Summary
Samspillet mellom en ATP-avhengig kromatinremodeler med en DNA-ligand er beskrevet ved hjelp av CD-spektroskopi. De induserte konformasjonsendringene på en genpromotor analysert av toppene som genereres, kan brukes til å forstå mekanismen for transkripsjonsregulering.
Abstract
Sirkulær dikroisme (CD) spektroskopi er en enkel og praktisk metode for å undersøke sekundærstrukturen og interaksjonene til biomolekyler. Nylige fremskritt innen CD-spektroskopi har gjort det mulig å studere DNA-proteininteraksjoner og konformasjonsdynamikk av DNA i ulike mikromiljø i detalj for en bedre forståelse av transkripsjonsregulering in vivo. Området rundt en potensiell transkripsjonssone må vikles ut for at transkripsjon skal skje. Dette er en kompleks prosess som krever koordinering av histone modifikasjoner, binding av transkripsjonsfaktoren til DNA, og andre kromatin ombyggingsaktiviteter. Ved hjelp av CD-spektroskopi er det mulig å studere konformasjonsendringer i promotorregionen forårsaket av regulatoriske proteiner, for eksempel ATP-avhengige kromatinremodelere, for å fremme transkripsjon. Konformasjonsendringene som forekommer i proteinet kan også overvåkes. I tillegg kan spørsmål om proteinets affinitet mot målets DNA og sekvensspesifikkhet løses ved å inkorporere mutasjoner i mål-DNA-et. Kort sagt, den unike forståelsen av denne sensitive og rimelige metoden kan forutsi endringer i kromatindynamikk, og dermed forbedre forståelsen av transkripsjonsregulering.
Introduction
Sirkulær dikroisme (CD) er en spektroskopisk teknikk som er avhengig av den iboende chiraliteten til biologiske makromolekyler som fører til differensialabsorpsjon av høyrehendt og venstrehendt sirkulært polarisert lys. Denne differensialabsorpsjonen er kjent som sirkulær dikroisme. Teknikken kan derfor brukes til å avgrense konformasjonen av biologiske makromolekyler, som proteiner og DNA, som begge inneholder kirale sentre1,2.
Elektromagnetiske bølger inneholder både elektriske og magnetiske komponenter. Både de elektriske og magnetfeltene svinger vinkelrett på bølgeforplantningsretningen. Når det gjelder uppolarisert lys, svinger disse feltene i mange retninger. Når lyset polariseres sirkulært, oppnås to elektromagnetiske felt ved 90° faseforskjell til hverandre. Kirale molekyler viser sirkulær optisk rotasjon (birefringence) slik at de vil absorbere høyrehendt sirkulært polarisert lys og venstrehånds sirkulært polarisert lys i forskjellige omfang3. Det resulterende elektriske feltet vil bli sporet som en ellipse, en funksjon av bølgelengden. CD-spekteret er dermed registrert som elliptikk (q), og dataene presenteres som Mean Residue Ellipticity som en funksjon av bølgelengde.
Når det gjelder proteiner, er Cα av aminosyrer (unntatt glycin) chiral, og dette utnyttes av CD-spektroskopi for å bestemme den sekundære strukturen til denne makromolekylen4. CD-spektraet av proteinmolekyler registreres vanligvis i Fjern UV-serien. α-spiralformede proteiner har to negative bånd på 222 nm og 208 nm og en positiv topp på 193 NM4. Proteiner med anti-parallell β-arks sekundær struktur viser en negativ topp på 218 nm og en positiv topp på 195 nm4. Proteiner med uordnede strukturer viser lav elliptikk nær 210 nm og en negativ topp på 195 nm4. Dermed gjør den veldefinerte toppen / båndene for forskjellige sekundære strukturer CD til et praktisk verktøy for å belyse konformasjonsendringene som forekommer i proteinens sekundære struktur under denaturering samt ligandbinding.
Nukleinsyrer har tre kilder til chiralitet: sukkermolekylet, mykheten til sekundærstrukturen og den langtrekkende tertiære bestillingen av DNA i miljøet5,6. CD-spektra av nukleinsyrer registreres vanligvis i området 190 til 300 nm, 5,6. Hver konformasjon av DNA, akkurat som proteiner, gir et karakteristisk spektrum, selv om toppene / båndene kan variere i noen grader på grunn av løsningsmiddelforhold og forskjeller i DNA-sekvenser7. B-DNA, den vanligste formen, er preget av en positiv topp rundt 260-280 nm og en negativ topp rundt 245 nm6. Toppene/båndene til B-form DNA er generelt små fordi baseparene er vinkelrett på den doble helixen, og gir svak chiralitet til molekylet. A-DNA gir en dominerende positiv topp på 260 nm og en negativ topp rundt 210 nm6. Z-DNA, den venstrehendte helixen, gir et negativt bånd på 290 nm og en positiv topp rundt 260 nm6. Dette DNA-et gir også en ekstremt negativ topp på 205 nm6.
I tillegg til disse konformasjonene kan DNA også danne triplexer, quadruplexes og hårnåler, som alle kan preges av CD-spektroskopi. Den parallelle G-quadruplex gir et dominerende positivt bånd på 260 nm, mens den anti-parallelle G-quadruplex gir et negativt bånd på 260 nm og en positiv topp på 290 nm, noe som gjør det enkelt å skille mellom de to former for quadruplex strukturer6. Triplexes gir ikke et karakteristisk spektrum8. For eksempel viser spektraet til et 36 nukleotidlangt DNA med potensial til å danne en intramolekylær trippelhelix som inneholder G.G.C og T.A.T basepar i nærvær av Na + et sterkt negativt bånd på 240 nm og en bred positiv topp. Den brede positive toppen viser bidrag på 266, 273 og 286 nm. Det samme oligonukleotidet i nærvær av Na+ og Zn+ viser fire negative bånd (213, 238, 266 og 282 nm) og en positiv topp på 258 nm. Dermed kan spektra av triplex DNA variere avhengig av saltforhold8.
I tillegg til disse konformasjonene har CD-spektra gjort det mulig å identifisere en annen form for DNA kalt X-DNA. X-DNA dannes når DNA-sekvensen inneholder alternative adenin- og tyminrester. CD-spektraet til X-DNA inneholder to negative topper på 250 og 280 nm. Svært lite informasjon er tilgjengelig om X-DNA, selv om det har blitt spekulert i å fungere som en vask for positiv supercoiling6,9. Endringer i CD-spektra kan også avsløre detaljer om ligandproteininteraksjoner og har derfor blitt lagt til arsenalet av molekylære metoder for å oppdage legemiddelproteininteraksjoner10,11,12,13,14. CD-spektra har også blitt brukt til å overvåke endringene i den sekundære strukturen av proteiner under foldeprosessen15. På samme måte kan CD-spektra også brukes til å undersøke ligand-DNA-interaksjoner16,17.
CD-spektroskopi er derfor en enkel, billig metode for å skille mellom de forskjellige formene for DNA-konformasjon, forutsatt at det er tilgang til ikke-så billig utstyr og programvare. Metoden er svært følsom og rask. Det krever bare en liten mengde DNA, noe som gir det en fordel over den alternative teknikken for kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titrasjoner med ligander og substrater er også enkle å utføre. Den største begrensningen er at DNA-et skal være svært rent. Det anbefales å bruke polyakrylamid gel elektroforese (PAGE)-renset DNA.
Informasjonen innhentet av CD-spektra har hovedsakelig blitt brukt til å utlede proteinstrukturelle egenskaper og for å identifisere distinkte DNA-konforme. I denne studien har CD-spektra blitt brukt til å integrere resultatene oppnådd fra et in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) eksperiment for å avgrense om proteinet av interesse / anslått transkripsjonsfaktor kan føre til en konformasjonsendring i promotorområdet av effektorgenene. Dette samarbeidet bidrar til å utvikle tradisjonelle CD-spektroskopiske teknikker ved å forutsi mekanismen for transkripsjonsregulering ved den anslåtte transkripsjonsfaktoren på og rundt transkripsjonsstartstedet (TSS) til en promotør.
Kromatin ombygging er en veldefinert mekanisme som er kjent for å regulere DNA-metabolske prosesser ved å gjøre det tettpakkede kromatin tilgjengelig for ulike regulatoriske faktorer som transkripsjonsfaktorer, komponenter av DNA-replikasjon eller skadereparasjonsproteiner. De ATP-avhengige kromatinremodelerne, også kjent som SWI/SNF-familien av proteiner, er viktige remodelerproteiner tilstede i eukaryote celler18,19. Fylogenetisk klynging har kategorisert SWI/SNF-familien av proteiner i 6 undergrupper20: Snf2-lignende, Swr1-lignende, SSO1653-lignende, Rad54-lignende, Rad5/16-lignende og fjern. SMARCAL1, proteinet av interesse i denne studien, tilhører den fjerne undergruppen20. Dette proteinet har blitt brukt til å undersøke sin modus for transkripsjonsregulering ved hjelp av CD-spektroskopi.
De fleste medlemmene av de ATP-avhengige kromatinoppussingsproteinene har vist seg å enten omplassere eller kaste ut nukleosomer eller formidle histonevariantutveksling på en ATP-avhengig måte21,22. Noen medlemmer av denne familien har imidlertid ikke vist seg å ombygge nukleosomer, for eksempel SMARCAL1. Selv om studier har vist at SMARCAL1 forbinder med polytene kromosomer, mangler eksperimentelle bevis angående dens evne til å ombygge nukleosomer23. Derfor ble det postulert at SMARCAL1 kan regulere transkripsjon ved å endre samsvaret med DNA24. CD-spektroskopi ga en enkel og tilgjengelig metode for å validere denne hypotesen.
SMARCAL1 er et ATP-avhengig kromatinoppussingsprotein som primært fungerer som en glødende helicase25,26,27. Det har blitt postulert for å modulere transkripsjon ved å ombygge DNA-konformasjonen24. For å teste denne hypotesen ble SMARCAL1s rolle i regulering av gentranskripsjon under doksorubicinindusert DNA-skade studert. I disse studiene ble SMARCAL1 brukt til in vivo-analyse og ADAAD for in vitro-analyser28,29. Tidligere studier har vist at ADAAD kan gjenkjenne DNA på en strukturavhengig, men sekvensuavhengig måte30,31. Proteinet binder seg optimalt til DNA-molekyler som har dobbelstreng til overgangsregioner med én tråd, i likhet med stammesløyfe-DNA, og hydrolyserer ATP 30,31.
In vivo-eksperimenter viste at SMARCAL1 regulerer uttrykket av MYC, DROSHA, DGCR8 og DICER ved å binde seg til promotorregionene28,29. Samhandlingsområdet ble identifisert av ChIP-eksperimenter28,29. ChIP-teknikken brukes til å analysere samspillet mellom et protein og dets cognate DNA i cellen. Målet er å avgjøre om spesifikke proteiner, for eksempel transkripsjonsfaktorer på promotører eller andre DNA-bindende nettsteder, er bundet til spesifikke genomiske områder. Proteinet bundet til DNA er først kryssbundet ved hjelp av formaldehyd. Dette etterfølges av isolasjon av kromatin. Det isolerte kromatinet skjæres til 500 bp fragmenter enten ved sonikering eller nuklease fordøyelse, og proteinet bundet til DNA er immunoprecipitated ved hjelp av antistoffer som er spesifikke for proteinet. Krysskoblingen reverseres, og DNA-et analyseres enten ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) eller kvantitativ sanntids-PCR.
ChIP-resultatene førte til hypotesen om at SMARCAL1 muligens formidler transkripsjonsregulering ved å indusere en konformasjonsendring i promotorregionene til disse genene. QGRS-tilordning og Mfold-programvare ble brukt til å identifisere potensialet i disse promotorområdene for å danne sekundære strukturer28,29. QGRS-tilordning brukes til å forutsi G-quadruplexes32, mens Mfold33 analyserer en sekvenss evne til å danne sekundære strukturer som stamceller.
Etter sekundær strukturanalyse ble ytterligere in vitro-eksperimenter utført med rekombinant 6X Hans-taggede Aktive DNA-avhengige ATPase A Domain (ADAAD), den bovine homologen til SMARCAL1, renset fra Escherichia coli34. ATPase-analyser ble utført ved hjelp av ADAAD for å fastslå at de identifiserte DNA-sekvensene kunne fungere som effektorer28,29. Til slutt ble CD-spektroskopi utført for å overvåke konformasjonsendringene som ble indusert i DNA-molekylet av ADAAD28,29.
For å bevise at ATPase-aktiviteten til proteinet var avgjørende for å indusere en konformasjonsendring i DNA-molekylet, ble enten etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) tilsatt til chelate Mg+2 eller Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en spesifikk hemmer av SWI/SNF-proteinet, ble tilsatt35,36 . Denne CD-spektroskopiske teknikken kan brukes med ethvert renset protein som har blitt demonstrert av ChIP eller en annen relevant analyse for å binde seg til en predikert genomisk region av en promotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arbeidskonsentrasjon av reaksjonskomponentene
- Forbered arbeidskonsentrasjonene av buffere for CD og andre reaksjonskomponenter ferskt (se tabell 1) og hold dem ved 4 °C før du setter opp reaksjonene.
MERK: For CD-reaksjonene som er beskrevet i dette dokumentet, er arbeidskonsentrasjonene av komponenter som følger: Natriumfosfatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase aktivitet
- Før CD-spektroskopi etablerer du ATPase-aktiviteten til proteinet i nærvær av DNA-molekylene for å sikre at proteinet som brukes i CD-spektroskopien er aktivt og for å identifisere DNA-molekylene som er optimalt effektive for å fremkalle ATP hydrolyse.
- Mål ATPase-aktiviteten til proteinet i nærvær av forskjellige DNA-molekyler av en NADH-koblet oksidasjonsanalyse som består av følgende to reaksjoner.
- Bland 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA og 1x REG-buffer i en 96-brønnsplate til et endelig volum på 250 μL.
MERK: Pyruvat kinase enzymet bruker ADP og Pi til å konvertere fosfoenolpyruvat til pyruvat, og dermed regenerere ATP. Dette sikrer at ATP alltid er i en mettende konsentrasjon i reaksjonen. I den andre reaksjonen omdannes pyruvaten dannet av virkningen av pyruvatkinase av laktat dehydrogenase til laktat. I denne reaksjonen oksideres ett NADH-molekyl til NAD+. Forbruket av NADH måles ved å måle molekylets absorbans ved 340 nm. - Inkuber i 30 min ved 37 °C i en inkubator.
- Mål mengden NAD+ ved 340 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
- For å måle mengden NAD+, bruk programvaren som følger med mikroplateleseren.
- Klikk på NADH-analysen for å måle absorbansen ved 340 nm.
- Plasser 96-brønnsplaten på plateholderen i instrumentet. Klikk på Les plate-knappen for å registrere absorbansen.
MERK: Konsentrasjonen av NAD+ beregnes ved hjelp av molar utryddelseskoeffisienten til NADH som 6,3 mM−1 ved bruk av eq (1).
A = εcl (1)
Her, A = Absorbans
ε = Molar utryddelseskoeffisient
c = Molar konsentrasjon
l = Optisk banelengde i cm
- Bland 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA og 1x REG-buffer i en 96-brønnsplate til et endelig volum på 250 μL.
3. Valg og tilberedning av CD-cuvettes
- Samle CD spektra i høy-transparent kvarts cuvettes. Bruk rektangulære eller sylindriske cuvettes.
MERK: En CD-kvarts cuvette (nominelt volum på 0,4 ml, banelengde på 1 mm) ble brukt til alle reaksjonene som er beskrevet i dette papiret. - Bruk en cuvette rengjøringsløsning for å rengjøre cuvette. Tilsett 1% cuvette rengjøringsløsning i vann for å lage 400 μL av løsningen, hell den i cuvette og inkuber den ved 37 °C i 1 time.
- Vask cuvette med vann flere ganger for å rengjøre cuvette. Ta en skanning av vannet eller bufferen i cuvette for å sjekke om det er rent.
MERK: Vannet eller bufferen må gi en avlesning i området 0 til 1 mdeg.
4. Fremstilling av proteiner og DNA oligonukleotid
- Hold volumet av proteinet under 50 μL i reaksjonen for å minimere mengdene av bufferkomponentene som noen ganger forårsaker dannelse av tvetydige topper. Hold proteinet på isen gjennom hele eksperimentet for å unngå nedbrytning.
- Bruk SIDErensede DNA-oligonukleotider i reaksjonene.
MERK: I reaksjonene som er beskrevet her, ble DNA brukt både i innfødte og varmekjølte former (hurtigkjølt (FC) og langsomt avkjølt (SC)). Rask kjøling fremmer intramolekylær binding i DNA, noe som gir mer sekundære strukturer. I motsetning til dette fremmer langsom kjøling intermolekylær binding i DNA-et, noe som resulterer i færre sekundære strukturer. - For rask kjøling, varm DNA ved 94 °C i 3 minutter på varmeblokken og avkjøl det umiddelbart på is. For langsom kjøling, varme DNA ved 94 °C i 3 minutter og la det avkjøles til romtemperatur med en hastighet på 1 °C per minutt.
5. Sette opp kontrolleksperimenter for å registrere basisspektraet
- Hold reaksjonsvolumet på 300 μL i alle reaksjonene. Sett opp totalt 5 baseline reaksjoner i 1,5 ml sentrifugerør, en etter en, som følger: i) Buffer + Vann; ii) Buffer + MgCl2 + ATP + Vann; iii) Buffer + MgCl2 + ATP + Protein + Vann; iv) iii + EDTA eller ADAADiN; v) Buffer + Protein +Vann.
6. Sette opp forsøkene for å spille inn CD-spektra
- Sett opp totalt 5 reaksjoner, en etter en, i 1,5 ml sentrifugerør som følger: i) Buffer + DNA + Vann; ii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Vann; iii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Vann; iv) iii + EDTA eller ADAADiN; v) Buffer + DNA + Protein +Vann.
7. Ta opp skanning
- Slå på gassen og slå på CD-spektrometeret.
- Slå på lampen etter 10-15 min. Slå på vannbadet og still inn holdertemperaturen ved 37 °C.
- Åpne CD-spektrumprogramvaren .
- Still temperaturen på 37 °C.
- Still inn bølgelengdeområdet på 180 - 300 nm.
- Sett klokkeslettet per punkt til 0,5 s.
- Sett skannenummeret til 5.
- Klikk på Pro-Data Viewer, lag en ny fil, og gi den nytt navn med detaljer om eksperimentet og datoen.
- Hold alle reaksjonskomponentene på isen for å unngå nedbrytning. Lag grunnlinjene og reaksjonene, en etter en, i sentrifugerør og bland dem ved pipettering. Overfør reaksjonsblandingen til cuvette nøye, og sørg for at det ikke er luftbobler.
- Hvis du utfører et tidskurseksperiment, inkuberer du reaksjonene ved 37 °C i ønsket tid og tar skanningen. Tilsett EDTA i bufferen som inneholder DNA, ATP, Mg+2 og protein for å stoppe ATP hydrolyse.
- Øk konsentrasjonen av EDTA og dens inkubasjonstid for å hemme ATPase-aktiviteten helt.
- Trekk basislinjene fra de tilsvarende reaksjonene i programvaren (trekk for eksempel reaksjon 1 fra baseline 1). Jevn ut dataene enten i CD-spektrumprogramvaren eller i programvare for dataplotting. Tegn inn dataene i programvaren for datategning.
MERK: Hvis du trekker grunnlinjene fra de tilsvarende reaksjonene, får du bare DNA-spektra med netto CD-spektra.
8. Dataanalyse og tolkning
- Bruk formelen gitt av eq (2) for å konvertere verdiene oppnådd i millidegrees til gjennomsnittlig rest ellipticity.
(2)
Her er S CD-signalet i millidegrees, c er DNA-konsentrasjonen i mg / ml, mRw er gjennomsnittlig restmasse, og l er banelengden i cm. - Plott en graf mot bølgelengde og gjennomsnittlig rest ellipticity ved hjelp av data plotting programvare og analysere toppene.
- Hvis du vil tegne inn grafen, velger du den gjennomsnittlige restellipsiteten på Y-aksen og bølgelengden på X-aksen og tegner inn et rett linjediagram.
MERK: Denne grafen vil gi egenskapene topper av forskjellige former for DNA. Dna-formene som tilsvarer toppene kan identifiseres ved hjelp av eksisterende litteratur6.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADAAD stabiliserer en stamme-loop som struktur på MYC-promotoren
Tidligere eksperimentelle bevis viste at SMARCAL1 er en negativ regulator av MYC29. Analyse av den 159 bp lange promotorregionen av MYC-genet av QGRS-tilordning viste at fremoverstrengen hadde potensial til å danne en G-quadruplex (tabell 2). Mfold viste at begge trådene i MYC DNA kunne danne en stamme-loop-lignende struktur (tabell 2). En 34 bp lang DNA-sekvens som inneholder G-quadruplex (GECE) ble syntetisert. Mfold-strukturene til fremover og den omvendte sekvensen av GECE oligonukleotid er vist i figur 1A,B.
ATPase-analyser ved hjelp av 6X His-ADAAD viste at raskt avkjølt GECE var en bedre effekt enn de innfødte og de langsomt avkjølte formene. Derfor ble raskt avkjølt GECE brukt til å spille inn CD-spektraet i fravær og tilstedeværelse av ATP og ADAAD. CD-spektraet viste at ADAAD induserer to positive topper-en ved 258 nm med en skulder på 269 nm og en større topp på 210 nm i DNA (figur 1C). Det ble også observert en dukkert mot det negative rundt 240 nm. Dette spekteret lignet på det som ble oppnådd da et syntetisk stammesløyfe-DNA, den optimale effekten av ADAAD, ble inkubert med proteinet og ATP (figur 2A, B). Triplex DNA kan gi et lignende spektrum37, noe som fører til hypotesen om at proteinet kan indusere en slik struktur i dette tilfellet. ATP danner et koordineringskompleks med Mg+2, og denne kationen er avgjørende for ATP hydrolyse. Tilsetningen av EDTA chelates Mg +2, noe som fører til hemming av ATP hydrolyse38. Derfor ble EDTA lagt til reaksjonsblandingen for å forstå om ATP hydrolyse av ADAAD var viktig for konformasjonsendring. Tilsetningen av EDTA til reaksjonen avviker denne konformasjonen. CD-spektra har nå en negativ topp på 210 nm og et bredt positivt bånd med topper på 230 og 250 nm (figur 1C).
Betydningen av ATPase-aktivitet ble også bekreftet ved hjelp av en ATPase-død mutant av ADAAD. K241A-mutasjonen forekommer i den bevarte GKT-boksen med motiv I, og denne mutanten har tidligere vist seg å mangle evnen til å hydrolysere ATP i nærvær av DNA31. Mutantproteinet ble uttrykt med en GST-tag og renset ved hjelp av glutathione affinitetskromatografi. Konformasjonsendringen som ble indusert i MYC DNA av denne mutanten var forskjellig fra den som ble indusert av wild-type ADAAD. CD-spekteret til MYC DNA i nærvær av mutantproteinet hadde en positiv topp på 210 nm og en negativ topp på 260 nm (figur 1D).
ADAAD induserer A-form for konformasjon hos DROSHA-promotor
Promotorregionene DROSHA, DGCR8 og DICER ble også analysert av QGRS-tilordning og Mfold-programvare. Både QGRS og MFold viste at promotorregionene har potensial til å danne G-quadruplex og stammelignende strukturer (tabell 2). Mfold-strukturene til de fremre og omvendte oligonukleotidene er vist i figur 3A,B. ATPase-aktiviteten viste at det innfødte og varmekjølte DNA-et oppførte seg på samme måte. Derfor ble den langsomt avkjølte formen av disse DNA-sekvensene brukt til CD-studier. CD-spektraet viste at ADAAD induserer en negativ topp på 210 nm og en positiv topp på 260 nm i DROSHA-promotoren (figur 3C). Dette spekteret er karakteristisk for A-DNA6.
ADAAD induserer B-X-overgang og G-quadruplex-formasjon i DGCR8-promotoren
Mfold-strukturene til fremover og de omvendte trådene til oligonukleotidene som brukes, er vist i figur 4A,B. Det ble observert en positiv topp på 210 nm og en bred negativ topp på 260 nm for DGCR8 par 1 (figur 4C). Dette spekteret er karakteristisk for B-X-overgang6. Mfold-strukturene til fremover og de omvendte trådene til oligonukleotidene som brukes, er vist i figur 4D,E. CD-spektraet til DGCR8 par 7 viste en sterk positiv topp på 210 og 270 nm og en negativ topp på 250 nm (figur 4F). Dette spekteret er karakteristisk for parallelle G-quadruplex DNA-strukturer6.
ADAAD induserer A-X-overgang i DICER-promotor
Mfold-strukturene til de fremre og omvendte oligonukleotidene er vist i figur 5A,B. En positiv topp på 210 nm og to negative topper-en på 230 nm og den andre på 260 nm topp-ble observert for DICER par 1 (Figur 5C). Disse toppene er karakteristiske for A-X DNA-overgang6,9. Alle CD-spektratoppene og formene for DNA som har spesifikke roller i transkripsjonsprosessen er oppsummert i tabell 3.
Figur 1: ADAAD endrer samsvaret med GECE DNA. Mfold-strukturer ble spådd for (A) fremoverstrengen og (B) omvendt tråd. (C) CD-spektra av GECE alene (svart), GECE inkubert med ATP og ADAAD før (rød) og etter å ha lagt til EDTA (blå). (D) CD-spektra av GECE inkubert med ATP og GST-merket ADAAD før (svart) og etter å ha lagt til EDTA (rød) samt CD-spektra av GECE inkubert med ATP og GST-merket K241A mutant (blå). Dette tallet er endret fra 29. Forkortelser: ADAAD = Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain; CD = sirkulær dikroisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: ADAAD endrer konformasjonen av slDNA. (A) Mfold-strukturen som er predikert for stamme-loop-DNA. (B) CD-spektra av slDNA alene (svart), slDNA inkubert med ATP og ADAAD (rød). Dette tallet er endret fra29. Forkortelser: ADAAD = Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain; slDNA = stamme-loop DNA; CD = sirkulær dikroisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: ADAAD endrer konformasjonen av DROSHA-par 5 DNA. Mfold struktur spådd for (A) fremover tråd og (B) omvendt tråd. (C) CD-spektra av DROSHA par 5 DNA alene (svart), DROSHA par 5 DNA inkubert med ATP og ADAAD (rød). Dette tallet er endret fra 28. Forkortelser: ADAAD = Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain; CD = sirkulær dikroisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: ADAAD endrer konformasjonen av DGCR8 par 1 og 7 DNA. Mfold strukturer spådd for (A) fremover tråd og (B) omvendt tråd av DGCR8 par 1 oligonukleotid. (C) CD-spektra av DGCR8 par 1 alene (svart), DGCR8 par 1 inkubert med ATP og ADAAD (rød). Mfold strukturer spådd for (D) fremover tråd og (E) omvendt tråd av DGCR8 par 7 oligonukleotid. (F) CD-spektra av DGCR8 par 7 alene (svart), DGCR8 par 7 inkubert med ATP og ADAAD (rød). Dette tallet er endret fra 28. Forkortelser: ADAAD = Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain; CD = sirkulær dikroisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: ADAAD endrer konformasjonen av DICER-par 1 DNA. Mfold struktur spådd for (A) fremover tråd og (B) omvendt tråd av DICER par 1 oligonukleotid. (C) CD-spektra av DICER par 1 alene (svart), DICER par 1 inkubert med ATP og ADAAD (rød). Dette tallet er endret fra 28. Forkortelser: ADAAD = Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain; CD = sirkulær dikroisme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 5x REG-buffer | |
| Komponent | Arbeidskonsentrasjon |
| Laktat dehydrogenase (LDH) | 50 enheter/ml |
| Magnesiumacetat (Mg(OAc)2) | 30 mM |
| Fosfoenolpyruvat (PEP) | 6,8 mg/ml |
| Pottasiumacetat (KOAc) | 300 mM |
| Pyruvat kinase (PK) | 50 enheter/ml |
| Tris-acetat (Tris-OAc) | 125 mM |
| β-mercaptoetanol (β-ME) | 25 mM |
Tabell 1: Bufferkomponenter.
| Oligonukleotider | Sekvens fremover | ΔG (m-Fold) Kcal/mol | G-skår (QGRS-tilordning) | Omvendt sekvens | ΔG kcal/mol (Mfold prediksjon) | G-skår (QGRS-tilordning) | |||
| slDNA | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| DROSHA-par 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8-par 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8-par 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| DICER-par 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tabell 2: Oligonukleotidsekvenser. Alle sekvensene er i retning 5'-3'. Forkortelser: slDNA = stamme-loop DNA.
| Oligonukleotider | CD Spectra Topper i nm (Etter inkubering med ATP og ADAAD) | Form av DNA | Rolle i transkripsjon |
| slDNA | +215, +250, +272 | Trippel | Undertrykkelse |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | Trippel | Undertrykkelse |
| DROSHA-par 5 | -210, +260 | A-DNA | Initiering/aktivering |
| DGCR8-par 1 | +210,-260 | B-X-overgang | Positiv superkobling/aktivering |
| DGCR8-par 7 | +210, -250, +270 | G-quadruplex | Aktivering |
| DICER-par 1 | +210, -230, -257 | A-X-overgang | Positiv superkobling/aktivering |
Tabell 3: CD-spektra topp som tilsvarer ulike former for DNA med sin rolle i transkripsjon. Forkortelser: ADAAD = Aktiv DNA-avhengig ATPase A Domain; CD = sirkulær dikroisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med denne artikkelen er å introdusere CD-spektroskopiteknikken som en tilnærming for å studere konformasjonsendringene som forekommer i DNA i nærvær av ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner og å koble disse konformasjonsendringene til genuttrykk. CD-spektroskopi gir en rask og lett tilgjengelig metode for å studere konformasjonsendringene i DNA.
Et avgjørende poeng å vurdere for denne teknikken er renheten til DNA og protein. Det anbefales å sikre at både DNA og protein er >95% rent. SIDErensede oligonukleotider må brukes i analysen, og proteinet bør fortrinnsvis være affinitetsrenset til >95% renhet. Den andre kritiske parameteren er at cuvette skal være ren slik at baselineavlesningen ikke overstiger 1 mdeg. Bufferne bør gjøres ved hjelp av autoklavert vann, og grunnlinjeavlesningen av bufferen bør ikke overstige 1 mdeg. For å studere konformasjonen av promotoren er det viktig å identifisere regionene der proteinet binder seg. Derfor er det tilrådelig å utføre ChIP-eksperimenter ved hjelp av proteinet av interesse, da denne prosessen bidrar til å identifisere DNA-sekvenser som er tilstede i promotorområdet til effektorgenet bundet av proteinet. Når regionen er identifisert, kan sekvensens evne til å vedta spesifikke strukturer analyseres ved hjelp av tilgjengelige bioinformatikkverktøy. Dette er viktig siden ChIP-primerne vanligvis er 200 bp lange og kan ha flere konformasjoner. Derfor vil bruk av bioinformatikkverktøy for å identifisere strukturene bidra til å forkorte lengden på oligonukleotidet til en struktur.
Til slutt, hvis proteinet av interesse er et ATP-avhengig kromatin ombyggingsprotein, må oligonukleotidenes evne til å fungere som en effektor kontrolleres ved hjelp av ATPase-analyser. I både CD-spektroskopi- og ATPase-analyser bør det utvises forsiktighet for å sikre at metningskonsentrasjoner av ligander brukes i reaksjonen. Hvis det er mulig, bør dissosiasjonskonstanten (Kd) for proteinligandinteraksjonen beregnes før du fortsetter med CD-spektroskopi. Tallrike metoder er tilgjengelige for beregning av bindingsparameteren. Ved hjelp av ATPase-analyser kan Michaelis-Menten-konstanten (KM) beregnes ved å titrere økende konsentrasjoner av DNA. KM kan i mange tilfeller tilnærmes bindingskonstanten. Hvis proteinet er fluorescerende, kan bindende konstanter beregnes ved hjelp av fluorescensspektroskopi. Hvis ingen av disse teknikkene er gjennomførbare, kan elektroforesemobilitetsskiftanalysen (EMSA) brukes.
Hovedproblemet med CD-spektroskopi oppstår når cuvettes ikke rengjøres eller når reagensene er urene. Hvis grunnlinjen er for høy, anbefales det å rengjøre cuvettes. Tallrike cuvette rengjøringsløsninger er tilgjengelige. Å plassere cuvettes i en fortynnet syreoppløsning i 16-24 timer bidrar også til å rengjøre cuvette. Det anbefales å kjøpe reagenser som er >95% rene og å bruke dobbeltdestillert og autoklavert vann. Baseline drift er et annet potensielt problem. Hvis du gjør et langsiktig eksperiment, anbefales det å periodisk sjekke grunnlinjen. Toppene av DNA når man studerer protein-DNA-interaksjoner samsvarer kanskje ikke akkurat med toppene / båndene oppnådd med DNA alene. Proteintopper observeres vanligvis i Fjern UV-området mellom 190 og 230 nm. Derfor kan topper under 250 nm ha forstyrrelser fra proteintoppen og gir kanskje ikke pålitelig informasjon. DNA kan vedta en rekke ikke-B-konformasjoner avhengig av sekvensen. Jo lenger DNA-sekvensen er, jo større er sjansen for at flere konformasjoner eksisterer i DNA-oligonukleotidet. Dette kan gjøre analysen vanskelig. Derfor er det tilrådelig å bruke kortere oligonukleotider som tilsvarer de potensielle strukturene som forventes av de bioinformatiske verktøyene.
Den andre store ulempen ved CD-spektroskopi er at den ikke tillater strukturanalyse på atomnivå, og det oppnådde spekteret er utilstrekkelig til å identifisere den eneste levedyktige strukturen. For eksempel gir både røntgenkrystallografi og protein NMR spektroskopi atomoppløsningsdata, mens CD-spektroskopi gir mindre detaljert strukturell informasjon. CD-spektroskopi er imidlertid en rask tilnærming som ikke nødvendiggjør store mengder proteiner eller betydelig databehandling. Som et resultat kan CD brukes til å undersøke et bredt spekter av løsningsmiddelvariabler som temperatur, pH, saltholdighet og tilstedeværelse av ulike kofaktorer. Den kan også brukes til å overvåke strukturelle endringer (på grunn av kompleks dannelse, folding / utfoldelse, denaturering på grunn av temperatur, denaturer og endringer i aminosyresekvens / mutasjon) i dynamiske systemer. Ved å koble det til stoppstrømsapparatet, kan det også brukes til å studere kinetikken til protein / DNA-ligandinteraksjoner.
Godt karakteriserte DNA-konforme inkluderer A / B / Z DNA, triplex, hårnål og G-quadruplexes. Alle disse formene for DNA er forbundet med en åpen DNA-konformasjon, det vil si viklet DNA som fungerer som vask for negativ superkobling. Transkripsjon er forbundet med negativ supercoiling da dannelsen av et åpent kompleks er en forutsetning for bevegelse av RNA-polymerase. Derfor innebærer transkripsjon av de fleste gener økt negativ supercoiling i promotorregionen. Studier har vist at nukleosom utfoldelse fører til A-DNA-konformasjon, som imidlertid er ustabil39. En mulighet er at proteinet av interesse, for eksempel SMARCAL1, binder seg til slike strukturer og stabiliserer dem, og dermed letter transkripsjon, som vist i tilfelle av DROSHA-promotører . Guanine quadruplex er basert på guanine tetrads bundet av Hoogsteen hydrogenbindinger. I silico analyse har bekreftet at G4-forming sekvenser er spesielt beriket proksimal til genpromotorer og på transkripsjon startsteder. Disse G4-sekvensene kan både aktivere og undertrykke transkripsjon.
Når det gjelder MYC-promotoren40, fungerer dannelsen av G-quadruplex som en undertrykker, mens når det gjelder human vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF), fungerer G-quadruplex-strukturen som et dokkingsted for transkripsjonsfaktorer41, og aktiverer dermed uttrykket for dette genet. Når det gjelder SMARCAL1, ble G-quadruplex-strukturen observert da ADAAD samhandlet med DGCR8 par 7 promotorsekvenser. Etter hvert som belegget til SMARCAL1 og RNAPII økte på dette primerparet, er det hypoteset at dannelsen av G-quadruplex i dette tilfellet korrelerer med transkripsjonsaktivering av dette genet. DNA kan også være positivt supercoiled, og fremdriften av RNA polymerase er kjent for å generere positiv supercoiling foran den. Denne transkripsjonsgenererte (+) superkoblingen kan forstyrre eller eliminere veiblokkproteiner, destabilisere nukleosomstrukturer for å gjøre DNA mer tilgjengelig for RNA-polymerase. X-DNA er en konformasjon av DNA som fungerer som vasker for positiv supercoiling. Det slående trekk ved et X-DNA er at det kan dannes på en sekvensspesifikk måte på promotoren til et gen. Når det gjelder SMARCAL1, induserte ADAAD A-X- og B-X-overganger på en ATP-avhengig måte i henholdsvis DICER- og DGCR8-promotorene. Kombinert med in vivo-data der økt SMARCAL1- og RNAPII-belegg ble funnet på disse promotorene i nærvær av doksorubicinindusert DNA-skade, kan det antas at X-DNA-formasjon letter transkripsjon ved å fjerne barrierer / blokker. Trippel DNA-helikier har ikke et karakteristisk spektrum. CD-spektraet til DNA-sekvensene som finnes i MYC-promotoren og det syntetiske stammesløyfe-DNA-et viste to positive topper-en ved 258 nm med en skulder på 269 nm og en større topp på 210 nm i DNA. Denne typen spektrum kan oppnås i tilfelle triplexes37. Triplexer er vanskelige å slappe av og er derfor kjent for å blokkere transkripsjon42. Derfor er det hypoteset at dannelsen av denne strukturen i c-MYC-promotoren av SMARCAL1 fører til undertrykkelse av transkripsjon.
Det skal bemerkes at ATP også binder seg til ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner. Den konserverte argininen som er tilstede i motivet VI av helicase-domenet til disse proteinene, samhandler via elektrostatiske interaksjoner med proteinets γ fosfat. Når det gjelder ADAAD, er Kd av protein-ATP interaksjon (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. Bindingen av ATP induserer en konformasjonsendring i proteinet slik at affiniteten til DNA øker. Bindingen av DNA induserer også en konformasjonsendring i proteinet som fører til økt 10 ganger affinitet for ATP31. For eksempel, når det gjelder ADAAD, observeres bånd / topper på -212 nm og -222 nm. ATP gir også band på 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm og -270 nm. Disse må trekkes fra spektra av DNA + ADAAD + ATP for å oppnå "netto" samsvar av DNA i nærvær av ligandene.
Dermed viser dette papiret bekvemmeligheten av CD-spektroskopi for studiet av konformasjonsendringene som forekommer i DNA i nærvær av ATP-avhengige kromatinoppussingsproteiner. Korrelering av endringene i DNA-samsvaret med ChIP-data kan gi etterforskerne informasjon om hvordan DNA-konforme kan aktivere/undertrykke transkripsjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, for CD-spektrofotometeret. V.J. og A.D. ble støttet av et fellesskap fra CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
References
- Woody, R. W.
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
- Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
- Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
- Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
- Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
- Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
- Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
- Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
- Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
- Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
- Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
- Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528 (2020).
- Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
- Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
- Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
- Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
- Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
- Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
- Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
- Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
- Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
- Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
- Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
- Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
- Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910 (2015).
- Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
- Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
- Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
- Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822 (2012).
- Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
- Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
- Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
- Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
- Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
- Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
- Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
- Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).
