Summary
L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.
Abstract
La spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) est une méthode simple et pratique pour étudier la structure secondaire et les interactions des biomolécules. Les progrès récents de la spectroscopie CD ont permis d’étudier en détail les interactions ADN-protéine et la dynamique conformationnelle de l’ADN dans différents microenvironnements pour une meilleure compréhension de la régulation transcriptionnelle in vivo. La zone autour d’une zone de transcription potentielle doit être déroulée pour que la transcription se produise. Il s’agit d’un processus complexe nécessitant la coordination des modifications des histones, la liaison du facteur de transcription à l’ADN et d’autres activités de remodelage de la chromatine. En utilisant la spectroscopie CD, il est possible d’étudier les changements conformationnels dans la région promotrice causés par les protéines régulatrices, telles que les remodeleurs de chromatine dépendants de l’ATP, pour favoriser la transcription. Les changements conformationnels qui se produisent dans la protéine peuvent également être surveillés. En outre, les questions concernant l’affinité de la protéine pour son ADN cible et la spécificité de la séquence peuvent être traitées en incorporant des mutations dans l’ADN cible. En bref, la compréhension unique de cette méthode sensible et peu coûteuse peut prédire les changements dans la dynamique de la chromatine, améliorant ainsi la compréhension de la régulation transcriptionnelle.
Introduction
Le dichroïsme circulaire (CD) est une technique spectroscopique qui repose sur la chiralité inhérente des macromolécules biologiques qui conduit à l’absorption différentielle de la lumière polarisée circulairement pour droitiers et gauchers. Cette absorption différentielle est connue sous le nom de dichroïsme circulaire. La technique peut donc être utilisée pour délimiter la conformation des macromolécules biologiques, telles que les protéines et l’ADN, qui contiennent toutes deux des centres chiraux1,2.
Les ondes électromagnétiques contiennent à la fois des composants électriques et magnétiques. Les champs électrique et magnétique oscillent perpendiculairement à la direction de propagation des ondes. Dans le cas de la lumière non polarisée, ces champs oscillent dans de nombreuses directions. Lorsque la lumière est polarisée circulairement, deux champs électromagnétiques sont obtenus à une différence de phase de 90° l’un par rapport à l’autre. Les molécules chirales présentent une rotation optique circulaire (biréfringence) telle qu’elles absorbent la lumière polarisée circulairement droite et la lumière polarisée circulairement gaucher à des degrés différents3. Le champ électrique résultant sera tracé comme une ellipse, une fonction de la longueur d’onde. Le spectre CD est donc enregistré comme ellipticité (q), et les données sont présentées comme ellipticité résiduelle moyenne en fonction de la longueur d’onde.
Dans le cas des protéines, le Cα des acides aminés (à l’exception de la glycine) est chiral, et ceci est exploité par spectroscopie CD pour déterminer la structure secondaire de cette macromolécule4. Les spectres CD des molécules de protéines sont généralement enregistrés dans la gamme Far UV. α-hélicoïdales ont deux bandes négatives à 222 nm et 208 nm et un pic positif à 193 nm4. Les protéines à structure secondaire anti-parallèle β feuille montrent un pic négatif à 218 nm et un pic positif à 195 nm4. Les protéines aux structures désordonnées présentent une faible ellipticité proche de 210 nm et un pic négatif à 195 nm4. Ainsi, les pics/bandes bien définis pour différentes structures secondaires font de la CD un outil pratique pour élucider les changements conformationnels qui se produisent dans la structure secondaire des protéines pendant la dénaturation ainsi que la liaison aux ligands.
Les acides nucléiques ont trois sources de chiralité : la molécule de sucre, l’hélicité de la structure secondaire et l’ordre tertiaire à longue distance de l’ADN dans l’environnement5,6. Les spectres CD des acides nucléiques sont généralement enregistrés dans la gamme de 190 à 300 nm5,6. Chaque conformation de l’ADN, tout comme les protéines, donne un spectre caractéristique, bien que les pics/bandes puissent varier de certains degrés en raison des conditions de solvant et des différences dans les séquences d’ADN7. L’ADN-B, la forme la plus courante, se caractérise par un pic positif autour de 260-280 nm et un pic négatif autour de 245 nm6. Les pics/bandes de l’ADN de forme B sont généralement petits parce que les paires de bases sont perpendiculaires à la double hélice, conférant une faible chiralité à la molécule. L’ADN-A donne un pic positif dominant à 260 nm et un pic négatif autour de 210 nm6. L’ADN-Z, l’hélice gaucher, donne une bande négative à 290 nm et un pic positif autour de 260 nm6. Cet ADN donne également un pic extrêmement négatif à 205 nm6.
En plus de ces conformations, l’ADN peut également former des triplex, des quadruplexes et des épingles à cheveux, qui peuvent tous être distingués par spectroscopie CD. Le G-quadruplex parallèle donne une bande positive dominante à 260 nm, tandis que le G-quadruplex anti-parallèle donne une bande négative à 260 nm et un pic positif à 290 nm, ce qui facilite la distinction entre les deux formes de structures quadruplex6. Les triplex ne donnent pas de spectre caractéristique8. Par exemple, les spectres d’un ADN de 36 nucléotides ayant le potentiel de former une triple hélice intramoléculaire contenant des paires de bases G.G.C et T.A.T en présence de Na+ montrent une forte bande négative à 240 nm et un large pic positif. Le pic positif général montre des contributions à 266, 273 et 286 nm. Le même oligonucléotide en présence de Na+ et Zn+ montre quatre bandes négatives (213, 238, 266 et 282 nm) et un pic positif à 258 nm. Ainsi, les spectres de l’ADN triplex peuvent varier en fonction des conditions de sel8.
En plus de ces conformations, les spectres CD ont permis l’identification d’une autre forme d’ADN appelée X-ADN. L’ADN-X se forme lorsque la séquence d’ADN contient des résidus alternatifs d’adénine et de thymine. Les spectres CD de l’ADN-X contiennent deux pics négatifs à 250 et 280 nm. Très peu d’informations sont disponibles sur l’ADN-X, bien qu’il ait été spéculé pour fonctionner comme un puits pour le superenroulage positif6,9. Les changements dans les spectres DE LA MC peuvent également révéler des détails sur les interactions ligand-protéine et, par conséquent, ont été ajoutés à l’arsenal des méthodes moléculaires pour détecter les interactions médicament-protéine10,11,12,13,14. Les spectres CD ont également été utilisés pour surveiller les changements dans la structure secondaire des protéines pendant le processus de repliement15. De même, les spectres CD peuvent également être utilisés pour sonder les interactions ligand-ADN16,17.
La spectroscopie CD est donc une méthode facile et peu coûteuse pour distinguer les différentes formes de conformation de l’ADN, à condition qu’il y ait accès à des équipements et des logiciels moins coûteux. La méthode est extrêmement sensible et rapide. Il ne nécessite qu’une petite quantité d’ADN, ce qui lui donne un avantage sur la technique alternative de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN). Les titrages avec des ligands et des substrats sont également faciles à effectuer. La contrainte majeure est que l’ADN doit être très pur. Il est conseillé d’utiliser de l’ADN purifié par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE).
Les informations obtenues par les spectres CD ont été principalement utilisées pour déduire les caractéristiques structurelles des protéines et pour identifier des conformateurs d’ADN distincts. Dans cette étude, les spectres CD ont été utilisés pour intégrer les résultats obtenus d’une expérience in vivo d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) afin de déterminer si la protéine d’intérêt / facteur de transcription prédit peut entraîner un changement conformationnel dans la région promotrice de ses gènes effecteurs. Cette collaboration contribue à la progression des techniques spectroscopiques CD traditionnelles en prédisant le mécanisme de régulation de la transcription par le facteur de transcription prédit sur et autour du site de début de transcription (SCT) d’un promoteur.
Le remodelage de la chromatine est un mécanisme bien défini connu pour réguler les processus métaboliques de l’ADN en rendant la chromatine étroitement emballée accessible à divers facteurs régulateurs tels que les facteurs de transcription, les composants de la réplication de l’ADN ou les protéines de réparation des dommages. Les remodeleurs de chromatine dépendants de l’ATP, également connus sous le nom de famille de protéines SWI/SNF, sont des protéines remodelantes clés présentes dans les cellules eucaryotes18,19. Le regroupement phylogénétique a classé la famille de protéines SWI/SNF en 6 sous-groupes20 : Snf2-like, Swr1-like, SSO1653-like, Rad54-like, Rad5/16-like, et distant. SMARCAL1, la protéine d’intérêt dans cette étude, appartient au sous-groupe distant20. Cette protéine a été utilisée pour étudier son mode de régulation transcriptionnelle à l’aide de la spectroscopie CD.
Il a été démontré que la plupart des membres des protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP se repositionnent ou éliminent les nucléosomes ou interviennent dans l’échange de variantes d’histones d’une manière dépendante de l’ATP21,22. Cependant, il n’a pas été démontré que certains membres de cette famille remodelent les nucléosomes, par exemple SMARCAL1. Même si des études ont montré que SMARCAL1 s’associe aux chromosomes polytènes, les preuves expérimentales concernant sa capacité à remodeler les nucléosomes font défaut23. Par conséquent, il a été postulé que SMARCAL1 peut réguler la transcription en modifiant la conformation de l’ADN24. La spectroscopie CD a fourni une méthode facile et accessible pour valider cette hypothèse.
SMARCAL1 est une protéine de remodelage de la chromatine dépendante de l’ATP qui fonctionne principalement comme une hélicase de recuit25,26,27. Il a été postulé pour moduler la transcription en remodelant la conformation de l’ADN24. Pour tester cette hypothèse, le rôle de SMARCAL1 dans la régulation de la transcription des gènes lors des dommages à l’ADN induits par la doxorubicine a été étudié. Dans ces études, SMARCAL1 a été utilisé pour l’analyse in vivo et ADAAD pour les essais in vitro28,29. Des études antérieures ont montré que l’ADAAD peut reconnaître l’ADN d’une manière dépendante de la structure mais indépendante de la séquence30,31. La protéine se lie de manière optimale aux molécules d’ADN possédant des régions de transition double brin à simple brin, similaires à l’ADN de boucle tige, et hydrolyse l’ATP 30,31.
Des expériences in vivo ont montré que SMARCAL1 régule l’expression de MYC, DROSHA, DGCR8 et DICER en se liant aux régions promotrices28,29. La région d’interaction a été identifiée par les expériences ChIP28,29. La technique ChIP est utilisée pour analyser l’interaction d’une protéine avec son ADN apparenté dans la cellule. Son objectif est de déterminer si des protéines spécifiques, telles que des facteurs de transcription sur des promoteurs ou d’autres sites de liaison à l’ADN, sont liées à des domaines génomiques spécifiques. La protéine liée à l’ADN est d’abord réticulée à l’aide de formaldéhyde. Ceci est suivi par l’isolement de la chromatine. La chromatine isolée est cisaillée en fragments de 500 pb soit par sonication, soit par digestion nucléase, et la protéine liée à l’ADN est immunoprécipitée à l’aide d’anticorps spécifiques à la protéine. La réticulation est inversée et l’ADN est analysé à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou d’une PCR quantitative en temps réel.
Les résultats du ChIP ont conduit à l’hypothèse que SMARCAL1 intervient peut-être dans la régulation transcriptionnelle en induisant un changement conformationnel dans les régions promotrices de ces gènes. Le cartographe QGRS et le logiciel Mfold ont été utilisés pour identifier le potentiel de ces régions promotrices à former des structures secondaires28,29. Le mappeur QGRS est utilisé pour prédire les G-quadruplex32, tandis que Mfold33 analyse la capacité d’une séquence à former des structures secondaires telles que des boucles de tige.
Après l’analyse de la structure secondaire, d’autres expériences in vitro ont été réalisées avec l’ATPase A A (ADAAD) recombinant 6X His-tagged Active DNA-dependent ATPase A Domain, l’homologue bovin de SMARCAL1, purifié à partir d’Escherichia coli34. Des tests ATPase ont été effectués à l’aide de l’ADAAD pour établir que les séquences d’ADN identifiées pouvaient agir comme effecteurs28,29. Enfin, la spectroscopie CD a été réalisée pour surveiller les changements conformationnels induits dans la molécule d’ADN par ADAAD28,29.
Pour prouver que l’activité ATPase de la protéine était essentielle pour induire un changement conformationnel dans la molécule d’ADN, soit de l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) a été ajouté au chélate Mg+2, soit de la néomycine inhibiteur du domaine de l’ATPase A dépendante de l’ADN actif (ADAADiN), un inhibiteur spécifique de la protéine SWI/SNF, a été ajoutée35,36 . Cette technique spectroscopique CD peut être utilisée avec n’importe quelle protéine purifiée qui a été démontrée par ChIP ou tout autre test pertinent pour se lier à une région génomique prédite d’un promoteur.
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Protocol
1. Concentration en fonction des composants de la réaction
- Préparer à nouveau les concentrations de travail des tampons pour la MC et d’autres composants de réaction (voir tableau 1) et les maintenir à 4 °C avant de mettre en place les réactions.
REMARQUE: Pour les réactions CD décrites dans le présent article, les concentrations de travail des composants sont les suivantes: tampon phosphate de sodium (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, ADN 500 nM, protéine 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Activité ATPase
- Avant la spectroscopie CD, établissez l’activité ATPase de la protéine en présence des molécules d’ADN pour vous assurer que la protéine utilisée dans la spectroscopie CD est active et pour identifier les molécules d’ADN qui sont d’une efficacité optimale pour provoquer l’hydrolyse de l’ATP.
- Mesurer l’activité ATPase de la protéine en présence de différentes molécules d’ADN par un dosage d’oxydation couplé au NADH composé des deux réactions suivantes.
- Mélanger 0,1 μM d’ADAAD, 2 mM d’ATP, 10 nM d’ADN et 1x tampon REG dans une plaque de 96 puits pour obtenir un volume final de 250 μL.
REMARQUE: L’enzyme pyruvate kinase utilise l’ADP et le Pi pour convertir le phosphoénolpyruvate en pyruvate, régénérant ainsi l’ATP. Cela garantit que l’ATP est toujours dans une concentration saturante dans la réaction. Dans la seconde réaction, le pyruvate formé par l’action de la pyruvate kinase est converti par la lactate déshydrogénase en lactate. Dans cette réaction, une molécule de NADH est oxydée en NAD+. La consommation de NADH est mesurée en mesurant l’absorbance de la molécule à 340 nm. - Incuber pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur.
- Mesurez la quantité de NAD+ à 340 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
- Pour mesurer la quantité de NAD+, utilisez le logiciel fourni avec le lecteur de microplaques.
- Cliquez sur le test NADH pour mesurer l’absorbance à 340 nm.
- Placez la plaque de 96 puits sur le support de plaque de l’instrument. Cliquez sur le bouton Lire la plaque pour enregistrer l’absorbance.
REMARQUE: La concentration de NAD+ est calculée en utilisant le coefficient d’extinction molaire du NADH de 6,3 mM−1 en utilisant eq (1).
A = εcl (1)
Ici, A = Absorbance
ε = Coefficient d’extinction molaire
c = Concentration molaire
l = Longueur du chemin optique en cm
- Mélanger 0,1 μM d’ADAAD, 2 mM d’ATP, 10 nM d’ADN et 1x tampon REG dans une plaque de 96 puits pour obtenir un volume final de 250 μL.
3. Choix et préparation des cuvettes CD
- Collectez les spectres de CD dans des cuvettes de quartz à haute transparence. Utilisez des cuvettes rectangulaires ou cylindriques.
REMARQUE : Une cuvette de quartz CD (volume nominal de 0,4 mL, longueur de trajet de 1 mm) a été utilisée pour toutes les réactions décrites dans le présent article. - Utilisez une solution de nettoyage de cuvette pour nettoyer la cuvette. Ajouter la solution nettoyante de la cuvette à 1 % dans l’eau pour obtenir 400 μL de la solution, verser dans la cuvette et l’incuber à 37 °C pendant 1 h.
- Lavez la cuvette avec de l’eau plusieurs fois pour nettoyer la cuvette. Faites un balayage de l’eau ou du tampon dans la cuvette pour vérifier si elle est propre.
REMARQUE: L’eau ou le tampon doit donner une lecture dans la plage de 0 à 1 mdeg.
4. Préparation de protéines et d’oligonucléotides d’ADN
- Maintenir le volume de la protéine en dessous de 50 μL dans la réaction pour minimiser les quantités de composants tampons qui provoquent parfois la formation de pics ambigus. Gardez la protéine sur la glace tout au long de l’expérience pour éviter toute dégradation.
- Utilisez des oligonucléotides d’ADN purifiés page dans les réactions.
REMARQUE: Dans les réactions décrites ici, l’ADN a été utilisé à la fois sous forme native et refroidie à la chaleur (refroidie rapidement (FC) et refroidie lentement (SC)). Le refroidissement rapide favorise la liaison intramoléculaire dans l’ADN, produisant plus de structures secondaires. En revanche, le refroidissement lent favorise la liaison intermoléculaire dans l’ADN, ce qui entraîne moins de structures secondaires. - Pour un refroidissement rapide, chauffer l’ADN à 94 °C pendant 3 min sur le bloc chauffant et le refroidir immédiatement sur de la glace. Pour un refroidissement lent, chauffer l’ADN à 94 °C pendant 3 min et le laisser refroidir à température ambiante à une vitesse de 1 °C par minute.
5. Mise en place d’expériences de contrôle pour enregistrer les spectres de base
- Maintenir le volume de réaction à 300 μL dans toutes les réactions. Mettre en place un total de 5 réactions de base dans des tubes centrifuges de 1,5 mL, un par un, comme suit: i) Tampon + Eau; ii) Tampon + MgCl2 + ATP + Eau; iii) Tampon + MgCl2 + ATP + Protéine + Eau; iv) iii + EDTA ou ADAADiN; v) Tampon + Protéine + Eau.
6. Mise en place des expériences pour enregistrer des spectres de CD
- Mettre en place un total de 5 réactions, une par une, dans des tubes centrifuges de 1,5 mL comme suit: i) Tampon + ADN + Eau; ii) Tampon + ADN + MgCl2 + ATP + Eau; iii) Tampon + ADN + MgCl2 + ATP + Protéine + Eau; iv) iii + EDTA ou ADAADiN; v) Tampon + ADN + Protéine + Eau.
7. Enregistrement de l’analyse
- Allumez le gaz et allumez le spectromètre CD.
- Allumez la lampe après 10-15 min. Allumez le bain-marie et réglez la température du support à 37 °C.
- Ouvrez le logiciel CD spectrum .
- Réglez la température à 37 °C.
- Réglez la plage de longueurs d’onde entre 180 et 300 nm.
- Réglez le temps par point sur 0,5 s.
- Définissez le numéro d’analyse sur 5.
- Cliquez sur Pro-Data Viewer, créez un nouveau fichier et renommez-le avec des détails sur l’expérience et la date.
- Gardez tous les composants de la réaction sur la glace pour éviter toute dégradation. Faites les lignes de base et les réactions, une par une, dans des tubes centrifuges et mélangez-les par pipetage. Transférer soigneusement le mélange réactionnel dans la cuvette, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
- Si vous effectuez une expérience de cours temporel, incuber les réactions à 37 ° C pendant le temps requis et prenez le scan. Ajoutez de l’EDTA au tampon contenant l’ADN, l’ATP, le Mg+2 et la protéine pour arrêter l’hydrolyse de l’ATP.
- Augmenter la concentration d’EDTA et son temps d’incubation pour inhiber complètement l’activité de l’ATPase.
- Soustrayez les lignes de base des réactions correspondantes dans le logiciel (p. ex., soustrayez la réaction 1 de la ligne de base 1). Lissez les données soit dans le logiciel de spectre de CD, soit dans le logiciel de traçage de données. Tracez les données dans le logiciel de traçage des données.
REMARQUE: En soustrayant les lignes de base des réactions correspondantes, on obtiendra les spectres CD nets de l’ADN uniquement.
8. Analyse et interprétation des données
- Utilisez la formule donnée par eq (2) pour convertir les valeurs obtenues en millidégrès en ellipticité des résidus.
(2)
Ici, S est le signal CD en millidères, c est la concentration d’ADN en mg/mL, mRw est la masse moyenne des résidus et l est la longueur du chemin en cm. - Tracez un graphique par rapport à la longueur d’onde et à l’ellipticité moyenne des résidus à l’aide du logiciel de traçage des données et analysez les pics.
- Pour tracer le graphique, sélectionnez l’ellipticité moyenne des résidus sur l’axe Y et la longueur d’onde sur l’axe X et tracez un graphique en ligne droite.
REMARQUE: Ce graphique fournira les pics caractéristiques de différentes formes d’ADN. Les formes d’ADN correspondant aux pics peuvent être identifiées à l’aide de la littérature existante6.
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Representative Results
ADAAD stabilise une structure en forme de boucle de tige sur le promoteur MYC
Des preuves expérimentales antérieures ont montré que SMARCAL1 est un régulateur négatif de MYC29. L’analyse de la région promotrice de 159 pb de long du gène MYC par le cartographe QGRS a montré que le brin avant avait le potentiel de former un G-quadruplex (tableau 2). Mfold a montré que les deux brins de l’ADN MYC pouvaient former une structure en forme de boucle de tige (tableau 2). Une séquence d’ADN de 34 bp de long contenant le G-quadruplex (GECE) a été synthétisée. Les structures Mfold de la séquence avant et arrière de l’oligonucléotide GECE sont représentées à la figure 1A,B.
Les tests ATPase utilisant 6X His-ADAAD ont montré que le GECE refroidi rapidement était un meilleur effecteur que les formes natives et refroidies lentement. Par conséquent, le GECE à refroidissement rapide a été utilisé pour enregistrer les spectres CD en l’absence et en présence d’ATP et d’ADAAD. Les spectres CD ont montré que l’ADAAD induit deux pics positifs, l’un à 258 nm avec une épaule à 269 nm et un pic plus important à 210 nm dans l’ADN (Figure 1C). Un creux vers le négatif autour de 240 nm a également été observé. Ce spectre était similaire à celui obtenu lorsqu’un ADN synthétique de la boucle de la tige, l’effecteur optimal de l’ADAAD, était incubé avec la protéine et l’ATP (Figure 2A, B). L’ADN triplex peut donner un spectre similaire37, ce qui conduit à l’hypothèse que la protéine pourrait induire une telle structure dans ce cas. L’ATP forme un complexe de coordination avec Mg+2, et ce cation est essentiel pour l’hydrolyse de l’ATP. L’ajout de chélates d’EDTA Mg+2, conduisant à l’inhibition de l’hydrolyse de l’ATP38. Par conséquent, l’EDTA a été ajouté au mélange réactionnel pour comprendre si l’hydrolyse de l’ATP par ADAAD était importante pour le changement conformationnel. L’ajout d’EDTA à la réaction abroge cette conformation. Les spectres CD ont maintenant un pic négatif de 210 nm et une large bande positive avec des pics à 230 et 250 nm (Figure 1C).
L’importance de l’activité de l’ATPase a également été confirmée à l’aide d’un mutant mort en ATPase de l’ADAAD. La mutation K241A se produit dans la boîte GKT conservée du motif I, et il a été démontré précédemment que ce mutant n’avait pas la capacité d’hydrolyser l’ATP en présence d’ADN31. La protéine mutante a été exprimée avec une étiquette GST et purifiée par chromatographie d’affinité avec le glutathion. Le changement conformationnel induit dans l’ADN MYC par ce mutant était différent de celui induit par l’ADAAD de type sauvage. Le spectre CD de l’ADN MYC en présence de la protéine mutante possédait un pic positif de 210 nm et un pic négatif de 260 nm (Figure 1D).
ADAAD induit une forme A de conformation dans le promoteur DROSHA
Les régions promotrices de DROSHA, DGCR8 et DICER ont également été analysées par le cartographe QGRS et le logiciel Mfold. QGRS et MFold ont montré que les régions promotrices possèdent le potentiel de former des structures G-quadruplex et des structures en forme de tige (tableau 2). Les structures Mfold des oligonucléotides avant et arrière sont représentées à la figure 3A,B. L’activité de l’ATPase a montré que l’ADN natif et refroidi thermiquement se comportait de la même manière. Par conséquent, la forme refroidie lentement de ces séquences d’ADN a été utilisée pour les études sur la MC. Les spectres CD ont montré que l’ADAAD induit un pic négatif à 210 nm et un pic positif à 260 nm dans le promoteur DROSHA (Figure 3C). Ce spectre est une caractéristique de l’ADN-A6.
ADAAD induit la transition B-X et la formation de G-quadruplex dans le promoteur DGCR8
Les structures Mfold des brins avant et arrière des oligonucléotides utilisés sont représentées à la figure 4A,B. Un pic positif à 210 nm et un large pic négatif à 260 nm ont été observés pour la paire DGCR8 1 (Figure 4C). Ce spectre est caractéristique de la transition B-X6. Les structures Mfold des brins avant et arrière des oligonucléotides utilisés sont illustrées à la figure 4D,E. Les spectres CD de la paire DGCR8 7 ont montré un fort pic positif à 210 et 270 nm et un pic négatif à 250 nm (Figure 4F). Ce spectre est caractéristique des structures parallèles de l’ADN G-quadruplex6.
ADAAD induit une transition A-X dans le promoteur DICER
Les structures Mfold des oligonucléotides avant et arrière sont illustrées à la figure 5A,B. Un pic positif à 210 nm et deux pics négatifs - l’un à 230 nm et l’autre à 260 nm crête - ont été observés pour la paire DICER 1 (Figure 5C). Ces pics sont caractéristiques de la transition de l’ADN A-X6,9. Tous les pics du spectre CD et les formes d’ADN ayant des rôles spécifiques dans le processus de transcription ont été résumés dans le tableau 3.
Figure 1 : L’ADAAD modifie la conformation de l’ADN GECE. Les structures Mfold ont été prédites pour le brin avant (A) et le brin inverse (B). (C) Spectres CD de GECE seul (noir), GECE incubé avec ATP et ADAAD avant (rouge) et après ajout d’EDTA (bleu). (D) Spectres CD du GECE incubés avec l’ADAAD marqué à l’ATP et à la TPS avant (noir) et après l’ajout de l’EDTA (rouge) ainsi que les spectres CD du GECE incubés avec l’ATP et le mutant K241A marqué gST (bleu). Ce chiffre a été modifié par rapport à 29. Abréviations : ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dichroïsme circulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’ADAAD modifie la conformation de l’ADNd. (A) Structure Mfold prédite pour l’ADN de la boucle de la tige. (B) Spectres CD de slDNA seul (noir), slDNA incubé avec ATP et ADAAD (rouge). Ce chiffre a été modifié à partir de29. Abréviations : ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; aDNnc = ADN de la boucle de la tige; CD = dichroïsme circulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : ADAAD modifie la conformation de l’ADN de la paire DROSHA 5. Structure Mfold prévue pour le brin avant (A) et le brin inverse (B). (C) Spectres CD de l’ADN de la paire DROSHA 5 seul (noir), de l’ADN de la paire DROSHA 5 incubé avec de l’ATP et de l’ADAAD (rouge). Ce chiffre a été modifié à partir de28. Abréviations : ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dichroïsme circulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’ADAAD modifie la conformation de l’ADN des paires DGCR8 1 et 7. Structures Mfold prédites pour le brin avant (A) et le brin inverse (B) de l’oligonucléotide DGCR8 paire 1. (C) Spectres CD de DGCR8 paire 1 seule (noir), DGCR8 paire 1 incubée avec ATP et ADAAD (rouge). Structures Mfold prédites pour le brin avant (D) et le brin inverse (E) de l’oligonucléotide DGCR8 paire 7. (F) Spectres CD de DGCR8 paire 7 seule (noir), DGCR8 paire 7 incubée avec ATP et ADAAD (rouge). Ce chiffre a été modifié à partir de28. Abréviations : ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dichroïsme circulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L’ADAAD modifie la conformation de l’ADN de la paire DICER 1. Structure Mfold prédite pour le brin avant (A) et le brin inverse (B) de l’oligonucléotide DICER pair 1. (C) Spectres CD de la paire DICER 1 seule (noir), de la paire DICER 1 incubée avec de l’ATP et de l’ADAAD (rouge). Ce chiffre a été modifié à partir de28. Abréviations : ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dichroïsme circulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| 5x tampon REG | |
| Composant | Concentration de travail |
| Lactate déshydrogénase (LDH) | 50 unités/mL |
| Acétate de magnésium (Mg(OAc)2) | 30 mM |
| Phosphoénolpyruvate (PPE) | 6,8 mg/mL |
| Acétate de pottasium (KOAc) | 300 mM |
| Pyruvate kinase (PK) | 50 unités/mL |
| Acétate de Tris (Tris-OAc) | 125 mM |
| β-mercaptoéthanol (β-ME) | 25 mM |
Tableau 1 : Composants de la mémoire tampon.
| Oligonucléotides | Séquence avant | ΔG (m-Fold) Kcal/mol | G-score (mappeur QGRS) | Séquence inverse | ΔG kcal/mol (prédiction Mfold) | G-score (mappeur QGRS) | |||
| aDNs sl | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| DROSHA Paire 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 Paire 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG GCCCACGGGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 Paire 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| Paire DICER 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tableau 2 : Séquences d’oligonucléotides. Toutes les séquences sont dans le sens 5'-3'. Abréviations : slDNA = ADN de la boucle de la tige.
| Oligonucléotides | CD Spectra Peaks en nm (après incubation avec ATP et ADAAD) | Forme de l’ADN | Rôle dans la transcription |
| aDNs sl | +215, +250, +272 | Triplex | Répression |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | Triplex | Répression |
| DROSHA Paire 5 | -210, +260 | ADN-A | Initiation/Activation |
| DGCR8 Paire 1 | +210,-260 | B-X Transition | Superenroulage/activation positif |
| DGCR8 Paire 7 | +210, -250, +270 | G-quadruplex | Activation |
| Paire DICER 1 | +210, -230, -257 | A-X Transition | Superenroulage/activation positif |
Tableau 3 : Pic des spectres CD correspondant à différentes formes d’ADN avec leur rôle dans la transcription. Abréviations : ADAAD = Active DNA-dependent ATPase A Domain; CD = dichroïsme circulaire.
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Discussion
Le but de cet article est d’introduire la technique de spectroscopie CD comme une approche pour étudier les changements conformationnels se produisant dans l’ADN en présence de protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP et de lier ces changements conformationnels à l’expression des gènes. La spectroscopie CD fournit une méthode rapide et facilement accessible pour étudier les changements conformationnels dans l’ADN.
Un point crucial à considérer pour cette technique est la pureté de l’ADN et des protéines. Il est conseillé de s’assurer que l’ADN et les protéines sont purs à >95%. Les oligonucléotides purifiés page doivent être utilisés dans le dosage, et la protéine doit être de préférence purifiée par affinité à >95% de pureté. L’autre paramètre critique est que la cuvette doit être propre de sorte que la lecture de base ne dépasse pas 1 mdeg. Les tampons doivent être fabriqués à l’aide d’eau autoclavée et la lecture de base du tampon ne doit pas dépasser 1 mdeg. Pour étudier la conformation du promoteur, il est essentiel d’identifier les régions où la protéine se lie. Par conséquent, il est conseillé d’effectuer des expériences ChIP en utilisant la protéine d’intérêt car ce processus permet d’identifier les séquences d’ADN présentes dans la région promotrice du gène effecteur lié par la protéine. Une fois la région identifiée, la capacité de la séquence à adopter des structures spécifiques peut être analysée à l’aide des outils bioinformatiques disponibles. Ceci est important car les amorces ChIP mesurent généralement 200 pb de long et peuvent avoir plusieurs conformations. Par conséquent, l’utilisation d’outils bioinformatiques pour identifier les structures aiderait à raccourcir la longueur de l’oligonucléotide à une structure.
Enfin, si la protéine d’intérêt est une protéine de remodelage de la chromatine dépendante de l’ATP, la capacité des oligonucléotides à agir comme effecteur doit être vérifiée à l’aide de tests ATPase. Dans les tests de spectroscopie CD et d’ATPase, il faut veiller à ce que des concentrations saturées de ligands soient utilisées dans la réaction. Si possible, la constante de dissociation (Kd) pour l’interaction protéine-ligand doit être calculée avant de procéder à la spectroscopie CD. De nombreuses méthodes sont disponibles pour calculer le paramètre de liaison. En utilisant des tests ATPase, la constante de Michaelis-Menten (KM) peut être calculée en titrant des concentrations croissantes d’ADN. Le KM, dans de nombreux cas, peut être approximé à la constante de liaison. Si la protéine est fluorescente, les constantes de liaison peuvent être calculées à l’aide de la spectroscopie de fluorescence. Si aucune de ces techniques n’est réalisable, le test de changement de mobilité par électrophorèse (EMSA) peut être utilisé.
Le principal problème de la spectroscopie CD survient lorsque les cuvettes ne sont pas nettoyées ou lorsque les réactifs sont impurs. Si la ligne de base est trop élevée, il est conseillé de nettoyer les cuvettes. De nombreuses solutions de nettoyage de cuvettes sont disponibles. Placer les cuvettes dans une solution acide diluée pendant 16-24 h aide également à nettoyer la cuvette. Il est conseillé d’acheter des réactifs purs à >95% et d’utiliser de l’eau double distillée et autoclavée. La dérive de base est un autre problème potentiel. Si vous faites une expérience à long terme, il est conseillé de vérifier périodiquement la ligne de base. Les pics d’ADN lors de l’étude des interactions protéine-ADN peuvent ne pas correspondre exactement aux pics/bandes obtenus avec l’ADN seul. Les pics protéiques sont généralement observés dans la gamme Far UV entre 190 et 230 nm. Par conséquent, les pics inférieurs à 250 nm peuvent avoir des interférences du pic protéique et peuvent ne pas fournir d’informations fiables. L’ADN peut adopter une variété de conformations non-B en fonction de la séquence. Plus la séquence d’ADN est longue, plus le risque de coexistence de multiples conformations dans l’oligonucléotide d’ADN est élevé. Cela peut rendre l’analyse difficile. Par conséquent, il est conseillé d’utiliser des oligonucléotides plus courts correspondant aux structures potentielles prédites par les outils bioinformatiques.
L’autre inconvénient majeur de la spectroscopie CD est qu’elle ne permet pas l’analyse de la structure au niveau atomique et que le spectre obtenu est insuffisant pour identifier la seule structure viable. Par exemple, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN des protéines fournissent des données de résolution atomique, tandis que la spectroscopie CD fournit des informations structurelles moins détaillées. Cependant, la spectroscopie CD est une approche rapide qui ne nécessite pas de grandes quantités de protéines ou un traitement considérable des données. Par conséquent, la MC peut être utilisée pour étudier un large éventail de variables de solvant telles que la température, le pH, la salinité et la présence de divers cofacteurs. Il peut également être utilisé pour surveiller les changements structurels (dus à la formation complexe, au repliement / dépliage, à la dénaturation due à la température, aux dénaturants et aux changements dans la séquence / mutation des acides aminés) dans les systèmes dynamiques. En le connectant à l’appareil d’arrêt-écoulement, il peut également être utilisé pour étudier la cinétique des interactions protéine/ADN-ligand.
Les conformateurs d’ADN bien caractérisés comprennent l’ADN A / B / Z, le triplex, l’épingle à cheveux et les quadruplex G. Toutes ces formes d’ADN sont associées à une conformation ouverte de l’ADN, c’est-à-dire à un ADN déroulé qui sert de puits pour le superenroulage négatif. La transcription est associée à un superenroulage négatif car la formation d’un complexe ouvert est une condition préalable au mouvement de l’ARN polymérase. Par conséquent, la transcription de la plupart des gènes implique une augmentation du superenroulage négatif dans la région promotrice. Des études ont montré que le déploiement des nucléosomes conduit à la conformation de l’ADN-A, qui est cependant instable39. Une possibilité est que la protéine d’intérêt, par exemple SMARCAL1, se lie à de telles structures et les stabilise, facilitant ainsi la transcription, comme on le voit dans le cas des promoteurs DROSHA . Le quadruplex guanine est basé sur des tétrades de guanine liées par des liaisons hydrogène Hoogsteen. L’analyse in silico a confirmé que les séquences formant G4 sont notablement enrichies proximales aux promoteurs de gènes et aux sites de début de transcription. Ces séquences G4 peuvent à la fois activer et réprimer la transcription.
Dans le cas du promoteur MYC40, la formation de G-quadruplex agit comme un répresseur, tandis que dans le cas du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain (VEGF), la structure G-quadruplex fonctionne comme un site d’amarrage pour les facteurs de transcription41, activant ainsi l’expression de ce gène. Dans le cas de SMARCAL1, la structure G-quadruplex a été observée lorsque ADAAD interagissait avec les séquences promotrices de la paire DGCR8 7. Comme l’occupation de SMARCAL1 et RNAPII a augmenté sur cette paire d’amorces, on suppose que la formation de G-quadruplex, dans ce cas, est en corrélation avec l’activation de la transcription de ce gène. L’ADN peut également être positivement superenroulé, et la progression de l’ARN polymérase est connue pour générer un superenroulage positif devant elle. Ce superenroulage généré par transcription (+) peut perturber ou éliminer les protéines de barrage routier, déstabilisant les structures nucléosomes pour rendre l’ADN plus accessible à l’ARN polymérase. L’ADN-X est une conformation de l’ADN qui agit comme des puits pour un superenroulage positif. La caractéristique frappante d’un ADN-X est qu’il peut se former d’une manière spécifique à la séquence sur le promoteur d’un gène. Dans le cas de SMARCAL1, ADAAD a induit des transitions A-X et B-X de manière dépendante de l’ATP dans les promoteurs DICER et DGCR8, respectivement. Combiné avec des données in vivo où une augmentation de l’occupation de SMARCAL1 et RNAPII a été trouvée sur ces promoteurs en présence de dommages à l’ADN induits par la doxorubicine, on peut émettre l’hypothèse que la formation d’ADN X facilite la transcription en supprimant les barrières / blocs. Les hélices triples d’ADN n’ont pas de spectre caractéristique. Les spectres CD des séquences d’ADN présentes dans le promoteur MYC et l’ADN synthétique de la boucle de la tige ont montré deux pics positifs, l’un à 258 nm avec une épaule à 269 nm et un pic plus grand à 210 nm dans l’ADN. Ce type de spectre peut être obtenu dans le cas des triplex37. Les triplex sont difficiles à dérouler et, par conséquent, sont connus pour bloquer la transcription42. Par conséquent, on suppose que la formation de cette structure dans le promoteur c-MYC par SMARCAL1 conduit à la répression de la transcription.
Il convient de noter que l’ATP se lie également aux protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP. L’arginine conservée présente dans le motif VI du domaine hélicase de ces protéines interagit via des interactions électrostatiques avec le γ-phosphate de la protéine43. Dans le cas de l’ADAAD, le Kd de l’interaction protéine-ATP est (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. La liaison de l’ATP induit un changement conformationnel dans la protéine tel que l’affinité de l’ADN augmente. La liaison de l’ADN induit également un changement de conformation dans la protéine conduisant à une affinité 10 fois supérieure pour l’ATP31. Par exemple, dans le cas de l’ADAAD, des bandes/pics sont observés à -212 nm et -222 nm. L’ATP donne également des bandes à 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm et -270 nm. Ceux-ci doivent être soustraits des spectres d’ADN + ADAAD + ATP pour obtenir la conformation « nette » de l’ADN en présence des ligands.
Ainsi, cet article montre la commodité de la spectroscopie CD pour l’étude des changements conformationnels se produisant dans l’ADN en présence de protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP. La corrélation des changements dans la conformation de l’ADN avec les données ChIP peut fournir aux chercheurs des informations sur la façon dont les conformateurs d’ADN activent / répriment la transcription.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier l’Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, pour le spectrophotomètre CD. V.J. et A.D. ont été soutenus par une bourse du CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
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