Summary
Protokollet beskriver beredningen av cellmembranaffinitetskromatografikolonner (CMAC) med immobiliserade cellmembranfragment innehållande funktionella transmembrantropomyosinkinasreceptor B-proteiner. Användningen av CMAC-kolumner vid identifiering av specialiserade växtmetaboliter som interagerar med dessa receptorer och närvarande i komplexa naturliga blandningar förklaras också.
Abstract
Kemikalier som syntetiseras av växter, svampar, bakterier och marina ryggradslösa djur har varit en rik källa till nya läkemedelsträffar och ledningar. Läkemedel såsom statiner, penicillin, paklitaxel, rapamycin, eller artemisinin, vanligen används i medicinsk praxis, har först identifierats och isolerats från naturliga produkter. Identifiering och isolering av biologiskt aktiva specialiserade metaboliter från naturliga källor är dock en utmanande och tidskrävande process. Traditionellt isoleras och renas enskilda metaboliter från komplexa blandningar efter extraktion av biomassa. Därefter testas de isolerade molekylerna i funktionella analyser för att verifiera deras biologiska aktivitet. Här presenterar vi användningen av cellulära membranaffinitetskromatografikolonner (CMAC) för att identifiera biologiskt aktiva föreningar direkt från komplexa blandningar. CMAC-kolumner möjliggör identifiering av föreningar som interagerar med immobiliserade funktionella transmembranproteiner (TMP) inbäddade i deras ursprungliga fosfolipid-dubbelskiktsmiljö. Detta är ett målinriktat tillvägagångssätt, vilket kräver att man känner till TMP vars aktivitet man avser att modulera med den nyligen identifierade småmolekylära läkemedelskandidaten. I detta protokoll presenterar vi ett tillvägagångssätt för att förbereda CMAC-kolumner med immobiliserad tropomyosinkinasreceptor B (TrkB), som har framstått som ett livskraftigt mål för läkemedelsupptäckt för många nervsystemet. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att montera CMAC-kolonnen med immobiliserade TrkB-receptorer med hjälp av neuroblastomcellinjer som överuttrycker TrkB-receptorer. Vi presenterar vidare tillvägagångssättet för att undersöka kolonnens funktionalitet och dess användning vid identifiering av specialiserade växtmetaboliter som interagerar med TrkB-receptorer.
Introduction
Botaniska blandningar är rika på farmakologiskt aktiva föreningar1, som fungerar som en bra källa för identifiering av nya läkemedelsträffar och leder 2,3,4,5. Upptäckten av nya läkemedel från naturprodukter har varit ett fruktbart tillvägagångssätt och många för närvarande godkända läkemedel härstammar från föreningar som först identifierades i naturen. Den kemiska mångfalden av naturliga föreningar är svår att matcha av konstgjorda bibliotek av kemiskt syntetiserade molekyler. Många naturliga föreningar interagerar med och modulerar mänskliga proteinmål och kan betraktas som evolutionärt optimerade läkemedelsliknande molekyler6. Dessa naturliga föreningar är särskilt väl lämpade för läkemedelsledaridentifiering för användning vid neurologiska störningar6. Två av de för närvarande FDA-godkända läkemedlen för hantering av Alzheimers sjukdom (AD) härrör från naturliga alkaloider, nämligen: galantamin och rivastigmin (ett derivat av fysostigmin)6. L-DOPA, för närvarande det vanligaste förskrivna läkemedlet för Parkinsons sjukdom, identifierades först från den breda bönan (Vicia faba L.) 7. Pergolid och lisurid, dopaminerga receptoragonister är derivat av naturliga ergotalkaloider från parasitsvampen Claviceps purpurea8. Reserpin, en alkaloid isolerad från indisk ormrot (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var ett av de första antipsykotiska läkemedlen9. Nyligen har dysreglerat immunsvar och systemisk inflammation kopplats till utvecklingen av många neurologiska sjukdomar, såsom egentlig depression eller neurodegenerativa sjukdomar10. En växtbaserad kost tillsammans med andra livsstilsinterventioner har visat sig förbättra kognitiva och funktionella förmågor hos äldre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Vissa elektrofila molekyler som tillhör triterpener och polyfenoler har visat sig modulera inflammatoriska svar i både in vitro- och in vivo-modeller 12. Till exempel stör naturliga föreningar som innehåller α,β-omättad karbonyl (t.ex. curcumin, kanelaldehyd) eller isotiocyanatgrupp (t.ex. sulforafan) Toll-liknande receptor-4 (TLR4) dimerisering som hämmar nedströmssyntesen av proinflammatoriska cytokiner i en murin interleukin-3 beroende pro-B-cellinje12,22 . Epidemiologiska bevis pekar starkt på att fytokemikalier i kosten, som finns i komplexa livsmedelsmatriser, också kan utgöra en livskraftig källa till nya läkemedelsledningar6.
Ett av de största hindren för identifiering av biologiskt aktiva molekyler som finns i växtextrakt, inklusive växtbaserad mat, är komplexiteten hos de undersökta proverna. Traditionellt isoleras, renas de enskilda föreningarna och testas därefter för biologisk aktivitet. Detta tillvägagångssätt leder vanligtvis till identifiering av de mest rikliga och väl karakteriserade föreningarna. Fenotypiska läkemedelsupptäcktsmetoder utan ett definierat molekylärt mål förlitar sig på biostyrd fraktionering av komplexa blandningar23. I detta tillvägagångssätt fraktioneras ett extrakt i mindre komplexa delfraktioner som därefter testas i fenotypiska analyser. Isoleringen och reningen av aktiva föreningar styrs av biologisk aktivitet verifierad i analysen. Kunskapen om identiteten hos ett specificerat läkemedelsmål kan avsevärt påskynda identifieringen av farmakologiskt aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar. Dessa tillvägagångssätt är vanligtvis baserade på immobilisering av det molekylära målet, till exempel ett enzym, på en fast yta, som magnetiska pärlor23. De immobiliserade målen används därefter i screeningexperimenten vilket resulterar i isolering av föreningar som interagerar med målet. Även om detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning vid identifiering av föreningar som riktar sig mot cytosoliska proteiner, har det varit mindre vanligt vid identifiering av kemikalier som interagerar med transmembranproteiner (TMP)23. En ytterligare utmaning i immobiliseringen av TMP härrör från det faktum att proteinets aktivitet beror på dess interaktion med cellmembranfosfolipider och andra molekyler i dubbelskiktet, såsom kolesterol23,24. Det är viktigt att bevara dessa subtila interaktioner mellan proteiner och deras inhemska fosfolipid dubbelskiktsmiljö när man försöker immobilisera transmembranmålet.
I cellulär membranaffinitetskromatografi (CMAC) är cellmembranfragment, och inte renade proteiner, immobiliserade på det artificiella membranet (IAM) stationära faspartiklar23. IAM stationära faser framställs genom kovalent bindning av fosfatidylkolinanaloger på kiseldioxid. Nyligen har nya klasser av IAM stationära faser utvecklats där fria amin- och silanolgrupper är sluttäckta (IAM. Persondator. DD2-partiklar). Under CMAC-kolonner förbereds cellmembranfragment på ytan av IAM-partiklar genom adsorption.
CMAC-kolumner har hittills använts för att immobilisera olika klasser av TMP inklusive jonkanaler (t.ex. nikotinreceptorer), GPCR (t.ex. opioidreceptorer), proteintransportörer (t.ex. p-glykoprotein), etc.24. De immobiliserade proteinmålen har använts vid karakterisering av farmakodynamik (t.ex. dissociationskonstant, Kd) eller bestämning av bindningskinetik (kpå och kav) av småmolekylära ligander som interagerar med målet samt i processen att identifiera potentiella nya läkemedelsledningar som finns i komplexa matriser24 . Här presenterar vi beredningen av CMAC-kolumner med den immobiliserade tropomyosinkinasreceptorn B (TrkB), som har framstått som ett livskraftigt mål för läkemedelsupptäckt för många nervsystemet.
Tidigare studier visade att aktiveringen av den hjärnhärledda neurotrofiska faktorn (BDNF) / TrkB-vägen är associerad med förbättring av vissa neurologiska sjukdomar, såsom AD eller egentlig depression 25,26,27,28. Det rapporterades att BDNF-nivåerna och dess receptor TrkB-uttryck minskar i AD, och liknande minskningar försämrar hippocampusfunktionen i djurmodeller av AD29. Minskade nivåer av BDNF rapporterades i serum och hjärna hos AD-patienter 30,31,32. Tau-överuttryck eller hyperfosforylering visade sig nedreglera BDNF-uttryck i primära neuroner och AD-djurmodeller 33,34,35. Dessutom rapporterades BDNF ha skyddande effekter på β-amyloidinducerad neurotoxicitet in vitro och in vivo36. Direkt administrering av BDNF i råtthjärnan visade sig öka inlärning och minne hos kognitivt nedsatta djur37. BDNF/TrkB framstod som ett giltigt mål för att förbättra neurologiska och psykiatriska störningar inklusive AD 28,38. Att rikta in sig på BDNF/ TrkB-signalvägen för utveckling av terapier i AD kommer potentiellt att öka vår förståelse av sjukdomen39. Tyvärr kan BDNF i sig inte användas som behandling på grund av dess dåliga farmakokinetiska egenskaper och negativa biverkningar40. Småmolekylaktivatorer av TrkB/ BDNF-vägar har undersökts som potentiella TrkB-ligander 41,42,43. Bland testade småmolekylära agonister har 7,8-dihydroxiflavon (7,8-DHF) visat sig aktivera BDNF/TrkB-vägen 41,44,45,46. Ett derivat av 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenyl-4H-kromen-7,8-diyl bis(metylkarbamat)) övervägs för närvarande som ett möjligt läkemedel för AD47. Nyligen visades det att flera antidepressiva medel fungerar genom direkt bindning till TrkB och främjande av BDNF-signalering, vilket ytterligare betonar vikten av att driva TrkB som ett giltigt mål för att behandla olika neurologiska störningar48.
Protokollet beskriver processen för montering av funktionell TrkB-kolumn och TrkB-NULL negativ kontrollkolonn. Kolonnerna karakteriseras med användning av en känd naturlig produkt småmolekylär ligand: 7,8-DHF. Dessutom beskriver vi processen för screening av komplexa matriser, med hjälp av växtextrakt som ett exempel, för identifiering av föreningar som interagerar med TrkB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling av SH-SY5Y neuroblastomceller (TrkB och TrkB-NULL (föräldra) cellinjer)
OBS: Cellinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) och SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 köptes från Kerafast. Odlade celler används som en källa till transmembranreceptorerna som ska immobiliseras för framställning av CMAC-kolumner. Följande steg beskriver hur man får cellmembranfragment och monterar funktionella CMAC-kolumner.
- Odla cellerna i ett cellodlingsmedium framställt genom att blanda 450 ml RPMI-media, 50 ml FBS, 5 ml penicillin/ streptomycinlösning och 0,3 mg / ml genetik (G418) i en 150 mm cellodlingsskål vid 37 ° C i en fuktig atmosfär med 5%CO2.
2. Cell skörd
- Bekräfta cellsammanflöde (80% -90%) med hjälp av ett mikroskop, nått efter 3-4 dagar efter cellpassage.
- Aspirera cellodlingsmedium ovanför cellerna och tvätta cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 1x, pH 7,4). Ta bort PBS och tillsätt 2 ml lågkoncentrerad trypsin (0,25%) för att ta bort celler.
- Snurra försiktigt plattan för att jämnt täcka alla celler med trypsinlösning och inkubera cellerna i cirka 2 minuter vid 37 °C i en fuktig atmosfär med 5% CO2. Tillsätt 8 ml cellodlingsmedium till lösgörande celler och överför fristående celler till ett 50 ml koniskt rör och placera det på is.
- Använd en hemocytometer för att uppskatta antalet celler (cirka 3 x 107 celler). Blanda cellsuspension genom pipettering upp och ner för att erhålla jämn celltäthet i blandningen. Placera 10 μL cellsuspension under täckglaset och räkna cellerna under ett mikroskop med ett 40x mål.
3. Cellhomogenisering
- Förbered stamlösningar av följande proteashämmare: bensamidin (200 mM), fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF, 10 mM) och kommersiellt tillgängliga proteashämmare cocktail (100x koncentration) innehållande 4-(2-aminoetyl)bensensulfonylfluoridhydroklorid (AEBSF), aprotinin, bestatin och leupeptin.
VARNING: PMSF ska endast hanteras inuti dragskåpet.- Förbered bensamidin stamlösning (200 mM) genom att lösa upp 120 mg bensamidin i 5 ml ultrarent avjoniserat vatten. Förvaras vid 4 °C och används inom en dag. Nyberedd lösning före varje användning (rekommenderas).
- Förbered PMSF-stamlösning (10 mM) genom att lösa upp 0,017 g PMSF i 10 ml etanol. Förvaras vid - 20 °C.
- Förbered proteashämmare cocktail (100x) genom att lösa upp kommersiellt tillgänglig proteashämmare blandning i 1 ml ultrarent avjoniserat vatten. Blanda noggrant och alikvotera 200-300 μl av cocktailen och förvara vid - 20 °C före användning.
- Förbered ATP-stamlösning (100 mM) genom att lösa upp 55,114 mg ATP-dinatriumsalthydrat i 1 ml avjoniserat ultrarent vatten. Blanda blandningen noggrant och alikvotera 100 μL och förvara vid - 20 °C före användning.
- Förbered bufferten genom att lösa upp 3,03 g tris(hydroximetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl, 50 mM), 2,9 g natriumklorid (NaCl, 100 mM), 0,22 g vattenfri kalciumklorid (CaCl2, 3 mM), 0,2 g magnesiumkloridhexahydrat (MgCl2, 2 mM) och 0,19 kaliumklorid (KCl, 5 mM) i 500 ml ultrarent avjoniserat vatten.
- Förbered homogeniseringsbufferten genom att blanda 17,3 ml av bufferten som bereddes i steg 3.3 med 0,3 ml (3 mM) bensamidin stamlösning, 0,2 ml (0,1 mM) PMSF-stamlösning, 0,2 ml proteashämmare cocktailblandning, 20 μl (100 μM) ATP-stamlösning, 2 ml (10%) glycerol och 0,029 g (5 mM) EDTA (tabell 1). Justera pH till 7,4 med saltsyralösning.
- Snurra ner cellerna som skördats i steg 2.3 vid 4 °C i 5 minuter vid 400 x g. Ta bort supernatanten och tvätta den återstående cellpelleten med 10 ml iskall PBS (1x, pH 7,4). Snurra ner cellerna igen vid 4 °C i 5 min vid 400 x g.
- Kassera supernatanten och ersätt den med 20 ml homogeniseringsbuffert som bereddes i steg 3.4. Placera det koniska röret på is.
- Överför cellsuspensionen till en 40 ml Dounce homogenisatorvävnadskvarn och lägg den på is. Homogenisera suspensionen manuellt, på is, med 40 upp-och-ner-stötslag. Överför homogeniserad cellsuspension till ett 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera homogenatet vid 4 °C i 7 min vid 400 x g. Kassera pelleten och överför supernatanten till ett nytt koniskt rör och centrifugera den vid 4 °C i 30 minuter vid 47900 x g. Spara cellmembranpelleten och kassera supernatanten.
4. Cellmembran solubilisering
- Förbered solubiliseringsbufferten genom att blanda 8,7 ml av buffertlösningen gjord i steg 3.3 med 0,1 ml (0,1 mM) PMSF-stamlösning, 0,15 ml (3 mM) bensamidinstockslösning, 0,1 ml proteashämmarecocktail, 10 μl (100 μM) ATP-stamlösning, 1 ml (10%) glycerol och 0,2 g (2%) natriumcholat (tabell 2).
- Överför solubiliseringsbufferten till det koniska röret med cellmembranfragment erhållna i steg 3.8 och återsuspendera pelleten. Vrid den resulterande blandningen vid 150 rpm vid 4 °C i 18 timmar.
OBS: Vid denna tidpunkt kan experimentet pausas för cellmembranpelletslöslighet över natten.
5. Cellmembran immobilisering på IAM. Persondator. DD2-partiklar
- Efter 18 timmar centrifugerar du solubiliseringsblandningen vid 4 °C i 30 minuter vid 47900 x g.
- Håll supernatanten och kassera pelleten. Tillsätt 100 mg IAM. Persondator. DD2-partiklar, till supernatanten, virveln och rotera den resulterande suspensionsblandningen vid 150 rpm vid 4 °C i 1 timme.
- För att underlätta immobilisering av cellmembranfragment på IAM. Persondator. DD2-partiklar fortsätter till dialyssteget enligt beskrivningen nedan.
- Förbered dialysbufferten i 4 liter ultrarent avjoniserat vatten genom att tillsätta 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) och 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabell 3).
OBS: PMSF är inte lösligt i vatten, lös därför upp det först i liten volym etanol och tillsätt sedan långsamt i bägaren med bufferten. - Justera pH till 7,4 med saltsyralösning. Placera bufferten vid 4 °C i minst 1 timme innan du fortsätter till dialyssteget.
- Förbered dialysröret genom att skära 10 cm cellulosamembrandialysslangar (10 K MWCO, 35 mm) och överför suspensionen som innehåller IAM. Persondator. DD2-partiklar och cellmembranfragment i dialysröret. Använd dialysslangklämmor för att stänga båda ändarna av dialysröret.
- Placera dialysröret som innehåller IAM. Persondator. DD2 stationär fas i dialysbufferten och dialysera vid 4 °C i 24 timmar under försiktig omrörning.
- Efter 24 timmar placerar du dialysslangen i den nyberedda dialysbufferten och fortsätter dialysen i ytterligare 24 timmar.
- Förbered dialysbufferten i 4 liter ultrarent avjoniserat vatten genom att tillsätta 24 g tris-HCl (50 mM), 23,4 g NaCl (100 mM), 0,06 g CaCl2 (0,1 mM), 5,85 g EDTA (5 mM) och 0,07 g PMSF (0,1 mM; Tabell 3).
6. Cmac-kolonnförpackning
- Förbered ammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) som kommer att användas för att tvätta IAM. Persondator. DD2-partiklar och i kolonnkarakteriseringsexperiment genom att lösa upp 0,7708 g ammoniumacetat i 1 liter ultrarent avjoniserat vatten. Justera pH till 7,4 med saltsyralösning.
- Efter 48 timmars dialys, ta bort dialysröret från dialysbufferten och överför innehållet i dialysröret till ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera blandningen vid 4 °C i 5 minuter vid 400 x g. Kassera supernatanten och tvätta den återstående pelleten tre gånger med 10 ml ammoniumacetatbuffert och centrifugera blandningen vid 4 °C i 5 minuter vid 400 x g efter varje tvätt.
- Efter den tredje tvätten, återsuspendera den återstående pelleten i 1 ml ammoniumacetatbuffert. Blanda det noggrant och använd den resulterande uppslamningen för att packa 5/20 glaskolonnen för att ge CMAC-kromatografikolonn.
- För att packa kolonnen, placera först ett bottenfilter som tidigare blötläggts med ammoniumacetatbuffert i filterhållaren. Montera filterhållaren i glaskolonnen och skruva fast pelarlocket för att säkra hållarens position. Placera kolonnen vertikalt i en fingerklämma och säkra den i labbstativet. Placera en bägare under kolumnen.
- Överför med hjälp av en enkanals pipettor en liten volym av den uppslamning som erhölls i steg 6.4 till glaskolonnen. Häll materialet långsamt och håll pipettspetsen mot glaskolonnväggen. Låt förpackningsmaterialet sätta sig innan du häller en annan volym uppslamning.
- För att påskynda förpackningsprocessen, ta bort bufferten ovanför den stationära sängen med en mikropipett mellan varje steg. Upprepa dessa steg tills 1 ml av flytgödseln är packad.
- Placera ett övre filter och skruva fast adapterenheten så att det inte finns någon återstående buffert ovanför den stationära fasen, som visas i figur 1. Säkra adapterenhetens position med adapterlåset.
- Anslut kolonnen till en högpresterande vätskekromatografipump (HPLC), ställ in flödeshastigheten på 0,2 ml/min och tvätta kolonnen över natten med ammoniumacetatbuffert. Kolumnen är nu redo för karakteriseringssteget. Förvara kolonnen vid 4 °C tills den används.
OBS: För längre lagring (kolonn som inte används längre än en vecka) kör kolonnen med 0,05% natriumazidlösning i ammoniumacetatbuffert och förvara vid 4 °C.
VARNING: Natriumazid är mycket giftigt när det intas oralt eller absorberas genom huden; den ska endast hanteras under dragskåpet. Se till att bära en labbrock, skyddsglasögon och handskar (nitril föredras) när du arbetar med natriumazid.
7. Cmac-kolumnkarakterisering
- Konfokalmikroskopi och BDNF-bindning
- Förbered IAM. Pcc. DD2 stationära faspartiklar med immobiliserade cellmembranfragment erhållna separat från SH-SY5Y neuroblastomceller som överuttrycker TrkB- och SH-SY5Y TrkB-NULL-celler genom att följa instruktionerna från steg 1 till steg 6.4.
- För prover som kommer att inkuberas med BDNF före antikroppsfärgning, förbered BDNF-stamlösning genom att lösa upp 10 μg BDNF i 100 μL ultrarent avjoniserat vatten. Förvara lösningen vid -20 °C.
- Överföring i separata 1,5 ml mikrocentrifugrör, 100 μl alikvot IAM. Persondator. DD2-kolonnförpackningsmaterial med immobiliserade SH-SY5Y-neuroblastomceller som överuttrycker TrkB och 100 μL alikvot av IAM. Persondator. DD2-kolonnförpackningsmaterial med immobiliserade SH-SY5Y TrkB-NULL-celler suspenderade i ammoniumacetatbuffert.
- Tillsätt 390 μl ammoniumacetatbuffert, 10 μl BDNF-stamlösning och 0,5 μl ATP-stamlösning (beredd i steg 3.2) i varje rör och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med gungning.
- För prover som inte kommer att inkuberas med BDNF före antikroppsfärgning, överför 100 μL alikvot IAM. Persondator. DD2-kolonnförpackningsmaterial med immobiliserade SH-SY5Y-neuroblastomceller som överuttrycker TrkB suspenderat i ammoniumacetat i 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 400 μl ammoniumacetatbuffert och 0,5 μl ATP-stamlösning (beredd i steg 3.2) i varje rör och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur med gungning.
- Snurra de prover som beretts i steg 7.1.2 och 7.1.4 vid 4 °C i 1 min vid 10 000 x g och kassera supernatanten.
- Tvätta de resulterande pelletsen med 500 μl ammoniumacetatbuffert i 10 min och snurra igen vid 4 °C i 1 min vid 10 000 x g och kassera supernatanten.
- Tillsätt 220 μl ammoniumacetatbuffert till var och en av pelletsen, 25 μl 10% normalt getserum och 5 μl primär anti-BDNF-antikropp. Inkubera i ett kylrum (4 °C) över natten med gungning.
- När inkubationssteget är klart snurrar du blandningen i 1 min vid 10 000 x g vid 4 °C och kasserar supernatanten.
- Tvätta den resulterande pelleten 3 gånger med ammoniumacetatbuffert innehållande 1% milt rengöringsmedel (t.ex. natriumcholat) i 10 min och snurra blandningarna i 1 min vid 10 000 x g vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Bered sekundär antikroppslösning genom att blanda 900 μl ammoniumacetatbuffert, 100 μl 10 % normalt getserum och 1 μl fluoroforkonjugerad sekundär antikropp (1:1 000 spädning). Tillsätt 300 μl sekundär antikroppslösning till var och en av de pellets som erhållits i steg 7.1.9. och inkubera över natten vid 4 °C med gungning.
- Snurra blandningen vid 10 000 x g i 1 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Tvätta den resulterande pelleten 3 gånger med ammoniumacetatbuffert innehållande 1% milt rengöringsmedel (t.ex. natriumkolat) i 10 min och snurra blandningen i 1 min vid 10 000 x g vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Återsuspendera de resulterande pelletsen i 50 μL ammoniumacetatbuffert. Placera 20 μl av var och en av blandningarna på ett objektglas och täck med ett täckglas.
- Bild på IAM. Persondator. DD2-partiklar med de immobiliserade cellmembranfragmenten med användning av ett konfokalt laserscanningsmikroskop med excitation vid 488 nm och emission vid 520 nm genererat med hjälp av ett fast tillståndslasersystem. Använd ett 20x mål med en NA på 0,75 och WD på 0,35 mm.
- Frontal affinitetskromatografi med 7,8-DHF som markörligand
- Anslut en CMAC-kolonn till ett HPLC-system med en diodmatrisdetektor och/eller masspektrometer.
- Bered 500 ml 1 mM lösning av 7,8-DHF i ammoniumacetatbuffert innehållande 5% metanol.
- Pumpa konstant koncentration av markörliganden (1 mM) genom CMAC-kolonnen vid 0,4 ml/min flödeshastighet vid rumstemperatur. Övervaka elueringsprofilen med antingen en diodmatrisdetekteringsdetektor (DAD) (våglängd 254 nm) eller masspektrometer (använd övervakningsläge för en jon; m / z 253 i negativt joniseringsläge).
- Efter avslutad körning utför tvätt över natten genom att köra ammoniumacetatbuffert genom kolonnen.
- Upprepa steg 7.2.2. - 7.2.4. med olika koncentrationer av markörliganden (750 nM, 500 nM, 300 nM), tvätta kolumnerna över natten efter varje körning. Använd frontal affinitetskromatografi för att beräkna liganden Kd, som granskats i detalj, någon annanstans. 24,51
- Förskjutningsstudier med Centella asiatica (L.) Urb. (gotu kola) extrakt
- Bered 500 ml 500 nM lösning av 7,8-DHF i ammoniumacetatbuffert innehållande 5% metanol och 0,2% vattenhaltigt gotu kolaextrakt (10 mg/ml).
- Pumpa konstant koncentration av markörliganden (500 nM) med extraktet genom kolonnen vid 0,4 ml/min flödeshastighet vid rumstemperatur. Övervaka elueringsprofilen med antingen en DAD-detektor (våglängd 254 nm) eller en masspektrometer (använd övervakningsläge för en jon; m/z 253 i negativt joniseringsläge).
- Efter avslutad körning utför tvätt över natten genom att köra ammoniumacetatbuffert genom kolonnen.
- Plotta elueringsprofilerna för 500 nM 7,8-DHF och den som erhålls efter att ha kört lösningen med gotu kola-extrakt för att inspektera markörligandförskjutning.
8. Saknad toppkromatografimetod för att identifiera potentiella TrkB-bindemedel från gotu kola-extrakt
- Fraktionering av gotu kola extrakt på CMAC kolumner
- Anslut separat CMAC TrkB- och TrkB-NULL-kolumnerna till ett HPLC-system och injicera 50 μL av det vattenhaltiga gotu kola-extraktet (10 mg / ml) på var och en av kolumnerna. Pumpammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) innehållande 5 % metanol genom kolonnen vid 0,4 ml/min flödeshastighet vid rumstemperatur.
- Samla fraktioner separat från CMAC TrkB- och TrkB-NULL-kolumner enligt följande: 0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, 15-20 min, 20-25 min, 25-30 min, 30-35 min, 35-40 min, 40-45 min, 45-50 min, 50-55 min, 55-60 min.
- Frys och frys de erhållna fraktionerna. Resuspend lyofiliserade fraktioner i 50 μL metanol innan du fortsätter till ultraprestanda vätskekromatografi och masspektrometrianalys.
- Ultraprestanda vätskekromatografi fyrdubbla flygtid masspektrometri (UPLC-QTOF-MS) analys av gotu kola CMAC fraktioner
- Analysera alla fraktioner som erhållits i punkt 8.1.3. med hjälp av en masspektrometer i kombination med ett UPLC-system (UPLC-MSE-analysläge ). Analysera fraktionerna med en C18-kolonn (2,1 x 50 mm, 1,7 μm) med en C18 VanGuard-förkolonn (2,1 mm x 5 mm, 1,7 μm).
- Elue kolonnen med hjälp av följande gradientlösningar med en flödeshastighet på 0,3 ml/ min med mobil fas A (vatten med 0,1% myrsyra) och B (acetonitril med 0,1% myrsyra): 0,0 min 99% A 1% B, 1,5 min 84% A 16% B, 5,0 min 80% A 20% B, 7,0 min 75% A 25% B, 10,0 min 65% A 35% B, 20,0-24,0 min 1% A 99% B, 25,0-29,0 min 99% A 1% B.
- Ställ in injektionsvolymen för varje prov på 3 μL. Utför MSE i upplösning positiva och negativa jonlägen, med kollisionsenergi vid 4V för låg energi och 20-35 V för hög energi.
- Använd följande ESI-källförhållanden i positivt joniseringsläge: kapillärspänning 1,5 kV, provtagningskon 40 V, källförskjutning 80, källtemperatur 100 °C, upplösningstemperatur 350 °C, kongasflöde 38,0 L/h, upplösningsgas 400 L/h.
- Använd följande ESI-källförhållanden i negativt joniseringsläge: kapillärspänning 1,45 kV, provtagningskon 40 V, källförskjutning 80, källtemperatur 110 °C, upplösningstemperatur 300 °C, kongasflöde 50,0 l/h, upplösningsgasflöde 652 l/h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollet monterades två CMAC-kromatografiska kolumner: en med de immobiliserade SH-SY5Y-neuroblastomcellmembranfragmenten med överuttryckt TrkB och en med SH-SY5Y TrkB-NULL-cellmembranfragment. Den korrekt monterade CMAC-kolonnen presenteras i figur 1 och stegen som är involverade i immobilisering av cellmembranfragment presenteras i figur 2.
Sedan immobiliseringen av TrkB-receptorer på IAM. Persondator. DD2-kromatografisk stationär fas hade inte försökts tidigare, den framgångsrika immobiliseringen av receptorerna bekräftades genom antikroppsfärgning och frontal affinitetskromatografi med användning av en markörligand: 7,8-DHF. En schematisk representation av antikroppsfärgningsexperimentet presenteras i figur 2. Cellmembranfragment erhållna från neuroblastom cellinje överuttryckande TrkB-receptorer och cellmembranfragment från föräldracelllinje utan TrkB-receptorer (TrkB-NULL)) immobiliserades på IAM. Persondator. DD2-partiklar med hjälp av det optimerade protokollet. Därefter inkuberades partiklarna med immobiliserade cellmembranfragment med BDNF (fysiologisk ligand) och sedan med primära och fluorescerande märkta sekundära antikroppar (Figur 2). Iam. Persondator. DD2-partiklar med immobiliserat neuroblastom TrkB-cellmembranfragment och i närvaro av BDNF resulterade i fluorescerande märkta partiklar (Figur 3C). Ingen fluorescens (förutom svag bakgrundsfluorescens) observerades när TrkB-NULL-cellmembraninkapslade IAM-partiklar undersöktes (figur 3A) eller när ingen BDNF användes för TrkB-cellmembraninkapslade IAM-partiklar (figur 3B).
För att karakterisera bindningen av en liten markörligand (7,8-DHF) till de immobiliserade TrkB-receptorerna utfördes frontal affinitetskromatografi med olika koncentrationer av 7,8-DHF. Ett typiskt kromatogram med ökande 7,8 DHF-koncentrationer på en funktionell CMAC-kolonn presenteras i figur 4. Specifik bindning av 7,8-DHF till den immobiliserade TrkB bekräftades av de koncentrationsberoende minskningarna av retentionstiden för markörliganden. Frontal affinitetskromatografiresultat erhållna på en icke-funktionell CMAC-kolonn presenteras i figur 5. Bristen på koncentrationsberoende förändringar i retentionen av markörliganden indikerar det misslyckade försöket i CMAC-beredning.
Föreningar som injiceras på CMAC-kolonnen interagerar inte bara specifikt utan kan också icke-specifikt interagera med IAM. Persondator. DD2-partiklar, fosfolipid dubbelskikt av de immobiliserade cellmembranfragmenten och andra proteiner som finns i dubbelskiktet. För att utesluta föreningar som inte specifikt interagerar med CMAC-kolonnen under screening av komplexa extrakt för TrkB-bindemedel är det viktigt att förbereda CMAC-negativ kontrollkolonn genom att immobilisera cellmembranfragment av föräldracellinjen som inte uttrycker det riktade proteinet (i detta fall TrkB-NULL). Frontal affinitetskromatografiresultat erhållna på en negativ CMAC TrkB-NULL-kolumn presenteras i figur 6.
Funktionella CMAC-kolumner kan användas för olika ändamål, såsom karakterisering av det riktade proteinet, studier av interaktioner mellan enskilda föreningar och de immobiliserade målen (t.ex. erhållande av dissociationskonstant, Kd) eller bestämning av bindningskinetik (kpå och kav) etc.24. Kolumnerna kan också användas för att screena komplexa prover, såsom växtextrakt för närvaron av föreningar som binder till TrkB-receptorer, och därför potentiellt innehåller molekyler som fungerar som TrkB-agonister eller antagonister. För att verifiera om ett extrakt potentiellt innehåller föreningar som interagerar med de immobiliserade receptorerna utförs ett enkelt förskjutningsexperiment. Resultatet av tävlingsexperimentet utfört med gotu kola-extrakt och 500 nM av 7,8-DHF på en funktionell TrkB-kolonn presenteras i figur 7. Tillsatsen av 0,2% vattenhaltigt gotu kola-extrakt (10 mg/ml) resulterade i en signifikant minskning av 7,8-DHF-retention som indikerar närvaron av konkurrerande ligander för agonistbindningsstället. Resultatet av förskjutningsexperimentet som utfördes på CMAC-negativa TrkB-NULL-kolumnen presenteras i figur 8. Bristen på reduktion av 7,8-DHF-retention på den kolumnen bekräftar ytterligare bristen på funktionella TrkB-receptorer på CMAC TrkB-NULL-kolonnen.
För att identifiera specialiserade metaboliter som specifikt interagerar med de immobiliserade målen används CMAC-kolumner i ett tillvägagångssätt som kallas saknad toppkromatografi52 efter förskjutningsexperimentet. I detta tillvägagångssätt kromatograferas en liten volym av det undersökta extraktet parallellt på kolonnen som innehåller det undersökta immobiliserade målet och CMAC-negativa kontrollkolonnen. Dessa två kolumner skiljer sig åt i uttrycket av målet, därför beror eventuella skillnader i retentionsmönstren för enskilda molekyler på den specifika karaktären av interaktioner med de undersökta målen på CMAC-kolonnen som innehåller dessa TMP: er. De erhållna kromatogrammen jämförs, och föreningar representerade av toppar som på liknande sätt behålls på båda kolumnerna är märkta som icke-specifikt interagerande molekyler. Närvaron av en topp i senare fraktioner på CMAC-kolonnen med de immobiliserade receptorerna och bristen på en topp som representerar samma förening i tidiga fraktioner av CMAC-negativ kolonn representerar specifik interaktion mellan föreningen och det immobiliserade målet. De föreningar som identifieras i detta steg kan riktas mot isolering och ytterligare testning utan att behöva utföra biostyrd fraktionering. Den saknade toppkromatografimetoden användes för att identifiera föreningar som specifikt interagerar med TrkB-receptorer från gotu kola-extrakt. Gotu kola extrakt fraktionerades på både TrkB och TrkB-NULL kolumner och föreningar närvarande i dessa fraktioner analyserades med hjälp av UPLC-QTOF-MS. Undersökning av kromatogrammen för var och en av fraktionerna ledde till identifieringen av en förening som starkt behålls på TrkB-kolonnen (50-55 min fraktion), medan den eluerade tidigt TrkB-NULL-kolonnen (0-5 min fraktion), vilket indikerar specifik interaktion med de immobiliserade TrkB-receptorerna (Figur 9). Föreningen eluerar vid ~ 17,48 min (figur 9) är nu inriktad på isolering och testning i funktionella analyser.
Figur 1. Korrekt monterad CMAC-kolumn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. CMAC-beredningssteg och fluorescerande antikroppsmärkning av de immobiliserade receptorerna. Schematisk representation av beredningen av en CMAC-kolonn (1-4) och antikroppsmärkningsexperimentet (5-8). (1) Homogeniserade cellmembranfragment innehållande riktat transmembranprotein, TrkB. (2) Solubiliserade cellmembranfragment i en micellär struktur. (3) Cellmembranfragment immobiliserade på ytan av IAM-partiklarna. (4) IAM-partiklar med immobiliserade cellmembranfragment packade i en glaskolonn. (5) Immobiliserad TrkB-receptor i cellmembranfragmenten. (6) Bindning av den naturliga liganden BDNF till den funktionella TrkB-receptorn. (7) Bindning av de primära antikropparna till BDNF-molekyler. (8) Bindning av fluoroformärkta sekundära antikroppar till de primära antikropparna som resulterar i grön fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Immobilisering av cellmembranfragment med TrkB-receptorer på IAM-partiklar. Konfokalmikroskopibilder som visar immobilisering av cellmembranfragment med funktionella TrkB-receptorer på IAM-partiklar. (A) Cellmembranfragment från SH-SY5Y TrkB-NULL-cellinjen immobiliserade på IAM-partiklar efter inkubation med BDNF, primär antikropp och fluoroformärkt sekundär antikropp. (B) Cellmembranfragment från SH-SY5Y Neuroblastom cellinjer som uttrycker TrkB immobiliserade på IAM-partiklar efter inkubation med primär antikropp och fluoroformärkt sekundär antikropp utan BDNF. (C) Cellmembranfragment från SH-SY5Y neuroblastomcellinjer som uttrycker TrkB immobiliserade på IAM-partiklar efter inkubation med BDNF, primär antikropp och fluoroformärkt sekundär antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Frontal affinitetskromatogram med 7,8-DHF på TrkB CMAC-kolonnen. Frontalkromatogram med ökande koncentrationer av 7,8-DHF på TrkB CMAC-kolonnen, där A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM och D - 300 nM. Ammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol användes som elueringsmedel vid en flödeshastighet på 0,4 ml/min .
Figur 5. Frontal affinitetskromatogram med 7,8-DHF på icke-funktionell TrkB CMAC-kolonn. Frontalkromatogram med olika koncentrationer av 7,8-DHF på den icke-funktionella TrkB CMAC-kolonnen, där A -1 μM, B - 1 μM, C - 750 nM och D - 500 nM. Ammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol användes som elueringsmedel vid en flödeshastighet på 0,4 ml/min .
Figur 6. Frontal affinitetskromatogram med 7,8-DHF på TrkB-NULL CMAC-kolonnen. Frontalkromatogram med ökande koncentrationer av 7,8-DHF på TrkB-NULL CMAC-kolonnen, där A - 1 mM, B - 750 nM, C - 500 nM och D - 300 nM. Ammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) med 5 % metanol användes som elueringsmedel vid en flödeshastighet på 0,4 ml/min .
Figur 7. Frontal affinitetskromatogram av 7,8-DHF med 0,2% gotu kola-extrakt på TrkB CMAC-kolonnen. Representativ frontal elueringsprofil på (A) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola extrakt (10 mg/ml) och (B) 500 nM 7,8-DHF på CMAC TrkB-kolonnen. Ammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol användes som elueringsmedel vid en flödeshastighet på 0,4 ml/min .
Figur 8. Frontal affinitetskromatogram av 7,8-DHF med 0,2% gotu kola-extrakt på TrkB-NULL CMAC-kolonnen. Representativ frontal elueringsprofil för (A) 500 nM 7,8-DHF och (B) 500 nM 7,8-DHF + 0,2% gotu kola-extrakt (10 mg/ml) på TrkB-NULL CMAC-kolonnen. Ammoniumacetatbuffert (10 mM, pH 7,4) med 5% metanol användes som elueringsmedel vid en flödeshastighet på 0,4 ml/min .
Figur 9. UPLC-MS-kromatogram av gotu kola-extraktfraktioner. UPLC-MS-kromatogram av gotu kola-extraktfraktioner (A) eluerade mellan 0-5 min från TrkB-NULL CMAC-kolonnen och (C) eluerade mellan 50-55 min från CMAC TrkB-kolonnen. En förening med en retentionstid på 17,48 min närvarande i båda fraktionerna, vilket bekräftades av matchande masspektra (B och D) identifierades som ett potentiellt TrkB-bindemedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Homogenisering Buffert | ||||
| 1 | Tris(hydroximetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumklorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Vattenfri kalciumklorid (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Magnesiumkloridhexahydrat (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Kaliumklorid (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Bensamidin | 3 mM | ||
| 8 | Proteashämmare cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glycerol | 10% | ||
| 10 | Adenosin 5'-trifosfat (ATP) dinatriumsalthydrat | 100 μM | ||
| 11 | Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) | 5mM | ||
Tabell 1. Homogeniseringsbuffertkomposition.
| Solubiliseringsbuffert | ||||
| 1 | Tris(hydroximetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumklorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Vattenfri kalciumklorid (CaCl2) | 3 mM | ||
| 4 | Magnesiumkloridhexahydrat (MgCl2) | 2 mM | ||
| 5 | Kaliumklorid (KCl) | 5 mM | ||
| 6 | Fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
| 7 | Bensamidin | 3 mM | ||
| 8 | Proteashämmare cocktail (100X) | (1/100) | ||
| 9 | Glycerol | 10% | ||
| 10 | Adenosin 5'-trifosfat (ATP) dinatriumsalthydrat | 100 μM | ||
| 11 | Natriumkolat | 2% | ||
Tabell 2. Solubiliseringsbuffertkomposition.
| Dialys Buffert | ||||
| 1 | Tris(hydroximetyl)aminometanhydroklorid (Tris-HCl) | 50 mM | ||
| 2 | Natriumklorid (NaCl) | 100 mM | ||
| 3 | Vattenfri kalciumklorid (CaCl2) | 0,1 mM | ||
| 4 | Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) | 5 mM | ||
| 5 | Fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) | 0,1 mM | ||
Tabell 3. Dialysbuffertsammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifiering av aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar av specialiserade metaboliter är en mycket utmanande uppgift23. Traditionellt isoleras enskilda föreningar och deras aktivitet testas i olika analyser. Detta tillvägagångssätt är tidskrävande och kostsamt och leder ofta till isolering och identifiering av de vanligaste och väl karakteriserade föreningarna23. Screeninganalyser som för närvarande används med hög kapacitet är starkt beroende av screeningkombinatoriska kemibibliotek med redan kända mål och är inte utformade för att identifiera och isolera biologiskt aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar53.
CMAC möjliggör identifiering av föreningar riktade mot TMP 23,24,54. I denna teknik immobiliseras cellmembranfragment med TMP på ytan av IAM stationära faspartiklar23,24. CMAC är ett unikt tillvägagångssätt som möjliggör immobilisering av cellmembranfragment med riktade proteiner på det fasta stödet som imiterar cellmembranfosfolipid dubbelskikt24. Detta gör det möjligt att bevara funktionaliteten hos immobiliserade proteinmål och ger nära fysiologiska förhållanden samtidigt som CMAC används för att identifiera små molekyler som interagerar med TMP: er. CMAC erbjuder fördelen med möjligheter till upptäckt av nya kemiska byggnadsställningar från unika naturproduktbibliotek, som inte kan testas med någon annan av de för närvarande använda analyserna23 . Det föreslagna tillvägagångssättet gör det möjligt att identifiera föreningar som interagerar med TMP utan att avslöja arten av denna interaktion. Interaktionssättet (allosterisk eller ortosterisk interaktion; hämning eller aktivering) måste verifieras med hjälp av funktionella cellbaserade analyser. CMAC med de immobiliserade proteinmålen kan också användas vid karakterisering av farmakodynamik (t.ex. dissociationskonstant, Kd) eller bestämning av bindningskinetik (kpå och kav) av småmolekylära ligander som interagerar med målet samt i processen för karakterisering av bindningsställena på det immobiliserade proteinet24 . Även om CMAC endast tillåter identifiering av föreningar som binder till TMP, är det ett innovativt tillvägagångssätt som avsevärt påskyndar det första steget i läkemedelsupptäcktspipelinen, eftersom det inte kräver föreningsrening, vilket för närvarande har varit den största flaskhalsen i läkemedelsupptäcktsprocessen från naturliga blandningar.
Även om det presenterade protokollet fokuserar på immobilisering av en transmembranreceptor (TrkB), kan CMAC-teknik användas vid framställning av kolumner med andra mål. En av de avgörande aspekterna av CMAC-beredning är valet av cellinje eller vävnad som används för att isolera cellmembranfragment. Om kolumner används vid screening av komplexa blandningar för föreningar som interagerar med de immobiliserade receptorerna, rekommenderas det att använda cellinjer som överuttrycker det riktade proteinet. Att använda en sådan cellinje kommer att resultera i ett högre antal immobiliserade mål och öka chansen att identifiera föreningar med lägre affinitet mot målet eller mindre rikliga molekyler. Om man fokuserar på karakteriseringen av det immobiliserade proteinet rekommenderas användning av en inbyggd cellinje, eftersom post-translationella modifieringar som proteinet genomgår såväl som fosfolipidmiljön kan skilja sig avsevärt i den transfekterade cellinjen.
Vissa aspekter av cellmembranisolering och immobilisering på IAM-partiklar är kritiska och kan kräva modifieringar beroende på receptortyp eller proteinkälla. För att förhindra proteolytisk klyvning av de immobiliserade proteinerna är det viktigt att använda lämpliga proteashämmare i homogeniserings- och solubiliseringsbuffertarna. En litteratursökning rekommenderas för att identifiera nödvändiga proteashämmare. I processen med protokolloptimering bestämde vi att tillsatsen av ATP och glycerol ökar antalet bindningsställen (Bmax) på CMAC-kolumner vid immobilisering av TrkB. Andra kofaktorer kan vara nödvändiga vid optimering av immobilisering av andra typer av transmembranmål24. För närvarande undersöker vi tillsatsen av kolesterol i processen med TrkB-immobilisering, eftersom kolesterol nyligen visade sig modifiera effekterna av TrkB-ligander48. Det rapporterades tidigare att tillsats av kolesterol och/eller andra lipider kan krävas för att erhålla funktionella CMAC kolumner24.
Olika typer av detektorer kan användas för att övervaka kolonneluatet inklusive diodmatrisdetektor för ligander med kromoforer, masspektrometri eller radioflödesdetektor för radioaktiva ligander.
Övervakning av stabiliteten hos CMAC-kolumner är av avgörande betydelse. CMAC-kolumner kan vara stabila i upp till flera månader, beroende på typ av immobiliserat protein, användningsfrekvens och lagringsförhållanden. Det rekommenderas att kolonnen förvaras i 0,05 % natriumazidlösning i ammoniumacetatbuffert vid 4 °C om kolonnen förblir oanvänd i mer än en vecka. Det är viktigt att tvätta kolonnen noggrant med ammoniumacetatbuffert efter längre perioder innan du försöker använda den. Det rekommenderas att övervaka kolonnens funktionalitet genom att injicera en vald koncentration av en markörligand varje vecka.
Trots många fördelar har CMAC-tekniken flera begränsningar som måste beaktas när man använder kolumnerna i läkemedelsupptäcktsinsatser. För det första minskar antalet immobiliserade transmembranmål med tiden, och därför rekommenderas att det totala antalet bindningsställen övervakas varje vecka24. En av anledningarna till denna minskning är konsekvensen av immobiliseringsprocessen som är baserad på adsorption och inte involverar införandet av kovalenta bindningar. Lipofila föreningar kan bibehållas starkt på CMAC-kolumner på grund av signifikant ospecifik bindning till IAM-ytan och fosfolipid-dubbelskikt. Detta ökar avsevärt analystiden och minskar dataflödet. Processen för CMAC-kolonnberedning är cellinjespecifik och kräver en grundlig förståelse för immobiliserade proteiners natur, vilket gör den mindre lämplig för mindre karakteriserade mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lukasz Ciesla samarbetar med Regis Technologies, leverantören av IAM. Persondator. DD2-partiklar.
Acknowledgments
Z.C.A. stöddes av Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Center for Complimentary and Integrative Medicine vid National Institutes of Health under prisnummer 1R41AT011716-01. Detta arbete stöddes också delvis av American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies bidrag till L.C. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-8 Dihydroxyflavone hydrate | Sigma-Aldrich | D5446-10 mg | ≥98% (HPLC) |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383-1 g | |
| Ammonium acetate | VWR Chemicals BDH | BDH9204-500 g | |
| BDNF antibody | Invitrogen | PA5-15198-400 μL | Primary antibody; 2 mg/mL of concentration |
| Benzamidine hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | B6506-25 g | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human | Sigma-Aldrich | B3795-10 μg | Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture |
| Calcium chloride | VWR Analytical | BDH9224-1 kg | |
| Cholic acid sodium salt | Alfa Aesar | J62050-100 g | |
| Dounce homogenizer | VWR | 71000-516 | 40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H) |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 493511 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR Analytical | BDH-9232-500 g | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442-500 mL | sterile-filtered, suitable for cell culture |
| G418 disulfate salt solution | Sigma-Aldrich | G8168-100 mL | 50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture |
| Glycerol | VWR Life Science | E520-100 mL | |
| Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2) | Regis Technologies, Inc. | 1-771050-500 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | VWR Analytical | BDH9244-500 mL | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322425 | |
| Nikon C2 DUVb | Nikon | Confocal laser scanning microscope | |
| Normal goat serum (10%) | Life Technologies | 50197Z | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100 mL | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Thermo Scientific | 36978-5 g | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | VWR Life Science | K812-500 mL | 1x |
| Potassium chloride | VWR Chemicals BDH | 0395-1 kg | |
| Protease inhibitor cocktail | VWR Life Science Ambreso | M221-1 mL | Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758-500 mL | with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen Alexa Flour Plus 488 | A32731 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B | Kerafast | ECP007 | |
| SH-SY5Y Trk-NULL cell line | Kerafast | ECP005 | |
| Snake skin dialysis tubing | Thermo Scientific | 88245 | 10K MWCO, 35 mm dry I.D. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | BDH VWR Analytical | BDH9286-2.5 kg | |
| Tricorn 5/20 column | GE Healthcare | 24-4064-08 | |
| Tris-HCl | VWR Life Science | 0497-1 kg | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-500 mL | 0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA |
References
- Thomford, N. E., et al. Natural Products for Drug Discovery in the 21st Century: Innovations for Novel Drug Discovery. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1578 (2018).
- Atanasov, A. G., Zotchev, S. B., Dirsch, V. M. International Natural Product Sciences Taskforce, Supuran, C.T. Natural products in drug discovery: advances and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (3), 200-216 (2021).
- Altmann, K. H. Drugs from the Oceans: Marine Natural Products as Leads for Drug Discovery. Chimia. 71 (10), 646-652 (2017).
- Bernardini, S., Tiezzi, A., Laghezza Masci, V., Ovidi, E. Natural products for human health: an historical overview of the drug discovery approaches. Natural Product Research. 32 (16), 1926-1950 (2018).
- DeCorte, B. L. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (20), 9295-9304 (2016).
- Lee, J., Jo, D. G., Park, D., Chung, H. Y., Mattson, M. P. Adaptive cellular stress pathways as therapeutic targets of dietary phytochemicals: focus on the nervous system. Pharmacological Reviews. 66 (3), 815-868 (2014).
- Hornykiewicz, O. L-DOPA: from a biologically inactive amino acid to a successful therapeutic agent. Amino Acids. 23 (1-3), 65-70 (2002).
- Hoyer, D. Targeting the 5-HT system: Potential side effects. Neuropharmacology. 179, 108233 (2020).
- Nur, S., Adams, C. E. Chlorpromazine versus reserpine for schizophrenia. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4, (2016).
- Chung, H. Y., et al. Redefining Chronic Inflammation in Aging and Age-Related Diseases: Proposal of the Senoinflammation Concept. Aging and Disease. 10 (2), 367-382 (2019).
- Fitzgerald, K. N., et al. Potential reversal of epigenetic age using a diet and lifestyle intervention: a pilot randomized clinical trial. Aging. 13 (7), 9419-9432 (2021).
- Zhao, L., Lee, J. Y., Hwang, D. H. Inhibition of pattern recognition receptor-mediated inflammation by bioactive phytochemicals. Nutrition Reviews. 69 (6), 310-320 (2011).
- Corbi, G., et al. Dietary Phytochemicals in Neuroimmunoaging: A New Therapeutic Possibility for Humans? Frontiers in Pharmacology. 7, 364 (2016).
- Davinelli, S., et al. Dietary phytochemicals and neuro-inflammaging: from mechanistic insights to translational challenges. Immunity & Ageing: I & A. 13, 16 (2016).
- Ostan, R., et al. Inflammaging and cancer: a challenge for the Mediterranean diet. Nutrients. 7 (4), 2589-2621 (2015).
- Martucci, M., et al. Mediterranean diet and inflammaging within the hormesis paradigm. Nutrition Reviews. 75 (6), 442-455 (2017).
- Szarcvel Szic, K., Declerck, K., Vidakovic, M., Vanden Berghe, W. From inflammaging to healthy aging by dietary lifestyle choices: is epigenetics the key to personalized nutrition. Clinical Epigenetics. 7 (1), 33 (2015).
- Dean, E., Gormsen Hansen, R. Prescribing optimal nutrition and physical activity as "first-line" interventions for best practice management of chronic low-grade inflammation associated with osteoarthritis: evidence synthesis. Arthritis. , 560634 (2012).
- Ruiz-Núñez, B., Pruimboom, L., Dijck-Brouwer, D. A., Muskiet, F. A. Lifestyle and nutritional imbalances associated with Western diseases: causes and consequences of chronic systemic low-grade inflammation in an evolutionary context. TheJournal of Nutritional Biochemistry. 24 (7), 1183-1201 (2013).
- Agarwal, P., et al. MIND Diet Associated with Reduced Incidence and Delayed Progression of Parkinsonism in Old Age. The Journal of Nutrition, Health & Aging. 22 (10), 1211-1215 (2018).
- Morris, M. C., et al. MIND diet associated with reduced incidence of Alzheimer's Disease. Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. 11 (9), 1007-1014 (2015).
- Franceschi, C., Garagnani, P., Parini, P., Giuliani, C., Santoro, A. Inflammaging: a new immune-metabolic viewpoint for age-related diseases. Nature Reviews. Endocrinology. 14 (10), 576-590 (2018).
- Ciesla, L., Moaddel, R. Comparison of analytical techniques for the identification of bioactive compounds from natural products. Natural Product Reports. 33 (10), 1131-1145 (2016).
- Moaddel, R., Wainer, I. W. The preparation and development of cellular membrane affinity chromatography columns. Nature Protocols. 4 (2), 197-205 (2009).
- Ferrer, I., et al. BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58 (7), 729-739 (1999).
- Numakawa, T., Odaka, H., Adachi, N. Actions of Brain-Derived Neurotrophin Factor in the Neurogenesis and Neuronal Function, and Its Involvement in the Pathophysiology of Brain Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3650 (2018).
- Lima Giacobbo, B., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Brain Disorders: Focus on Neuroinflammation. Molecular Neurobiology. 56 (5), 3295-3312 (2019).
- Wang, Z. H., et al. Deficiency in BDNF/TrkB Neurotrophic Activity Stimulates δ-Secretase by Upregulating C/EBPβ in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 28 (3), 655-669 (2019).
- Devi, L., Ohno, M. TrkB Reduction Exacerbates Alzheimer's Disease-like Signaling Aberrations and Memory Deficits without Affecting beta-Amyloidosis in 5XFAD Mice. Translational Psychiatry. 5 (5), 562 (2015).
- Jiao, S. S., et al. Brain-derived Neurotrophic Factor Protects against Tau-related Neurodegeneration of Alzheimer's Disease. Translational Psychiatry. 6 (10), 907 (2016).
- Ng, T., Ho, C., Tam, W., Kua, E., Ho, R. C. Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Levels in Patients with Alzheimer's Disease (AD): A Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), 257 (2019).
- Amidfar, M., de Oliveira, J., Kucharska, E., Budni, J., Kim, Y. K. The Role of CREB and BDNF in Neurobiology and Treatment of Alzheimer's Disease. Life Sciences. 257, 118020 (2020).
- Atasoy, I. L., et al. Both Secreted and the Cellular Levels of BDNF Attenuated due to Tau Hyperphosphorylation in Primary Cultures of Cortical Neurons. Journal of Chemical Neuroanatomy. 80, 19-26 (2017).
- Rosa, E., et al. Tau Downregulates BDNF Expression in Animal and Cellular Models of Alzheimer's Disease. Neurobiology of Aging. 48, 135-142 (2016).
- Xiang, J., et al. Delta-secretase-cleaved Tau Antagonizes TrkB Neurotrophic Signalings, Mediating Alzheimer's Disease Pathologies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 9094-9102 (2019).
- Giuffrida, M. L., Copani, A., Rizzarelli, E. A Promising Connection between BDNF and Alzheimer's Disease. Aging. 10 (8), 1791-1792 (2018).
- Ando, S., et al. Animal Model of Dementia Induced by Entorhinal Synaptic Damage and Partial Restoration of Cognitive Deficits by BDNF and Carnitine. Journal of Neuroscience Research. 70 (3), 519-527 (2002).
- Fischer, D. L., Sortwell, C. E. BDNF Provides Many Routes Toward STN DBS-Mediated Disease Modification. Movement Disorders. Official Journal of the Movement Disorder Society. 34 (1), 22-34 (2019).
- Zhang, F., Kang, Z., Li, W., Xiao, Z., Zhou, X. Roles of Brain-derived Neurotrophic Factor/Tropomyosin-related Kinase B (BDNF/TrkB) Signalling in Alzheimer's Disease. Journal of Clinical Neuroscience: Official Journal of the Neurological Society of Australasia. 19 (7), 946-949 (2012).
- Pilakka-Kanthikeel, S., Atluri, V. S., Sagar, V., Saxena, S. K., Nair, M. Targeted Brain Derived Neurotropic Factors (BDNF) Delivery across the Blood-Brain Barrier for Neuro-protection using Magnetic Nano Carriers: An In-vitro Study. PLoS One. 8 (4), 62241 (2013).
- Jang, S. W., et al. A Selective TrkB Agonist with Potent Neurotrophic Activities by 7,8-Dihydroxyflavone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (6), 2687-2692 (2010).
- Todd, D., et al. A Monoclonal Antibody TrkB Receptor Agonist as a Potential Therapeutic for Huntington's Disease. Plos One. 9 (2), 87923 (2014).
- Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-Related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
- Liu, X., et al. Biochemical and Biophysical Investigation of the Brain-derived Neurotrophic Factor Mimetic 7,8-Dihydroxyflavone in the Binding and Activation of the TrkB Receptor. The Journal of Biological Chemistry. 289 (40), 27571-27584 (2014).
- Chen, L., Gao, X., Zhao, S., Hu, W., Chen, J. The Small-Molecule TrkB Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Decreases Hippocampal Newborn Neuron Death After Traumatic Brain Injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 74 (6), 557-567 (2015).
- Liu, X., et al. Optimization of a Small Tropomyosin-related Kinase B (TrkB) Agonist 7,8-Dihydroxyflavone Active in Mouse Models of Depression. Journal of Medicinal Chemistry. 55 (19), 8524-8537 (2012).
- Zhang, Z., et al. 7,8-Dihydroxyflavone Prevents Synaptic Loss and Memory Deficits in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 39 (3), 638-650 (2014).
- Casarotto, P. C., et al. Antidepressant Drugs Act by Directly Binding to TRKB Neurotrophin Receptors. Cell. 184 (5), 1299-1313 (2021).
- Iyer, R., et al. Entrectinib is a potent inhibitor of Trk-driven neuroblastomas in a xenograft mouse model. Cancer letters. 372 (2), 179-186 (2016).
- Iyer, R., et al. Nanoparticle delivery of an SN38 conjugate is more effective than irinotecan in a mouse model of neuroblastoma. Cancer letters. 360 (2), 205-212 (2015).
- Ng, E. S., Chan, N. W., Lewis, D. F., Hindsgaul, O., Schriemer, D. C.
- Maciuk, A., Moaddel, R., Haginaka, J., Wainer, I. W. Screening of Tobacco Smoke Condensate for Nicotinic Acetylcholine Receptor Ligands using Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns and Missing Peak Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (2), 238-246 (2008).
- Harvey, A. L., Edrada-Ebel, R., Quinn, R. J. The Re-emergence of Natural Products for Drug Discovery in the Genomics Era. Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (2), 111-129 (2015).
- Ciesla, L., et al. Development and Characterization of the α3β4α5 Nicotinic Receptor Cellular Membrane Affinity Chromatography Column and Its Application for on line Screening of Plant Extracts. Journal of Chromatography A. 1431, 138-144 (2016).
