Summary
Diabetisk retinopati er en av de ledende årsakene til blindhet. Histologi, blod-retinal barriere sammenbrudd analyse, og fluorescens angiografi er verdifulle teknikker for å forstå patofysiologien til netthinnen, noe som ytterligere kan forbedre effektiv legemiddelscreening mot diabetisk retinopati.
Abstract
En bakre segment øyesykdom som diabetisk retinopati endrer fysiologien til netthinnen. Diabetisk retinopati er preget av en netthinneavløsning, nedbrytning av blodretinalbarrieren (BRB) og retinal angiogenese. En in vivo rotte modell er et verdifullt eksperimentelt verktøy for å undersøke endringene i strukturen og funksjonen til netthinnen. Vi foreslår tre forskjellige eksperimentelle teknikker i rottemodellen for å identifisere morfologiske endringer i retinalceller, retinal vaskulatur og kompromittert BRB. Retinal histologi brukes til å studere morfologien til ulike retinalceller. Kvantitativ måling utføres også ved retinal celleantall og tykkelsesmåling av forskjellige netthinnelag. En BRB-sammenbruddsanalyse brukes til å bestemme lekkasjen av ekstraokulære proteiner fra plasma til glassvev på grunn av nedbrytning av BRB. Fluorescens angiografi brukes til å studere angiogenese og lekkasje av blodkar ved å visualisere retinal vaskulatur ved hjelp av FITC-dextran fargestoff.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) er en av de mest komplekse sekundære komplikasjoner av diabetes mellitus. Det er også den ledende årsaken til forebyggbar blindhet i befolkningen i arbeidsfør alder over hele verden. I en nylig metaanalyse av 32,4 millioner blinde mennesker var 830 000 (2,6 %) blinde på grunn av DR1. Andelen synstap tilskrevet diabetes rangert som nummer sju i 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnostiseres av vaskulære abnormiteter i det bakre okulære vevet. Klinisk er det delt inn i to stadier - Ikke-proliferativ DR (NPDR) og Proliferative DR (PDR), basert på vaskularisering i netthinnen. Hyperglykemi regnes som den potente regulatoren av DR, da det impliserer flere veier involvert i nevrodegenerasjon4,5, betennelse6,7 og mikrovaskulær8 i netthinnen. Flere metabolske komplikasjoner indusert på grunn av hyperglykemi inkluderer akkumulering av avanserte glykasjonssluttprodukter (AGE), polyolbane, hexosaminvei og proteinkinase-C-bane. Disse veiene er ansvarlige for celleproliferasjon (endotelceller), migrasjon (pericytter) og apoptose (nevrale retinalceller, pericytter og endotelceller) basert på ulike stadier av diabetisk retinopati. Disse metabolske endringene kan føre til fysiologiske endringer som netthinneavløsning, tap av netthinneceller, nedbrytning av blodretinalbarrieren (BRB), aneurisme og angiogenese9.
Streptozotocin (STZ) indusert type-1 diabetes er en veletablert og godt akseptert praksis hos rotter for evaluering av diabetespatogenese og dens komplikasjoner. Diabetogene effekter av STZ skyldes selektiv ødeleggelse av bukspyttkjertel holme β-celler10. Som et resultat vil dyrene gjennomgå insulinmangel, hyperglykemi, polydipsi og polyuri, som alle er karakteristiske for menneskelig type-1 diabetes mellitus11. Ved alvorlig diabetesinduksjon administreres STZ ved 40-65 mg/kg kroppsvekt intravenøst eller intraperitonealt i voksen alder. Etter ca. 72 timer presenterer disse dyrene blodsukkernivåer større enn 250 mg/dl10,12.
For å forstå de fysiologiske endringene i netthinnen på grunn av nevrodegenerasjon, betennelse og angiogenese, bør forskjellige teknikker optimaliseres i eksperimentelle dyremodeller. Strukturelle og funksjonelle endringer i retinalceller og netthinnefartøy kan studeres ved hjelp av ulike teknikker som histologi, BRB-analyse og fluorescensangiografi.
Histologi innebærer studiet av anatomien til celler, vev og organer på mikroskopisk nivå. Det etablerer en sammenheng mellom strukturen og funksjonen til celler / vev. Flere trinn utføres for å visualisere og identifisere de mikroskopiske endringene i vevsstruktur, og dermed sammenligne sunne og syke kolleger13. Derfor er det viktig å standardisere hvert trinn i histologi omhyggelig. Ulike trinn involvert i retinal histologi er fiksering av prøven, trimming av prøven, dehydrering, rydding, impregnering med paraffin, parafininnstøtning, seksjonering og farging (Hematoxylin og Eosin farging)13,14.
I en sunn netthinne styres transporten av molekyler over netthinnen av BRB, sammensatt av endotelceller og pericytter på innsiden, og retinal pigment epitelceller på ytre side. Imidlertid begynner indre BRB endotelceller og pericytter å degenerere under den syke tilstanden, og BRB er også kompromittert15. På grunn av denne BRB-sammenbruddet lekker mange molekyler med lav molekylvekt inn i glasslegemet og netthinnevev16. Etter hvert som sykdommen utvikler seg, lekker mange andre proteinmolekyler (lav og høy molekylvekt) også til glasslegemet og netthinnevev på grunn av homeostaseforstyrrelser17. Det fører til ulike andre komplikasjoner og til slutt makulaødem og blindhet. Derfor, kvantifisere proteinnivået i glasslegemet og sammenligne sunne og diabetikere tiltak kompromittert BRB.
Fluorescens angiografi er en teknikk som brukes til å studere blodsirkulasjonen av netthinnen og choroid ved hjelp av fluorescerende fargestoff. Den brukes til å visualisere vaskulatur av netthinnen og choroid ved å injisere fluorescein fargestoff via intravenøs rute eller hjerteinjeksjon18. Når fargestoffet er injisert, når det først retinal arteriene, etterfulgt av retinal årer. Denne sirkulasjonen av fargestoff er vanligvis fullført innen 5 til 10 min fra injeksjon av fargestoff19. Det er en viktig teknikk for å diagnostisere ulike bakre segment okulære sykdommer, inkludert diabetisk retinopati og choroidal neovascularization20. Det bidrar til å oppdage store og mindre vaskulaturendringer i normale og syke forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger alle retningslinjene for dyrepleie fra Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinal histologi
- Enukleasjon og fiksering av øyet
- Euthanize en 2 til 3 måneder gammel diabetiker Wistar mannlig rotte sammen med alderstilpasset kontroll (14 til 15 uker gammel) ved hjelp av en høy dose pentobarbital (150 mg / kg) injisert gjennom intraperitoneal ruten. Ingen påviselig hjerterytme bekrefter dødsfallet innen 2-5 min.
- Forfør øyet ved å lage snitt ved hjelp av et skalpellblad på øyets nese- og temporale områder. Klipp deretter langs kantene ved hjelp av tang og mikrosaks for å fjerne øyet fra orbitalkontakten.
MERK: Før du ofrer rotter, må du holde de fikseringsløsningene klare.
FORSIKTIG: Formaldehyd irriterer huden, øyet, nesen og luftveiene. Det kan også forårsake kreft, da det er en potent hudsensibilisator. Bruk hansker og håndter den under panseret21. - Vask øyet grundig med 10 ml fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) i en Petri-tallerken for å fjerne blod. Fjern overflødig fett rundt øyet for enkel penetrasjon av den fikseringsløsningen.
- Plasser straks øyet i 5 ml fikseringsløsning ved hjelp av tang, og sørg for at det ikke sitter fast i vegger av glassflasker. Rør forsiktig i noen sekunder og bytt ut hetten med riktig merking. Inkuber øyet i fikseringsløsning i 24 til 48 timer under mørke forhold ved romtemperatur.
- Trimming av vev
- Etter fiksering, fjern øyet fra den fikseringsløsningen, vask med 10 ml PBS, og legg det i en Petri-tallerken som inneholder 10 ml PBS kjølt ved 4 °C.
- Bruk mikro tang, hold øyet med synsnerven og lag en nick på pars plana ved hjelp av mikrosaks. Skjær gjennom hele marginen av hornhinnen for å skille den fremre koppen av et øye. Bruk tang, velg linsen forsiktig, kast den og kutt synsnerven.
- Bruk buet mikrosaks, lag en langsgående del av den bakre øyemusken, passerer gjennom den optiske platen som deler den i to halvdeler. Plasser den i bunnen av kassetten og lukk lokket ordentlig uten forstyrrelser i vevet. Merk kassettene med vevsprøvenavnet og -datoen.
- Dehydrering, rydding og parafinimpregnering av vev
- Dehydrer det trimmede vevet ved gradvis overføring i 80 ml 50%, 70%, 90% og 100% etanol. Mens du overfører kassettene fra en konsentrasjon til en annen, må du sørge for å dab dem på rent vevspapir for å minimere forurensning.
MERK: La vevet stå i hver overføring i 30 min (to ganger). Den totale tiden som forbrukes for dette trinnet, er ca. 4 timer. - Ved dehydrering, overfør kassettene til 80 ml xylen i 30 min (to ganger) for å erstatte etanol med xylen.
MERK: Etter inkubasjon med xylen blir vevet gjennomsiktig.
FORSIKTIG: Xylen er en aromatisk forbindelse med en benzenring. Det irriterer øyet og slimhinnen og kan også forårsake depresjoner. - Til slutt impregner vevet med foroppvarmet paraffin ved 60 °C for å erstatte xylen i vevet. Dab kassettene flere ganger på silkepapir for å minimere xyleninnholdet og plassere i 200 ml parafin (væske ved 60 °C) i 2 timer (1 t x 2).
FORSIKTIG: Unngå innånding av smeltet parafin, da det produserer små lipiddråper som kan forårsake ubehag i luftveiene.
- Dehydrer det trimmede vevet ved gradvis overføring i 80 ml 50%, 70%, 90% og 100% etanol. Mens du overfører kassettene fra en konsentrasjon til en annen, må du sørge for å dab dem på rent vevspapir for å minimere forurensning.
- Innebygging av parafin
- Slå på parafininnbyggingsmaskinen minst 1 time før bruk for å smelte parafinen og for at stasjonene skal nå ønsket temperaturer. Fyll en stålform med smeltet parafinvoks ved å plassere den på en varm overflate, og fjern deretter en kassett om gangen fra parafinbeholderen.
- Flytt stålformen fra en varm til kald overflate (4 °C). På dette tidspunktet vil voksen i formen begynne å størkne. Før det størkner helt, plasser vevet i voks ved hjelp av tang og orienter vevet slik at den optiske skivedelen av den bakre koppen vender mot bunnen av formen.
MERK: Pass på at vevet ikke beveger seg og behold ønsket retning. Hvis ikke, legg formen tilbake på den varme arbeidsflaten til hele parafinen flytende, og start deretter igjen med trinn 1.4.2. - Når voksen i formen begynner å størkne, plasser straks kassettbasen på toppen av formen. Fyll forsiktig formen med paraffin over den øvre kanten av kassetten og overfør den sakte til en kald overflate (nær -20 °C) for rask størkning. Inntil den størkner, gjentar du prosessen med andre kassetter fra trinn 1.4.2.
- Når alle formene er størknet, skiller du stålformen fra kassetten. Hvis det er vanskelig, vent litt lenger og prøv igjen (ikke fjern det kraftig). Separasjon blir lettere ved fullstendig størkning. Nå blir kassetten basen av parafinblokken som skal holdes under seksjonering av mikrotom.
MERK: Denne blokken kan lagres ved romtemperatur for videre bruk. På dette tidspunktet kan prosessen stoppes og fortsettes senere (om nødvendig).
- Snitting
- Monter et mikrotomblad til engangsbruk i bladholderen. Fjern overflødig parafinvoks rundt kassetter slik at både øvre og nedre del av blokkene forblir parallelle med kniven. Monter blokken på kassettholderen.
- Lås opp håndhjulet for å føre det frem til overflaten av blokken er i kontakt med kanten av kniven. Trim overflødig parafinvoks på blokken til vevet visualiseres på overflaten av blokken. Sett seksjonstykkelsen til 5 μm og klipp et bånd på fem til seks seksjoner.
- Bruk tang til å overføre båndet forsiktig til overflaten av det forvarmede vannbadet (rundt 50 °C) for å brette båndet ut. Samle seksjoner på en glasssklie belagt med Mayers albumin ved å holde lysbildet under delen. Løft delene forsiktig og la skliene tørke horisontalt over natten ved 37 °C.
MERK: Lysbilder kan oppbevares ved romtemperatur i tørre bokser i flere måneder. På dette trinnet kan prosessen stoppes og fortsettes senere.
- Flekker
- Varm opp skliene som skal farges i en varmluftsovn ved 60 °C i 1 time før bruk for at parafinen skal smelte, og følg trinnene som nevnt i tabell 1.
FORSIKTIG: Hematoksylin- og Eosin-flekker er giftige ved innånding eller inntak. De har blitt rapportert å være kreftfremkallende.
- Varm opp skliene som skal farges i en varmluftsovn ved 60 °C i 1 time før bruk for at parafinen skal smelte, og følg trinnene som nevnt i tabell 1.
| Reagent | Stående tid | Gjentakelse (antall ganger) |
| Xylen | 5 min | 2 |
| 100% etanol | 5 min | 2 |
| 90% etanol | 5 min | 2 |
| 70% etanol | 5 min | 2 |
| 50% etanol | 5 min | 2 |
| Vann | 5 min | 2 |
| Hematoksylin | 4 min | 1 |
| Vannvask | ||
| 1% Syrealkohol i 70% etanol | 30 s | 1 |
| Vannvask | ||
| Scotts vann | 1 min | 1 |
| Vannvask | ||
| 50% etanol | 1 min | 1 |
| 95% etanol | 1 min | 1 |
| 0,25 % Eosin | 5 s | 1 |
| Vannvask | ||
| Vann | 2 min. | 1 |
| 95% etanol | 1 min | 1 |
| 100% etanol | 1 min | 1 |
| Xylen | 5 min | 2 |
| Montant og deksler | ||
Tabell 1. Hematoksylin og Eosin farging prosedyre
2. Blod-hjerne barriere sammenbrudd analyse
- Blod og glasslegemet samling
- Bedøv en 2 til 3 måneder gammel diabetiker Wistar hannrotte sammen med alderstilpasset kontroll (14 til 15 uker) ved bruk av ketamin (80 mg/kg) og xylazin (8 mg/kg). Bekreft bedøvelsestilstanden ved å trekke ut refleksen (tåklemme). Samle umiddelbart 1 ml blod ved hjertepunktering i et etylendiamintetraketisk syre (EDTA) belagt rør for å skille plasma fra fullblod.
- Avlivet rotten ved hjelp av en høy dose pentobarbital (150 mg/kg), injisert gjennom intraperitoneal ruten. Ingen påviselig hjerterytme bekrefter dødsfallet innen 2-5 min. Enucleate øyet og umiddelbart plassere det på tørris.
- Plasser øyet i en ren Petri-tallerken over tørris (anbefales) og begynn å dissekere øyet som nevnt i trinn 1.2.2.
- Fjern linsen, trekk glasslegemet forsiktig fra bakre kopp ved hjelp av mikro tang og legg den i et homogeniseringsrør som inneholder tre til fire glassperler (2-4 mm).
MERK: Disseksjon på tørris anbefales da det er lettere under fryseforhold å fjerne linsen og glasslegemet.
- Utarbeidelse av prøver
- Homogeniser glasslegemet humor i en perle homogenisator med middels hastighet i 10 s.
- Overfør blodet (1 ml) og glasslegemeprøver (10-20 μL) inn i mikrocentrifugerørene og sentrifuger begge prøvene ved 5200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Ved vellykket homogenisering har glasslegemet ensartet konsistens etter sentrifugering. Men når det gjelder ikke-jevn konsistens av glasslegemet, gjenta fra trinn 2.2.1 med økt homogeniseringstid. - Samle supernatant fra begge prøver, og fortynn glasslegemet humor og plasmaprøver i henholdsvis 1:10 og 1:20-forhold med PBS.
- Protein kvantifisering og glasslegemet-plasma protein ratio
- For å kvantisere proteinkonsentrasjon i glasslegemet humor og plasmaprøver, tilsett 5 μL fortynnede prøver til 250 μL Bradford reagens, bland godt og les absorbansen ved 590 nm innen 40 min.
MERK: Hvis absorpsjonsverdien til prøvene er over 1,0, fortynn prøvene ytterligere og gjenta prosedyren fra trinn 2.2.3. - Normaliser glasslegemet proteinnivå til plasmaproteinnivå fra samme rotte og mål foldforskjellen mellom sunne vs. diabetikerrotter.
- For å kvantisere proteinkonsentrasjon i glasslegemet humor og plasmaprøver, tilsett 5 μL fortynnede prøver til 250 μL Bradford reagens, bland godt og les absorbansen ved 590 nm innen 40 min.
3. Fluorescens angiografi
- FITC-dextran70000 fargeinjeksjon
- Bedøv en 2 til 3 måneder gammel diabetiker Wistar hannrotter sammen med den alderstilpassede kontrollen (14 til 15 uker) ved hjelp av 3% isofluran og bekreft pedaluttakets refleks (tåklemme). Dypp halen i et beger som inneholder varmt vann (37-40 °C). Rengjør halen med 70% etanol før du injiserer fargestoffet. Finn halens laterale vene og merk injeksjonsposisjonen i den nedre delen av halen.
MERK: Hvis innsettingen av kanylen svikter, kan du prøve å sette den inn et annet sted over gjeldende posisjon (tipp til halen). Det anbefales imidlertid å injisere en gang da gjentatt prikking kan føre til stressutvikling hos rotten, noe som kan forårsake vasokonstriksjon. - Injiser 1 ml 50 mg/ml FITC-dextran70000 fargestoffoppløsning gjennom halevenen og la fargestoffet sirkulere i 5 minutter. Avlivet rotten med en høy dose pentobarbital (150mg/kg), injisert gjennom intraperitoneal ruten. Ingen påviselig hjerterytme bekrefter dødsfallet innen 2-5 min. Forføre øyet som nevnt i trinn 1.1.1.
MERK: Om nødvendig kan øyet festes i 4% formaldehydoppløsning, i ikke mer enn 30 minutter.
- Bedøv en 2 til 3 måneder gammel diabetiker Wistar hannrotter sammen med den alderstilpassede kontrollen (14 til 15 uker) ved hjelp av 3% isofluran og bekreft pedaluttakets refleks (tåklemme). Dypp halen i et beger som inneholder varmt vann (37-40 °C). Rengjør halen med 70% etanol før du injiserer fargestoffet. Finn halens laterale vene og merk injeksjonsposisjonen i den nedre delen av halen.
- Klargjøring av flat montering
- For å forberede flate fester, hold dissekeringsverktøyene klare sammen med lysbilder og deksler. Plasser øyet i en Petri-tallerken fylt med kjølt PBS og begynn å dissekere øyet som nevnt i trinn 1.2.2.
- Plasser nå spissen av en spiss tang mellom sclera og netthinnen. Beveg den forsiktig langs kanten av koppen, og sørg for at netthinnen ikke er festet til scleraen på noe tidspunkt. Hvis det er noen hindring, kutt den delen sakte langs kanten ved hjelp av buet mikrosaks.
- Når det er bekreftet at netthinnen ikke er festet til sclera fra noen side, kutt nær den optiske platen, noe som gjør et lite hull slik at netthinnen helt løsner fra scleraen. Skyv netthinnen langsomt inn i PBS-oppløsningen og legg den på en ren flat sklie ved hjelp av en slikkepott eller tang.
- Bruk mikrosaks eller skalpellblader, gjør mindre kutt i netthinnen vev, dele den i fire kvadranter. Pass på at kuttene er minst 2 mm unna hullet som er igjen av den optiske platen i midten, som vist i figur 1.
- Fjern overflødig PBS fra sidene av vevet ved hjelp av 0,2 ml spisser uten å forstyrre den flate braketten.
- Plasser en dråpe anti-falming monteringsmedium (50 μL til 100 μL) på en flat montering, dekk med en dekslelip, og visualiser umiddelbart under et konfokalt mikroskop.
MERK: Oppretthold minimumslyset under hele prosedyren.
- Visualisering av flat montering
- Visualiser den flate braketten under 10x mål for et konfokalt mikroskop. Utfør flisskanning for å fange opp hele den flate braketten som ett enkelt bilde. Antall fliser avhenger av størrelsen på den retinal flate braketten. Utfør også Z-stabling for å visualisere venene og arteriene i forskjellige foci (foretrukket størrelse for Z-stack er 5 μm, avhengig av hvilken antall Z-stack-trinn varierer).
- Bruk PMT- og HyD-detektor ved % forsterkning som henholdsvis 700-900 og 100-150. Velg utslippsområde mellom 510-530 nm for FITC-dextran fargestoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal histologi
I diabetisk netthinne gjennomgår netthinneceller degenerasjon. I tillegg øker tykkelsen på netthinnelagene på grunn av ødem22. Bildene som er oppnådd etter Hematoxylin- og Eosin-farging, kan brukes til celletelling og måling av tykkelsen på forskjellige lag, som vist i figur 2 ved hjelp av ImageJ.
Blod-retinal barriere sammenbrudd analyse
Ettersom BRB er kompromittert hos diabetikerrotter, blir lekkasje fremtredende, noe som fører til opphopning av biomolekyler fra plasma til netthinnen og glasslegemet. Hos diabetikerrotter er proteinlekkasje fra plasma til glasslegemet rundt tre ganger høyere sammenlignet med friske rotter (figur 3). Protein kan estimeres ved hjelp av en hvilken som helst kit-metode som Lowry-metoden, Bicinchoninic acid (BCA)-metoden eller Bradford-metoden (nevnt i dette papiret, avsnitt 2.3). Det anbefales å nylig dissekere øyet, da en forsinkelse i behandlingen kan føre til sterk glasslegemet vedheft med netthinnen, noe som gjør det vanskelig å skille. Feil separasjon av glasslegemet fra netthinnen kan føre til falske positive resultater.
Fluorescens angiografi
Denne teknikken brukes til å visualisere netthinnens lekkasje og vaskulatur, inkludert mikro- og makrovaskulatur. Utvalget av størrelsen på FITC-dextran er basert på anvendelsen for ulike studier. Lavmolekylær FITC-dextran, fra 4-6 kDa, brukes til å visualisere lekkasje i vaskulaturen. Derimot brukes høymolekylære FITC-dextran molekyler, alt fra 70 kDa til 2 millioner Da, til å visualisere angiogenese. Vellykket injeksjon av fargestoff resulterer i visualisering av hele vaskulaturen til den retinal flate braketten, som vist i figur 4. De oppnådde bildene etter konfikal mikroskopi kan brukes til å bestemme området vaskulatur okkupert i hele netthinnen ved hjelp av ImageJ-programvare for å sammenligne sunne og syke grupper.
Figur 1. Retinal flat-mount forberedelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Histologi bilder av sunn vs. diabetisk netthinne. (A) og (B) representerer H&E-farget retinal bilder av kontroll (A) og diabetiker rotte (B) under 40x. Den totale tykkelsen på netthinnen og hvert lag øker i diabetikerforhold (C). Forkortelser: PRL = fotoreseptorlag, ONL = ytre kjernefysisk lag, OPL = ytre plexiformlag, INL = indre kjernefysisk lag, IPL = indre plexiformlag og GCL = Ganglion-cellelag. Data er representert som gjennomsnittlig ± SD. * representerer en signifikant forskjell fra kontrollgruppen (P < 0,0001), mens # representerer en betydelig forskjell fra kontrollgruppen ved P < 0,05, oppnådd ved ANOVA-testen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Blod-retinal barriere sammenbrudd i friske vs. diabetiker rotter. Grafen representerer glasslegemet plasmaproteinforholdet mellom sunne vs. diabetikerrotter. Data er representert som gjennomsnittlig ± SEM. * representerer en signifikant forskjell fra kontrollgruppen (P < 0,01) oppnådd ved uparret t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Fluorescens angiografi av retinal vaskulatur. (A) og (B) representerer en flat montering av netthinnen visualisert ved flisskanning og søm bildene under 10x. (A) representerer kontroll netthinnen, (B) representerer diabetisk netthinne. Den hvite pilen indikerer lekkasje. Alle bilder ble hentet av Z-stack (5 μm tykkelse). Skalastenger i (A) og (B) er 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologi
Retinal histologi utføres for å visualisere de morfologiske endringene i retinalceller og lag. Ulike trinn, inkludert valg av fixative løsning, fikseringsvarighet, dehydrering og parafinimpregnering, må optimaliseres. Vevsstørrelsen bør ikke overstige 3 mm, da den fixative penetrasjonen blir langsom. Den ofte brukte 4% paraformaldehyden fører til netthinneavløsning selv i det sunne øyet på grunn av den relativt høye osmolariteten til løsningen sammenlignet med vandig humor og glasslegemet humor, noe som fører til falske positive resultater23. Den høye osmolariteten til løsningen resulterer i volumkontraksjon og fører til krymping av vev. Den fixative løsningen som brukes i denne protokollen er 1% formaldehyd med 1,25% glutaraldehyd, som har relativt mindre osmolaritet, reduserer vevsforvrengningen, minimerer netthinnens løsrivelse fra det retinale pigmentepitelet, og bevarer også strukturen i sin opprinnelige tilstand. Et annet utvalg av fixativ løsning er eddiksyre og etanol med formaldehyd. Sur tilstand av fixativ løsning kan hjelpe til med rask fiksering av vev, mens etanol forbedrer penetrasjonen av den fikseringsløsningen. Optimalisering av forholdet mellom etanol og eddiksyre er imidlertid viktig, da overflødig konsentrasjon kan føre til krymping eller hevelse i vevet, henholdsvis24. Evalueringsparametere for vellykket vevsfiksering inkluderer løsrivelse av netthinnen, intakte netthinnelag og vevskrymping. En annen kritisk faktor mens du utfører fiksering er volumet av fikseringsløsning, som skal være minst 20 til 25 ganger størrelsen på øyet for riktig fiksering25. I tillegg er det viktig å virvle øyebollet eller vevet når det overføres fra en løsning til en annen, slik at den ikke holder seg til bunnen eller veggene i beholderen.
Ufullstendig vevsbehandling, inkludert dehydrering og impregnering med parafin, kan krympe og tørke vev, som kan visualiseres når depresjon oppstår på overflaten av blokken. I tillegg vil dårlig vevsbehandling også resultere i fargelegging av seksjoner i hvitt når de utsettes for vann25. Hvis vevet ikke behandles riktig, kan det tas tilbake gjennom xylen for å fjerne parafin, etterfulgt av rehydrering i nedbrytning av etanol, (dvs. 100% etanol, 90% etanol og 70% etanol). Gjenta igjen trinnene fra 1,3 til 1,4 for å forberede parafinblokker.
Mens du forbereder parafinblokker, er det viktig å sørge for at vevet er omgitt av parafin og ingen luftbobler blir sett. Enhver feil i å forberede blokken vil føre til mislykket seksjonering av vev. Noen ganger blir den bakre koppen brettet under behandlingen; På dette tidspunktet kan den trekkes forsiktig fra hverandre ved hjelp av tang (i oppvarmet paraffin), men ikke i den grad det skader vevet. Anta at vevsorienteringen i stålform ikke er som ønsket mens parafinen begynner å størkne; I så fall kan det settes tilbake til smeltet parafin og vev for å re-orientere vevet for å forberede parafinblokker. Også, mens du overfører vevet til innbyggingsformen, må du sørge for at parafinen rundt vevet ikke størkner. Det skaper en hårlinje separasjon mellom vevet og innebygging medium (paraffin) i blokken25. Hvis det skjer, smelt parafinen rundt vevet ved å plassere den i varm parafin og plassere den i stålformen igjen.
Under seksjonering må bladet være skarpt nok til å gi utfoldede bånd av vev. Ikke bruk en bestemt del av bladet mer enn 30 ganger. Hvis blokken ikke deler riktig, anta at bladet er sløvt og derfor erstatte det eller slip det på nytt. Hvis seksjonene ikke er riktige, kan det også skyldes feil parafinimpregnering eller bruk av gammel parafin for å impregnere og forberede blokker. Parafinen i blokken kan smeltes ned, og fersk paraffin kan brukes til å forberede blokken. For å unngå ujevne seksjoner, roter mikrotomens hjul sakte med jevne svinger i stedet for raske, rykkete bevegelser.
Mens du utfører Hematoxylin og Eosin farging, optimalisere tiden for Hematoxylin og Eosin flekk er kritisk som det kan føre til under- eller over-farging vev. Feil smelting av parafin eller rehydrering av vevet vil føre til ujevn farging. Den kan visualiseres som de hvite delene på lysbildet. Dehydrer vevet og smelt igjen parafin i en varmluftsovn, etterfulgt av trinnene som er nevnt i tabell 1. Videre er en av de vanlige feilene som utføres under H &E-farging bruk av alkohol som dehydrant etter Eosin-flekk. Overdreven bruk av alkohol kan føre til underfarging av cytoplasma og inklusjonslegemer som kan føre til dårlig fargede seksjoner25. Bruk av montant medium bør gjøres umiddelbart etter fjerning av overflødig xylen, og unngå tørking av xylen, da det kan føre til forvrengning av vevet. Også vandig basert montør (som glyserol i PBS) må unngås da vevet er i dehydrert tilstand. Vandig basert montant trenger ikke inn i vevet og resulterer i disige bilder.
Ved optimalisering av alle trinnene nevnt ovenfor, vil forskere kunne utføre histologi vellykket. Det tar rundt tre til fice forsøk på å velge ønsket fixative løsning og optimalisere andre prosessparametere.
Blod-retinal barriere sammenbrudd
Det mest delikate trinnet i denne teknikken er isolasjonen av glasslegemet fra øyet. Det utføres best på et friskt øye. Bruk av tørris anbefales for enkel isolering av glasslegemet, spesielt hvis glasslegemet forblir festet til netthinnen. Ofte kan linse eller netthinneblanding med glasslegemet identifiseres ved turbiditet av glasslegeme på grunn av netthinnen. Disse problemene kan vanligvis unngås ved hjelp av fryseforhold. Men hvis glasslegemet er ved siden av linsen, kan de skilles ved å kutte i skjæringspunktet mellom linsen og glasslegemet ved hjelp av mikrosaks. Hvis netthinnen trekker ut sammen med glasslegemet, kan netthinnen fjernes stykke for stykke ved hjelp av mikro tang. Bruk av filtersentrifugering foreslås også for enkel isolering av glasslegemet fra linsen og netthinnen26. Siden glasslegemet er en gellignende struktur, trenger den homogenisering for en homogen blanding av proteiner. Vanligvis, som nevnt i trinn 2.2.1, er en enkelt homogeniseringssyklus tilstrekkelig for riktig homogenisering, som kan identifiseres ved flytendegjøring av glasslegemet humor ved sentrifugering. Hvis glasslegemets gele natur observeres etter sentrifugering, gjenta homogenisering (trinn 2.2.1). Protein kvantifisering kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst kit metode, men bør være følsom for å oppdage de lave proteinnivåene i glasslegemet opp til 2 μg / μL.
Fluorescens angiografi
Denne teknikken tar sikte på å visualisere netthinnens vaskulære nettverk, og dermed må fargestoffet nå jevnt i netthinnen mikrovessels. Ulike trinn kan optimaliseres for å sikre dette, for eksempel injeksjonsstedet og sirkulasjonstiden. Et fargestoff kan injiseres via hale vene injeksjon eller hjerteinjeksjon. Hjerteinjeksjon risikerer å injisere fargestoffet på et annet sted enn hjertet hvis det ikke er godt trent; Derfor er hale vene injeksjon foretrukket. Det er imidlertid lett å identifisere sidevenen når den dyppes i varmt vann (37-40 °C) og rengjøres med 70% etanol. Etanol bidrar til å utvide blodkarene, noe som kan bidra til å få tilgang til venens plassering. Det er også viktig at fargestoffet injiseres bare i venen. Unnlatelse av å injisere fargestoff i halevenen kan føles av motstand mens du injiserer fargestoffet eller buler det nærliggende området på grunn av subkutan injeksjon. Nålen kan fjernes og settes inn igjen på et annet sted i halen. Vellykket hale vene injeksjon kan også visualiseres ved tvungen vannlating av rotten; fargen på fargestoff er synlig i rotte urin innen 30 til 40 s.
Også sirkulasjonstiden er viktig; vanligvis er 5 til 10 min tilstrekkelig til å sirkulere fargestoff i retinal fartøy med hell. En flat montering kan tilberedes i et friskt øye eller et fast øye. Å forberede en flat montering i et friskt øye kan være utfordrende, men når du mestrer, er teknikken mest foretrukket som under fiksering, fargen begynner å lekke i fixative løsning27. Derfor bør fiksering ikke forlenges i mer enn 30 minutter for hele øyet. I tilfelle problemer med å skille frisk netthinne, kan den til og med festes til en fikseringsløsning (4% formaldehyd) etter å ha skilt den bakre koppen fra den fremre koppen i 15 til 20 minutter. Det er ofte sett at fargestoffet lekker fra blodkarene til omkringliggende vev, selv i sunn netthinne. Dette kan skyldes overflødig fiksering; Derfor bør tiden som trengs for fiksering optimaliseres. Det forbedrer bare den enkle isolasjonen av netthinnen og bevarer strukturen for fremtidig bruk. Videre kan økt sirkulasjonstid for fargestoff i dyret også føre til fargelekkasje fra netthinnekar til omkringliggende vev, som må optimaliseres.
Størrelse på FITC-dextran er viktig, da høyere molekylvektfargestoff ikke vil komme inn i mikrovaskulaturer. I motsetning vil lavere molekylvektfarge lekke fra nye kar i den sunne netthinnen28. Derfor er FITC-dextran med en molekylvekt på 70 kD foretrukket å utføre fluorescens angiografi, for å visualisere lekkasje og vaskulatur i netthinnen. Imidlertid er en betydelig begrensning av denne teknikken varigheten av utviklingen av neovascularization hos diabetikerrotter og den invasive prosedyren i studien, som kan erstattes i fremtiden av ikke-invasive teknikker som elektroretinogram, fundus og andre ikke-invasive optiske instrumenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfattere ønsker å anerkjenne Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) for støtte til Dr. Nirmal J. Vi vil også takke University Grant of Commission for å gi Junior Research Fellowship til Manisha Malani og Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus for å tilby infrastrukturelt anlegg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
