Summary
La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La histología, el ensayo de ruptura de la barrera hematoencefaliana y la angiografía por fluorescencia son técnicas valiosas para comprender la fisiopatología de la retina, lo que podría mejorar aún más la detección eficaz de medicamentos contra la retinopatía diabética.
Abstract
Una enfermedad ocular del segmento posterior como la retinopatía diabética altera la fisiología de la retina. La retinopatía diabética se caracteriza por un desprendimiento de retina, ruptura de la barrera sangre-retina (BRB) y angiogénesis retiniana. Un modelo de rata in vivo es una valiosa herramienta experimental para examinar los cambios en la estructura y función de la retina. Proponemos tres técnicas experimentales diferentes en el modelo de rata para identificar cambios morfológicos de las células de la retina, la vasculatura retiniana y el BRB comprometido. La histología retiniana se utiliza para estudiar la morfología de varias células de la retina. Además, la medición cuantitativa se realiza mediante el recuento de células de la retina y la medición del grosor de diferentes capas de la retina. Un ensayo de descomposición de BRB se utiliza para determinar la fuga de proteínas extraoculares del plasma al tejido vítreo debido a la descomposición de BRB. La angiografía por fluorescencia se utiliza para estudiar la angiogénesis y la fuga de vasos sanguíneos mediante la visualización de la vasculatura retiniana con el tinte FITC-dextrano.
Introduction
La retinopatía diabética (RD) es una de las complicaciones secundarias más complejas de la diabetes mellitus. También es la principal causa de ceguera prevenible en la población en edad de trabajar en todo el mundo. En un metaanálisis reciente de 32,4 millones de personas ciegas, 830.000 (2,6%) personas eran ciegas debido a dr1. La proporción de pérdida de visión atribuida a la diabetes ocupó el séptimo lugar en 2015 con un 1,06% (0,15-2,38) a nivel mundial2,3.
La retinopatía diabética se diagnostica por anomalías vasculares en los tejidos oculares posteriores. Clínicamente, se divide en dos etapas: DR no proliferativa (NPDR) y DR proliferativa (PDR), según la vascularización en la retina. La hiperglucemia es considerada el potente regulador de la RD ya que implica varias vías implicadas en la neurodegeneración4,5, la inflamación6,7 y la microvasculatura8 en la retina. Las múltiples complicaciones metabólicas inducidas debido a la hiperglucemia incluyen la acumulación de productos finales de glicación avanzada (AGE), la vía del poliol, la vía de la hexosamina y la vía de la proteína quinasa-C. Estas vías son responsables de la proliferación celular (células endoteliales), la migración (pericitos) y la apoptosis (células retinianas neurales, pericitos y células endoteliales) basadas en diferentes etapas de la retinopatía diabética. Estas alteraciones metabólicas pueden conducir a cambios fisiológicos como desprendimiento de retina, pérdida de células retinianas, ruptura de la barrera sangre-retina (BRB), aneurismas y angiogénesis9.
La diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina (STZ) es una práctica bien establecida y bien aceptada en ratas para evaluar la patogénesis de la diabetes y sus complicaciones. Los efectos diabetogénicos de la STZ se deben a la destrucción selectiva de las células β de los islotes pancreáticos10. Como resultado, los animales sufrirán deficiencia de insulina, hiperglucemia, polidipsia y poliuria, todas las cuales son características de la diabetes mellitus tipo 1 humana11. Para la inducción de diabetes grave, STZ se administra a 40-65 mg / kg de peso corporal por vía intravenosa o intraperitoneal durante la edad adulta. Después de aproximadamente 72 h, estos animales presentan niveles de glucosa en sangre superiores a 250 mg/dL10,12.
Para comprender las alteraciones fisiológicas de la retina debidas a la neurodegeneración, la inflamación y la angiogénesis, se deben optimizar diferentes técnicas en modelos animales experimentales. Los cambios estructurales y funcionales en las células de la retina y los vasos retinianos se pueden estudiar mediante diversas técnicas, como la histología, el ensayo de descomposición de BRB y la angiografía por fluorescencia.
La histología implica el estudio de la anatomía de las células, tejidos y órganos a nivel microscópico. Establece una correlación entre la estructura y la función de las células/tejidos. Se realizan varios pasos para visualizar e identificar las alteraciones microscópicas en la estructura tisular, comparando así contrapartes sanas y enfermas13. Por lo tanto, es esencial estandarizar cada paso de la histología meticulosamente. Varios pasos involucrados en la histología retiniana son la fijación de la muestra, el recorte de la muestra, la deshidratación, el aclaramiento, la impregnación con parafina, la incrustación de parafina, la seccionamiento y la tinción (tinción de hematoxilina y eosina)13,14.
En una retina sana, el transporte de moléculas a través de la retina está controlado por BRB, compuesto por células endoteliales y pericitos en el lado interno, y células epiteliales pigmentarias de la retina en el lado externo. Sin embargo, las células endoteliales internas del BRB y los pericitos comienzan a degenerar durante la enfermedad, y el BRB también se ve comprometido15. Debido a esta descomposición del BRB, muchas moléculas de bajo peso molecular se filtran en el tejido vítreo y retiniano16. A medida que la enfermedad progresa, muchas otras moléculas de proteínas (bajo y alto peso molecular) también se filtran en el tejido vítreo y retiniano debido a la alteración de la homeostasis17. Conduce a varias otras complicaciones y, en última instancia, edema macular y ceguera. Por lo tanto, cuantificar los niveles de proteínas en el vítreo y comparar los estados saludables y diabéticos compromete las medidas de BRB.
La angiografía por fluorescencia es una técnica utilizada para estudiar la circulación sanguínea de la retina y la coroides utilizando tinte fluorescente. Se utiliza para visualizar la vasculatura de la retina y la coroides mediante la inyección de colorante de fluoresceína por vía intravenosa o inyección cardíaca18. Una vez que se inyecta el tinte, primero llega a las arterias de la retina, seguido de las venas de la retina. Esta circulación de tinte generalmente se completa dentro de los 5 a 10 minutos posteriores a la inyección de tinte19. Es una técnica importante para diagnosticar diversas enfermedades oculares del segmento posterior, incluyendo la retinopatía diabética y la neovascularización coroidea20. Ayuda a detectar cambios en la vasculatura mayor y menor en condiciones normales y enfermas.
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Protocol
Este protocolo sigue todas las pautas de cuidado animal proporcionadas por el Comité Institucional de Ética Animal, BITS-Pilani, campus de Hyderabad.
1. Histología de la retina
- Enucleación y fijación del ojo
- Sacrificar a una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas de edad) utilizando una dosis alta de pentobarbital (150 mg / kg) inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún latido cardíaco detectable confirma la muerte dentro de 2-5 min.
- Enucle el ojo haciendo incisiones usando una cuchilla de bisturí en las regiones nasal y temporal del ojo. Luego corte a lo largo de sus bordes usando fórceps y micro tijeras para extraer el ojo de la cavidad orbitaria.
NOTA: Antes de sacrificar ratas, mantenga las soluciones fijadoras listas.
PRECAUCIÓN: El formaldehído irrita la piel, los ojos, la nariz y las vías respiratorias. También puede causar cáncer, ya que es un potente sensibilizador de la piel. Use guantes y manipule debajo del capó21. - Lave bien el ojo con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de Petri para eliminar la sangre. Retire el exceso de grasa que rodea el ojo para facilitar la penetración de la solución fijadora.
- Coloque inmediatamente el ojo en 5 ml de solución fijadora con la ayuda de fórceps y asegúrese de que no esté pegado a las paredes de los viales de vidrio. Revuelva suavemente durante unos segundos y reemplace la tapa con el etiquetado adecuado. Incubar el ojo en solución fijadora durante 24 a 48 h en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente.
- Recorte de tejido
- Después de la fijación, retire el ojo de la solución fijadora, lávelo con 10 ml de PBS y colóquelo en una placa de Petri que contenga 10 ml de PBS refrigerado a 4 °C.
- Usando micro pinzas, sostenga el ojo con el nervio óptico y haga un corte en pars plana con la ayuda de micro tijeras. Corte a través de todo el margen de la córnea para separar la copa anterior de un ojo. Usando fórceps, levante la lente suavemente, deséchela y corte el nervio óptico.
- Usando micro tijeras curvas, hacer una sección longitudinal del ocular posterior, pasando a través del disco óptico dividiéndolo en dos mitades. Colóquelo en la base del cassette y cierre la tapa correctamente sin ninguna perturbación en el tejido. Etiquete los casetes con el nombre y la fecha de la muestra de tejido.
- Deshidratación, limpieza e impregnación de parafina del tejido
- Deshidratar el tejido recortado por transferencia gradual en 80 mL de 50%, 70%, 90% y 100% etanol. Mientras transfiere los casetes de una concentración a otra, asegúrese de aplicarlos en papel de seda limpio para minimizar la contaminación.
NOTA: Permita que el tejido permanezca de pie en cada transferencia durante 30 minutos (dos veces). El tiempo total consumido para este paso es de aproximadamente 4 h. - Tras la deshidratación, transfiera los casetes a 80 ml de xileno durante 30 minutos (dos veces) para reemplazar el etanol con xileno.
NOTA: Después de la incubación con xileno, el tejido se vuelve translúcido.
PRECAUCIÓN: El xileno es un compuesto aromático con un anillo de benceno. Irrita el ojo y la membrana mucosa y también puede causar depresiones. - Finalmente, impregne el tejido con parafina precalentada a 60 °C para reemplazar el xileno en el tejido. Frote los casetes varias veces en papel de seda para minimizar el contenido de xileno y colóquelos en 200 ml de parafina (líquido a 60 °C) durante 2 h (1 h x 2).
PRECAUCIÓN: Evite inhalar parafina derretida, ya que produce pequeñas gotas de lípidos que pueden causar molestias respiratorias.
- Deshidratar el tejido recortado por transferencia gradual en 80 mL de 50%, 70%, 90% y 100% etanol. Mientras transfiere los casetes de una concentración a otra, asegúrese de aplicarlos en papel de seda limpio para minimizar la contaminación.
- Incrustación de parafina
- Encienda la máquina de incrustación de parafina al menos 1 h antes de usarla para fundir la parafina y para que las estaciones alcancen las temperaturas deseadas. Llene un molde de acero con cera de parafina derretida colocándola sobre una superficie caliente, luego retire un cassette a la vez del recipiente de parafina.
- Mueva el molde de acero de una superficie caliente a una fría (4 °C). En este punto, la cera en el molde comenzará a solidificarse. Antes de que se solidifique por completo, coloque el tejido en cera con la ayuda de fórceps y oriente el tejido de modo que la porción del disco óptico de la copa posterior esté orientada hacia la base del molde.
NOTA: Asegúrese de que el tejido no se mueva y mantenga la orientación deseada. De lo contrario, vuelva a colocar el molde en la superficie de trabajo caliente hasta que toda la parafina se licúe, luego comience de nuevo con el paso 1.4.2. - A medida que la cera en el molde comienza a solidificarse, coloque inmediatamente la base del cassette sobre el molde. Llene cuidadosamente el molde con parafina por encima del borde superior del cassette y transfiéralo lentamente a una superficie fría (cerca de -20 ° C) para una solidificación rápida. Hasta que se solidifique, repita el proceso con otros casetes del paso 1.4.2.
- Una vez que todos los moldes estén solidificados, separe el molde de acero del cassette. Si es difícil, espere un poco más e inténtelo de nuevo (no lo retire con fuerza). La separación se vuelve más fácil después de la solidificación completa. Ahora el cassette se convierte en la base del bloque de parafina que se sujetará durante el seccionamiento por microtomo.
NOTA: Este bloque se puede almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. En este punto, el proceso se puede detener y continuar más tarde (si es necesario).
- Seccionamiento
- Instale una cuchilla de microtomo desechable en el soporte de la cuchilla. Retire el exceso de cera de parafina alrededor de los casetes para que tanto la parte superior como la inferior de los bloques permanezcan paralelas al cuchillo. Coloque el bloque en el soporte del cassette.
- Desbloquea el volante de mano para avanzarlo hasta que la superficie del bloque esté en contacto con el filo del cuchillo. Recorte el exceso de cera de parafina en el bloque hasta que el tejido se visualice en la superficie del bloque. Ajuste el grosor de la sección a 5 μm y corte una cinta de cinco a seis secciones.
- Con fórceps, transfiera suavemente la cinta a la superficie del baño de agua precalentada (alrededor de 50 °C) para desplegar la cinta. Recoge secciones en un portaobjetos de vidrio recubierto con albúmina de Mayer sosteniendo la diapositiva debajo de la sección. Levante suavemente las secciones y deje que los toboganes se sequen horizontalmente durante la noche a 37 °C.
NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a temperatura ambiente en cajas secas durante varios meses. En este paso, el proceso se puede detener y continuar más tarde.
- Tinción
- Calentar los portaobjetos a teñir en un horno de aire caliente a 60 °C durante 1 h antes de usar para que la parafina se derrita, y siga los pasos mencionados en la Tabla 1.
PRECAUCIÓN: Las manchas de hematoxilina y eosina son tóxicas cuando se inhalan o ingieren. Se ha informado que son cancerígenos.
- Calentar los portaobjetos a teñir en un horno de aire caliente a 60 °C durante 1 h antes de usar para que la parafina se derrita, y siga los pasos mencionados en la Tabla 1.
| Reactivo | Tiempo de pie | Repetición (Número de veces) |
| Xileno | 5 minutos | 2 |
| 100% Etanol | 5 minutos | 2 |
| 90% Etanol | 5 minutos | 2 |
| 70% Etanol | 5 minutos | 2 |
| 50% Etanol | 5 minutos | 2 |
| Agua | 5 minutos | 2 |
| Hematoxilina | 4 minutos | 1 |
| Lavado con agua | ||
| 1% de alcohol ácido en etanol al 70% | 30 s | 1 |
| Lavado con agua | ||
| El agua de Scott | 1 min | 1 |
| Lavado con agua | ||
| 50% Etanol | 1 min | 1 |
| 95% Etanol | 1 min | 1 |
| 0.25% Eosina | 5 s | 1 |
| Lavado con agua | ||
| Agua | 2 min | 1 |
| 95% Etanol | 1 min | 1 |
| 100% Etanol | 1 min | 1 |
| Xileno | 5 minutos | 2 |
| Montante y funda | ||
Tabla 1. Procedimiento de tinción de hematoxilina y eosina
2. Ensayo de ruptura de la barrera hematoencefálica
- Recolección de sangre y vítreo
- Anestesiar a una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas) usando ketamina (80 mg / kg) y xilazina (8 mg / kg). Confirme el estado anestésico mediante el reflejo de extracción del pedal (pellizco del dedo del pie). Recolecte inmediatamente 1 ml de sangre por punción cardíaca en un tubo recubierto de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para separar el plasma de la sangre total.
- Eutanasiar a la rata usando una dosis alta de pentobarbital (150 mg/kg), inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún latido cardíaco detectable confirma la muerte dentro de 2-5 min. Enucle el ojo e inmediatamente colóquelo sobre hielo seco.
- Coloque el ojo en una placa de Petri limpia sobre hielo seco (recomendado) y comience a diseccionar el ojo como se menciona en el paso 1.2.2.
- Retire la lente, extraiga el vítreo con cuidado de la copa posterior con micro pinzas y colóquelo en un tubo de homogeneización que contenga de tres a cuatro cuentas de vidrio (2-4 mm).
NOTA: Se recomienda la disección en hielo seco ya que la eliminación del cristalino y el vítreo es más fácil en condiciones de congelación.
- Preparación de muestras
- Homogeneizar el humor vítreo en un homogeneizador de cuentas a velocidad media durante 10 s.
- Transfiera la sangre (1 ml) y las muestras vítreas (10-20 μL) a los tubos de la microcentrífuga y centrifugue ambas muestras a 5200 x g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: En el caso de una homogeneización exitosa, el vítreo tiene una consistencia uniforme después de la centrifugación. Sin embargo, en el caso de consistencia no uniforme del vítreo, repetir a partir del paso 2.2.1 con mayor tiempo de homogeneización. - Recolecte sobrenadante de ambas muestras y diluya el humor vítreo y las muestras de plasma en proporción 1:10 y 1:20, respectivamente, con PBS.
- Cuantificación de proteínas y relación proteína vítreo-plasma
- Para cuantificar la concentración de proteínas en muestras de humor vítreo y plasma, agregue 5 μL de muestras diluidas a 250 μL de reactivo Bradford, mezcle bien y lea la absorbancia a 590 nm en 40 min.
NOTA: Si el valor de absorción de las muestras es superior a 1.0, diluya aún más las muestras y repita el procedimiento del paso 2.2.3. - Normalizar el nivel de proteína vítrea a nivel de proteína plasmática de la misma rata y medir la diferencia de pliegue entre ratas sanas vs. diabéticas.
- Para cuantificar la concentración de proteínas en muestras de humor vítreo y plasma, agregue 5 μL de muestras diluidas a 250 μL de reactivo Bradford, mezcle bien y lea la absorbancia a 590 nm en 40 min.
3. Angiografía por fluorescencia
- Inyección de colorante FITC-dextran70000
- Anestesiar una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas) utilizando isoflurano al 3% y confirmar el reflejo de extracción del pedal (pellizco del dedo del pie). Sumerja la cola en un vaso de precipitados que contenga agua tibia (37-40 °C). Limpie la cola con etanol al 70% antes de inyectar el tinte. Localice la vena lateral de la cola y marque la posición de inyección en la parte inferior de la cola.
NOTA: Si la inserción de la aguja falla, intente insertarla en otra ubicación por encima de la posición actual (punta a la base de la cola). Sin embargo, se recomienda inyectarse una vez, ya que los pinchazos repetidos pueden conducir al desarrollo de estrés en la rata, lo que podría causar vasoconstricción. - Inyecte 1 ml de solución de tinte FITC-dextran70000 de 50 mg/ml a través de la vena de la cola y deje que el tinte circule durante 5 min. Eutanasiar a la rata con una dosis alta de pentobarbital (150 mg / kg), inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún latido cardíaco detectable confirma la muerte dentro de 2-5 min. Enucle el ojo como se menciona en el paso 1.1.1.
NOTA: Si es necesario, el ojo se puede fijar en solución de formaldehído al 4%, durante no más de 30 min.
- Anestesiar una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas) utilizando isoflurano al 3% y confirmar el reflejo de extracción del pedal (pellizco del dedo del pie). Sumerja la cola en un vaso de precipitados que contenga agua tibia (37-40 °C). Limpie la cola con etanol al 70% antes de inyectar el tinte. Localice la vena lateral de la cola y marque la posición de inyección en la parte inferior de la cola.
- Preparación de montaje plano
- Para preparar soportes planos, mantenga las herramientas de disección listas junto con las diapositivas y los cubrebocas. Coloque el ojo en una placa de Petri llena de PBS refrigerado y comience a diseccionar el ojo como se menciona en el paso 1.2.2.
- Ahora coloque la punta de un forceps puntiagudo entre la esclerótica y la retina. Muévalo suavemente a lo largo del borde de la copa, asegurándose de que la retina no esté unida a la esclerótica en ningún momento. Si hay alguna obstrucción, corte lentamente esa porción a lo largo del borde con micro tijeras curvas.
- Una vez que se confirma que la retina no está unida a la esclerótica desde ningún lado, corte cerca del disco óptico, haciendo un pequeño orificio tal que la retina se desprenda completamente de la esclerótica. Empuje lentamente la retina en la solución de PBS y colóquela en un portaobjetos plano limpio con la ayuda de una espátula o fórceps.
- Usando micro tijeras o cuchillas de bisturí, haga cortes menores en el tejido de la retina, dividiéndolo en cuatro cuadrantes. Asegúrese de que los cortes estén al menos a 2 mm de distancia del orificio dejado por el disco óptico en el centro, como se muestra en la Figura 1.
- Retire el exceso de PBS de los lados del tejido con puntas de 0,2 ml sin perturbar el soporte plano.
- Coloque una gota de medio de montaje antidesvanecimiento (50 μL a 100 μL) en un soporte plano, cúbralo con un estuche y visualice inmediatamente bajo un microscopio confocal.
NOTA: Mantenga la luz mínima durante todo el procedimiento.
- Visualización de montaje plano
- Visualice el montaje plano bajo el objetivo 10x de un microscopio confocal. Realice el escaneo de mosaicos para capturar todo el montaje plano como una sola imagen. El número de baldosas depende del tamaño de la montura plana retinal. Además, realice el apilamiento Z para visualizar las venas y arterias en diferentes focos (el tamaño preferido para la pila Z es de 5 μm, dependiendo de cuál, el número de pasos de la pila Z varía).
- Utilice el detector PMT y HyD en % de ganancia como 700-900 y 100-150, respectivamente. Elija el rango de emisión entre 510-530 nm para el tinte FITC-dextrano.
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Representative Results
Histología retiniana
En la retina diabética, las células de la retina sufren degeneración. Además, el grosor de las capas retinianas aumenta debido al edema22. Las imágenes obtenidas después de la tinción de hematoxilina y eosina se pueden utilizar para el recuento celular y la medición del grosor de diferentes capas, como se muestra en la Figura 2 utilizando ImageJ.
Ensayo de ruptura de la barrera sangre-retina
A medida que el BRB se ve comprometido en ratas diabéticas, la fuga se vuelve prominente, lo que lleva a la acumulación de biomoléculas del plasma a la retina y el vítreo. En ratas diabéticas, la fuga de proteínas del plasma al vítreo es alrededor de tres veces mayor en comparación con las ratas sanas (Figura 3). La proteína se puede estimar utilizando cualquier método de kit como el método de Lowry, el método de ácido bicinconinico (BCA) o el método de Bradford (mencionado en este artículo, sección 2.3). Se recomienda diseccionar el ojo recién hecho, ya que un retraso en el procesamiento podría conducir a una fuerte adhesión vítrea con la retina, lo que dificulta la separación. La separación inadecuada del vítreo de la retina puede conducir a resultados falsos positivos.
Angiografía por fluorescencia
Esta técnica se utiliza para visualizar la fuga y la vasculatura de la retina, incluida la micro y macro vasculatura. La selección del tamaño de FITC-dextran se basa en su aplicación para diversos estudios. El FITC-dextrano de bajo peso molecular, que varía de 4 a 6 kDa, se utiliza para visualizar fugas en la vasculatura. Por el contrario, las moléculas de FITC-dextrano de alto peso molecular, que van desde 70 kDa a 2 millones de Da, se utilizan para visualizar la angiogénesis. La inyección exitosa de tinte da como resultado la visualización de toda la vasculatura de la montura plana de la retina, como se muestra en la Figura 4. Las imágenes obtenidas después de la microscopía confocal se pueden utilizar para determinar el área de vasculatura ocupada en toda la retina utilizando el software ImageJ para comparar grupos sanos y enfermos.
Figura 1. Preparación de montaje plano retiniano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes histológicas de retina sana vs. diabética. (A) y (B) representan las imágenes retinianas teñidas de H&E de control (A) y rata diabética (B) por debajo de 40x. El grosor total de la retina y cada capa aumenta en condiciones diabéticas (C). Abreviaturas: PRL = capa fotorreceptora, ONL = capa nuclear externa, OPL = capa plexiforme externa, INL = capa nuclear interna, IPL = capa plexiforme interna y GCL = capa celular ganglionar. Los datos se representan como media ± DE. * representa una diferencia significativa con respecto al grupo control (P < 0,0001), mientras que # representa una diferencia significativa con respecto al grupo control en P < 0,05, obtenido por la prueba ANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ruptura de la barrera sangre-retina en ratas sanas vs. diabéticas. El gráfico representa la proporción de proteínas plasmáticas vítreas de ratas sanas vs. diabéticas. Los datos se representan como media ± SEM. * representa una diferencia significativa con respecto al grupo control (P < 0,01) obtenido por la prueba t no apareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Angiografía por fluorescencia de la vasculatura retiniana. (A) y (B) representan un montaje plano de retina visualizado por escaneo de mosaicos y uniendo las imágenes por debajo de 10x. (A) representa la retina de control, (B) representa la retina diabética. La flecha blanca indica fuga. Todas las imágenes se obtuvieron por pila Z (espesor de 5 μm). Las barras de escala en (A) y (B) son de 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Histología
La histología retiniana se realiza para visualizar los cambios morfológicos de las células y capas de la retina. Se deben optimizar varios pasos, incluida la elección de la solución fijadora, la duración de la fijación, la deshidratación y la impregnación de parafina. El tamaño del tejido no debe exceder los 3 mm, ya que la penetración del fijador se vuelve lenta. El paraformaldehído al 4% comúnmente utilizado conduce al desprendimiento de retina incluso en el ojo sano debido a la osmolaridad relativamente alta de la solución en comparación con el humor acuoso y el humor vítreo, lo que conduce a resultados falsos positivos23. La alta osmolaridad de la solución resulta en la contracción del volumen y conduce a la contracción de los tejidos. La solución fijadora utilizada en este protocolo es formaldehído al 1% con glutaraldehído al 1,25%, que tiene relativamente menos osmolaridad, reduce la distorsión tisular, minimiza el desprendimiento de retina de la capa epitelial pigmentaria de la retina y también conserva la estructura en su estado nativo. Otra opción de solución fijadora es el ácido acético y el etanol con formaldehído. La condición ácida de la solución fijadora puede ayudar en la fijación rápida del tejido, mientras que el etanol mejora la penetración de la solución fijadora. Sin embargo, la optimización de la proporción de etanol y ácido acético es esencial, ya que el exceso de concentración puede conducir a la contracción o hinchazón del tejido, respectivamente24. Los parámetros de evaluación para una fijación tisular exitosa incluyen desprendimiento de la retina, capas retinianas intactas y contracción del tejido. Otro factor crítico al realizar la fijación es el volumen de solución fijadora, que debe ser de al menos 20 a 25 veces el tamaño del ojo para una fijación adecuada25. Además, es importante girar el globo ocular o el tejido cada vez que se transfiere de una solución a otra, para que no se pegue al fondo o las paredes del recipiente.
El procesamiento incompleto del tejido, incluida la deshidratación y la impregnación con parafina, puede encoger y secar el tejido, que se puede visualizar cuando se produce depresión en la superficie del bloque. Además, un procesamiento deficiente de los tejidos también dará como resultado la coloración de las secciones en blanco cuando se expone al agua25. Si el tejido no se procesa correctamente, se puede recuperar a través del xileno para eliminar la parafina, seguido de la rehidratación en el gradiente descendente de etanol (es decir, 100% etanol, 90% etanol y 70% etanol). Una vez más, repita los pasos de 1.3 a 1.4 para preparar con éxito los bloques de parafina.
Al preparar bloques de parafina, es esencial asegurarse de que el tejido esté rodeado por todos los lados por parafina y no se vean burbujas de aire. Cualquier error en la preparación del bloque conducirá a una seccionamiento infructuoso del tejido. A veces, la copa posterior se dobla durante el procesamiento; en este punto, se puede separar suavemente usando fórceps (en parafina calentada) pero no en la medida en que dañe el tejido. Supongamos que la orientación del tejido en el molde de acero no es la deseada mientras la parafina comienza a solidificarse; en ese caso, se puede volver a poner en parafina y tejido derretido para reorientar el tejido para preparar bloques de parafina. Además, mientras transfiere el tejido al molde de incrustación, asegúrese de que la parafina alrededor del tejido no se solidifique. Crea una separación de la línea del cabello entre el tejido y el medio de incrustación (parafina) en el bloque25. Si sucede, derrita la parafina alrededor del tejido colocándola en parafina caliente y colocándola en el molde de acero nuevamente.
Durante la sección, la cuchilla debe ser lo suficientemente afilada como para dar cintas desplegadas de tejido. No use una porción particular de la cuchilla más de 30 veces. Si el bloque no se secciona correctamente, asuma que la cuchilla es roma y, por lo tanto, reemplácela o vuelva a afilarla. Si las secciones no son adecuadas, también podría deberse a una impregnación inadecuada de parafina o al uso de parafina vieja para impregnar y preparar bloques. La parafina en el bloque se puede fundir y se puede usar parafina fresca para preparar el bloque. Para evitar las secciones irregulares, gire la rueda del microtomo lentamente con giros uniformes en lugar de movimientos rápidos y bruscos.
Al realizar la tinción de hematoxilina y eosina, la optimización del tiempo de tinción de hematoxilina y eosina es fundamental, ya que puede provocar tinciones insuficientes o excesivas de los tejidos. La fusión inadecuada de la parafina o la rehidratación del tejido conducirán a una tinción desigual. Se puede visualizar como las secciones blancas de la diapositiva. Deshidratar el tejido y derretir de nuevo la parafina en un horno de aire caliente, seguido de los pasos mencionados en la Tabla 1. Además, uno de los errores comunes realizados durante la tinción de H&E es el uso de alcohol como deshidratante después de la tinción de Eosin. El consumo excesivo de alcohol puede conducir a una tinción insuficiente del citoplasma y de los cuerpos de inclusión, lo que puede dar lugar a secciones mal teñidas25. El uso de medio de montaje debe hacerse inmediatamente después de eliminar el exceso de xileno y evitar el secado del xileno, ya que puede provocar la distorsión del tejido. Además, se debe evitar el montante de base acuosa (como el glicerol en PBS) ya que el tejido está en un estado deshidratado. El montante de base acuosa no penetra en el tejido y da como resultado imágenes borrosas.
Al optimizar todos los pasos mencionados anteriormente, los investigadores podrán realizar la histología con éxito. Se necesitan alrededor de tres intentos para elegir la solución fijadora deseada y optimizar otros parámetros del proceso.
Ruptura de la barrera sangre-retina
El paso más delicado en esta técnica es el aislamiento del vítreo del ojo. Se realiza mejor en un ojo fresco. Se recomienda el uso de hielo seco para facilitar el aislamiento del vítreo, especialmente si los restos vítreos están adheridos a la retina. A menudo, la mezcla de lente o retina con vítreo se puede identificar por turbidez de vítreo debido a la retina. Estos problemas generalmente se pueden evitar utilizando condiciones de congelación. Sin embargo, si las etiquetas vítreas están al lado de la lente, se pueden separar cortando en la intersección de la lente y vítreas usando micro tijeras. Si la retina se extrae junto con el vítreo, la retina se puede extraer pieza por pieza utilizando micro fórceps. También se sugiere el uso de la centrifugación por filtro para facilitar el aislamiento del vítreo del cristalino y la retina26. Como el vítreo es una estructura similar a un gel, necesita homogeneización para una mezcla homogénea de proteínas. Por lo general, como se menciona en el paso 2.2.1, un solo ciclo de homogeneización es suficiente para una homogeneización adecuada, que se puede identificar mediante la licuación del humor vítreo en la centrifugación. Si se observa la naturaleza gelatinosa del vítreo después de la centrifugación, repita la homogeneización (paso 2.2.1). La cuantificación de proteínas se puede realizar utilizando cualquier método de kit, pero debe ser sensible a la detección de los bajos niveles de proteína en vítreos de hasta 2 μg / μL.
Angiografía por fluorescencia
Esta técnica tiene como objetivo visualizar la red vascular de la retina, y por lo tanto, el tinte debe llegar uniformemente en los microvasos de la retina. Se pueden optimizar varios pasos para garantizar esto, como el sitio de inyección y el tiempo de circulación. Se puede inyectar un tinte mediante inyección en la vena de la cola o inyección cardíaca. La inyección cardíaca corre el riesgo de inyectar el tinte en un sitio que no sea el corazón si no está bien entrenado; por lo tanto, se prefiere la inyección de la vena de la cola. Sin embargo, identificar la vena lateral es fácil cuando se sumerge en agua tibia (37-40 ° C) y se limpia con etanol al 70%. El etanol ayuda a dilatar los vasos sanguíneos, lo que puede ayudar a acceder a la ubicación de la vena. También es esencial que el tinte se inyecte solo en la vena. La falta de inyección de tinte en la vena de la cola se puede sentir por resistencia al inyectar el tinte o abultar el área cercana debido a la inyección subcutánea. La aguja se puede quitar y volver a insertar en otro sitio de la cola. La inyección exitosa de la vena de la cola también se puede visualizar mediante la micción forzada de la rata; el color del tinte es visible en la orina de rata dentro de 30 a 40 s.
Además, el tiempo de circulación es esencial; por lo general, de 5 a 10 min son suficientes para circular el tinte en los vasos de la retina con éxito. Una montura plana se puede preparar en un ojo fresco o un ojo fijo. Preparar un soporte plano en un ojo fresco puede ser un desafío, pero una vez dominado, la técnica es la más preferida ya que durante la fijación, el tinte comienza a filtrarse en solución fijadora27. Por lo tanto, la fijación no debe prolongarse durante más de 30 minutos para todo el ojo. En caso de dificultad para separar la retina fresca, incluso se puede fijar en una solución fijadora (formaldehído al 4%) después de separar la copa posterior de la copa anterior durante 15 a 20 min. A menudo se ve que el tinte se filtra de los vasos sanguíneos al tejido circundante, incluso en la retina sana. Esto podría deberse a un exceso de fijación; por lo tanto, el tiempo necesario para la fijación debe optimizarse. Solo mejora el fácil aislamiento de la retina y preserva la estructura para su uso futuro. Además, el aumento del tiempo de circulación del tinte en el animal también puede conducir a la fuga del tinte de los vasos de la retina al tejido circundante, que debe optimizarse.
El tamaño de FITC-dextran es esencial ya que el tinte de mayor peso molecular no entrará en las microvasculaturas. Por el contrario, el tinte de menor peso molecular se filtrará de los nuevos vasos de la retina sana28. Por lo tanto, se prefiere FITC-dextrano con un peso molecular de 70 kD para realizar angiografía por fluorescencia, para visualizar fugas y vasculatura en la retina. Sin embargo, una limitación significativa de esta técnica es la duración del desarrollo de la neovascularización en ratas diabéticas y el procedimiento invasivo del estudio, que podría ser reemplazado en el futuro por técnicas no invasivas como el electrorretinograma, el fondo de ojo y otros instrumentos ópticos no invasivos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer al Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR; ITR-2020-2882) para el apoyo financiero al Dr. Nirmal J. También nos gustaría agradecer a University Grant of Commission por proporcionar una beca de investigación junior a Manisha Malani y a Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, campus de Hyderabad por proporcionar instalaciones de infraestructura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
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