Summary
Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.
Abstract
Eine Augenerkrankung des hinteren Segments wie die diabetische Retinopathie verändert die Physiologie der Netzhaut. Die diabetische Retinopathie ist gekennzeichnet durch eine Netzhautablösung, den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) und die retinale Angiogenese. Ein In-vivo-Rattenmodell ist ein wertvolles experimentelles Werkzeug, um die Veränderungen in der Struktur und Funktion der Netzhaut zu untersuchen. Wir schlagen drei verschiedene experimentelle Techniken im Rattenmodell vor, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen, retinalen Gefäßen und kompromittiertem BRB zu identifizieren. Die Netzhauthistologie wird verwendet, um die Morphologie verschiedener Netzhautzellen zu untersuchen. Die quantitative Messung erfolgt auch durch retinale Zellzählung und Dickenmessung verschiedener Netzhautschichten. Ein BRB-Abbauassay wird verwendet, um das Austreten von extraokularen Proteinen aus dem Plasma in Glaskörper aufgrund des Abbaus von BRB zu bestimmen. Die Fluoreszenzangiographie wird verwendet, um die Angiogenese und das Austreten von Blutgefäßen zu untersuchen, indem retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff sichtbar gemacht werden.
Introduction
Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine der komplexesten sekundären Komplikationen des Diabetes mellitus. Es ist auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Bevölkerung im erwerbsfähigen Alter weltweit. In einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse von 32,4 Millionen blinden Menschen waren 830.000 (2,6%) Menschen aufgrund von DR1 blind. Der Anteil des Sehverlusts, der auf Diabetes zurückzuführen ist, belegte 2015 mit 1,06% (0,15-2,38) weltweit den siebten Platz2,3.
Die diabetische Retinopathie wird durch Gefäßanomalien im hinteren Augengewebe diagnostiziert. Klinisch ist es in zwei Stadien unterteilt - Non-Proliferative DR (NPDR) und Proliferative DR (PDR), basierend auf der Vaskularisation in der Netzhaut. Hyperglykämie gilt als der potente Regulator von DR, da sie mehrere Wege impliziert, die an Neurodegeneration4,5, Entzündungen6,7 und Mikrovaskulaturen8 in der Netzhaut beteiligt sind. Zu den multiplen metabolischen Komplikationen, die aufgrund von Hyperglykämie induziert werden, gehören die Anhäufung von fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs), Polyolweg, Hexosaminweg und Proteinkinase-C-Signalweg. Diese Signalwege sind verantwortlich für die Zellproliferation (Endothelzellen), Migration (Perizyten) und Apoptose (neuronale Netzhautzellen, Perizyten und Endothelzellen), die auf verschiedenen Stadien der diabetischen Retinopathie basieren. Diese metabolischen Veränderungen können zu physiologischen Veränderungen wie Netzhautablösung, Verlust von Netzhautzellen, Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB), Aneurysmen und Angiogenese führen9.
Streptozotocin (STZ) -induzierter Typ-1-Diabetes ist eine etablierte und akzeptierte Praxis bei Ratten zur Bewertung der Diabetes-Pathogenese und ihrer Komplikationen. Diabetogene Wirkungen von STZ sind auf die selektive Zerstörung der Pankreasinsel β-Zellen zurückzuführen10. Infolgedessen erleiden die Tiere Insulinmangel, Hyperglykämie, Polydipsie und Polyurie, die alle für den menschlichen Typ-1-Diabetes mellitus charakteristisch sind11. Bei schwerer Diabetes-Induktion wird STZ bei 40-65 mg/kg Körpergewicht intravenös oder intraperitoneal im Erwachsenenalter verabreicht. Nach etwa 72 h weisen diese Tiere einen Blutzuckerspiegel von mehr als 250 mg/dL10,12 auf.
Um die physiologischen Veränderungen der Netzhaut durch Neurodegeneration, Entzündung und Angiogenese zu verstehen, sollten verschiedene Techniken in experimentellen Tiermodellen optimiert werden. Strukturelle und funktionelle Veränderungen in Netzhautzellen und Netzhautgefäßen können durch verschiedene Techniken wie Histologie, BRB-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie untersucht werden.
Histologie beinhaltet das Studium der Anatomie von Zellen, Geweben und Organen auf mikroskopischer Ebene. Es stellt eine Korrelation zwischen der Struktur und Funktion von Zellen/Gewebe her. Es werden mehrere Schritte durchgeführt, um die mikroskopischen Veränderungen in der Gewebestruktur zu visualisieren und zu identifizieren und dabei gesunde und kranke Gegenstücke zu vergleichen13. Daher ist es wichtig, jeden Schritt der Histologie sorgfältig zu standardisieren. Verschiedene Schritte in der Netzhauthistologie sind die Fixierung der Probe, das Trimmen der Probe, Dehydratisierung, Clearing, Imprägnierung mit Paraffin, Paraffineinbettung, Schnitt und Färbung (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung)13,14.
In einer gesunden Netzhaut wird der Transport von Molekülen über die Netzhaut durch BRB gesteuert, das aus Endothelzellen und Perizyten auf der Innenseite und retinalen Pigmentepithelzellen auf der Außenseite besteht. Innere BRB-Endothelzellen und Perizyten beginnen jedoch während des erkrankten Zustands zu degenerieren, und BRB ist ebenfalls kompromittiert15. Aufgrund dieses BRB-Abbaus gelangen viele niedermolekulare Moleküle in Glaskörper und Netzhautgewebe16. Wenn die Krankheit fortschreitet, treten aufgrund von Homöostasestörungen auch viele andere Proteinmoleküle (niedriges und hohes Molekulargewicht) in Glaskörper und Netzhautgewebe aus17. Es führt zu verschiedenen anderen Komplikationen und letztendlich zu Makulaödemen und Blindheit. Daher kompromittierten die Quantifizierung der Proteinspiegel im Glaskörper und der Vergleich von gesunden und diabetischen Zuständen das BRB.
Die Fluoreszenzangiographie ist eine Technik, die verwendet wird, um die Blutzirkulation der Netzhaut und der Aderhaut mit Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen. Es wird verwendet, um das Gefäßsystem der Netzhaut und der Aderhaut zu visualisieren, indem Fluoresceinfarbstoff über intravenösen Weg oder Herzinjektion injiziert wird18. Sobald der Farbstoff injiziert ist, erreicht er zuerst die Netzhautarterien, gefolgt von Netzhautvenen. Diese Zirkulation von Farbstoff wird normalerweise innerhalb von 5 bis 10 Minuten nach der Injektion von Farbstoff19 abgeschlossen. Es ist eine wichtige Technik zur Diagnose verschiedener Augenerkrankungen des hinteren Segments, einschließlich diabetischer Retinopathie und choroidaler Neovaskularisation20. Es hilft, größere und kleine Gefäßveränderungen unter normalen und kranken Zuständen zu erkennen.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt allen Tierpflegerichtlinien, die von der Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, zur Verfügung gestellt werden.
1. Netzhauthistologie
- Enukleation und Fixierung des Auges
- Euthanasieren Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen alt) mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min.
- Enukleieren Sie das Auge, indem Sie Einschnitte mit einer Skalpellklinge an den Nasen- und Schläfenregionen des Auges vornehmen. Schneiden Sie dann mit einer Pinzette und einer Mikroschere entlang der Kanten, um das Auge aus der Orbitalhöhle zu entfernen.
HINWEIS: Bevor Sie Ratten opfern, halten Sie die Fixierlösungen bereit.
ACHTUNG: Formaldehyd reizt Haut, Auge, Nase und Atemwege. Es kann auch Krebs verursachen, da es ein starker Hautsensibilisator ist. Trage Handschuhe und behandle sie unter der Kapuze21. - Waschen Sie das Auge gründlich mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Petrischale, um Blut zu entfernen. Entfernen Sie das überschüssige Fett, das das Auge umgibt, um das Eindringen in die Fixierlösung zu erleichtern.
- Legen Sie das Auge sofort mit Hilfe einer Pinzette in 5 ml Fixierlösung und stellen Sie sicher, dass es nicht an Wänden von Glasfläschchen klebt. Rühren Sie einige Sekunden lang vorsichtig um und ersetzen Sie die Kappe durch die richtige Beschriftung. Inkubieren Sie das Auge in Fixierlösung für 24 bis 48 h unter dunklen Bedingungen bei Raumtemperatur.
- Trimmen von Gewebe
- Entfernen Sie nach der Fixierung das Auge aus der Fixierlösung, waschen Sie es mit 10 ml PBS und legen Sie es in eine Petrischale mit 10 ml PBS, gekühlt bei 4 ° C.
- Halten Sie mit einer Mikropinzette das Auge mit dem Sehnerv fest und machen Sie mit Hilfe einer Mikroschere einen Nick an Pars plana . Schneiden Sie den gesamten Rand der Hornhaut durch, um die vordere Tasse eines Auges zu trennen. Wählen Sie die Linse mit einer Pinzette vorsichtig aus, verwerfen Sie sie und schneiden Sie den Sehnerv ab.
- Machen Sie mit einer gekrümmten Mikroschere einen Längsschnitt der hinteren Augenmuschel, der durch die optische Scheibe verläuft und sie in zwei Hälften teilt. Legen Sie es in den Boden der Kassette und schließen Sie den Deckel richtig, ohne das Gewebe zu stören. Beschriften Sie die Kassetten mit dem Namen und Datum der Gewebeprobe.
- Dehydratisierung, Clearing und Paraffinimprägnierung von Gewebe
- Dehydrieren Sie das getrimmte Gewebe durch allmählichen Transfer in 80 ml von 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol. Während Sie die Kassetten von einer Konzentration in eine andere übertragen, achten Sie darauf, sie auf sauberes Seidenpapier zu tupfen, um die Kontamination zu minimieren.
HINWEIS: Lassen Sie das Gewebe bei jedem Transfer 30 Minuten (zweimal) stehen. Der Gesamtzeitaufwand für diesen Schritt beträgt ca. 4 h. - Nach der Dehydratisierung die Kassetten für 30 min (zweimal) in 80 ml Xylol überführen, um das Ethanol durch Xylol zu ersetzen.
HINWEIS: Nach der Inkubation mit Xylol wird das Gewebe durchscheinend.
ACHTUNG: Xylol ist eine aromatische Verbindung mit einem Benzolring. Es reizt das Auge und die Schleimhaut und kann auch Depressionen verursachen. - Zum Schluss das Gewebe mit vorgewärmtem Paraffin bei 60 °C imprägnieren, um Xylol im Gewebe zu ersetzen. Tupfen Sie die Kassetten mehrmals auf Seidenpapier, um den Xylolgehalt zu minimieren, und legen Sie 200 ml Paraffin (Flüssigkeit bei 60 °C) für 2 h (1 h x 2) ein.
VORSICHT: Vermeiden Sie das Einatmen von geschmolzenem Paraffin, da es winzige Lipidtröpfchen produziert, die Atembeschwerden verursachen können.
- Dehydrieren Sie das getrimmte Gewebe durch allmählichen Transfer in 80 ml von 50%, 70%, 90% und 100% Ethanol. Während Sie die Kassetten von einer Konzentration in eine andere übertragen, achten Sie darauf, sie auf sauberes Seidenpapier zu tupfen, um die Kontamination zu minimieren.
- Paraffin-Einbettung
- Schalten Sie die Paraffin-Einbettmaschine mindestens 1 Stunde vor Gebrauch ein, um das Paraffin zu schmelzen und die Stationen die gewünschten Temperaturen zu erreichen. Füllen Sie eine Stahlform mit geschmolzenem Paraffinwachs, indem Sie sie auf eine heiße Oberfläche legen, und entfernen Sie dann jeweils eine Kassette aus dem Paraffinbehälter.
- Bewegen Sie die Stahlform von einer heißen zu einer kalten Oberfläche (4 °C). An diesem Punkt beginnt sich das Wachs in der Form zu verfestigen. Bevor es sich vollständig verfestigt, legen Sie das Gewebe mit Hilfe einer Pinzette in Wachs und richten Sie das Gewebe so aus, dass der optische Bandscheibenteil der hinteren Tasse der Basis der Form zugewandt ist.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe nicht bewegt und behalten Sie die gewünschte Ausrichtung. Ist dies nicht der Fall, legen Sie die Form wieder auf die warme Arbeitsfläche, bis sich das gesamte Paraffin verflüssigt, und beginnen Sie dann erneut mit Schritt 1.4.2. - Wenn das Wachs in der Form zu erstarren beginnt, legen Sie sofort den Kassettenfuß auf die Form. Füllen Sie die Form vorsichtig mit Paraffin über dem oberen Rand der Kassette und geben Sie sie langsam auf eine kalte Oberfläche (in der Nähe von -20 ° C) für eine schnelle Erstarrung. Bis es sich verfestigt, wiederholen Sie den Vorgang mit anderen Kassetten aus Schritt 1.4.2.
- Sobald alle Formen verfestigt sind, trennen Sie die Stahlform von der Kassette. Wenn es schwierig ist, warten Sie etwas länger und versuchen Sie es erneut (entfernen Sie es nicht gewaltsam). Die Trennung wird bei vollständiger Erstarrung einfacher. Nun wird die Kassette zur Basis des Paraffinblocks, der während des Schnitts per Mikrotom gehalten werden soll.
HINWEIS: Dieser Block kann zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur gelagert werden. An dieser Stelle kann der Prozess gestoppt und später (falls erforderlich) fortgesetzt werden.
- Schnittdarstellung
- Installieren Sie eine Einweg-Mikrotomklinge in den Klingenhalter. Entfernen Sie überschüssiges Paraffinwachs um Kassetten herum, so dass sowohl der obere als auch der untere Teil der Blöcke parallel zum Messer bleiben. Befestigen Sie den Block am Kassettenhalter.
- Entriegeln Sie das Handrad, um es vorwärts zu bewegen, bis die Oberfläche des Blocks mit der Kante des Messers in Kontakt kommt. Schneiden Sie das überschüssige Paraffinwachs auf den Block, bis das Gewebe auf der Oberfläche des Blocks sichtbar ist. Stellen Sie die Schnittstärke auf 5 μm ein und schneiden Sie ein Band von fünf bis sechs Abschnitten ab.
- Übertragen Sie das Band vorsichtig mit einer Pinzette auf die Oberfläche des vorgewärmten Wasserbades (ca. 50 °C), um das Band zu entfalten. Sammeln Sie Abschnitte auf einem Glasobjektträger, der mit Mayers Albumin beschichtet ist, indem Sie den Objektträger unter den Abschnitt halten. Heben Sie die Abschnitte vorsichtig an und lassen Sie die Rutschen über Nacht bei 37 °C horizontal trocknen.
HINWEIS: Dias können bei Raumtemperatur in trockenen Boxen für mehrere Monate gelagert werden. In diesem Schritt kann der Prozess gestoppt und später fortgesetzt werden.
- Färbung
- Erhitzen Sie die zu befleckenden Objektträger in einem Heißluftofen 1 h lang bei 60 °C, bevor sie das Paraffin zum Schmelzen verwenden, und befolgen Sie die in Tabelle 1 genannten Schritte.
ACHTUNG: Hämatoxylin- und Eosinflecken sind giftig, wenn sie eingeatmet oder eingenommen werden. Es wurde berichtet, dass sie krebserregend sind.
- Erhitzen Sie die zu befleckenden Objektträger in einem Heißluftofen 1 h lang bei 60 °C, bevor sie das Paraffin zum Schmelzen verwenden, und befolgen Sie die in Tabelle 1 genannten Schritte.
| Reagenz | Stehzeit | Wiederholung (Anzahl der Male) |
| Xylol | 5 Minuten | 2 |
| 100% Ethanol | 5 Minuten | 2 |
| 90% Ethanol | 5 Minuten | 2 |
| 70% Ethanol | 5 Minuten | 2 |
| 50% Ethanol | 5 Minuten | 2 |
| Wasser | 5 Minuten | 2 |
| Hämatoxylin | 4 Minuten | 1 |
| Wasserwäsche | ||
| 1% Säurealkohol in 70% Ethanol | 30 Sek. | 1 |
| Wasserwäsche | ||
| Scotts Wasser | 1 min | 1 |
| Wasserwäsche | ||
| 50% Ethanol | 1 min | 1 |
| 95% Ethanol | 1 min | 1 |
| 0,25% Eosin | 5 s | 1 |
| Wasserwäsche | ||
| Wasser | 2 min | 1 |
| 95% Ethanol | 1 min | 1 |
| 100% Ethanol | 1 min | 1 |
| Xylol | 5 Minuten | 2 |
| Halterung und Deckglas | ||
Tabelle 1. Hämatoxylin- und Eosin-Färbeverfahren
2. Blut-Hirn-Differenz-Abbau-Assay
- Blut- und Glaskörperentnahme
- Anästhesien Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen) mit Ketamin (80 mg / kg) und Xylazin (8 mg / kg). Bestätigen Sie den Anästhesiezustand durch Pedal-Rückzugsreflex (Zehenklemme). Sammeln Sie sofort 1 ml Blut durch Herzpunktion in ein mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichtetes Rohr, um Plasma aus Vollblut zu trennen.
- Euthanasie die Ratte mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min. Enukleieren Sie das Auge und legen Sie es sofort auf Trockeneis.
- Legen Sie das Auge in eine saubere Petrischale über Trockeneis (empfohlen) und beginnen Sie mit der Sezierung des Auges, wie in Schritt 1.2.2 erwähnt.
- Entfernen Sie die Linse, ziehen Sie den Glaskörper vorsichtig mit einer Mikropinzette aus der hinteren Tasse und legen Sie ihn in ein Homogenisierungsröhrchen mit drei bis vier Glasperlen (2-4 mm).
HINWEIS: Die Dissektion auf Trockeneis wird empfohlen, da das Entfernen der Linse und des Glaskörpers unter Gefrierbedingungen einfacher ist.
- Vorbereitung von Proben
- Glaskörper in einem Perlenhomogenisator bei mittlerer Geschwindigkeit für 10 s homogenisieren.
- Die Blut- (1 ml) und Glaskörperproben (10-20 μL) werden in die Mikrozentrifugenröhrchen überführt und beide Proben bei 5200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
HINWEIS: Bei erfolgreicher Homogenisierung hat Glaskörper nach der Zentrifugation eine einheitliche Konsistenz. Bei ungleichmäßiger Konsistenz von Glaskörpern wiederholen Sie jedoch Schritt 2.2.1 mit erhöhter Homogenisierungszeit. - Sammeln Sie Überstände aus beiden Proben und verdünnen Sie Glaskörper- und Plasmaproben im Verhältnis 1:10 bzw. 1:20 mit PBS.
- Proteinquantifizierung und Glas-Plasma-Protein-Verhältnis
- Um die Proteinkonzentration in Glaskörper- und Plasmaproben zu quantifizieren, fügen Sie 5 μL verdünnte Proben zu 250 μL Bradford-Reagenz hinzu, mischen Sie gut und lesen Sie die Absorption bei 590 nm innerhalb von 40 Minuten ab.
HINWEIS: Wenn der Absorptionswert der Proben über 1,0 liegt, verdünnen Sie die Proben weiter und wiederholen Sie das Verfahren aus Schritt 2.2.3. - Normalisieren Sie den Glaskörperproteinspiegel auf den Plasmaproteinspiegel derselben Ratte und messen Sie den Faltenunterschied zwischen gesunden und diabetischen Ratten.
- Um die Proteinkonzentration in Glaskörper- und Plasmaproben zu quantifizieren, fügen Sie 5 μL verdünnte Proben zu 250 μL Bradford-Reagenz hinzu, mischen Sie gut und lesen Sie die Absorption bei 590 nm innerhalb von 40 Minuten ab.
3. Fluoreszenzangiographie
- FITC-dextran70000 Farbstoffinjektion
- Betäuben Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen) mit 3% Isofluran und bestätigen Sie den Pedalentzugsreflex (Zehenkneipe). Tauchen Sie den Schwanz in ein Becherglas mit warmem Wasser (37-40 °C). Reinigen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol, bevor Sie den Farbstoff injizieren. Suchen Sie die seitliche Vene des Schwanzes und markieren Sie die Injektionsposition im unteren Teil des Schwanzes.
HINWEIS: Wenn das Einführen der Nadel fehlschlägt, versuchen Sie, an einer anderen Stelle über der aktuellen Position (Spitze zur Basis des Schwanzes) einzuführen. Es wird jedoch empfohlen, einmal zu injizieren, da wiederholtes Stechen zu Stressentwicklung bei der Ratte führen kann, was zu einer Vasokonstriktion führen kann. - Injizieren Sie 1 ml 50 mg/ml FITC-dextran70000 Farbstofflösung durch die Schwanzvene und lassen Sie den Farbstoff für 5 min zirkulieren. Euthanasieren Sie die Ratte mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein nachweisbarer Herzschlag bestätigt den Tod innerhalb von 2-5 min. Das Auge wie in Schritt 1.1.1 erwähnt enukleieren.
HINWEIS: Bei Bedarf kann das Auge in 4% iger Formaldehydlösung für nicht mehr als 30 min fixiert werden.
- Betäuben Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen) mit 3% Isofluran und bestätigen Sie den Pedalentzugsreflex (Zehenkneipe). Tauchen Sie den Schwanz in ein Becherglas mit warmem Wasser (37-40 °C). Reinigen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol, bevor Sie den Farbstoff injizieren. Suchen Sie die seitliche Vene des Schwanzes und markieren Sie die Injektionsposition im unteren Teil des Schwanzes.
- Vorbereitung der flachen Montage
- Um flache Halterungen vorzubereiten, halten Sie die Sezierwerkzeuge zusammen mit den Schlitten und Deckgläsern bereit. Legen Sie das Auge in eine Petrischale, die mit gekühltem PBS gefüllt ist, und beginnen Sie mit der Sezierung des Auges, wie in Schritt 1.2.2 erwähnt.
- Legen Sie nun die Spitze einer spitzen Pinzette zwischen die Sklera und die Netzhaut. Bewegen Sie es vorsichtig entlang des gesamten Randes der Tasse und stellen Sie sicher, dass die Netzhaut an keiner Stelle an der Sklera befestigt ist. Wenn es ein Hindernis gibt, schneiden Sie diesen Teil langsam entlang der Felge mit einer gekrümmten Mikroschere ab.
- Sobald bestätigt ist, dass die Netzhaut von keiner Seite an der Sklera befestigt ist, schneiden Sie in der Nähe der optischen Scheibe ab und machen Sie ein kleines Loch, so dass sich die Netzhaut vollständig von der Sklera löst. Drücken Sie die Netzhaut langsam in PBS-Lösung und legen Sie sie mit Hilfe eines Spatels oder einer Pinzette auf einen sauberen, flachen Objektträger.
- Machen Sie mit einer Mikroschere oder Skalpellklingen kleinere Schnitte im Netzhautgewebe und teilen Sie es in vier Quadranten auf. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte mindestens 2 mm von dem Loch entfernt sind, das die optische Scheibe in der Mitte hinterlassen hat, wie in Abbildung 1 dargestellt.
- Entfernen Sie überschüssiges PBS von den Seiten des Gewebes mit 0,2 ml Spitzen, ohne die flache Halterung zu stören.
- Legen Sie einen Tropfen Anti-Fading-Montagemedium (50 μL bis 100 μL) auf eine flache Halterung, decken Sie es mit einem Deckglas ab und visualisieren Sie es sofort unter einem konfokalen Mikroskop.
HINWEIS: Halten Sie während des gesamten Vorgangs ein Minimum an Licht aufrecht.
- Visualisierung der flachen Halterung
- Visualisieren Sie die flache Halterung unter dem 10-fachen Objektiv eines konfokalen Mikroskops. Führen Sie Kachelscans durch, um die gesamte flache Montierung als einzelnes Image zu erfassen. Die Anzahl der Fliesen hängt von der Größe der retinalen flachen Montierung ab. Führen Sie auch ein Z-Stacking durch, um die Venen und Arterien in verschiedenen Herden zu visualisieren (bevorzugte Größe für Z-Stack beträgt 5 μm, je nachdem, je nachdem, welche Anzahl der Z-Stack-Schritte variiert).
- Verwenden Sie PMT- und HyD-Detektor mit % Verstärkung wie 700-900 bzw. 100-150. Wählen Sie den Emissionsbereich zwischen 510-530 nm für FITC-Dextran-Farbstoff.
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Representative Results
Netzhauthistologie
In der diabetischen Netzhaut erleiden Netzhautzellen eine Degeneration. Darüber hinaus nimmt die Dicke der Netzhautschichten aufgrund von Ödem22 zu. Die nach der Hämatoxylin- und Eosinfärbung erhaltenen Bilder können für die Zellzählung und die Messung der Dicke verschiedener Schichten verwendet werden, wie in Abbildung 2 mit ImageJ gezeigt.
Blut-Netzhaut-Barriere-Abbau-Assay
Da das BRB bei diabetischen Ratten kompromittiert ist, wird das Auslaufen deutlich, was zur Ansammlung von Biomolekülen aus dem Plasma zur Netzhaut und zum Glaskörper führt. Bei diabetischen Ratten ist der Proteinverlust aus dem Plasma in den Glaskörper im Vergleich zu gesunden Ratten etwa dreimal höher (Abbildung 3). Protein kann mit jeder Kit-Methode wie der Lowry-Methode, der Bicinchoninsäure-Methode (BCA) oder der Bradford-Methode (in diesem Papier, Abschnitt 2.3 erwähnt) geschätzt werden. Es wird empfohlen, das Auge frisch zu sezieren, da eine Verzögerung der Verarbeitung zu einer starken Glaskörperadhäsion mit der Netzhaut führen kann, was die Trennung erschwert. Eine unsachgemäße Trennung von Glaskörper von der Netzhaut kann zu falsch-positiven Ergebnissen führen.
Fluoreszenz-Angiographie
Diese Technik wird verwendet, um die Leckage und das Gefäßsystem der Netzhaut zu visualisieren, einschließlich Mikro- und Makrovaskulatur. Die Auswahl der Größe von FITC-dextran basiert auf seiner Anwendung für verschiedene Studien. FITC-Dextran mit niedrigem Molekulargewicht, im Bereich von 4-6 kDa, wird verwendet, um Leckagen im Gefäßsystem zu visualisieren. Im Gegensatz dazu werden hochmolekulare FITC-Dextran-Moleküle im Bereich von 70 kDa bis 2 Millionen Da verwendet, um die Angiogenese zu visualisieren. Die erfolgreiche Injektion von Farbstoff führt zur Visualisierung des gesamten Gefäßsystems der retinalen flachen Montierung, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die erhaltenen Bilder nach der konfokalen Mikroskopie können verwendet werden, um den Bereich des Gefäßsystems zu bestimmen, der in der gesamten Netzhaut mit der ImageJ-Software besetzt ist, um gesunde und kranke Gruppen zu vergleichen.
Abbildung 1. Netzhaut-Flat-Mount-Präparation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Histologische Bilder von gesunder vs. diabetischer Netzhaut. (A) und (B) stellen die H & E-gefärbten Netzhautbilder von Kontroll- (A) und diabetischen Ratten (B) unter 40x dar. Die Gesamtdicke der Netzhaut und jeder Schicht nimmt bei diabetischen Zuständen zu (C). Abkürzungen: PRL = Photorezeptorschicht, ONL = äußere Kernschicht, OPL = äußere plexiforme Schicht, INL = innere Kernschicht, IPL = innere plexiforme Schicht und GCL = Ganglienzellschicht. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. * stellt einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe dar (P < 0,0001), während # einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe bei P < 0,05 darstellt, der durch den ANOVA-Test erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Blut-Netzhaut-Schrankenabbau bei gesunden vs. diabetischen Ratten. Die Grafik stellt das Glaskörper-Plasmaprotein-Verhältnis von gesunden vs. diabetischen Ratten dar. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. * stellt einen signifikanten Unterschied zu der Kontrollgruppe (P < 0,01) dar, die durch ungepaarten t-Test erhalten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Fluoreszenzangiographie des retinalen Gefäßsystems. (A) und (B) stellen eine flache Halterung der Netzhaut dar, die durch Kachelscan und Zusammenfügen der Bilder unter 10x visualisiert wird. (A) stellt die Kontrollnetzhaut dar, (B) stellt die diabetische Netzhaut dar. Der weiße Pfeil zeigt eine Leckage an. Alle Bilder wurden mit Z-Stack (5 μm Dicke) aufgenommen. Die Maßstabsbalken in (A) und (B) betragen 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Histologie
Die Netzhauthistologie wird durchgeführt, um die morphologischen Veränderungen von Netzhautzellen und -schichten zu visualisieren. Verschiedene Schritte, einschließlich der Wahl der fixativen Lösung, der Fixationsdauer, der Dehydratation und der Paraffinimprägnierung, müssen optimiert werden. Die Gewebegröße sollte 3 mm nicht überschreiten, da die fixative Penetration langsam wird. Das häufig verwendete 4%ige Paraformaldehyd führt aufgrund der relativ hohen Osmolarität der Lösung im Vergleich zu Kammerwasser und Glaskörper auch beim gesunden Auge zu einer Netzhautablösung, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt23. Die hohe Osmolarität der Lösung führt zu einer Volumenkontraktion und führt zu einer Schrumpfung des Gewebes. Die in diesem Protokoll verwendete Fixierlösung ist 1% Formaldehyd mit 1,25% Glutaraldehyd, das eine relativ geringere Osmolarität aufweist, die Gewebeverzerrung reduziert, die retinale Ablösung von der retinalen Pigmentepithelschicht minimiert und auch die Struktur in ihrem nativen Zustand bewahrt. Eine weitere Wahl der fixativen Lösung ist Essigsäure und Ethanol mit Formaldehyd. Der saure Zustand der fixativen Lösung kann bei der schnellen Fixierung des Gewebes helfen, während Ethanol das Eindringen in die fixative Lösung verbessert. Die Optimierung des Verhältnisses von Ethanol und Essigsäure ist jedoch unerlässlich, da eine übermäßige Konzentration zu einer Schrumpfung bzw. Schwellung des Gewebes führen kann24. Zu den Bewertungsparametern für eine erfolgreiche Gewebefixierung gehören die Ablösung der Netzhaut, intakte Netzhautschichten und Gewebeschrumpfung. Ein weiterer kritischer Faktor bei der Durchführung der Fixierung ist das Volumen der fixativen Lösung, das für eine ordnungsgemäße Fixierung mindestens 20 bis 25 Mal so groß sein sollte wie das Auge25. Darüber hinaus ist es wichtig, den Augapfel oder das Gewebe zu schwenken, wenn er von einer Lösung zur anderen übertragen wird, damit er nicht am Boden oder an den Wänden des Behälters haftet.
Eine unvollständige Gewebeverarbeitung, einschließlich Dehydratation und Imprägnierung mit Paraffin, kann Gewebe schrumpfen und trocknen, was sichtbar gemacht werden kann, wenn Depressionen auf der Oberfläche des Blocks auftreten. Darüber hinaus führt eine schlechte Gewebeverarbeitung auch zur Färbung von Abschnitten in Weiß, wenn sie Wasser ausgesetzt werden25. Wenn das Gewebe nicht richtig verarbeitet wird, kann es durch Xylol zurückgenommen werden, um Paraffin zu entfernen, gefolgt von einer Rehydratation im Downgradienten von Ethanol (dh 100% Ethanol, 90% Ethanol und 70% Ethanol). Wiederholen Sie erneut die Schritte von 1.3 bis 1.4, um Paraffinblöcke erfolgreich vorzubereiten.
Bei der Herstellung von Paraffinblöcken ist unbedingt darauf zu achten, dass das Gewebe von allen Seiten von Paraffin umgeben ist und keine Luftblasen zu sehen sind. Jeder Fehler bei der Vorbereitung des Blocks führt zu einem erfolglosen Schneiden von Gewebe. Manchmal wird der hintere Becher während der Verarbeitung gefaltet; An dieser Stelle kann es mit einer Pinzette (in erhitztem Paraffin) sanft auseinandergezogen werden, jedoch nicht in dem Maße, dass es das Gewebe schädigt. Angenommen, die Gewebeorientierung in Stahlform ist nicht wie gewünscht, während das Paraffin zu erstarren beginnt; In diesem Fall kann es wieder auf geschmolzenes Paraffin und Gewebe zurückgesetzt werden, um das Gewebe neu auszurichten, um Paraffinblöcke herzustellen. Achten Sie beim Übertragen des Gewebes in die Einbettungsform darauf, dass sich das Paraffin um das Gewebe nicht verfestigt. Es entsteht eine Haaransatztrennung zwischen dem Gewebe und dem Einbettungsmedium (Paraffin) in den Block25. Wenn dies geschieht, schmelzen Sie das Paraffin um das Gewebe herum, indem Sie es in heißes Paraffin geben und es erneut in die Stahlform geben.
Während des Schneidens muss die Klinge scharf genug sein, um entfaltete Gewebebänder zu erhalten. Verwenden Sie einen bestimmten Teil der Klinge nicht mehr als 30 Mal. Wenn der Block nicht richtig geschnitten wird, gehen Sie davon aus, dass die Klinge stumpf ist, und ersetzen Sie sie daher oder schärfen Sie sie erneut. Wenn die Abschnitte nicht ordnungsgemäß sind, könnte dies auch auf eine unsachgemäße Paraffinimprägnierung oder die Verwendung von altem Paraffin zur Imprägnierung und Vorbereitung von Blöcken zurückzuführen sein. Das Paraffin im Block kann eingeschmolzen werden, und frisches Paraffin kann verwendet werden, um den Block vorzubereiten. Um die unebenen Abschnitte zu vermeiden, drehen Sie das Rad des Mikrotoms langsam mit gleichmäßigen Drehungen anstelle von schnellen, ruckartigen Bewegungen.
Bei der Durchführung der Hämatoxylin- und Eosinfärbung ist die Optimierung des Zeitpunkts der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von entscheidender Bedeutung, da dies zu einer Unter- oder Überfärbung des Gewebes führen kann. Unsachgemäßes Schmelzen von Paraffin oder Rehydratation des Gewebes führt zu ungleichmäßiger Färbung. Es kann als die weißen Abschnitte auf der Folie visualisiert werden. Dehydrieren Sie das Gewebe und schmelzen Sie Paraffin erneut in einem Heißluftofen, gefolgt von den in Tabelle 1 genannten Schritten. Darüber hinaus ist einer der häufigsten Fehler, die während der H & E-Färbung auftreten, die Verwendung von Alkohol als Dehydrant nach der Eosin-Färbung. Übermäßiger Alkoholkonsum könnte zu einer Unterfärbung von Zytoplasma und Einschlusskörpern führen, was zu schlecht gefärbten Abschnitten führen kann25. Die Verwendung von Mountant-Medium sollte unmittelbar nach dem Entfernen von überschüssigem Xylol erfolgen und das Austrocknen von Xylol vermeiden, da dies zu einer Verzerrung des Gewebes führen kann. Auch wässriges Mountant (wie Glycerin in PBS) muss vermieden werden, da sich das Gewebe in einem dehydrierten Zustand befindet. Wässriger Mountant dringt nicht in das Gewebe ein und führt zu verschwommenen Bildern.
Nach der Optimierung aller oben genannten Schritte werden die Forscher in der Lage sein, die Histologie erfolgreich durchzuführen. Es dauert etwa drei Versuche, um die gewünschte fixative Lösung auszuwählen und andere Prozessparameter zu optimieren.
Blut-Netzhaut-Schrankenabbau
Der heikelste Schritt in dieser Technik ist die Isolierung des Glaskörpers vom Auge. Es wird am besten mit einem frischen Auge durchgeführt. Die Verwendung von Trockeneis wird zur einfachen Isolierung von Glaskörpern empfohlen, insbesondere wenn der Glaskörper an der Netzhaut haftet. Oft kann eine Linsen- oder Netzhautmischung mit Glaskörper durch Trübung des Glaskörpers aufgrund von Netzhaut identifiziert werden. Diese Probleme können in der Regel durch das Einfrieren vermieden werden. Wenn sich die Glaskörpermarkierungen jedoch neben der Linse befinden, können sie durch Schneiden am Schnittpunkt der Linse und des Glaskörpers mit einer Mikroschere getrennt werden. Wenn die Netzhaut zusammen mit dem Glaskörper herausgezogen wird, kann die Netzhaut Stück für Stück mit einer Mikropinzette entfernt werden. Die Verwendung der Filterzentrifugation wird auch für eine einfache Isolierung des Glaskörpers von der Linse und Retina26 empfohlen. Da Glaskörper eine gelartige Struktur sind, muss er für eine homogene Mischung von Proteinen homogenisiert werden. Normalerweise, wie in Schritt 2.2.1 erwähnt, ist ein einziger Homogenisierungszyklus für eine ordnungsgemäße Homogenisierung ausreichend, die durch Verflüssigung von Glaskörper bei der Zentrifugation identifiziert werden kann. Wenn die Gelnatur des Glaskörpers nach der Zentrifugation beobachtet wird, wiederholen Sie die Homogenisierung (Schritt 2.2.1). Die Proteinquantifizierung kann mit jeder Kit-Methode durchgeführt werden, sollte jedoch empfindlich auf den Nachweis der niedrigen Proteinspiegel im Glaskörper bis zu 2 μg / μL reagieren.
Fluoreszenz-Angiographie
Diese Technik zielt darauf ab, das Gefäßnetzwerk der Netzhaut sichtbar zu machen, und daher muss der Farbstoff gleichmäßig in die retinalen Mikrogefäße gelangen. Um dies zu gewährleisten, können verschiedene Schritte optimiert werden, wie z.B. die Injektionsstelle und die Umwälzzeit. Ein Farbstoff kann durch Schwanzveneninjektion oder Herzinjektion injiziert werden. Bei der kardialen Injektion besteht die Gefahr, dass der Farbstoff an einer anderen Stelle als dem Herzen injiziert wird, wenn er nicht gut trainiert ist; Daher ist eine Schwanzveneninjektion bevorzugt. Die Identifizierung der Seitenvene ist jedoch einfach, wenn sie in warmes Wasser (37-40 ° C) getaucht und mit 70% Ethanol gereinigt wird. Ethanol hilft, die Blutgefäße zu erweitern, was beim Zugang zum Ort der Vene helfen kann. Es ist auch wichtig, dass der Farbstoff nur in die Vene injiziert wird. Das Versäumnis, Farbstoff in die Schwanzvene zu injizieren, kann durch Widerstand während der Injektion des Farbstoffs oder Ausbuchtung des nahe gelegenen Bereichs aufgrund der subkutanen Injektion gefühlt werden. Die Nadel kann entfernt und wieder an einer anderen Stelle des Schwanzes eingesetzt werden. Eine erfolgreiche Schwanzveneninjektion kann auch durch erzwungenes Wasserlassen der Ratte visualisiert werden; Die Farbe des Farbstoffs ist im Rattenurin innerhalb von 30 bis 40 s sichtbar.
Auch die Umlaufzeit ist wesentlich; In der Regel reichen 5 bis 10 min aus, um Farbstoffe in Netzhautgefäßen erfolgreich zirkulieren zu lassen. Eine flache Halterung kann in einem frischen Auge oder einem festen Auge hergestellt werden. Die Vorbereitung einer flachen Halterung in einem frischen Auge kann eine Herausforderung sein, aber sobald sie gemeistert ist, wird die Technik am meisten bevorzugt, da während der Fixierung der Farbstoff in der fixativen Lösung austritt27. Daher sollte die Fixierung nicht länger als 30 Minuten für das ganze Auge verlängert werden. Bei Schwierigkeiten bei der Trennung der frischen Netzhaut kann sie sogar in eine Fixierlösung (4% Formaldehyd) fixiert werden, nachdem die hintere Tasse 15 bis 20 min von der vorderen Tasse getrennt wurde. Es wird oft gesehen, dass der Farbstoff aus den Blutgefäßen in das umgebende Gewebe austritt, auch in einer gesunden Netzhaut. Dies könnte auf eine übermäßige Fixierung zurückzuführen sein; Daher sollte die für die Fixierung benötigte Zeit optimiert werden. Es verbessert nur die einfache Isolierung der Netzhaut und bewahrt die Struktur für die zukünftige Verwendung. Darüber hinaus kann eine erhöhte Durchblutungszeit von Farbstoff im Tier auch zu Farbstoffaustritt aus Netzhautgefäßen in das umgebende Gewebe führen, was optimiert werden muss.
Die Größe von FITC-Dextran ist wichtig, da Farbstoffe mit höherem Molekulargewicht nicht in Mikrogefäße gelangen. Im Gegensatz dazu tritt Farbstoff mit niedrigerem Molekulargewicht aus neuen Gefäßen der gesunden Netzhaut28 aus. Daher wird FITC-Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 kD bevorzugt, um eine Fluoreszenzangiographie durchzuführen, um Leckagen und Gefäße in der Netzhaut sichtbar zu machen. Eine signifikante Einschränkung dieser Technik ist jedoch die Dauer der Entwicklung der Neovaskularisation bei diabetischen Ratten und das invasive Verfahren der Studie, das in Zukunft durch nicht-invasive Techniken wie Elektroretinogramm, Fundus und andere nicht-invasive optische Instrumente ersetzt werden könnte.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) zur Förderung von Dr. Nirmal J. Wir möchten uns auch bei der University Grant of Commission für die Bereitstellung eines Junior Research Fellowship für Manisha Malani und der Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, für die Bereitstellung infrastruktureller Einrichtungen bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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