Summary
Diabetisk retinopati är en av de främsta orsakerna till blindhet. Histologi, blod-retinal barriärnedbrytningsanalys och fluorescensangiografi är värdefulla tekniker för att förstå näthinnans patofysiologi, vilket ytterligare kan förbättra den effektiva läkemedelsscreeningen mot diabetisk retinopati.
Abstract
En bakre segment ögonsjukdom som diabetisk retinopati förändrar näthinnans fysiologi. Diabetisk retinopati kännetecknas av en retinalavskiljning, nedbrytning av blod-retinalbarriären (BRB) och retinal angiogenes. En in vivo-råttmodell är ett värdefullt experimentellt verktyg för att undersöka förändringarna i näthinnans struktur och funktion. Vi föreslår tre olika experimentella tekniker i råttmodellen för att identifiera morfologiska förändringar av retinala celler, retinal vaskulatur och komprometterad BRB. Retinal histologi används för att studera morfologin hos olika retinala celler. Kvantitativ mätning utförs också genom retinal cellantal och tjockleksmätning av olika retinala lager. En BRB-nedbrytningsanalys används för att bestämma läckaget av extraokulära proteiner från plasma till glasvävnad på grund av nedbrytningen av BRB. Fluorescensangiografi används för att studera angiogenes och läckage av blodkärl genom att visualisera retinal vaskulatur med fitc-dextranfärgämne.
Introduction
Diabetisk retinopati (DR) är en av de mest komplexa sekundära komplikationerna av diabetes mellitus. Det är också den främsta orsaken till blindhet som kan förebyggas i befolkningen i arbetsför ålder över hela världen. I en nyligen genomförd metaanalys av 32,4 miljoner blinda människor var 830 000 (2,6%) personer blinda på grund av DR1. Andelen synförlust som tillskrivs diabetes rankades som sjunde år 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnostiseras av vaskulära abnormiteter i de bakre okulära vävnaderna. Kliniskt är det uppdelat i två steg - Non-Proliferative DR (NPDR) och Proliferative DR (PDR), baserat på vaskulariseringen i näthinnan. Hyperglykemi anses vara den potenta regulatorn för DR eftersom det implicerar flera vägar som är involverade i neurodegeneration4,5, inflammation6,7 och mikrovaskulatur8 i näthinnan. Flera metaboliska komplikationer inducerade på grund av hyperglykemi inkluderar ackumulering av avancerade glykationsslutprodukter (AGEs), polyolväg, hexosaminväg och proteinkinas-C-väg. Dessa vägar är ansvariga för cellproliferation (endotelceller), migration (pericyter) och apoptos (neurala retinala celler, pericyter och endotelceller) baserat på olika stadier av diabetisk retinopati. Dessa metaboliska förändringar kan leda till fysiologiska förändringar såsom näthinneavlossning, förlust av retinala celler, nedbrytning av blod-retinalbarriären (BRB), aneurysmer och angiogenes9.
Streptozotocin (STZ) inducerad typ 1-diabetes är en väletablerad och väl accepterad praxis hos råttor för utvärdering av diabetespatogenes och dess komplikationer. Diabetogena effekter av STZ beror på selektiv förstörelse av bukspottkörtelns öar β-celler10. Som ett resultat kommer djuren att genomgå insulinbrist, hyperglykemi, polydipsi och polyuri, som alla är karakteristiska för human typ 1-diabetes mellitus11. För svår diabetesinduktion administreras STZ med 40-65 mg/kg kroppsvikt intravenöst eller intraperitonealt under vuxen ålder. Efter cirka 72 timmar uppvisar dessa djur blodsockernivåer högre än 250 mg/dl10,12.
För att förstå de fysiologiska förändringarna i näthinnan på grund av neurodegeneration, inflammation och angiogenes bör olika tekniker optimeras i experimentella djurmodeller. Strukturella och funktionella förändringar i retinala celler och retinala kärl kan studeras med olika tekniker såsom histologi, BRB-nedbrytningsanalys och fluorescensangiografi.
Histologi innebär studier av anatomin hos celler, vävnader och organ på mikroskopisk nivå. Det etablerar en korrelation mellan strukturen och funktionen hos celler / vävnad. Flera steg utförs för att visualisera och identifiera de mikroskopiska förändringarna i vävnadsstrukturen och därigenom jämföra friska och sjuka motsvarigheter13. Därför är det viktigt att standardisera varje steg i histologin noggrant. Olika steg som är involverade i retinal histologi är fixering av provet, trimning av provet, uttorkning, rensning, impregnering med paraffin, paraffininbäddning, sektionering och färgning (Hematoxylin och Eosinfärgning)13,14.
I en frisk näthinna styrs transporten av molekyler över näthinnan av BRB, bestående av endotelceller och pericyter på insidan och retinala pigmentepitelceller på utsidan. Inre BRB-endotelceller och pericyter börjar emellertid degenerera under det sjuka tillståndet, och BRB äventyras också15. På grund av denna BRB-nedbrytning läcker många molekyler med låg molekylvikt in i glas- och näthinnevävnad16. När sjukdomen fortskrider läcker också många andra proteinmolekyler (låg och hög molekylvikt) in i glas- och näthinnevävnad på grund av homeostasstörning17. Det leder till olika andra komplikationer och i slutändan makulärt ödem och blindhet. Därför komprometterade KVANTIFIERING av proteinnivåerna i glaskroppen och jämförelse av friska och diabetiska tillståndsåtgärder BRB.
Fluorescensangiografi är en teknik som används för att studera blodcirkulationen i näthinnan och koroid med fluorescerande färgämne. Det används för att visualisera vaskulaturen i näthinnan och koroiden genom att injicera fluoresceinfärgämne via intravenös väg eller hjärtinjektion18. När färgämnet injiceras når det först retinala artärer, följt av retinala vener. Denna cirkulation av färgämne slutförs vanligtvis inom 5 till 10 minuter från injektionen av färgämne19. Det är en viktig teknik för att diagnostisera olika bakre segment okulära sjukdomar, inklusive diabetisk retinopati och koroidal neovaskularisering20. Det hjälper till att upptäcka större och mindre vaskulaturförändringar i normala och sjuka tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer alla riktlinjer för djurvård som tillhandahålls av Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinal histologi
- Enukleation och fixering av ögat
- Avliva en 2 till 3 månader gammal diabetisk Wistar-hanråtta tillsammans med den åldersmatchade kontrollen (14 till 15 veckor gammal) med en hög dos pentobarbital (150 mg/kg) injicerad via intraperitoneal väg. Inga detekterbara hjärtslag bekräftar dödsfallet inom 2-5 minuter.
- Enukleera ögat genom att göra snitt med ett skalpellblad på ögats nasala och temporala regioner. Skär sedan längs kanterna med pincett och mikrosax för att ta bort ögat från orbitaluttaget.
OBS: Innan du offrar råttor, håll de fixativa lösningarna redo.
VARNING: Formaldehyd irriterar hud, öga, näsa och luftvägar. Det kan också orsaka cancer eftersom det är en potent hudsensibiliserare. Använd handskar och hantera den under huven21. - Tvätta ögat noggrant med 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en petriskål för att avlägsna blod. Ta bort överflödigt fett som omger ögat för enkel penetration av den fixativa lösningen.
- Placera omedelbart ögat i 5 ml fixativ lösning med hjälp av pincett och se till att det inte fastnar på väggar av glasflaskor. Rör om försiktigt i några sekunder och sätt tillbaka locket med korrekt märkning. Inkubera ögat i fixativ lösning i 24 till 48 timmar under mörka förhållanden vid rumstemperatur.
- Trimning av vävnad
- Efter fixering, ta bort ögat från fixeringslösningen, tvätta med 10 ml PBS och placera det i en petriskål innehållande 10 ml PBS kyld vid 4 ° C.
- Använd mikrotång, håll ögat med synnerven och gör ett nick på pars plana med hjälp av mikrosax. Skär genom hela hornhinnans marginal för att separera den främre koppen i ett öga. Använd pincett, plocka linsen försiktigt, kasta den och skär synnerven.
- Använd böjd mikrosax och gör en längsgående sektion av den bakre ögonkoppen och passera genom den optiska skivan som delar den i två halvor. Placera den i kassettens botten och stäng locket ordentligt utan störningar i vävnaden. Märk kassetterna med vävnadsprovets namn och datum.
- Uttorkning, rensning och paraffinimpregnering av vävnad
- Dehydrera den trimmade vävnaden genom gradvis överföring i 80 ml av 50%, 70%, 90% och 100% etanol. När du överför kassetterna från en koncentration till en annan, se till att dutta dem på rent silkespapper för att minimera kontaminering.
OBS: Låt vävnaden stå i varje överföring i 30 min (två gånger). Den totala tidsåtgången för detta steg är cirka 4 timmar. - Vid uttorkning, överför kassetterna till 80 ml xylen i 30 min (två gånger) för att ersätta etanolen med xylen.
OBS: Efter inkubation med xylen blir vävnaden genomskinlig.
VARNING: Xylen är en aromatisk förening med en bensenring. Det irriterar ögat och slemhinnan och kan också orsaka depressioner. - Impregnera slutligen vävnaden med förvärmt paraffin vid 60 °C för att ersätta xylen i vävnaden. Dutta kassetterna flera gånger på silkespapper för att minimera xylenhalten och lägg i 200 ml paraffin (vätska vid 60 °C) i 2 timmar (1 h x 2).
VARNING: Undvik att andas in smält paraffin, eftersom det producerar små lipiddroppar som kan orsaka andningsbesvär.
- Dehydrera den trimmade vävnaden genom gradvis överföring i 80 ml av 50%, 70%, 90% och 100% etanol. När du överför kassetterna från en koncentration till en annan, se till att dutta dem på rent silkespapper för att minimera kontaminering.
- Paraffin inbäddning
- Slå på paraffininbäddningsmaskinen minst 1 timme före användning för att smälta paraffinet och för att stationerna ska nå önskade temperaturer. Fyll en stålform med smält paraffinvax genom att placera den på en het yta och ta sedan bort en kassett i taget från paraffinbehållaren.
- Flytta stålformen från en varm till en kall yta (4 °C). Vid denna tidpunkt börjar vaxet i formen stelna. Innan den stelnar helt, placera vävnaden i vax med hjälp av pincett och orientera vävnaden så att den optiska skivdelen av den bakre koppen är vänd mot formens botten.
OBS: Se till att vävnaden inte rör sig och behåll önskad orientering. Om inte, sätt tillbaka formen på den varma arbetsytan tills hela paraffinet flyter och börja sedan igen med steg 1.4.2. - När vaxet i formen börjar stelna, placera omedelbart kassettbasen ovanpå formen. Fyll försiktigt formen med paraffin ovanför kassettens övre kant och överför den långsamt till en kall yta (nära -20 ° C) för snabb stelning. Tills den stelnar, upprepa processen med andra kassetter från steg 1.4.2.
- När alla formar har stelnat, separera stålformen från kassetten. Om det är svårt, vänta lite längre och försök igen (ta inte bort det kraftfullt). Separationen blir lättare vid fullständig stelning. Nu blir kassetten basen för paraffinblocket som ska hållas under sektionering av mikrotom.
OBS: Detta block kan förvaras vid rumstemperatur för vidare användning. Vid denna tidpunkt kan processen stoppas och fortsättas senare (om det behövs).
- Snittning
- Installera ett engångsmikrotomblad i bladhållaren. Ta bort överflödigt paraffinvax runt kassetter så att både de övre och nedre delarna av blocken förblir parallella med kniven. Montera blocket på kassetthållaren.
- Lås upp handhjulet för att avancera det tills blockets yta är i kontakt med knivens kant. Trimma överskottet av paraffinvax på blocket tills vävnaden visualiseras på blockets yta. Ställ in sektionstjockleken på 5 μm och klipp ett band med fem till sex sektioner.
- Använd pincett och överför försiktigt bandet till ytan på det förvärmda vattenbadet (cirka 50 ° C) för att fälla ut bandet. Samla sektioner på en glasrutschkana belagd med Mayers albumin genom att hålla bilden under sektionen. Lyft försiktigt sektionerna och låt rutschkanorna torka horisontellt över natten vid 37 °C.
OBS: Bilder kan förvaras vid rumstemperatur i torra lådor i flera månader. I detta steg kan processen stoppas och fortsättas senare.
- Färgning
- Värm rutschkanorna som ska färgas i en varmluftsugn vid 60 °C i 1 timme före användning för att paraffinet ska smälta och följ stegen som nämns i tabell 1.
VARNING: Hematoxylin- och Eosinfläckar är giftiga vid inandning eller intag. De har rapporterats vara cancerframkallande.
- Värm rutschkanorna som ska färgas i en varmluftsugn vid 60 °C i 1 timme före användning för att paraffinet ska smälta och följ stegen som nämns i tabell 1.
| Reagens | Ståtid | Repetition (Antal gånger) |
| Xylen | 5 minuter | 2 |
| 100% etanol | 5 minuter | 2 |
| 90% etanol | 5 minuter | 2 |
| 70% etanol | 5 minuter | 2 |
| 50% etanol | 5 minuter | 2 |
| Vatten | 5 minuter | 2 |
| Hematoxylin | 4 minuter | 1 |
| Vatten tvätt | ||
| 1% Sur alkohol i 70% etanol | 30 s | 1 |
| Vatten tvätt | ||
| Scotts vatten | 1 min | 1 |
| Vatten tvätt | ||
| 50% etanol | 1 min | 1 |
| 95% etanol | 1 min | 1 |
| 0.25% Eosin | 5 s | 1 |
| Vatten tvätt | ||
| Vatten | 2 minuter | 1 |
| 95% etanol | 1 min | 1 |
| 100% etanol | 1 min | 1 |
| Xylen | 5 minuter | 2 |
| Montering och täckglas | ||
Tabell 1. Hematoxylin och Eosin färgningsförfarande
2. Analys av nedbrytning av blod-hjärnbarriären
- Blod och glaskroppssamling
- Bedöva en 2 till 3 månader gammal diabetisk Wistar-hanråtta tillsammans med den åldersmatchade kontrollen (14 till 15 veckor) med ketamin (80 mg/kg) och xylazin (8 mg/kg). Bekräfta anestesitillståndet med pedalreflex (tå nypa). Samla omedelbart 1 ml blod genom hjärtpunktering i ett etylendiamintetraättiksyra (EDTA) belagt rör för att separera plasma från helblod.
- Avliva råttan med en hög dos pentobarbital (150 mg/kg), injicerad via intraperitoneal väg. Inga detekterbara hjärtslag bekräftar dödsfallet inom 2-5 minuter. Enucleate ögat och placera det omedelbart på torris.
- Placera ögat i en ren petriskål ovanför torris (rekommenderas) och börja dissekera ögat enligt steg 1.2.2.
- Ta bort linsen, dra glaskroppen försiktigt från den bakre koppen med mikrotång och placera den i ett homogeniseringsrör som innehåller tre till fyra glaspärlor (2-4 mm).
OBS: Dissektion på torris rekommenderas eftersom det är lättare att ta bort linsen och glaskroppen under frysningsförhållanden.
- Framställning av prover
- Homogenisera glasögonhumor i en pärlhomogenisator med medelhastighet i 10 s.
- Överför blod(1 ml) och glaskroppar (10-20 μL) till mikrocentrifugrören och centrifugera båda proverna vid 5200 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: Vid framgångsrik homogenisering har glaskroppen enhetlig konsistens efter centrifugering. Vid ojämn konsistens av glaskropp, upprepa emellertid från steg 2.2.1 med ökad homogeniseringstid. - Samla supernatant från båda proverna och späd glasartad humor och plasmaprover i förhållandet 1:10 respektive 1:20 med PBS.
- Proteinkvantifiering och glaskroppsplasmaproteinförhållande
- För att kvantitera proteinkoncentrationen i glasartade humor- och plasmaprover, tillsätt 5 μL utspädda prover till 250 μL Bradford-reagens, blanda väl och läs absorbansen vid 590 nm inom 40 minuter.
OBS: Om absorptionsvärdet för proverna är över 1,0, späd proverna ytterligare och upprepa proceduren från steg 2.2.3. - Normalisera glasartad proteinnivå till plasmaproteinnivå från samma råtta och mät vikskillnaden mellan friska kontra diabetiska råttor.
- För att kvantitera proteinkoncentrationen i glasartade humor- och plasmaprover, tillsätt 5 μL utspädda prover till 250 μL Bradford-reagens, blanda väl och läs absorbansen vid 590 nm inom 40 minuter.
3. Fluorescensangiografi
- FITC-dextran70000 färgämne injektion
- Bedöva en 2 till 3 månader gammal diabetisk Wistar-hanråtta tillsammans med den åldersmatchade kontrollen (14 till 15 veckor) med 3% isofluran och bekräfta pedalabstinensreflexen (tåklämman). Doppa svansen i en bägare som innehåller varmt vatten (37-40 °C). Rengör svansen med 70% etanol innan du injicerar färgämnet. Leta reda på svansens laterala ven och markera injektionspositionen i den nedre delen av svansen.
OBS: Om införandet av nålen misslyckas, försök att sätta in på en annan plats ovanför den aktuella positionen (spets till svansens botten). Det rekommenderas dock att injicera en gång eftersom upprepad prickning kan leda till stressutveckling hos råttan, vilket kan orsaka vasokonstriktion. - Injicera 1 ml 50 mg / ml FITC-dextran70000 färglösning genom svansvenen och låt färgämnet cirkulera i 5 minuter. Avliva råttan med en hög dos pentobarbital (150 mg/kg), injicerad via intraperitoneal väg. Inga detekterbara hjärtslag bekräftar dödsfallet inom 2-5 minuter. Enukleera ögat enligt steg 1.1.1.
OBS: Vid behov kan ögat fixeras i 4% formaldehydlösning, i högst 30 min.
- Bedöva en 2 till 3 månader gammal diabetisk Wistar-hanråtta tillsammans med den åldersmatchade kontrollen (14 till 15 veckor) med 3% isofluran och bekräfta pedalabstinensreflexen (tåklämman). Doppa svansen i en bägare som innehåller varmt vatten (37-40 °C). Rengör svansen med 70% etanol innan du injicerar färgämnet. Leta reda på svansens laterala ven och markera injektionspositionen i den nedre delen av svansen.
- Förberedelse av platt montering
- För att förbereda plana fästen, håll dissekeringsverktygen redo tillsammans med glidbanorna och täckglasen. Placera ögat i en petriskål fylld med kylt PBS och börja dissekera ögat enligt steg 1.2.2.
- Placera nu spetsen på en spetsig framcep mellan sclera och näthinnan. Flytta den försiktigt längs koppens kant och se till att näthinnan inte är fäst vid sclera när som helst. Om det finns något hinder, klipp långsamt den delen längs fälgen med böjd mikrosax.
- När det väl har bekräftats att näthinnan inte är fäst vid sclera från vilken sida som helst, skär nära den optiska skivan, vilket gör ett litet hål så att näthinnan helt lossnar från sclera. Tryck långsamt näthinnan i PBS-lösningen och placera den på en ren platt glid med hjälp av en spatel eller pincett.
- Använd mikrosax eller skalpellblad, gör mindre snitt i näthinnans vävnad och dela den i fyra kvadranter. Se till att skärningarna är minst 2 mm från hålet som lämnas av den optiska skivan i mitten, som visas i figur 1.
- Ta bort överflödig PBS från sidorna av vävnaden med 0,2 ml spetsar utan att störa det plana fästet.
- Placera en droppe anti-blekningsmonteringsmedium (50 μL till 100 μL) på ett plant fäste, täck med en täckglas och visualisera omedelbart under ett konfokalmikroskop.
OBS: Behåll minimalt ljus under hela proceduren.
- Visualisering av platt fäste
- Visualisera det plana fästet under 10x målet för ett konfokalmikroskop. Utför panelskanning för att fånga hela det platta fästet som en enda bild. Antalet plattor beror på storleken på retinal plattfäste. Utför också Z-stapling för att visualisera venerna och artärerna i olika foci (föredragen storlek för Z-stack är 5 μm, beroende på vilket antalet Z-stacksteg varierar).
- Använd PMT- och HyD-detektorn med % förstärkning som 700-900 respektive 100-150. Välj utsläppsområde mellan 510-530 nm för FITC-dextranfärgämne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal histologi
I den diabetiska näthinnan genomgår retinala celler degenerering. Dessutom ökar tjockleken på retinala skikt på grund av ödem22. Bilderna som erhålls efter hematoxylin- och Eosinfärgning kan användas för cellantal och mätning av tjockleken på olika lager, som visas i figur 2 med hjälp av ImageJ.
Analys av nedbrytning av blod-retinal barriär
Eftersom BRB äventyras hos diabetiska råttor blir läckage framträdande, vilket leder till ackumulering av biomolekyler från plasma till näthinnan och glaskroppen. Hos diabetiska råttor är proteinläckaget från plasma till glaskropp cirka tre gånger högre jämfört med friska råttor (figur 3). Protein kan uppskattas med hjälp av vilken kitmetod som helst, såsom Lowry-metoden, Bicinchoninic Acid (BCA) -metoden eller Bradford-metoden (som nämns i detta papper, avsnitt 2.3). Det rekommenderas att nyligen dissekera ögat, eftersom en fördröjning i bearbetningen kan leda till stark glasögonvidhäftning med näthinnan, vilket gör det svårt att separera. Felaktig separation av glaskropp från näthinnan kan leda till falskt positiva resultat.
Fluorescensangiografi
Denna teknik används för att visualisera näthinnans läckage och vaskulatur, inklusive mikro- och makrovaskulatur. Valet av storleken på FITC-dextran baseras på dess tillämpning för olika studier. Lågmolekylär vikt FITC-dextran, allt från 4-6 kDa, används för att visualisera läckage i vaskulaturen. Däremot används FITC-dextranmolekyler med hög molekylvikt, som sträcker sig från 70 kDa till 2 miljoner Da, för att visualisera angiogenes. Framgångsrik injektion av färgämne resulterar i att visualisera hela vaskulaturen i det retinala platta fästet, som visas i figur 4. De erhållna bilderna efter konfokalmikroskopi kan användas för att bestämma vaskulaturområdet som upptas i hela näthinnan med hjälp av ImageJ-programvara för att jämföra friska och sjuka grupper.
Figur 1. Retinal plattmonterad förberedelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Histologibilder av frisk kontra diabetisk näthinna. (A) och (B) representerar H&E-färgade retinala bilder av kontroll (A) och diabetisk råtta (B) under 40x. Den totala tjockleken på näthinnan och varje lager ökar under diabetiska tillstånd (C). Förkortningar: PRL = fotoreceptorskikt, ONL = yttre kärnskiktet, OPL = yttre plexiformskiktet, INL = inre kärnskiktet, IPL = inre plexiformskiktet och GCL = Ganglioncellskiktet. Data representeras som medelvärde ± SD. * representerar en signifikant skillnad från kontrollgruppen (P < 0,0001), medan # representerar en signifikant skillnad från kontrollgruppen vid P < 0,05, erhållen genom ANOVA-testet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Blod-retinal barriärnedbrytning hos friska kontra diabetiska råttor. Grafen representerar glaskroppens plasmaproteinförhållande mellan friska och diabetiska råttor. Data representeras som medelvärde ± SEM. * representerar en signifikant skillnad från kontrollgruppen (P < 0,01) erhållen genom opat t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Fluorescensangiografi av retinal vaskulatur. (A) och (B) representerar ett platt fäste av näthinnan visualiserat genom kakelskanning och sömnad av bilderna under 10x. (A) representerar kontrollhinnan, (B) representerar diabetisk näthinna. Den vita pilen indikerar läckage. Alla bilder erhölls med Z-stack (5 μm tjocklek). Skalstängerna i (A) och (B) är 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologi
Retinal histologi utförs för att visualisera de morfologiska förändringarna av retinala celler och lager. Olika steg, inklusive val av fixeringslösning, fixeringstid, uttorkning och paraffinimpregnering, måste optimeras. Vävnadsstorleken bör inte överstiga 3 mm, eftersom den fixerande penetrationen blir långsam. Den vanliga 4% paraformaldehyd leder till retinalavskiljning även i det friska ögat på grund av lösningens relativt höga osmolaritet jämfört med vattenhaltig humor och glasartad humor, vilket leder till falskt positiva resultat23. Lösningens höga osmolaritet resulterar i volymkontraktion och leder till krympning av vävnader. Den fixativa lösningen som används i detta protokoll är 1% formaldehyd med 1,25% glutaraldehyd, som har relativt mindre osmolaritet, minskar vävnadsförvrängningen, minimerar retinalavskiljningen från retinalpigmentepitelskiktet och bevarar också strukturen i sitt ursprungliga tillstånd. Ett annat val av fixativ lösning är ättiksyra och etanol med formaldehyd. Surt tillstånd av fixeringslösning kan hjälpa till vid snabb fixering av vävnad, medan etanol förbättrar penetreringen av den fixerande lösningen. Optimering av förhållandet mellan etanol och ättiksyra är dock viktigt eftersom överskottskoncentration kan leda till krympning respektive svullnad i vävnaden24. Utvärderingsparametrar för framgångsrik vävnadsfixering inkluderar frigöring av näthinnan, intakta retinala lager och vävnadskrympning. En annan kritisk faktor vid fixering är volymen av fixeringslösning, som bör vara minst 20 till 25 gånger ögats storlek för korrekt fixering25. Dessutom är det viktigt att virvla ögongloben eller vävnaden när den överförs från en lösning till en annan, så att den inte fastnar i behållarens botten eller väggar.
Ofullständig vävnadsbehandling, inklusive uttorkning och impregnering med paraffin, kan krympa och torr vävnad, som kan visualiseras när depression uppstår på blockets yta. Dessutom kommer dålig vävnadsbehandling också att resultera i färgning av sektioner i vitt när de utsätts för vatten25. Om vävnaden inte bearbetas korrekt kan den tas tillbaka genom xylen för att avlägsna paraffin, följt av rehydrering i nedgradient av etanol,(dvs 100% etanol, 90% etanol och 70% etanol). Upprepa återigen stegen från 1,3 till 1,4 för att framgångsrikt förbereda paraffinblock.
När du förbereder paraffinblock är det viktigt att se till att vävnaden är omgiven från alla håll av paraffin och inga luftbubblor ses. Eventuella misstag vid beredningen av blocket kommer att leda till misslyckad sektionering av vävnad. Ibland viks den bakre koppen under bearbetningen; vid denna tidpunkt kan den dras försiktigt isär med pincett (i uppvärmd paraffin) men inte i den utsträckning det skadar vävnaden. Antag att vävnadsorienteringen i stålform inte är som önskad medan paraffinet börjar stelna; i så fall kan den sättas tillbaka till smält paraffin och vävnad för att omorientera vävnaden för att förbereda paraffinblock. När du överför vävnaden till inbäddningsformen, se till att paraffinet runt vävnaden inte stelnar. Det skapar en hårlinjeseparation mellan vävnaden och inbäddningsmediet (paraffin) i blocket25. Om det händer, smälta paraffinet runt vävnaden genom att placera det i varmt paraffin och placera det i stålformen igen.
Under sektionering måste bladet vara tillräckligt skarpt för att ge utfällda band av vävnad. Använd inte en viss del av bladet mer än 30 gånger. Om blocket inte sektionerar ordentligt, anta att bladet är trubbigt och byt därför ut det eller skärp det igen. Om sektionerna inte är korrekta kan det också bero på felaktig paraffinimpregnering eller användning av gammalt paraffin för att impregnera och förbereda block. Paraffinet i blocket kan smälta ner och färskt paraffin kan användas för att förbereda blocket. För att undvika de ojämna sektionerna, rotera mikrotomens hjul långsamt med jämna varv snarare än snabba, ryckiga rörelser.
När du utför Hematoxylin- och Eosinfärgning är det viktigt att optimera tiden för Hematoxylin och Eosin-fläck eftersom det kan leda till under- eller överfärgning av vävnader. Felaktig smältning av paraffin eller rehydrering av vävnaden leder till ojämn färgning. Den kan visualiseras som de vita sektionerna på bilden. Dehydrera vävnaden och smält igen paraffin i en varmluftsugn, följt av stegen som nämns i tabell 1. Dessutom är ett av de vanliga felen som utförs under H & E-färgning användningen av alkohol som ett dehydrant efter Eosin-fläck. Överdriven användning av alkohol kan leda till underfärgning av cytoplasma och inklusionskroppar, vilket kan leda till dåligt färgade sektioner25. Användning av monteringsmedium bör ske omedelbart efter avlägsnande av överskott av xylen och undvika torkning av xylen eftersom det kan leda till snedvridning av vävnaden. Vattenbaserat monteringsmedel (såsom glycerol i PBS) måste också undvikas eftersom vävnaden är i ett uttorkat tillstånd. Vattenbaserat fäste tränger inte in i vävnaden och resulterar i dimmiga bilder.
Efter optimering av alla steg som nämns ovan kommer forskare att kunna utföra histologi framgångsrikt. Det tar cirka tre att fice försök att välja önskad fixativ lösning och optimera andra processparametrar.
Nedbrytning av blod-retinal barriär
Det mest känsliga steget i denna teknik är isoleringen av glaskroppen från ögat. Det utförs bäst på ett nytt öga. Användning av torris rekommenderas för enkel isolering av glas, speciellt om glaskroppen förblir fäst vid näthinnan. Ofta kan lins- eller näthinneblandning med glaskropp identifieras genom grumlighet av glaskropp på grund av näthinnan. Dessa problem kan vanligtvis undvikas med hjälp av frysningsförhållanden. Men om glaskroppstaggarna är bredvid linsen kan de separeras genom att klippa vid skärningspunkten mellan linsen och glaskroppen med hjälp av mikrosax. Om näthinnan drar ut tillsammans med glaskroppen kan näthinnan avlägsnas bit för bit med hjälp av mikrotångar. Användning av filtercentrifugering föreslås också för enkel isolering av glaskroppen från linsen och näthinnan26. Eftersom glaskropp är en gelliknande struktur behöver den homogenisering för en homogen blandning av proteiner. Vanligtvis, som nämnts i steg 2.2.1, är en enda homogeniseringscykel tillräcklig för korrekt homogenisering, vilken kan identifieras genom kondensering av glasartad humor vid centrifugering. Om glaskroppens gelkaraktär observeras efter centrifugering, upprepa homogeniseringen (steg 2.2.1). Proteinkvantifiering kan utföras med vilken kitmetod som helst, men bör vara känslig för att detektera de låga proteinnivåerna i glasartad upp till 2 μg / μL.
Fluorescensangiografi
Denna teknik syftar till att visualisera näthinnans vaskulära nätverk, och därför måste färgämnet nå jämnt i retinala mikrokärl. Olika steg kan optimeras för att säkerställa detta, såsom injektionsstället och cirkulationstiden. Ett färgämne kan injiceras via injektion av svansvenen eller hjärtinjektion. Hjärtinjektion riskerar att injicera färgämnet på en annan plats än hjärtat om det inte är välutbildat; därför föredras injektion av svansvenen. Att identifiera den laterala venen är dock lätt när den doppas i varmt vatten (37-40 ° C) och rengörs med 70% etanol. Etanol hjälper till att utvidga blodkärlen, vilket kan hjälpa till att komma åt venens placering. Det är också viktigt att färgämnet endast injiceras i venen. Underlåtenhet att injicera färgämne i svansvenen kan kännas av motstånd när man injicerar färgämnet eller utbuktar det närliggande området på grund av subkutan injektion. Nålen kan avlägsnas och sättas in igen på en annan plats i svansen. Framgångsrik injektion av svansvenen kan också visualiseras genom tvångsurinering av råttan; färgen på färgämnet är synlig i råtturin inom 30 till 40 s.
Cirkulationstiden är också viktig; vanligtvis är 5 till 10 minuter tillräckliga för att cirkulera färgämne i retinala kärl framgångsrikt. Ett platt fäste kan beredas i ett friskt öga eller ett fast öga. Att förbereda ett plant fäste i ett nytt öga kan vara utmanande, men när tekniken väl behärskas är den mest föredragen eftersom färgämnet under fixeringen börjar läcka i fixeringslösning27. Därför bör fixeringen inte förlängas i mer än 30 minuter för hela ögat. Vid svårigheter att separera färsk näthinna kan den till och med fixeras i en fixativ lösning (4% formaldehyd) efter att ha separerat den bakre koppen från den främre koppen i 15 till 20 min. Det ses ofta att färgämnet läcker från blodkärlen till omgivande vävnad, även i frisk näthinna. Detta kan bero på överdriven fixering; Därför bör den tid som behövs för fixering optimeras. Det förbättrar bara den enkla isoleringen av näthinnan och bevarar strukturen för framtida bruk. Dessutom kan ökad cirkulationstid för färgämne i djuret också leda till färgläckage från retinala kärl till omgivande vävnad, vilket måste optimeras.
Storleken på FITC-dextran är avgörande eftersom färgämne med högre molekylvikt inte kommer in i mikrovaskulaturer. Däremot kommer färgämne med lägre molekylvikt att läcka ut från nya kärl i den friska näthinnan28. Därför föredras FITC-dextran med en molekylvikt på 70 kD för att utföra fluorescensangiografi, för att visualisera läckage och vaskulatur i näthinnan. En signifikant begränsning av denna teknik är emellertid varaktigheten av utvecklingen av neovaskularisering hos diabetiska råttor och det invasiva förfarandet i studien, som i framtiden kan ersättas av icke-invasiva tekniker såsom elektroretinogram, fundus och andra icke-invasiva optiska instrument.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författare vill erkänna Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) för finansieringsstöd till Dr. Nirmal J. Vi vill också tacka University Grant of Commission för att ge Junior Research Fellowship till Manisha Malani och Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus för att tillhandahålla infrastrukturell anläggning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | Anesthesia agent | |
| Ketamine hydrochloride | Troikaa Pharmaceuticals | Anesthesia agent | |
| Xylazine | Indian Immunologicals Limited | Anesthesia agent | |
| Pentobarbital sodium | Zora Pharma | Euthanesia agent | |
| Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde | HiMedia, Avra | MB059, ASG2529 | Prepared in-house |
| Ethanol | Hayman | F204325 | Dehydration |
| Xylene | HiMedia | MB-180 | Clearing of ethanol or paraffin |
| Paraffin wax | HiMedia | GRM10702 | used for embedding tissue |
| Glycerol | HiMedia | TC503 | To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides |
| Hydrochloric acid | Sisco Research laboratories Pvt. Ltd. | 65955 | For preparation of 1 % acid alcohol |
| Acetic acid | HiMedia | AS119 | For preparation of eosin |
| Scotts water | Leica | 3802900 | Bluing reagent |
| Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution | Sigma | 1.09254.0500 | Staining of nuclei |
| Eosin | HiMedia | GRM115 | Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house |
| DPX Mountant media | Sigma | 6522 | Visualization and protection of retinal sections |
| Equipments | |||
| Glassware | Borosil | ||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Cassettes | HiMedia | PW1292 | To hold tissue during histology processing |
| Water bath | GT Sonic | GT Sonic-D9 | Temperature maintenance |
| Paraffin embedding station | Myr | EC 350 | Preparation of paraffin blocks |
| Microtome | Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd. | YD-335A | Sectioning |
| Blades | Leica | Leica 818 | Sectioning |
| Slides | HiMedia | BG005 | Holding paraffin-tissue sections |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Blood Retinal Barrier breakdown | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| Dry ice | Not applicable | Not applicable | Dissection |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Protein quantification |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| EDTA coated tubes | J.K Diagnostics | Not applicable | Separate plasma from whole blood |
| Homogenization tubes | MP Biomedicals | SKU: 115076200-CF | Homogenization of vitreous |
| Homogenization caps | MP Biomedicals | SKU: 115063002-CF | Homogenization of vitreous |
| Glass beads | MP Biomedicals | SKU: 116914801 | Homogenization of vitreous |
| Homogeniser | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | Homogenization of vitreous |
| 96-well plate - Transparent | Grenier | GN655101 | Protein quantification |
| Plate reader | Molecular devices | SpectrMax M4 | Absorbance measurement |
| Centrifuge | REMI | CPR240 Plus | Centrifugation |
| Fluorescence Angiography | |||
| Reagents | |||
| Isoflurane | Abbott | B506 | Anesthesia |
| FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO | FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia | FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185 | Prepared in-house |
| Fluoroshied | Sigma | F6182 | Anti-fading mounting medium |
| Equipments | |||
| Corneal forcep | Stephens Instruments | S5-1200 | Dissection |
| Colibri forcep | Stephens Instruments | S5-1135 | Dissection |
| Curved micro scissor | Stephens Instruments | S7-1311 | Dissection |
| Vannas scissor | Stephens Instruments | S7-1387 | Dissection |
| Iris scissor | Stephens Instruments | S7-1015 | Dissection |
| Glassware | Borosil | Not applicable | |
| Slides | HiMedia | BG005 | Flatmount preparation |
| Coverslips | HiMedia | BG014C | To cover tissue after adding mounting media |
| Confocal microscope | Leica | DMi8 | Visualization of flatmount |
References
- Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
- Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
- Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
- Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
- El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
- Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).
- Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
- Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
- Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).
- Akbarzadeh, A., et al.
- Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
- Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
- Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
- Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
- do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
- Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
- D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
- Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
- Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
- Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
- Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
- Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).
- D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).
