Summary
당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.
Abstract
당뇨병성 망막병증과 같은 후부 절편 안구 질환은 망막의 생리학을 변화시킵니다. 당뇨병성 망막병증은 망막 박리, 혈액-망막 장벽(BRB)의 붕괴, 및 망막 혈관신생을 특징으로 한다. 생체 내 쥐 모델은 망막의 구조와 기능의 변화를 조사하는 데 유용한 실험 도구입니다. 우리는 망막 세포, 망막 혈관 구조 및 손상된 BRB의 형태 학적 변화를 확인하기 위해 쥐 모델에서 세 가지 실험 기술을 제안합니다. 망막 조직학은 다양한 망막 세포의 형태를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 정량적 측정은 망막 세포 수 및 상이한 망막층의 두께 측정에 의해 수행된다. BRB 분해 분석은 BRB의 분해로 인한 혈장에서 유리체 조직으로의 안구 외 단백질의 누출을 결정하는 데 사용됩니다. 형광 혈관 조영술은 FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하여 혈관 신생 및 혈관 누출을 연구하는 데 사용됩니다.
Introduction
당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병의 가장 복잡한 이차적 합병증 중 하나이다. 또한 전 세계 노동 연령 인구에서 예방 가능한 실명의 주요 원인이기도합니다. 32.4 만 명의 시각 장애인에 대한 최근의 메타 분석에서 830,000 (2.6 %)의 사람들이 DR1로 인해 시각 장애인이었습니다. 당뇨병으로 인한 시력 손실의 비율은 2015 년 전 세계적으로 1.06 % (0.15-2.38)로 7 위를 차지했습니다 2,3.
당뇨병성 망막병증은 후부 안구 조직의 혈관 이상에 의해 진단된다. 임상적으로, 망막에서의 혈관화에 기초한 비증식성 DR (NPDR) 및 증식성 DR (PDR)의 두 단계로 나뉘어진다. 고 혈당증은 망막의 신경 변성4,5, 염증6,7 및 미세 혈관 구조8에 관련된 여러 경로를 암시하기 때문에 DR의 강력한 조절제로 간주됩니다. 고혈당증으로 인해 유도되는 다중 대사 합병증에는 고급 당화 최종 생성물 (AGEs), 폴리올 경로, 헥소사민 경로 및 단백질 키나아제-C 경로의 축적이 포함된다. 이러한 경로는 당뇨병성 망막병증의 여러 단계에 기초한 세포 증식(내피 세포), 이동(혈관주위세포) 및 아폽토시스(신경 망막 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포)를 담당한다. 이러한 대사 변화는 망막 박리, 망막 세포의 손실, 혈액 망막 장벽 (BRB)의 붕괴, 동맥류 및 혈관신생9과 같은 생리적 변화를 일으킬 수 있습니다.
스트렙토조토신 (STZ) 유도 제1형 당뇨병은 당뇨병 발병기전과 그 합병증을 평가하기 위한 쥐에서 잘 정립되고 잘 받아들여지는 관행이다. STZ의 당뇨병 유발 효과는 췌장섬 β 세포의 선택적 파괴에 기인한다10. 결과적으로, 동물들은 인슐린 결핍, 고혈당증, 폴리 딥시아 및 다뇨증을 겪을 것이며, 이들 모두는 인간 유형 1 당뇨병의 특징입니다 11. 심한 당뇨병 유발의 경우, STZ는 성인기에 정맥 내 또는 복강 내 40-65 mg / kg 체중으로 투여됩니다. 약 72 시간 후,이 동물들은 250 mg / dL10,12 이상의 혈당 수치를 나타냅니다.
신경 퇴행, 염증 및 혈관신생으로 인한 망막의 생리적 변화를 이해하려면 실험 동물 모델에서 다양한 기술을 최적화해야합니다. 망막 세포 및 망막 혈관의 구조적 및 기능적 변화는 조직학, BRB 분해 분석 및 형광 혈관조영술과 같은 다양한 기술에 의해 연구될 수 있다.
조직학은 현미경 수준에서 세포, 조직 및 기관의 해부학 연구를 포함합니다. 그것은 세포 / 조직의 구조와 기능 사이의 상관 관계를 수립합니다. 조직 구조의 미세한 변화를 시각화하고 식별하기 위해 몇 가지 단계가 수행되어 건강한 상대와 병든 상대물을 비교합니다13. 따라서 조직학의 각 단계를 세심하게 표준화하는 것이 필수적입니다. 망막 조직학에 관여하는 다양한 단계는 시편의 고정, 표본 트리밍, 탈수, 클리어링, 파라핀 함침, 파라핀 임베딩, 절편화 및 염색 (Hematoxylin and Eosin staining)13,14입니다.
건강한 망막에서, 망막을 가로지르는 분자의 수송은 BRB에 의해 조절되며, 내피 세포와 내측의 혈관주위세포, 그리고 바깥쪽의 망막 색소 상피 세포로 구성됩니다. 그러나, 내부 BRB 내피 세포 및 혈관주위세포는 병든 상태 동안 퇴화하기 시작하고, BRB도 또한 손상된다15. 이러한 BRB 분해로 인해 많은 저분자량 분자가 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다16. 질병이 진행됨에 따라 많은 다른 단백질 분자 (저분자량 및 고분자량)도 항상성 장애로 인해 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다17. 그것은 다양한 다른 합병증과 궁극적으로 황반 부종과 실명으로 이어집니다. 따라서 유리체의 단백질 수준을 정량화하고 건강한 상태와 당뇨병 상태를 비교하면 BRB가 손상되었습니다.
형광 혈관 조영술은 형광 염료를 사용하여 망막과 맥락막의 혈액 순환을 연구하는 데 사용되는 기술입니다. 정맥 내 경로 또는 심장 주사를 통해 플루오레세인 염료를 주입하여 망막과 맥락막의 혈관 구조를 시각화하는 데 사용됩니다18. 염료가 주입되면 먼저 망막 동맥에 도달하고 망막 정맥에 도달합니다. 염료의 이러한 순환은 일반적으로 염료19의 주입으로부터 5 내지 10분 이내에 완료된다. 당뇨병성 망막증과 맥락막 신생혈관화를 포함한 다양한 후부 절편 안구 질환을 진단하는 것은 중요한 기술이다20. 그것은 정상 및 병든 상태에서 크고 사소한 혈관 구조 변화를 감지하는 데 도움이됩니다.
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Protocol
이 프로토콜은 기관 동물 윤리위원회, BITS-Pilani, 하이데라바드 캠퍼스에서 제공하는 모든 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 망막 조직학
- 눈의 핵형성 및 고정
- 복강내 경로를 통해 주사된 고용량의 펜토바르비탈(150mg/kg)을 사용하여 연령 일치 대조군(14~15주령)과 함께 2~3개월 된 당뇨병성 위스타 수컷 쥐를 안락사시킨다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다.
- 눈의 비강 및 측두엽 부위에 메스 블레이드를 사용하여 절개를하여 눈을 에핵화하십시오. 그런 다음 포셉과 마이크로 가위를 사용하여 가장자리를 따라 자르면 오비탈 소켓에서 눈을 제거합니다.
참고 : 쥐를 희생하기 전에 고정 솔루션을 준비하십시오.
주의: 포름알데히드는 피부, 눈, 코 및 호흡기를 자극합니다. 또한 강력한 피부 감작제이기 때문에 암을 유발할 수 있습니다. 장갑을 끼고 후드 아래에서 다루십시오21. - 페트리 접시에 인산완충식염수(PBS) 용액 10mL로 눈을 깨끗이 씻어 혈액을 제거한다. 고정 용액의 쉬운 침투를 위해 눈 주위의 과도한 지방을 제거하십시오.
- 포셉의 도움으로 즉시 5mL의 고정 용액에 눈을 넣고 유리 바이알 벽에 붙어 있지 않은지 확인하십시오. 몇 초 동안 부드럽게 저어주고 뚜껑을 적절한 라벨로 교체하십시오. 실온에서 어두운 조건에서 24 내지 48 시간 동안 고정 용액에서 눈을 인큐베이션한다.
- 조직의 트리밍
- 고정 후, 고정 용액으로부터 눈을 제거하고, PBS 10 mL로 세척하고, 이를 4°C에서 냉각된 PBS 10 mL를 함유하는 페트리 디쉬에 넣는다.
- 마이크로 포셉을 사용하여 시신경으로 눈을 잡고 마이크로 가위의 도움으로 파 플라나 에서 닉을 만드십시오. 각막의 전체 여백을 잘라 눈의 앞쪽 컵을 분리하십시오. 포셉을 사용하여 렌즈를 부드럽게 선택하고 버리고 시신경을 자릅니다.
- 곡선 마이크로 가위를 사용하여 후부 아이컵의 세로 부분을 만들어 광학 디스크를 통과하여 두 개의 반으로 나눕니다. 카세트 바닥에 놓고 조직에 방해가되지 않고 뚜껑을 올바르게 닫으십시오. 카세트에 조직 샘플 이름과 날짜에 레이블을 지정합니다.
- 조직의 탈수, 제거 및 파라핀 함침
- 80 mL의 50%, 70%, 90%, 및 100% 에탄올 중에서 점진적으로 전달함으로써 트리밍된 조직을 탈수시킨다. 카세트를 한 농도에서 다른 농도로 옮기는 동안 오염을 최소화하기 위해 깨끗한 티슈 페이퍼에 카세트를 담그십시오.
참고: 조직이 각 전사에 30분 동안 서 있게 하십시오(두 번). 이 단계에 소요되는 총 시간은 약 4시간입니다. - 탈수시, 카세트를 80 mL의 자일렌에 30 분 (두 번) 동안 옮겨 에탄올을 자일렌으로 교체하십시오.
참고 : 자일렌과 함께 배양 한 후 조직은 반투명이됩니다.
주의: 자일렌은 벤젠 고리가 있는 방향족 화합물입니다. 그것은 눈과 점막을 자극하고 또한 우울증을 일으킬 수 있습니다. - 마지막으로, 조직을 60°C에서 예열된 파라핀으로 함침시켜 조직 내의 크실렌을 대체한다. 자일렌 함량을 최소화하기 위해 카세트를 티슈 페이퍼 상에 여러 번 담그고 파라핀 200 mL (60°C에서 액체)에 2 h (1 h x 2) 동안 놓는다.
주의: 녹은 파라핀은 호흡기 불편을 유발할 수 있는 작은 지질 방울을 생성하므로 흡입하지 마십시오.
- 80 mL의 50%, 70%, 90%, 및 100% 에탄올 중에서 점진적으로 전달함으로써 트리밍된 조직을 탈수시킨다. 카세트를 한 농도에서 다른 농도로 옮기는 동안 오염을 최소화하기 위해 깨끗한 티슈 페이퍼에 카세트를 담그십시오.
- 파라핀 임베딩
- 파라핀을 녹이고 스테이션이 원하는 온도에 도달하기 위해 사용하기 전에 적어도 1 시간 전에 파라핀 임베딩 기계를 켭니다. 용융 된 파라핀 왁스로 강철 몰드를 뜨거운 표면에 놓아 채운 다음 파라핀 용기에서 한 번에 하나의 카세트를 제거하십시오.
- 강몰드를 뜨거운에서 차가운 표면(4°C)으로 옮깁니다. 이 시점에서 금형의 왁스가 응고되기 시작합니다. 완전히 응고되기 전에 포셉의 도움으로 조직을 왁스에 넣고 후부 컵의 광학 디스크 부분이 금형의 바닥을 향하도록 조직의 방향을 조정하십시오.
참고: 조직이 움직이지 않고 원하는 방향을 유지하는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 전체 파라핀이 액화 될 때까지 몰드를 따뜻한 작업 표면에 다시 놓은 다음 1.4.2 단계로 다시 시작하십시오. - 금형의 왁스가 응고되기 시작하면 즉시 카세트베이스를 몰드 위에 놓습니다. 카세트의 상단 가장자리 위에 파라핀으로 몰드를 조심스럽게 채우고 천천히 차가운 표면 (-20 °C 근처)으로 옮겨 빠른 응고를 받으십시오. 고형화 될 때까지 1.4.2 단계의 다른 카세트로 프로세스를 반복하십시오.
- 모든 금형이 응고되면 강철 몰드를 카세트에서 분리하십시오. 힘들면 조금 더 기다렸다가 다시 시도하십시오 (강제로 제거하지 마십시오). 분리는 완전한 응고시 더 쉬워집니다. 이제 카세트는 마이크로톰에 의해 절편화되는 동안 유지되는 파라핀 블록의 염기가 된다.
참고: 이 블록은 추가 사용을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. 이 시점에서 프로세스를 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다(필요한 경우).
- 단면화
- 블레이드 홀더에 일회용 마이크로톰 블레이드를 설치합니다. 카세트 주위에 과도한 파라핀 왁스를 제거하여 블록의 윗부분과 아래쪽 부분이 나이프와 평행하게 유지되도록하십시오. 블록을 카세트 홀더에 맞춥니다.
- 블록의 표면이 나이프의 가장자리와 닿을 때까지 핸드 휠을 잠금 해제하여 전진시킵니다. 조직이 블록의 표면에서 시각화 될 때까지 블록에 과량의 파라핀 왁스를 트림하십시오. 단면 두께를 5 μm로 설정하고 다섯 개 내지 여섯 개의 섹션으로 리본을 자릅니다.
- 포셉을 사용하여 리본을 미리 예열 된 수조 (약 50 ° C)의 표면에 부드럽게 옮겨 리본을 펼칩니다. 메이어의 알부민으로 코팅된 유리 슬라이드에 슬라이드를 섹션 아래로 잡고 섹션을 수집합니다. 섹션을 부드럽게 들어 올리고 슬라이드를 37°C에서 하룻밤 동안 수평으로 건조시킵니다.
참고: 슬라이드는 실온에서 몇 달 동안 드라이 박스에 보관할 수 있습니다. 이 단계에서는 프로세스를 중지하고 나중에 계속할 수 있습니다.
- 얼룩
- 염색될 슬라이드를 파라핀이 녹이는 것을 사용하기 전에 60°C의 열풍오븐에서 1시간 동안 가열하고, 표 1에 언급된 바와 같은 단계를 따른다.
주의: 헤마톡실린과 에오신 얼룩은 흡입하거나 섭취할 때 독성이 있습니다. 그들은 발암 성으로보고되었습니다.
- 염색될 슬라이드를 파라핀이 녹이는 것을 사용하기 전에 60°C의 열풍오븐에서 1시간 동안 가열하고, 표 1에 언급된 바와 같은 단계를 따른다.
| 시약 | 서 있는 시간 | 반복(횟수) |
| 자일렌 | 5 분 | 2 |
| 100% 에탄올 | 5 분 | 2 |
| 90% 에탄올 | 5 분 | 2 |
| 70% 에탄올 | 5 분 | 2 |
| 50% 에탄올 | 5 분 | 2 |
| 물 | 5 분 | 2 |
| 헤마톡실린 | 4 분 | 1 |
| 물 세척 | ||
| 70% 에탄올에 있는 1% 산성 알콜 | 30초 | 1 |
| 물 세척 | ||
| 스콧의 물 | 1 분 | 1 |
| 물 세척 | ||
| 50% 에탄올 | 1 분 | 1 |
| 95% 에탄올 | 1 분 | 1 |
| 0.25% 에오신 | 5초 | 1 |
| 물 세척 | ||
| 물 | 2 분 | 1 |
| 95% 에탄올 | 1 분 | 1 |
| 100% 에탄올 | 1 분 | 1 |
| 자일렌 | 5 분 | 2 |
| 마운던트 및 커버슬립 | ||
표 1. 헤마톡실린과 에오신 염색 절차
2. 혈액-뇌 장벽 파괴 분석
- 혈액과 유리체 수집
- 케타민 (80 mg / kg)과 자일라진 (8 mg / kg)을 사용하여 연령 일치 대조군 (14 ~ 15 주)과 함께 2 ~ 3 개월 된 당뇨병 성 Wistar 수컷 쥐를 마취하십시오. 페달 철수 반사 (발가락 꼬집음)로 마취 상태를 확인합니다. 즉시 1 mL의 혈액을 심장 천공으로 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 코팅 튜브에 넣어 전혈에서 혈장을 분리하십시오.
- 복강 내 경로를 통해 주사 된 고용량의 펜토바르비탈 (150 mg / kg)을 사용하여 쥐를 안락사시킵니다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다. 눈을 핵을 띠고 즉시 드라이 아이스 위에 놓습니다.
- 드라이 아이스 위의 깨끗한 페트리 접시에 눈을 넣고 (권장) 1.2.2 단계에서 언급 한 것처럼 눈을 해부하기 시작하십시오.
- 렌즈를 제거하고 마이크로 포셉을 사용하여 후부 컵에서 유리체를 조심스럽게 당겨 세 개에서 네 개의 유리 비드 (2-4mm)가 들어있는 균질화 튜브에 넣으십시오.
참고: 드라이 아이스에 대한 해부술은 렌즈를 제거하고 유리체는 동결 조건에서 더 쉽기 때문에 권장됩니다.
- 시료의 제조
- 비드 균질화기에서 유리체 유머를 중간 속도로 10초 동안 균질화하십시오.
- 혈액(1 mL) 및 유리체 샘플(10-20 μL)을 미세원심분리 튜브에 옮기고 두 샘플 모두를 4°C에서 10분 동안 5200 x g 에서 원심분리한다.
참고 : 성공적인 균질화의 경우, 유리체는 원심분리 후 균일 한 일관성을 갖는다. 그러나, 유리체의 불균일한 일관성의 경우, 단계 2.2.1부터 균질화 시간이 증가하면서 반복한다. - 두 샘플 모두로부터 상청액을 수집하고, 유리체 유머 및 혈장 샘플을 PBS로 각각 1:10 및 1:20 비율로 희석한다.
- 단백질 정량화 및 유리체-혈장 단백질 비율
- 유리체 유머 및 혈장 샘플에서 단백질 농도를 정량하기 위해, 희석된 샘플 5 μL를 브래드포드 시약 250 μL에 첨가하고, 잘 혼합하고, 40분 이내에 590 nm에서 흡광도를 판독한다.
참고: 샘플의 흡수 값이 1.0 이상이면 샘플을 더 희석하고 2.2.3 단계의 절차를 반복하십시오. - 유리체 단백질 수준을 동일한 랫트의 혈장 단백질 수준으로 정상화하고 건강한 쥐와 당뇨병 쥐 사이의 접이식 차이를 측정합니다.
- 유리체 유머 및 혈장 샘플에서 단백질 농도를 정량하기 위해, 희석된 샘플 5 μL를 브래드포드 시약 250 μL에 첨가하고, 잘 혼합하고, 40분 이내에 590 nm에서 흡광도를 판독한다.
3. 형광혈관조영술
- FITC-dextran70000 염료 주입
- 2 내지 3개월령의 당뇨 수컷 위스타 수컷 래트를 3% 이소플루란을 사용하여 연령 일치 대조군(14 내지 15주)과 함께 마취시키고 페달 금단 반사(발가락 핀치)를 확인하였다. 꼬리를 따뜻한 물(37-40°C)을 함유하는 비이커에 담그십시오. 염료를 주입하기 전에 꼬리를 70 % 에탄올로 닦으십시오. 꼬리의 측면 정맥을 찾아 꼬리의 아래 부분에 주입 위치를 표시하십시오.
참고: 바늘 삽입에 실패하면 현재 위치 위의 다른 위치(꼬리 밑 팁)에 삽입해 보십시오. 그러나 반복적 인 찌르기가 쥐의 스트레스 발달로 이어질 수 있으므로 한 번 주사하는 것이 좋습니다.이 주사는 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다. - 꼬리 정맥을 통해 50 mg/mL FITC-dextran70000 염료 용액 1 mL를 주입하고 염료가 5분 동안 순환하도록 하십시오. 복강 내 경로를 통해 주사 된 고용량의 펜토바르비탈 (150mg / kg)으로 쥐를 안락사시킵니다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이내에 사망을 확인하지 못합니다. 단계 1.1.1에서 언급된 바와 같이 눈을 핵화시킨다.
참고 : 필요한 경우 눈을 4 % 포름 알데히드 용액으로 30 분 이상 고정 할 수 있습니다.
- 2 내지 3개월령의 당뇨 수컷 위스타 수컷 래트를 3% 이소플루란을 사용하여 연령 일치 대조군(14 내지 15주)과 함께 마취시키고 페달 금단 반사(발가락 핀치)를 확인하였다. 꼬리를 따뜻한 물(37-40°C)을 함유하는 비이커에 담그십시오. 염료를 주입하기 전에 꼬리를 70 % 에탄올로 닦으십시오. 꼬리의 측면 정맥을 찾아 꼬리의 아래 부분에 주입 위치를 표시하십시오.
- 플랫 마운트 준비
- 플랫 마운트를 준비하려면 슬라이드 및 커버슬립과 함께 해부 도구를 준비하십시오. 차가운 PBS로 채워진 페트리 접시에 눈을 넣고 1.2.2 단계에서 언급 한 바와 같이 눈을 해부하기 시작하십시오.
- 이제 공막과 망막 사이에 뾰족한 집게의 끝을 놓습니다. 컵의 테두리를 따라 부드럽게 움직여 망막이 어느 시점에서도 공막에 부착되지 않도록하십시오. 장애물이있는 경우 곡선 마이크로 가위를 사용하여 림을 따라 그 부분을 천천히 자릅니다.
- 망막이 어느 쪽에서나 공막에 부착되지 않은 것이 확인되면 시신경 디스크 근처에서 잘라 망막이 공막에서 완전히 분리되도록 작은 구멍을 만듭니다. 망막을 PBS 용액으로 천천히 밀어 넣고 주걱이나 포셉의 도움으로 깨끗한 평평한 슬라이드에 놓습니다.
- 마이크로 가위 또는 메스 블레이드를 사용하여 망막 조직을 약간 자르고 네 개의 사분면으로 나눕니다. 그림 1과 같이 컷이 중앙에 있는 광학 디스크가 남긴 구멍에서 최소 2mm 이상 떨어져 있는지 확인합니다.
- 평평한 마운트를 방해하지 않고 0.2 mL 팁을 사용하여 조직의 측면에서 과도한 PBS를 제거하십시오.
- 페이딩 방지 장착 배지(50μL ~ 100μL)를 평평한 마운트에 한 방울 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮은 다음 공초점 현미경으로 즉시 시각화합니다.
주: 전체 절차 동안 최소 조명을 유지하십시오.
- 플랫 마운트의 시각화
- 공초점 현미경의 10x 목표 하에서 플랫 마운트를 시각화하십시오. 타일 스캔을 수행하여 플랫 마운트 전체를 단일 이미지로 캡처합니다. 타일의 수는 망막 플랫 마운트의 크기에 따라 다릅니다. 또한 Z 스태킹을 수행하여 서로 다른 초점의 정맥과 동맥을 시각화합니다 (Z 스택의 기본 크기는 Z 스택 단계 수에 따라 5 μm입니다).
- % 이득에서 PMT 및 HyD 검출기를 각각 700-900 및 100-150으로 사용하십시오. FITC-덱스트란 염료에 대해 510-530 nm 사이의 방출 범위를 선택하십시오.
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Representative Results
망막 조직학
당뇨병성 망막에서 망막 세포는 변성을 겪습니다. 또한, 부종으로 인해 망막층의 두께가 증가합니다.22. Hematoxylin 및 Eosin 염색 후에 얻어진 이미지는 ImageJ를 사용하여 도 2 에 도시된 바와 같이 세포 수 및 상이한 층의 두께의 측정에 사용될 수 있다.
혈액-망막 장벽 파괴 분석
BRB가 당뇨병 쥐에서 손상됨에 따라 누출이 두드러지며 혈장에서 망막 및 유리체로 생체 분자가 축적됩니다. 당뇨병 쥐에서 혈장에서 유리체로의 단백질 누출은 건강한 쥐와 비교할 때 약 3 배 더 높습니다 (그림 3). 단백질은 Lowry 방법, Bicinchoninic acid (BCA) 방법 또는 Bradford 방법 (이 논문, 섹션 2.3에서 언급)과 같은 임의의 키트 방법을 사용하여 추정 될 수 있습니다. 처리 지연으로 인해 망막과의 강한 유리체 접착이 발생하여 분리가 어려워 질 수 있으므로 눈을 신선하게 해부하는 것이 좋습니다. 망막에서 유리체를 부적절하게 분리하면 위양성 결과가 발생할 수 있습니다.
형광 혈관조영술
이 기술은 마이크로 및 매크로 혈관 구조를 포함하여 망막의 누출 및 혈관 구조를 시각화하는 데 사용됩니다. FITC-덱스트란의 크기 선택은 다양한 연구를위한 응용 프로그램을 기반으로합니다. 4-6 kDa에 이르는 저분자량 FITC-덱스트란은 혈관구조에서의 누출을 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 70 kDa 내지 2 백만 Da에 이르는 고분자량 FITC-덱스트란 분자는 혈관신생을 가시화하는데 사용된다. 염료의 성공적인 주입은 도 4에 도시된 바와 같이 망막 편평한 마운트의 전체 혈관구조를 가시화하는 결과를 가져온다. 공초점 현미경 검사 후 획득 된 이미지는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 전체 망막에서 차지하는 혈관 구조의 영역을 결정하는 데 사용하여 건강한 그룹과 병든 그룹을 비교할 수 있습니다.
그림 1. 망막 플랫 마운트 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 건강한 대 당뇨병 망막의 조직학 이미지. (A) 및 (B)는 40x 미만의 대조군 (A) 및 당뇨병성 래트 (B)의 H&E 염색된 망막 이미지를 나타낸다. 망막과 각 층의 전체 두께는 당뇨병 상태 (C)에서 증가합니다. 약어: PRL = 광수용체 층, ONL = 외부 핵층, OPL = 외부 플렉시폼 층, INL = 내부 핵층, IPL = 내부 플렉시폼 층, 및 GCL = 신경절 세포층. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. *는 대조군과의 유의한 차이 (P < 0.0001)를 나타내는 반면, #은 ANOVA 검정에 의해 얻어진 P < 0.05에서 대조군과 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 건강한 대 당뇨병 쥐의 혈액 망막 장벽 붕괴. 그래프는 건강한 쥐 대 당뇨병 쥐의 유리체 혈장 단백질 비율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. *는 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 얻어진 대조군(P<0.01)과의 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 망막 혈관 구조의 형광 혈관 조영술. (A) 및 (B)는 타일 스캔 및 10x 미만의 이미지를 바느질함으로써 가시화된 망막의 평평한 마운트를 나타낸다. (A)는 조절 망막을 나타내고, (B)는 당뇨병성 망막을 나타낸다. 흰색 화살표는 누출을 나타냅니다. 모든 이미지는 Z-스택(5 μm 두께)에 의해 얻어졌다. (A)와 (B)의 배율 막대는 0.5mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
조직학
망막 조직학은 망막 세포 및 층의 형태학적 변화를 시각화하기 위해 수행된다. 고정 용액 선택, 고정 기간, 탈수 및 파라핀 함침을 포함한 다양한 단계를 최적화해야합니다. 조직 크기는 고정 침투가 느려지기 때문에 3mm를 초과해서는 안됩니다. 일반적으로 사용되는 4 % 파라 포름 알데히드는 수성 유머 및 유리체 유머에 비해 용액의 상대적으로 높은 삼투압으로 인해 건강한 눈에서도 망막 박리를 일으켜 위양성 결과를 초래합니다23. 용액의 높은 삼투압은 부피 수축을 초래하고 조직의 수축을 초래합니다. 이 프로토콜에 사용 된 고정 용액은 1 % 포름 알데히드와 1.25 % 글루타르 알데히드로, 상대적으로 적은 삼투압을 가지며, 조직 왜곡을 줄이며, 망막 색소 상피층으로부터의 망막 박리를 최소화하고, 또한 구조를 원래 상태로 보존합니다. 고정 용액의 또 다른 선택은 포름 알데히드가있는 아세트산과 에탄올입니다. 고정 용액의 산성 상태는 조직의 신속한 고정에 도움이 될 수 있으며 에탄올은 고정 용액의 침투를 향상시킵니다. 그러나, 에탄올과 아세트산의 비율을 최적화하는 것은 과잉 농도가 각각 조직의 수축 또는 팽윤을 야기할 수 있기 때문에 필수적이다24. 성공적인 조직 고정을 위한 평가 파라미터는 망막의 박리, 무손상 망막층, 및 조직 수축을 포함한다. 고정을 수행하는 동안 또 다른 중요한 요소는 적절한 고정을 위해 눈 크기의 20 ~ 25 배 이상이어야하는 고정 용액의 부피입니다25. 또한 한 용액에서 다른 용액으로 옮겨 질 때마다 안구 나 조직을 소용돌이 치며 용기의 바닥이나 벽에 달라 붙지 않도록하는 것이 중요합니다.
파라핀을 사용한 탈수 및 함침을 포함한 불완전한 조직 처리는 조직을 수축시키고 건조시킬 수 있으며, 이는 블록 표면에 우울증이 발생할 때 시각화 될 수 있습니다. 또한, 불량한 조직 처리는 또한 물에 노출되었을 때 절편을 흰색으로 착색시키는 결과를 초래할 것이다25. 조직이 올바르게 처리되지 않으면, 자일렌을 통해 다시 취하여 파라핀을 제거한 다음, 에탄올(즉, 100% 에탄올, 90% 에탄올 및 70% 에탄올)의 다운구배에서 재수화시킬 수 있다. 다시 1.3에서 1.4까지의 단계를 반복하여 파라핀 블록을 성공적으로 준비하십시오.
파라핀 블록을 준비하는 동안 조직이 파라핀으로 사방에서 둘러싸여 있고 기포가 보이지 않도록하는 것이 중요합니다. 블록을 준비하는 데 실수가 있으면 조직의 절편이 실패하게됩니다. 때로는 후부 컵이 가공 중에 접히기도합니다. 이 시점에서 포셉 (가열 된 파라핀)을 사용하여 부드럽게 떼어 낼 수 있지만 조직을 손상시키는 정도까지는 당길 수 없습니다. 파라핀이 응고되기 시작하는 동안 강철 몰드의 조직 배향이 원하는만큼 원하지 않는다고 가정하십시오. 이 경우, 파라핀 블록을 제조하기 위해 조직을 재배향시키기 위해 파라핀과 조직을 다시 녹여 다시 넣을 수 있다. 또한, 조직을 매립 몰드로 옮기는 동안, 조직 주위의 파라핀이 응고되지 않도록 보장한다. 블록25에 조직과 매립 배지(파라핀) 사이에 헤어라인 분리를 생성한다. 그런 일이 발생하면 파라핀을 뜨거운 파라핀에 넣고 다시 강철 몰드에 놓아 조직 주위를 녹입니다.
단면화하는 동안, 칼날은 펼쳐진 조직의 리본을 줄 수있을만큼 날카로워야합니다. 블레이드의 특정 부분을 30 회 이상 사용하지 마십시오. 블록이 제대로 단면화되지 않으면 블레이드가 무딘 것으로 가정하고 교체하거나 다시 날카롭게하십시오. 절편이 적절하지 않은 경우, 부적절한 파라핀 함침 또는 오래된 파라핀을 사용하여 블록을 함침시키고 준비하기 때문일 수도 있습니다. 블록의 파라핀은 녹을 수 있으며 신선한 파라핀을 사용하여 블록을 준비 할 수 있습니다. 고르지 않은 부분을 피하려면 미세 톰의 바퀴를 빠르고 육포 같은 움직임보다는 회전으로 천천히 회전하십시오.
Hematoxylin 및 Eosin 염색을 수행하는 동안, Hematoxylin 및 Eosin 염색의 시간을 최적화하는 것은 조직의 과소 또는 과다 염색을 유발할 수 있기 때문에 중요합니다. 파라핀의 부적절한 용융 또는 조직의 재수화는 고르지 않은 염색으로 이어질 것입니다. 슬라이드의 흰색 섹션으로 시각화 할 수 있습니다. 조직을 탈수시키고 다시 열풍오븐에서 파라핀을 녹이고, 이어서 표 1에 언급된 단계를 수행한다. 또한 H & E 염색 중에 수행되는 일반적인 오류 중 하나는 Eosin 염색 후 알코올을 탈수제로 사용하는 것입니다. 알코올의 과도한 사용은 세포질 및 봉입체의 과소 염색으로 이어질 수 있으며, 이로 인해 제대로 염색되지 않은 섹션이 발생할 수 있습니다25. 마운택트 배지의 사용은 과도한 자일렌을 제거한 직후에 이루어져야하며, 조직의 왜곡을 유발할 수 있으므로 자일렌의 건조를 피하십시오. 또한, 수성계 마운트(PBS 중의 글리세롤과 같은)는 조직이 탈수 상태에 있기 때문에 피해야 한다. 수성 기반 마운팅제는 조직에 침투하지 않아 흐릿한 이미지를 생성합니다.
위에서 언급 한 모든 단계를 최적화하면 연구원은 조직학을 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 원하는 고정 솔루션을 선택하고 다른 공정 매개 변수를 최적화하려는 시도를 피싱하는 데 약 세 가지가 걸립니다.
혈액 망막 장벽 붕괴
이 기술에서 가장 섬세한 단계는 유리체를 눈에서 분리하는 것입니다. 그것은 신선한 눈에서 가장 잘 수행됩니다. 드라이 아이스의 사용은 유리체의 쉬운 분리를 위해 권장되며, 특히 유리체가 망막에 부착 된 채로 남아있는 경우 특히 그렇습니다. 종종, 수정체 또는 망막과 유리체 혼합은 망막으로 인한 유리체의 탁도에 의해 확인 될 수 있습니다. 이러한 문제는 일반적으로 동결 조건을 사용하여 피할 수 있습니다. 그러나 유리체 태그가 렌즈 옆에 있으면 마이크로 가위를 사용하여 렌즈와 유리체의 교차점에서 절단하여 분리 할 수 있습니다. 망막이 유리체와 함께 당겨지면 마이크로 포셉을 사용하여 망막을 하나씩 제거 할 수 있습니다. 필터 원심분리의 사용은 또한 수정체와 망막으로부터 유리체를 쉽게 분리하기 위해 제안된다26. 유리체는 젤 같은 구조이기 때문에 단백질의 균질 한 혼합물을 위해 균질화가 필요합니다. 보통, 단계 2.2.1에서 언급된 바와 같이, 단일 균질화 사이클은 적절한 균질화를 위해 충분하며, 이는 원심분리 시 유리체 유머의 액화에 의해 확인될 수 있다. 원심분리 후에 유리체의 겔 성질이 관찰되면, 균질화를 반복한다(단계 2.2.1). 단백질 정량화는 모든 키트 방법을 사용하여 수행 할 수 있지만 최대 2 μg / μL의 유리체에서 낮은 단백질 수준을 감지하는 데 민감해야합니다.
형광 혈관조영술
이 기술은 망막의 혈관 네트워크를 시각화하는 것을 목표로하므로 염료는 망막 미세 혈관에 고르게 도달해야합니다. 주사 부위 및 순환 시간과 같은 이를 보장하기 위해 다양한 단계가 최적화될 수 있다. 염료는 꼬리 정맥 주사 또는 심장 주사를 통해 주사 될 수 있습니다. 심장 주사는 잘 훈련되지 않으면 심장 이외의 부위에 염료를 주입 할 위험이 있습니다. 따라서 꼬리 정맥 주사가 바람직합니다. 그러나, 측방정맥을 확인하는 것은 따뜻한 물(37-40°C)에 담그고 70% 에탄올로 세척할 때 쉽다. 에탄올은 혈관을 확장시켜 정맥의 위치에 접근하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 염료가 정맥에만 주입되는 것이 필수적입니다. 꼬리 정맥에 염료를 주입하지 못하면 피하 주사로 인해 염료를 주입하거나 인근 부위를 부풀어 오르는 동안 저항에 의해 느껴질 수 있습니다. 바늘을 제거하고 꼬리의 다른 부위에 다시 삽입 할 수 있습니다. 성공적인 꼬리 정맥 주사는 또한 쥐의 강제 배뇨에 의해 시각화 될 수있다; 염료의 색깔은 30 ~ 40 초 이내에 쥐 소변에서 볼 수 있습니다.
또한 순환 시간은 필수적입니다. 일반적으로 5 ~ 10 분이면 망막 혈관에서 색소를 성공적으로 순환시키기에 충분합니다. 평평한 마운트는 신선한 눈이나 고정 된 눈으로 준비 할 수 있습니다. 신선한 눈으로 플랫 마운트를 준비하는 것은 어려울 수 있지만, 일단 마스터되면 고정 중에 염료가 고정 용액에서 누출되기 시작하는 기술이 가장 바람직합니다27. 따라서 전체 눈에 대해 30 분 이상 고정을 연장해서는 안됩니다. 신선한 망막을 분리하는 데 어려움이있는 경우, 15 ~ 20 분 동안 전방 컵에서 후부 컵을 분리 한 후 고정 용액 (4 % 포름 알데히드)에 고정 할 수도 있습니다. 염료가 건강한 망막에서도 혈관에서 주변 조직으로 누출되는 것을 종종 볼 수 있습니다. 이것은 과도한 고정 때문일 수 있습니다. 따라서 고정에 필요한 시간을 최적화해야합니다. 그것은 단지 망막의 쉬운 분리를 강화하고 미래의 사용을 위해 구조를 보존합니다. 또한, 동물에서 염료의 순환 시간이 증가하면 망막 혈관에서 주변 조직으로 염료가 누출 될 수 있으므로 최적화해야합니다.
FITC-덱스트란의 크기는 더 높은 분자량 염료가 마이크로 혈관구조에 들어가지 않기 때문에 필수적이다. 대조적으로, 더 낮은 분자량 염료는 건강한 망막28의 새로운 혈관에서 누출됩니다. 따라서, 분자량 70 kD의 FITC-덱스트란은 형광 혈관조영술을 수행하고, 망막에서의 누출 및 혈관구조를 가시화하는 것이 바람직하다. 그러나이 기술의 중요한 한계는 당뇨병 쥐의 신생혈관 발달 기간과 연구의 침습적 절차이며, 이는 장래에 전기 망막, 안저 및 기타 비 침습적 광학 기기와 같은 비 침습적 기술로 대체 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 인도 의학 연구위원회 (ICMR; ITR-2020-2882) 박사 Nirmal J.에 대한 자금 지원 우리는 또한 인프라 시설을 제공 한 Manisha Malani 및 Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad 캠퍼스에 주니어 연구 펠로우십을 제공 한 University Grant of Commission에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
