अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है। हिस्टोलॉजी, रक्त-रेटिना बाधा टूटने परख, और प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी रेटिना के पैथोफिजियोलॉजी को समझने के लिए मूल्यवान तकनीकें हैं, जो मधुमेह रेटिनोपैथी के खिलाफ कुशल दवा स्क्रीनिंग को और बढ़ा सकती हैं।

Abstract

डायबिटिक रेटिनोपैथी जैसी एक पश्चवर्ती खंड आंख की बीमारी रेटिना के शरीर विज्ञान को बदल देती है। मधुमेह रेटिनोपैथी को रेटिना टुकड़ी, रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी) के टूटने और रेटिना एंजियोजेनेसिस की विशेषता है। एक इन विवो चूहा मॉडल रेटिना की संरचना और कार्य में परिवर्तन की जांच करने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक उपकरण है। हम रेटिना कोशिकाओं, रेटिना वास्कुलचर, और समझौता किए गए बीआरबी के रूपात्मक परिवर्तनों की पहचान करने के लिए चूहे के मॉडल में तीन अलग-अलग प्रयोगात्मक तकनीकों का प्रस्ताव करते हैं। रेटिना हिस्टोलॉजी का उपयोग विभिन्न रेटिना कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, मात्रात्मक माप रेटिना सेल गिनती और विभिन्न रेटिना परतों की मोटाई माप द्वारा किया जाता है। एक BRB टूटने परख का उपयोग बीआरबी के टूटने के कारण प्लाज्मा से विट्रियस ऊतक के लिए एक्स्ट्राओकुलर प्रोटीन के रिसाव को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी का उपयोग एफआईटीसी-डेक्सट्रान डाई का उपयोग करके रेटिना वास्कुलचर की कल्पना करके एंजियोजेनेसिस और रक्त वाहिकाओं के रिसाव का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

Introduction

मधुमेह रेटिनोपैथी (डीआर) मधुमेह मेलिटस की सबसे जटिल माध्यमिक जटिलताओं में से एक है। यह दुनिया भर में कामकाजी उम्र की आबादी में रोकथाम योग्य अंधापन का प्रमुख कारण भी है। 32.4 मिलियन अंधे लोगों के हाल के मेटा-विश्लेषण में, 830,000 (2.6%) लोग DR1 के कारण अंधे थे। मधुमेह के लिए जिम्मेदार दृष्टि हानि का अनुपात 2015 में वैश्विक स्तर पर 1.06% (0.15-2.38) पर सातवें स्थान पर रहा।

मधुमेह रेटिनोपैथी का निदान पश्चवर्ती ओकुलर ऊतकों में संवहनी असामान्यताओं द्वारा किया जाता है। नैदानिक रूप से, इसे दो चरणों में विभाजित किया गया है - रेटिना में संवहनीकरण के आधार पर गैर-प्रोलिफेरेटिव डीआर (एनपीडीआर) और प्रोलिफेरेटिव डीआर (पीडीआर)। हाइपरग्लाइसेमिया को डीआर का शक्तिशाली नियामक माना जाता है क्योंकि यह रेटिना में न्यूरोडीजेनेरेशन 4,5, सूजन 6,7 और माइक्रोवैस्कुलचर 8 में शामिल कई मार्गों को फंसाता है। हाइपरग्लाइसेमिया के कारण प्रेरित कई चयापचय जटिलताओं में उन्नत ग्लाइकेशन एंड प्रोडक्ट्स (एजीई), पॉलीओल पाथवे, हेक्सोसामाइन पाथवे और प्रोटीन किनेज-सी पाथवे का संचय शामिल है। ये रास्ते मधुमेह रेटिनोपैथी के विभिन्न चरणों के आधार पर सेल प्रसार (एंडोथेलियल कोशिकाएं), प्रवासन (पेरिसाइट), और एपोप्टोसिस (तंत्रिका रेटिना कोशिकाओं, पेरिसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं) के लिए जिम्मेदार हैं। ये चयापचय परिवर्तन रेटिना डिटेचमेंट, रेटिना कोशिकाओं के नुकसान, रक्त-रेटिना बाधा (बीआरबी), एन्यूरिज्म और एंजियोजेनेसिस 9 के टूटने जैसे शारीरिक परिवर्तनों को जन्म दे सकते हैं।

Streptozotocin (एसटीजेड) प्रेरित टाइप -1 मधुमेह मधुमेह रोगजनन और इसकी जटिलताओं का मूल्यांकन करने के लिए चूहों में एक अच्छी तरह से स्थापित और अच्छी तरह से स्वीकृत अभ्यास है। एसटीजेड के डायबेटोजेनिक प्रभाव अग्नाशयी आइलेट β-कोशिकाओं के चयनात्मक विनाश के कारण होते हैं10। नतीजतन, जानवरों को इंसुलिन की कमी, हाइपरग्लाइसीमिया, पॉलीडिप्सिया और पॉलीयूरिया से गुजरना होगा, जिनमें से सभी मानव टाइप -1 मधुमेह मेलिटस 11 की विशेषता हैं। गंभीर मधुमेह प्रेरण के लिए, एसटीजेड को वयस्कता के दौरान 40-65 मिलीग्राम / किलोग्राम शरीर के वजन पर अंतःशिरा या अंतःक्रियात्मक रूप से प्रशासित किया जाता है। लगभग 72 घंटे के बाद, ये जानवर 250 मिलीग्राम / डीएल 10,12 से अधिक रक्त शर्करा के स्तर को प्रस्तुत करते हैं।

न्यूरोडीजेनेरेशन, सूजन और एंजियोजेनेसिस के कारण रेटिना के शारीरिक परिवर्तनों को समझने के लिए, प्रयोगात्मक पशु मॉडल में विभिन्न तकनीकों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। रेटिना कोशिकाओं और रेटिना वाहिकाओं में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन विभिन्न तकनीकों जैसे कि हिस्टोलॉजी, बीआरबी ब्रेकडाउन परख और प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी द्वारा किया जा सकता है।

हिस्टोलॉजी में सूक्ष्म स्तर पर कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों की शरीर रचना का अध्ययन शामिल है। यह कोशिकाओं / ऊतकों की संरचना और कार्य के बीच एक सहसंबंध स्थापित करता है। ऊतक संरचना में सूक्ष्म परिवर्तनों की कल्पना करने और पहचानने के लिए कई चरण किए जाते हैं, जिससे स्वस्थ और रोगग्रस्त समकक्षों की तुलना की जाती है। इसलिए, हिस्टोलॉजी के प्रत्येक चरण को सावधानीपूर्वक मानकीकृत करना आवश्यक है। रेटिना हिस्टोलॉजी में शामिल विभिन्न चरणों में नमूने का निर्धारण, नमूने को ट्रिम करना, निर्जलीकरण, समाशोधन, पैराफिन के साथ गर्भाधान, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और स्टेनिंग (हेमेटोक्सिलिन और इओसिन स्टेनिंग) 13,14 हैं।

एक स्वस्थ रेटिना में, रेटिना में अणुओं के परिवहन को बीआरबी द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो आंतरिक पक्ष पर एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट से बना होता है, और बाहरी तरफ रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाएं होती हैं। हालांकि, आंतरिक बीआरबी एंडोथेलियल कोशिकाएं और पेरिसाइट रोगग्रस्त स्थिति के दौरान विघटित होने लगते हैं, और बीआरबी से भी समझौता किया जाता है। इस बीआरबी टूटने के कारण, कई कम आणविक भार अणु विट्रियस और रेटिना ऊतक 16 में रिसाव करते हैं। जैसे-जैसे रोग बढ़ता है, कई अन्य प्रोटीन अणु (कम और उच्च आणविक वजन) भी होमोस्टैसिस गड़बड़ी के कारण विट्रियस और रेटिना ऊतक में रिसाव करते हैं। यह विभिन्न अन्य जटिलताओं और अंततः धब्बेदार एडिमा और अंधापन की ओर जाता है। इसलिए, विट्रियस में प्रोटीन के स्तर को परिमाणित करना और स्वस्थ और मधुमेह राज्यों के उपायों की तुलना बीआरबी से समझौता करना।

प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी एक तकनीक है जिसका उपयोग फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके रेटिना और कोरॉइड के रक्त परिसंचरण का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इसका उपयोग अंतःशिरा मार्ग या कार्डियक इंजेक्शन 18 के माध्यम से फ्लोरोसीन डाई इंजेक्ट करके रेटिना और कोरॉइड के वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए किया जाता है। एक बार डाई इंजेक्ट किए जाने के बाद, यह पहले रेटिना धमनियों तक पहुंचता है, उसके बाद रेटिना नसों द्वारा। डाई का यह परिसंचरण आमतौर पर डाई 19 के इंजेक्शन से 5 से 10 मिनट के भीतर पूरा हो जाता है। यह मधुमेह रेटिनोपैथी और choroidal neovascularization20 सहित विभिन्न पश्चवर्ती खंड ओकुलर रोगों का निदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। यह सामान्य और रोगग्रस्त स्थितियों में प्रमुख और मामूली वास्कुलचर परिवर्तनों का पता लगाने में मदद करता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल संस्थागत पशु नैतिकता समिति, बिट्स-पिलानी, हैदराबाद परिसर द्वारा प्रदान किए गए सभी पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. रेटिना histology

  1. आंख का न्यूक्लिएशन और निर्धारण
    1. एक 2 से 3 महीने के मधुमेह Wistar पुरुष चूहे के साथ उम्र मिलान नियंत्रण (14 से 15 सप्ताह पुराने) के साथ euthanize pentobarbital (150 मिलीग्राम / किग्रा) की एक उच्च खुराक का उपयोग कर intraperitoneal मार्ग के माध्यम से इंजेक्शन. कोई भी पता लगाने योग्य दिल की धड़कन 2-5 मिनट के भीतर मौत की पुष्टि नहीं करती है।
    2. आंख के नाक और अस्थायी क्षेत्रों पर एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके चीरों को बनाकर आंख को न्यूक्लिएट करें। फिर कक्षीय सॉकेट से आंख को हटाने के लिए संदंश और माइक्रो कैंची का उपयोग करके इसके किनारों के साथ काटें।
      नोट: चूहों का बलिदान करने से पहले, फिक्सेटिव समाधान तैयार रखें।
      सावधानी: फॉर्मेल्डिहाइड त्वचा, आंख, नाक और श्वसन पथ को परेशान करता है। यह कैंसर का कारण भी बन सकता है क्योंकि यह एक शक्तिशाली त्वचा संवेदक है। दस्ताने पहनें और इसे hood21 के नीचे संभालें।
    3. रक्त को हटाने के लिए पेट्री डिश में फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ आंख को अच्छी तरह से धोएं। fixative समाधान के आसान प्रवेश के लिए आंख के आसपास के अतिरिक्त वसा को हटा दें।
    4. तुरंत संदंश की मदद से आंख को फिक्सेटिव समाधान के 5 मिलीलीटर में रखें, और सुनिश्चित करें कि यह कांच की शीशियों की दीवारों से चिपका नहीं है। कुछ सेकंड के लिए धीरे से हिलाएं और उचित लेबलिंग के साथ टोपी को बदलें। कमरे के तापमान पर अंधेरे की स्थिति में 24 से 48 घंटे के लिए फिक्सेटिव समाधान में आंख को इनक्यूबेट करें।
  2. ऊतक की छँटाई
    1. निर्धारण के बाद, आंख को फिक्सेटिव समाधान से हटा दें, पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा पीबीएस के 10 एमएल युक्त पेट्री डिश में रखें।
    2. माइक्रो संदंश का उपयोग करके, ऑप्टिक तंत्रिका के साथ आंख को पकड़ें और माइक्रो कैंची की मदद से पार्स प्लाना पर एक निक बनाएं। एक आंख के पूर्वकाल कप को अलग करने के लिए कॉर्निया के पूरे मार्जिन के माध्यम से काटें। संदंश का उपयोग करके, लेंस को धीरे से चुनें, इसे छोड़ दें, और ऑप्टिक तंत्रिका को काट दें।
    3. घुमावदार माइक्रो कैंची का उपयोग करते हुए, पीछे के आईकप का एक अनुदैर्ध्य खंड बनाएं, ऑप्टिक डिस्क के माध्यम से गुजरते हुए इसे दो हिस्सों में विभाजित करें। इसे कैसेट के आधार में रखें और ऊतक को किसी भी गड़बड़ी के बिना ढक्कन को ठीक से बंद कर दें। ऊतक नमूना नाम और तिथि के साथ कैसेट लेबल.
  3. निर्जलीकरण, समाशोधन, और ऊतक के पैराफिन गर्भाधान
    1. 50%, 70%, 90%, और 100% इथेनॉल के 80 mL में क्रमिक हस्तांतरण द्वारा छंटनी किए गए ऊतक को निर्जलित करें। कैसेट को एक एकाग्रता से दूसरे में स्थानांतरित करते समय, संदूषण को कम करने के लिए उन्हें साफ टिशू पेपर पर थपकी देना सुनिश्चित करें।
      नोट: ऊतक को 30 मिनट (दो बार) के लिए प्रत्येक हस्तांतरण में खड़े होने की अनुमति दें। इस चरण के लिए कुल खपत समय लगभग 4 घंटे है।
    2. निर्जलीकरण पर, कैसेट को 30 मिनट (दो बार) के लिए 80 मिलीलीटर जाइलीन में स्थानांतरित करें ताकि इथेनॉल को जाइलीन के साथ बदल दिया जा सके।
      नोट: जाइलीन के साथ इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक पारभासी हो जाता है।
      सावधानी: Xylene एक बेंजीन अंगूठी के साथ एक सुगंधित यौगिक है। यह आंख और श्लेष्मा झिल्ली को परेशान करता है और अवसाद का कारण भी बन सकता है।
    3. अंत में, ऊतक में जाइलीन को बदलने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म पैराफिन के साथ ऊतक को गर्भवती करें। जाइलीन सामग्री को कम करने के लिए टिशू पेपर पर कई बार कैसेट्स को दबाएं और पैराफिन के 200 मिलीलीटर (60 डिग्री सेल्सियस पर तरल) में 2 ज (1 ज एक्स 2) के लिए रखें।
      सावधानी: पिघले हुए पैराफिन को साँस लेने से बचें, क्योंकि यह छोटे लिपिड बूंदों का उत्पादन करता है जो श्वसन असुविधा का कारण बन सकता है।
  4. पैराफिन एम्बेडिंग
    1. पैराफिन को पिघलाने के लिए उपयोग करने से पहले कम से कम 1 घंटे पैराफिन एम्बेडिंग मशीन को चालू करें और स्टेशनों के लिए वांछित तापमान तक पहुंचने के लिए। पिघले हुए पैराफिन मोम के साथ एक स्टील मोल्ड को गर्म सतह पर रखकर भरें, फिर पैराफिन कंटेनर से एक समय में एक कैसेट को हटा दें।
    2. स्टील मोल्ड को गर्म से ठंडी सतह (4 डिग्री सेल्सियस) पर ले जाएं। इस बिंदु पर, मोल्ड में मोम को ठोस करना शुरू कर देगा। इससे पहले कि यह पूरी तरह से ठोस हो जाए, संदंश की मदद से मोम में ऊतक को रखें और ऊतक को उन्मुख करें ताकि पीछे के कप का ऑप्टिक डिस्क हिस्सा मोल्ड के आधार का सामना कर रहा हो।
      नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक स्थानांतरित नहीं होता है और अपने वांछित अभिविन्यास रखें। यदि नहीं, तो मोल्ड को गर्म काम की सतह पर वापस रखें जब तक कि पूरे पैराफिन लिकेफिज़ न हो जाएं, फिर चरण 1.4.2 के साथ फिर से शुरू करें।
    3. जैसा कि मोल्ड में मोम ठोस होना शुरू हो जाता है, तुरंत मोल्ड के शीर्ष पर कैसेट आधार रखें। कैसेट के ऊपरी किनारे के ऊपर पैराफिन के साथ मोल्ड को ध्यान से भरें और धीरे-धीरे इसे तेजी से ठोसीकरण के लिए ठंडी सतह (-20 डिग्री सेल्सियस के पास) में स्थानांतरित करें। जब तक यह ठोस नहीं हो जाता है, तब तक चरण 1.4.2 से अन्य कैसेट के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।
    4. एक बार जब सभी मोल्ड्स को ठोस कर दिया जाता है, तो स्टील मोल्ड को कैसेट से अलग करें। यदि यह कठिन है, तो थोड़ा लंबा इंतजार करें और फिर से प्रयास करें (इसे बलपूर्वक न निकालें)। पूर्ण ठोसीकरण पर पृथक्करण आसान हो जाता है। अब कैसेट माइक्रोटोम द्वारा सेक्शनिंग के दौरान आयोजित किए जाने वाले पैराफिन ब्लॉक का आधार बन जाता है।
      नोट: इस ब्लॉक को आगे के उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस बिंदु पर, प्रक्रिया को रोका जा सकता है और बाद में जारी रखा जा सकता है (यदि आवश्यक हो)।
  5. अनुभागन
    1. ब्लेड धारक में एक डिस्पोजेबल माइक्रोटोम ब्लेड स्थापित करें। कैसेट के चारों ओर अतिरिक्त पैराफिन मोम को हटा दें ताकि ब्लॉक के ऊपरी और निचले दोनों हिस्से चाकू के समानांतर रहें। कैसेट धारक पर ब्लॉक फिट करें।
    2. इसे आगे बढ़ाने के लिए हाथ-पहिया को अनलॉक करें जब तक कि ब्लॉक की सतह चाकू के किनारे के संपर्क में न हो। ब्लॉक पर अतिरिक्त पैराफिन मोम को ट्रिम करें जब तक कि ऊतक को ब्लॉक की सतह पर कल्पना नहीं की जाती है। अनुभाग मोटाई को 5 μm पर सेट करें और पांच से छह वर्गों का रिबन काटें।
    3. संदंश का उपयोग करके, रिबन को प्रकट करने के लिए रिबन को धीरे-धीरे पूर्व-गर्म पानी के स्नान (लगभग 50 डिग्री सेल्सियस) की सतह पर स्थानांतरित करें। अनुभाग के नीचे स्लाइड को पकड़कर मेयर की एल्ब्यूमिन के साथ लेपित ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को इकट्ठा करें। धीरे से वर्गों को उठाएं और स्लाइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर क्षैतिज रूप से सूखने की अनुमति दें।
      नोट: स्लाइड को कई महीनों के लिए सूखे बक्से में कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस चरण में, प्रक्रिया को रोका जा सकता है और बाद में जारी रखा जा सकता है।
  6. धुंधला
    1. पैराफिन पिघलने के लिए उपयोग करने से पहले स्लाइड को 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए गर्म हवा ओवन में दागने के लिए गर्म करें, और तालिका 1 में उल्लिखित चरणों का पालन करें।
      सावधानी: हेमेटोक्सिलिन और इओसिन दाग विषाक्त होते हैं जब साँस लेते हैं या निगलते हैं। उन्हें कार्सिनोजेनिक बताया गया है।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्थायी समय पुनरावृत्ति (बार की संख्या)
ज़ाइलीन 5 मिनट 2
100% इथेनॉल 5 मिनट 2
90% इथेनॉल 5 मिनट 2
70% इथेनॉल 5 मिनट 2
50% इथेनॉल 5 मिनट 2
पानी 5 मिनट 2
हेमेटोक्सिलिन 4 मिनट 1
पानी धोने
70% इथेनॉल में 1% एसिड अल्कोहल 30 सेकंड 1
पानी धोने
स्कॉट का पानी 1 मिनट 1
पानी धोने
50% इथेनॉल 1 मिनट 1
95% इथेनॉल 1 मिनट 1
0.25% इओसिन 5 सेकंड 1
पानी धोने
पानी 2 मिनट 1
95% इथेनॉल 1 मिनट 1
100% इथेनॉल 1 मिनट 1
ज़ाइलीन 5 मिनट 2
Mountant और coverslip

तालिका 1. Hematoxylin और Eosin धुंधला प्रक्रिया

2. रक्त मस्तिष्क बाधा टूटने परख

  1. रक्त और vitreous संग्रह
    1. केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (8 मिलीग्राम / किग्रा) का उपयोग करके उम्र-मिलान नियंत्रण (14 से 15 सप्ताह) के साथ एक 2 से 3 महीने के मधुमेह Wistar पुरुष चूहे को एनेस्थेटिक करें। पेडल द्वारा एनेस्थेटिक स्थिति की पुष्टि करें पलटा वापस लें (पैर की अंगुली चुटकी)। तुरंत पूरे रक्त से प्लाज्मा को अलग करने के लिए एक ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) लेपित ट्यूब में कार्डियक पंचर द्वारा रक्त के 1 मिलीलीटर इकट्ठा करें।
    2. पेंटोबार्बिटल (150 मिलीग्राम / किग्रा) की उच्च खुराक का उपयोग करके चूहे को euthanize करें, इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है। कोई भी पता लगाने योग्य दिल की धड़कन 2-5 मिनट के भीतर मौत की पुष्टि नहीं करती है। आंख को न्यूक्लिएट करें और तुरंत इसे सूखी बर्फ पर रखें।
    3. सूखी बर्फ (अनुशंसित) के ऊपर एक साफ पेट्री डिश में आंख रखें और चरण 1.2.2 में उल्लिखित आंखों को विच्छेदन करना शुरू करें।
    4. लेंस को हटा दें, सूक्ष्म संदंश का उपयोग करके पीछे के कप से विट्रियस को ध्यान से खींचें और इसे तीन से चार ग्लास मोतियों (2-4 मिमी) वाले एक समरूपता ट्यूब में रखें।
      नोट: सूखी बर्फ पर विच्छेदन की सिफारिश की जाती है क्योंकि लेंस को हटाने और ठंड की स्थिति में विट्रियस आसान होता है।
  2. नमूनों की तैयारी
    1. 10 s के लिए मध्यम गति पर एक मनका homogenizer में vitreous हास्य homogenize.
    2. रक्त (1 एमएल) और विट्रियस नमूने (10-20 μL) को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5200 x g पर दोनों नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: सफल homogenization के मामले में, vitreous centrifugation के बाद एक समान स्थिरता है। हालांकि, vitreous की गैर-समान स्थिरता के मामले में, बढ़े हुए समरूपता समय के साथ चरण 2.2.1 से दोहराएं।
    3. दोनों नमूनों से supernatant ले लीजिए, और पीबीएस के साथ क्रमशः 1: 10 और 1: 20 अनुपात में vitreous हास्य और प्लाज्मा नमूनों को पतला।
  3. प्रोटीन परिमाणीकरण और विट्रियस-प्लाज्मा प्रोटीन अनुपात
    1. विट्रियस हास्य और प्लाज्मा नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता को क्वांटिटेट करने के लिए, ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 250 μL में पतला नमूनों के 5 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करें, और 40 मिनट के भीतर 590 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
      नोट:: यदि नमूनों का अवशोषण मान 1.0 से ऊपर है, तो नमूनों को और पतला करें और चरण 2.2.3 से प्रक्रिया को दोहराएँ।
    2. एक ही चूहे से प्लाज्मा प्रोटीन स्तर के लिए vitreous प्रोटीन के स्तर को सामान्य और स्वस्थ बनाम मधुमेह चूहों के बीच गुना अंतर को मापने।

3. प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी

  1. FITC-dextran70000 डाई इंजेक्शन
    1. एनेस्थेटिक एक 2 से 3 महीने के मधुमेह Wistar पुरुष चूहे के साथ-साथ उम्र से मेल खाने वाले नियंत्रण (14 से 15 सप्ताह) 3% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके और पेडल वापसी पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) की पुष्टि करें। पूंछ को गर्म पानी (37-40 डिग्री सेल्सियस) वाले बीकर में डुबोएं। डाई को इंजेक्ट करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ पूंछ को साफ करें। पूंछ की पार्श्व शिरा का पता लगाएं और पूंछ के निचले हिस्से में इंजेक्शन की स्थिति को चिह्नित करें।
      नोट:: यदि सुई का सम्मिलन विफल रहता है, तो वर्तमान स्थिति (पूंछ के आधार के लिए टिप) के ऊपर किसी अन्य स्थान में सम्मिलित करने का प्रयास करें। हालांकि, एक बार इंजेक्ट करने की सलाह दी जाती है क्योंकि बार-बार चुभने से चूहे में तनाव का विकास हो सकता है, जिससे वाहिकासंकीर्णन हो सकता है।
    2. पूंछ नस के माध्यम से 50 मिलीग्राम / एमएल FITC-dextran70000 डाई समाधान के 1 एमएल इंजेक्ट करें और डाई को 5 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें। पेंटोबार्बिटल (150mg / kg) की एक उच्च खुराक के साथ चूहे को Euthanize करें, इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है। कोई भी पता लगाने योग्य दिल की धड़कन 2-5 मिनट के भीतर मौत की पुष्टि नहीं करती है। न्यूक्लिएट आंख के रूप में चरण 1.1.1 में उल्लेख किया गया है।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो आंख को 4% फॉर्मेल्डिहाइड समाधान में तय किया जा सकता है, 30 मिनट से अधिक नहीं के लिए।
  2. फ्लैट माउंट तैयारी
    1. फ्लैट माउंट तैयार करने के लिए, स्लाइड और कवरलिप्स के साथ विच्छेदन उपकरण तैयार रखें। ठंडी पीबीएस से भरे एक पेट्री डिश में आंख रखें और चरण 1.2.2 में उल्लिखित आंख को विच्छेदन करना शुरू करें।
    2. अब स्क्लेरा और रेटिना के बीच एक नुकीले संदंश की नोक रखें। धीरे से इसे कप के रिम के साथ ले जाएं, यह सुनिश्चित करें कि रेटिना किसी भी बिंदु पर स्क्लेरा से जुड़ी नहीं है। यदि कोई बाधा है, तो धीरे-धीरे घुमावदार सूक्ष्म कैंची का उपयोग करके रिम के साथ उस हिस्से को काट लें।
    3. एक बार जब यह पुष्टि हो जाती है कि रेटिना किसी भी तरफ से स्क्लेरा से जुड़ा नहीं है, तो ऑप्टिक डिस्क के पास काट दिया जाता है, जिससे एक छोटा छेद होता है जैसे कि रेटिना पूरी तरह से स्क्लेरा से अलग हो जाता है। धीरे-धीरे रेटिना को पीबीएस समाधान में धकेलें और इसे स्पैटुला या संदंश की मदद से एक साफ फ्लैट स्लाइड पर रखें।
    4. माइक्रो कैंची या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके, रेटिना ऊतक में मामूली कटौती करें, इसे चार चतुर्थांश में विभाजित करें। सुनिश्चित करें कि कटौती केंद्र में ऑप्टिक डिस्क द्वारा छोड़े गए छेद से कम से कम 2 मिमी दूर है, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
    5. फ्लैट माउंट को परेशान किए बिना 0.2 एमएल युक्तियों का उपयोग करके ऊतक के किनारों से अतिरिक्त पीबीएस निकालें।
    6. एक फ्लैट माउंट पर एंटी-लुप्त होती बढ़ते माध्यम (50 μL से 100 μL) की एक बूंद रखें, एक कवरस्लिप के साथ कवर करें, और तुरंत एक confocal माइक्रोस्कोप के नीचे कल्पना करें।
      नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान न्यूनतम प्रकाश बनाए रखें।
  3. फ्लैट माउंट का विज़ुअलाइज़ेशन
    1. एक confocal माइक्रोस्कोप के 10x उद्देश्य के तहत फ्लैट माउंट कल्पना. एक ही छवि के रूप में पूरे फ्लैट माउंट को कैप्चर करने के लिए टाइल स्कैनिंग निष्पादित करें। टाइलों की संख्या रेटिना फ्लैट माउंट के आकार पर निर्भर करती है। इसके अलावा, विभिन्न फोकी में नसों और धमनियों की कल्पना करने के लिए जेड-स्टैकिंग करें (जेड-स्टैक के लिए पसंदीदा आकार 5 μm है, जिसके आधार पर, जेड-स्टैक चरणों की संख्या भिन्न होती है)।
    2. क्रमशः 700-900 और 100-150 के रूप में % लाभ पर PMT और HyD डिटेक्टर का उपयोग करें। FITC-dextran डाई के लिए 510-530 एनएम के बीच उत्सर्जन सीमा चुनें।

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Representative Results

रेटिना हिस्टोलॉजी
मधुमेह रेटिना में, रेटिना कोशिकाएं अध: पतन से गुजरती हैं। इसके अलावा, रेटिना परतों की मोटाई एडिमा 22 के कारण बढ़ जाती है। Hematoxylin और Eosin धुंधला के बाद प्राप्त छवियों का उपयोग सेल गिनती और विभिन्न परतों की मोटाई के माप के लिए किया जा सकता है, जैसा कि ImageJ का उपयोग करके चित्र 2 में दिखाया गया है।

रक्त रेटिना बाधा टूटने परख
जैसा कि बीआरबी को मधुमेह चूहों में समझौता किया जाता है, रिसाव प्रमुख हो जाता है, जिससे प्लाज्मा से रेटिना और विट्रियस तक बायोमोलेक्यूल्स का संचय होता है। मधुमेह चूहों में, स्वस्थ चूहों की तुलना में प्लाज्मा से विट्रियस तक प्रोटीन रिसाव लगभग तीन गुना अधिक होता है (चित्रा 3)। प्रोटीन का अनुमान किसी भी किट विधि का उपयोग करके लगाया जा सकता है जैसे कि लोरी विधि, Bicinchoninic एसिड (BCA) विधि, या ब्रैडफोर्ड विधि (इस पेपर में उल्लिखित, अनुभाग 2.3)। आंख को ताजा विच्छेदन करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि प्रसंस्करण में देरी से रेटिना के साथ मजबूत विट्रियस आसंजन हो सकता है, जिससे इसे अलग करना मुश्किल हो जाता है। रेटिना से विट्रियस के अनुचित अलगाव से झूठे-सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं।

प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी
इस तकनीक का उपयोग रेटिना के रिसाव और वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए किया जाता है, जिसमें सूक्ष्म और मैक्रो वास्कुलचर शामिल हैं। FITC-dextran के आकार का चयन विभिन्न अध्ययनों के लिए इसके आवेदन पर आधारित है। कम आणविक भार FITC-dextran, 4-6 kDa से लेकर, vasculature में रिसाव की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके विपरीत, उच्च आणविक भार FITC-dextran अणुओं, 70 kDa से लेकर 2 मिलियन Da तक, एंजियोजेनेसिस की कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है। डाई के सफल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप रेटिना फ्लैट माउंट के पूरे वास्कुलचर की कल्पना की जाती है, जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है। Confocal माइक्रोस्कोपी के बाद प्राप्त छवियों का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त समूहों की तुलना करने के लिए ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पूरे रेटिना में कब्जा किए गए वास्कुलचर के क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1. रेटिना फ्लैट-माउंट तैयारी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. स्वस्थ बनाम मधुमेह रेटिना के हिस्टोलॉजी छवियों. (ए) और (बी) 40x के तहत नियंत्रण (ए) और मधुमेह चूहे (बी) की एच एंड ई-दाग रेटिना छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। रेटिना की समग्र मोटाई और प्रत्येक परत मधुमेह की स्थिति (सी) में बढ़ जाती है। संक्षेप: PRL = फोटोरिसेप्टर परत, ONL = बाहरी परमाणु परत, OPL = बाहरी plexiform परत, INL = आंतरिक परमाणु परत, आईपीएल = आंतरिक plexiform परत, और GCL = गैंग्लियन सेल परत। डेटा को माध्य ± एसडी के रूप में दर्शाया जाता है। * नियंत्रण समूह (पी < 0.0001) से एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि # एनोवा परीक्षण द्वारा प्राप्त पी < 0.05 पर नियंत्रण समूह से एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. स्वस्थ बनाम मधुमेह चूहों में रक्त रेटिना बाधा टूटने. ग्राफ स्वस्थ बनाम मधुमेह चूहों के विट्रियस प्लाज्मा प्रोटीन अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को माध्य ± SEM के रूप में दर्शाया जाता है। * नियंत्रण समूह (P < 0.01) से एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करता है जो अनपेयर्ड टी-टेस्ट द्वारा प्राप्त किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. रेटिना वास्कुलचर की प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी. (ए) और (बी) रेटिना के एक फ्लैट माउंट का प्रतिनिधित्व करते हैं जो टाइल स्कैन द्वारा विज़ुअलाइज़ किया जाता है और 10x के तहत छवियों को सिलाई करता है। (ए) नियंत्रण रेटिना का प्रतिनिधित्व करता है, (बी) मधुमेह रेटिना का प्रतिनिधित्व करता है। सफेद तीर रिसाव को इंगित करता है। सभी छवियों को Z-स्टैक (5 μm मोटाई) द्वारा प्राप्त किया गया था। (A) और (B) में स्केल बार 0.5 मिमी हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल
रेटिना हिस्टोलॉजी रेटिना कोशिकाओं और परतों के रूपात्मक परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए किया जाता है। फिक्सेटिव समाधान, निर्धारण अवधि, निर्जलीकरण, और पैराफिन गर्भाधान की पसंद सहित विभिन्न चरणों को अनुकूलित करने की आवश्यकता है। ऊतक का आकार 3 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि फिक्सेटिव प्रवेश धीमा हो जाता है। आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड जलीय हास्य और विट्रियस हास्य की तुलना में समाधान की अपेक्षाकृत उच्च ऑस्मोलेरिटी के कारण स्वस्थ आंखों में भी रेटिना टुकड़ी की ओर जाता है, जो गलत-सकारात्मक परिणामों की ओर जाता है23। समाधान की उच्च osmolarity मात्रा संकुचन में परिणाम और ऊतकों के संकुचन की ओर जाता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला फिक्सेटिव समाधान 1.25% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ 1% फॉर्मेल्डिहाइड है, जिसमें अपेक्षाकृत कम ऑस्मोलेरिटी है, ऊतक विरूपण को कम करता है, रेटिना वर्णक उपकला परत से रेटिना टुकड़ी को कम करता है, और अपने मूल राज्य में संरचना को भी संरक्षित करता है। फिक्सेटिव समाधान का एक और विकल्प फॉर्मेल्डिहाइड के साथ एसिटिक एसिड और इथेनॉल है। फिक्सेटिव समाधान की अम्लीय स्थिति ऊतक के तेजी से निर्धारण में मदद कर सकती है, जबकि इथेनॉल फिक्सेटिव समाधान के प्रवेश में सुधार करता है। हालांकि, इथेनॉल और एसिटिक एसिड के अनुपात को अनुकूलित करना आवश्यक है क्योंकि अतिरिक्त एकाग्रता से क्रमशः ऊतक के सिकुड़न या सूजन हो सकती है। सफल ऊतक निर्धारण के लिए मूल्यांकन मापदंडों में रेटिना की टुकड़ी, बरकरार रेटिना परतें और ऊतक संकोचन शामिल हैं। निर्धारण करते समय एक और महत्वपूर्ण कारक फिक्सेटिव समाधान की मात्रा है, जो उचित निर्धारण के लिए आंख के आकार का कम से कम 20 से 25 गुना होना चाहिए25। इसके अलावा, जब भी एक समाधान से दूसरे में स्थानांतरित किया जाता है तो नेत्रगोलक या ऊतक को घुमाना महत्वपूर्ण है, ताकि यह कंटेनर के नीचे या दीवारों से चिपके न हो।

पैराफिन के साथ निर्जलीकरण और गर्भाधान सहित अपूर्ण ऊतक प्रसंस्करण, सिकुड़ सकता है और शुष्क ऊतक, जिसे ब्लॉक की सतह पर अवसाद होने पर कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, खराब ऊतक प्रसंस्करण के परिणामस्वरूप पानी के संपर्क में आने पर वर्गों के सफेद रंग में रंग भी होगा25। यदि ऊतक को सही ढंग से संसाधित नहीं किया जाता है, तो पैराफिन को हटाने के लिए इसे जाइलीन के माध्यम से वापस लिया जा सकता है, इसके बाद इथेनॉल के डाउनग्रेडिएंट में पुनर्जलीकरण किया जा सकता है, (यानी, 100% इथेनॉल, 90% इथेनॉल और 70% इथेनॉल)। फिर से, पैराफिन ब्लॉकों को सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए 1.3 से 1.4 तक के चरणों को दोहराएं।

पैराफिन ब्लॉक तैयार करते समय, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि ऊतक पैराफिन से सभी पक्षों से घिरा हुआ है और कोई हवा के बुलबुले नहीं देखे जाते हैं। ब्लॉक तैयार करने में कोई भी गलती ऊतक के असफल विभाजन का कारण बनेगी। कभी-कभी प्रसंस्करण के दौरान पीछे का कप मुड़ जाता है; इस बिंदु पर, इसे संदंश (गर्म पैराफिन में) का उपयोग करके धीरे से अलग किया जा सकता है, लेकिन इस हद तक नहीं कि यह ऊतक को नुकसान पहुंचाता है। मान लीजिए कि स्टील मोल्ड में ऊतक अभिविन्यास वांछित नहीं है, जबकि पैराफिन ठोस होना शुरू हो जाता है; उस मामले में, इसे पैराफिन ब्लॉक तैयार करने के लिए ऊतक को फिर से उन्मुख करने के लिए पिघले हुए पैराफिन और ऊतक पर वापस रखा जा सकता है। इसके अलावा, ऊतक को एम्बेडिंग मोल्ड में स्थानांतरित करते समय, सुनिश्चित करें कि ऊतक के चारों ओर पैराफिन ठोस नहीं होता है। यह ब्लॉक 25 में ऊतक और एम्बेडिंग माध्यम (पैराफिन) के बीच एक हेयरलाइन अलगाव बनाता है। यदि ऐसा होता है, तो पैराफिन को गर्म पैराफिन में रखकर ऊतक के चारों ओर पिघलाएं और इसे फिर से स्टील मोल्ड में रखें।

सेक्शनिंग के दौरान, ब्लेड को ऊतक के खुले रिबन देने के लिए पर्याप्त तेज होना चाहिए। ब्लेड के एक विशेष हिस्से का उपयोग 30 से अधिक बार न करें। यदि ब्लॉक ठीक से अनुभाग नहीं करता है, तो मान लें कि ब्लेड कुंद है और इसलिए, इसे बदलें या इसे फिर से तेज करें। यदि अनुभाग उचित नहीं हैं, तो यह अनुचित पैराफिन गर्भाधान या ब्लॉकों को गर्भवती करने और तैयार करने के लिए पुराने पैराफिन के उपयोग के कारण भी हो सकता है। ब्लॉक में पैराफिन को पिघलाया जा सकता है, और ब्लॉक तैयार करने के लिए ताजा पैराफिन का उपयोग किया जा सकता है। असमान वर्गों से बचने के लिए, माइक्रोटोम के पहिये को धीरे-धीरे घुमाएं, यहां तक कि तेज, झटकेदार आंदोलनों के बजाय भी मुड़ता है।

Hematoxylin और Eosin धुंधला प्रदर्शन करते समय, Hematoxylin और Eosin दाग के समय को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह ऊतकों के नीचे या अधिक धुंधला हो सकता है। पैराफिन के अनुचित पिघलने या ऊतक के पुनर्जलीकरण से असमान धुंधला हो जाएगा। इसे स्लाइड पर सफेद अनुभागों के रूप में विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। ऊतक को निर्जलित करें और फिर से गर्म हवा के ओवन में पैराफिन को पिघलाएं, इसके बाद तालिका 1 में उल्लिखित चरणों का पालन किया गया। इसके अलावा, एच एंड ई स्टेनिंग के दौरान की जाने वाली आम त्रुटियों में से एक ईओसिन दाग के बाद एक निर्जलक के रूप में शराब का उपयोग है। शराब के अत्यधिक उपयोग से साइटोप्लाज्म और समावेशन निकायों के अंडर-स्टेनिंग हो सकते हैं जो खराब दाग वाले सेक्शन 25 का कारण बन सकते हैं। अतिरिक्त जाइलीन को हटाने के तुरंत बाद माउंटेंट माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए, और जाइलीन के सूखने से बचना चाहिए क्योंकि इससे ऊतक का विरूपण हो सकता है। इसके अलावा, जलीय-आधारित माउंटेंट (जैसे पीबीएस में ग्लिसरॉल) से बचा जाना चाहिए क्योंकि ऊतक निर्जलित अवस्था में है। जलीय-आधारित माउंटेंट ऊतक में प्रवेश नहीं करता है और धुंधली छवियों में परिणाम देता है।

ऊपर उल्लिखित सभी चरणों को अनुकूलित करने पर, शोधकर्ता सफलतापूर्वक हिस्टोलॉजी करने में सक्षम होंगे। यह वांछित fixative समाधान चुनने और अन्य प्रक्रिया मापदंडों को अनुकूलित करने के लिए fice प्रयास करने के लिए लगभग तीन लेता है।

रक्त-रेटिना बाधा टूटना
इस तकनीक में सबसे नाजुक कदम आंख से विट्रियस का अलगाव है। यह एक ताजा आंख पर सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है। शुष्क बर्फ के उपयोग की सिफारिश विट्रियस के आसान अलगाव के लिए की जाती है, खासकर अगर विट्रियस रेटिना से जुड़ा रहता है। अक्सर, विट्रियस के साथ लेंस या रेटिना मिश्रण को रेटिना के कारण विट्रियस की टर्बिडिटी द्वारा पहचाना जा सकता है। इन समस्याओं को आमतौर पर ठंड की स्थिति का उपयोग करके टाला जा सकता है। हालांकि, यदि विट्रियस टैग लेंस के बगल में हैं, तो उन्हें लेंस के चौराहे पर काटकर अलग किया जा सकता है और माइक्रो कैंची का उपयोग करके विट्रियस किया जा सकता है। यदि रेटिना विट्रियस के साथ बाहर निकलता है, तो रेटिना को माइक्रो संदंश का उपयोग करके टुकड़ा-दर-टुकड़ा हटाया जा सकता है। फिल्टर centrifugation का उपयोग भी लेंस और रेटिना 26 से vitreous के आसान अलगाव के लिए सुझाव दिया है। चूंकि विट्रियस एक जेल जैसी संरचना है, इसलिए इसे प्रोटीन के एक समरूप मिश्रण के लिए समरूपता की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, जैसा कि चरण 2.2.1 में उल्लेख किया गया है, एक एकल समरूपता चक्र उचित समरूपता के लिए पर्याप्त है, जिसे सेंट्रीफ्यूजेशन पर विट्रियस हास्य के तरलीकरण द्वारा पहचाना जा सकता है। यदि सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद विट्रियस की जेल प्रकृति देखी जाती है, तो समरूपता (चरण 2.2.1) को दोहराएं। प्रोटीन परिमाणीकरण किसी भी किट विधि का उपयोग करके किया जा सकता है, लेकिन 2 μg / μL तक vitreous में कम प्रोटीन के स्तर का पता लगाने के लिए संवेदनशील होना चाहिए।

प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी
इस तकनीक का उद्देश्य रेटिना के संवहनी नेटवर्क की कल्पना करना है, और इसलिए, डाई को रेटिना माइक्रोवेस में समान रूप से पहुंचना चाहिए। इसे सुनिश्चित करने के लिए विभिन्न चरणों को अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि इंजेक्शन साइट और परिसंचरण समय। एक डाई पूंछ नस इंजेक्शन या कार्डियक इंजेक्शन के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है। कार्डियक इंजेक्शन दिल के अलावा किसी अन्य साइट पर डाई को इंजेक्ट करने का जोखिम उठाता है यदि अच्छी तरह से प्रशिक्षित नहीं है; इसलिए, पूंछ नस इंजेक्शन पसंद किया जाता है। हालांकि, पार्श्व शिरा की पहचान करना आसान है जब गर्म पानी (37-40 डिग्री सेल्सियस) में डुबोया जाता है और 70% इथेनॉल के साथ साफ किया जाता है। इथेनॉल रक्त वाहिकाओं को फैलाने में मदद करता है, जो नस के स्थान तक पहुंचने में मदद कर सकता है। यह भी आवश्यक है कि डाई को केवल नस में इंजेक्ट किया जाए। पूंछ की नस में डाई इंजेक्ट करने में विफलता को डाई इंजेक्ट करते समय प्रतिरोध द्वारा महसूस किया जा सकता है, जबकि डाई को इंजेक्ट करते समय या चमड़े के नीचे इंजेक्शन के कारण आस-पास के क्षेत्र को उभारते हुए। सुई को हटाया जा सकता है और पूंछ की किसी अन्य साइट में फिर से डाला जा सकता है। सफल पूंछ नस इंजेक्शन भी चूहे के जबरन पेशाब द्वारा कल्पना की जा सकती है; डाई का रंग 30 से 40 सेकंड के भीतर चूहे के मूत्र में दिखाई देता है।

इसके अलावा, परिसंचरण समय आवश्यक है; आमतौर पर, रेटिना वाहिकाओं में डाई को सफलतापूर्वक प्रसारित करने के लिए 5 से 10 मिनट पर्याप्त होते हैं। एक सपाट माउंट एक ताजा आंख या एक निश्चित आंख में तैयार किया जा सकता है। एक ताजा आंख में एक फ्लैट माउंट तैयार करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन एक बार महारत हासिल करने के बाद, तकनीक को सबसे अधिक पसंद किया जाता है क्योंकि निर्धारण के दौरान, डाई फिक्सेटिव समाधान 27 में रिसाव करना शुरू कर देती है। इसलिए, निर्धारण पूरी आंख के लिए 30 मिनट से अधिक समय तक नहीं होना चाहिए। ताजा रेटिना को अलग करने में कठिनाई के मामले में, इसे 15 से 20 मिनट के लिए पूर्वकाल कप से पीछे के कप को अलग करने के बाद एक फिक्सेटिव समाधान (4% फॉर्मेल्डिहाइड) में भी तय किया जा सकता है। यह अक्सर देखा जाता है कि डाई रक्त वाहिकाओं से आसपास के ऊतकों में लीक होती है, यहां तक कि स्वस्थ रेटिना में भी। यह अतिरिक्त निर्धारण के कारण हो सकता है; इसलिए, निर्धारण के लिए आवश्यक समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह केवल रेटिना के आसान अलगाव को बढ़ाता है और भविष्य के उपयोग के लिए संरचना को संरक्षित करता है। इसके अलावा, जानवर में डाई के परिसंचरण समय में वृद्धि भी रेटिना वाहिकाओं से आसपास के ऊतकों तक डाई रिसाव का कारण बन सकती है, जिसे अनुकूलित करने की आवश्यकता है।

FITC-dextran का आकार आवश्यक है क्योंकि उच्च आणविक भार डाई सूक्ष्म वास्कुलेटर में प्रवेश नहीं करेगा। इसके विपरीत, कम आणविक वजन डाई स्वस्थ रेटिना 28 के नए जहाजों से लीक होगा। इसलिए, रेटिना में रिसाव और वास्कुलचर की कल्पना करने के लिए, 70 केडी के आणविक वजन के साथ FITC-dextran को प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी करने के लिए पसंद किया जाता है। हालांकि, इस तकनीक की एक महत्वपूर्ण सीमा मधुमेह चूहों में नवसंवहनीकरण के विकास की अवधि और अध्ययन की आक्रामक प्रक्रिया है, जिसे भविष्य में गैर-आक्रामक तकनीकों जैसे इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम, फंडस और अन्य गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल उपकरणों द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखक भारतीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (आईसीएमआर) को स्वीकार करना चाहते हैं; आईटीआर-2020-2882) डॉ निर्मल जे को वित्त पोषण सहायता के लिए। हम मनीषा मलानी को जूनियर रिसर्च फेलोशिप प्रदान करने के लिए आयोग के विश्वविद्यालय अनुदान और अवसंरचनात्मक सुविधा प्रदान करने के लिए केंद्रीय विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला सुविधा, बिट्स-पिलानी, हैदराबाद परिसर को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Histology
Reagents
Isoflurane Abbott Anesthesia agent
Ketamine hydrochloride Troikaa Pharmaceuticals Anesthesia agent
Xylazine Indian Immunologicals Limited Anesthesia agent
Pentobarbital sodium Zora Pharma Euthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde HiMedia, Avra MB059, ASG2529 Prepared in-house
Ethanol Hayman F204325 Dehydration
Xylene HiMedia MB-180 Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin wax HiMedia GRM10702 used for embedding tissue
Glycerol HiMedia TC503 To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acid Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. 65955 For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acid HiMedia AS119 For preparation of eosin
Scotts water Leica 3802900 Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution Sigma 1.09254.0500 Staining of nuclei
Eosin HiMedia GRM115 Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant media Sigma 6522 Visualization and protection of retinal sections
Equipments
Glassware Borosil
Corneal forcep Stephens Instruments S5-1200 Dissection
Colibri forcep Stephens Instruments S5-1135 Dissection
Curved micro scissor Stephens Instruments S7-1311 Dissection
Vannas scissor Stephens Instruments S7-1387 Dissection
Iris scissor Stephens Instruments S7-1015 Dissection
Cassettes HiMedia PW1292 To hold tissue during histology processing
Water bath GT Sonic GT Sonic-D9 Temperature maintenance
Paraffin embedding station Myr EC 350 Preparation of paraffin blocks
Microtome Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. YD-335A Sectioning
Blades Leica Leica 818 Sectioning
Slides HiMedia BG005 Holding paraffin-tissue sections
Coverslips HiMedia BG014C To cover tissue after adding mounting media
Blood Retinal Barrier breakdown
Reagents
Isoflurane Abbott B506 Anesthesia
Dry ice Not applicable Not applicable Dissection
Bradford reagent Sigma B6916 Protein quantification
Equipments
Corneal forcep Stephens Instruments S5-1200 Dissection
Colibri forcep Stephens Instruments S5-1135 Dissection
Curved micro scissor Stephens Instruments S7-1311 Dissection
Vannas scissor Stephens Instruments S7-1387 Dissection
Iris scissor Stephens Instruments S7-1015 Dissection
Glassware Borosil Not applicable
EDTA coated tubes J.K Diagnostics Not applicable Separate plasma from whole blood
Homogenization tubes MP Biomedicals SKU: 115076200-CF Homogenization of vitreous
Homogenization caps MP Biomedicals SKU: 115063002-CF Homogenization of vitreous
Glass beads MP Biomedicals SKU: 116914801 Homogenization of vitreous
Homogeniser Bertin Instruments P000673-MLYS0-A Homogenization of vitreous
96-well plate - Transparent Grenier GN655101 Protein quantification
Plate reader Molecular devices SpectrMax M4 Absorbance measurement
Centrifuge REMI CPR240 Plus Centrifugation
Fluorescence Angiography
Reagents
Isoflurane Abbott B506 Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 Prepared in-house
Fluoroshied Sigma F6182 Anti-fading mounting medium
Equipments
Corneal forcep Stephens Instruments S5-1200 Dissection
Colibri forcep Stephens Instruments S5-1135 Dissection
Curved micro scissor Stephens Instruments S7-1311 Dissection
Vannas scissor Stephens Instruments S7-1387 Dissection
Iris scissor Stephens Instruments S7-1015 Dissection
Glassware Borosil Not applicable
Slides HiMedia BG005 Flatmount preparation
Coverslips HiMedia BG014C To cover tissue after adding mounting media
Confocal microscope Leica DMi8 Visualization of flatmount

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References

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Malani, M., Nirmal, J. Retinal… More

Malani, M., Nirmal, J. Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model. J. Vis. Exp. (183), e63111, doi:10.3791/63111 (2022).

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