Summary
이 프로토콜은 탈세포화된 정밀 절단된 폐 조각을 폐포 상피 유형 2 세포, 섬유아세포 및 내피 세포로 재채움으로써 재현 가능한 소규모 조작된 폐 조직을 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
천연 폐포 ex 생체의 건축 및 세포 복잡성을 재조정하는 개선된 3차원(3D) 폐 모델에 대한 필요성이 존재한다. 최근에 개발된 오가노이드 모델은 시험관 내에서 폐 상피 전구물질의 확장 및 연구를 촉진시켰지만, 이들 플랫폼은 전형적으로 마우스 종양 유래 매트릭스 및/또는 혈청에 의존하고, 단지 하나 또는 두 개의 세포 혈통을 통합한다. 여기에서, 우리는 탈세포화 정밀 절단 폐 절편 (PCLS)의 다중 계보 재세포화에 기초하여 조작된 폐 조직 (ELTs)을 생성하기 위한 프로토콜을 설명한다. ELT는 폐포 상피, 중간엽 및 내피를 포함하는 폐포 유사 구조를 함유하며, 이는 천연 폐와 매우 유사한 세포외 매트릭스(ECM) 기질 내에 있습니다. 조직을 생성하기 위해 쥐 폐는 아가로스로 팽창되고, 450 μm 두께의 조각으로 슬라이스되고, 스트립으로 절단되고, 탈세포화된다. 이어서, 생성된 무세포 ECM 스캐폴드를 일차 내피 세포, 섬유아세포, 및 폐포 상피 유형 2 세포(AEC2s)로 재시딩한다. AEC2s는 무혈청, 화학적으로 정의된 성장 배지로 적어도 7일 동안 ELT 배양물에서 유지될 수 있다. 조직 준비 및 배양 과정 전반에 걸쳐, 슬라이스는 카세트 시스템으로 클리핑되어 여러 ELT의 처리 및 표준화된 세포 시딩을 병렬로 용이하게 합니다. 이 ELT는 AEC2 및 그 틈새 시장을 조절하는 생화학 적 신호뿐만 아니라 폐포 내의 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용에 대한 조사를 용이하게해야하는 유기형 배양 플랫폼을 나타냅니다.
Introduction
폐포는 원위 폐의 기능 단위로, 폐포 상피 유형 1 세포 (AEC1s) 및 유형 2 세포 (AEC2s)에 의해 줄 지어있는 가스 교환 공극의 메쉬 워크를 포함한다. 상피의 기저에는 모세혈관의 조밀한 네트워크뿐만 아니라 중간엽을 지지하며, 이 섬세한 공기 주머니1에 강도와 유연성을 모두 제공하는 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드에 의해 엉덩이가 됩니다. 폐포는 또한 특발성 폐 섬유증2, 급성 호흡 곤란 증후군3 및 심각한 코로나 바이러스 질병 -19 (COVID-19)4를 포함한 수많은 폐 병리에서 부상 부위입니다. 지난 십 년 동안의 연구가 폐 상피 내에서 현저한 가소성을 밝혀냈지만, 일부 환경에서 원위 폐 복구를 가능하게 하는 메커니즘 - 그리고 다른 환경에서의 복구를 배제하는 메커니즘 - 은 여전히 강렬한 조사의 영역으로 남아 있습니다5. 폐포를 모델링하기 위해 개선 된 시험관 내 플랫폼의 개발은 폐포 생물학, 재생 및 치료제에 대한 연구를 촉진 할 것입니다.
AEC2s는 자가-갱신되고 AEC1s로 분화되며, 따라서 원위 폐6,7,8의 일차 줄기 세포로 간주된다. 그러나, 이들 세포는 표현형9의 손실 없이 일차 AEC2s를 배양하는 것과 관련된 어려움을 감안할 때 시험관내 연구에 특별한 도전을 제기한다. 종래의 2차원(2D) 배양에서, AEC2는 AEC1-유사 세포(10)의 일부 특징을 평탄화하고 채택한다. 대조적으로, 가장 일반적으로 오가노이드인 3D 배양 전략은 일차 AEC2s6,11,12에서 분화된 기능의 유지를 지원하고 다능성 줄기 세포(PSC) 유래 AEC2s13,14의 장기 배양을 허용한다. 오가노이드는 원위 폐 발달 15, 바이러스 감염11,15 및 AEC2 관련 유전 질환13,16,17을 모델링하는 데 사용되어 AEC2 생물학 및 재생에 대한 중요한 통찰력을 가능하게합니다. 그러나, 이들 배양 모델은 전형적으로 단지 하나 또는 두 개의 세포 계보를 포함하고, 천연 폐포의 아키텍처 또는 ECM 기질 중 어느 하나를 재검토하지 못하는 겔형 매트릭스에 세포를 내장한다.
ECM은 분자적, 지형적, 기계적 단서를 통한 세포 표현형 및 행동의 중요한 조절자입니다. 줄기 세포 운명을 조절하는 조직 특이적 틈새 시장의 핵심 구성 요소를 포함; 국 부적으로 분비된 성장 인자18,19,20,21의 이용가능성을 조절하는 저수지 역할을 한다. 따라서 천연 ECM 상에서 세포를 배양하는 것은 생체내 조직의 생물학을 모델링하기 위해 시험관내 시스템의 예측 능력을 증가시킬 수 있다. 탈세포화, 세제, 효소 또는 물리적 또는 기타 방법을 통해 조직에서 세포 물질을 제거하는 과정으로,22,23을 신중하게 수행 할 때 천연 기관의 ECM 스캐 폴딩을 상당 부분 보존 할 수 있습니다. 이러한 스캐폴드는 3D 생체모방 배양을 위해 세포로 재채워질 수 있다. 그러나, 탈세포화 스캐폴드는 조직 공학 응용에 널리 사용되지만, 일상적인 세포 배양을 위한 이들의 사용은 제한되었다. 몇몇 이전의 연구들은 폐 절편 또는 작은 폐 조직 세그먼트의 탈세포화 및 재세포화를 보고하였다. 개념 증명 연구 24,25,26 외에도, 재채워진 폐 조각은 섬유아세포-매트릭스 접착력 27,28을 연구하고 섬유아세포 표현형 27,29에 대한 병든 폐 매트릭스의 효과를 조사하기 위해 사용되었다. 정밀 절단 조직 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 향상된 기술을 통해 탈세포 폐 조각은 폐포, 기도 및 혈관 하부 구조를 보존하면서 세포를 배양하는 편리하고 작은 규모의 플랫폼을 제공 할 수 있습니다. 여러 세포 유형을 통합하면 생리적으로 관련된 3D 환경 내에서 세포 - 세포 상호 작용에 대한 연구가 가능합니다. 그러나, 배양 과정 전반에 걸쳐 조직의 취급을 용이하게 하고, 알려진 수의 세포를 갖는 조직의 제어되고 재현가능한 시딩을 보장하기 위해서는 개선된 전략이 필요하다.
여기에서는 탈세포화 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)을 일차 내피 세포, AEC2s 및 섬유 아세포로 재채움으로써 조작 폐 조직 (ELT)을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 앞서 기술한 조작된 심장 조직 시스템(30) 및 전체 폐 탈세포화-재세포화 전략(22,31)의 적응에서, 우리는 쥐 폐로부터 PCLS를 절단하고 절편을 재사용 가능한 조직 배양 카세트로 클리핑하여 하류 조작을 단순화하고 표준화하는 절차를 기술한다. 잘린 슬라이스는 탈세포화되어 무세포 ECM 스캐폴드를 형성하며, 이는 맞춤형 시딩 욕조에 다시 채워집니다. 폐 슬라이스 스캐폴드는 중요한 ECM 구성 요소 및 아키텍처를 보존하고 최소 7일 동안 다중 계통 폐포 유사 구조 내에서 AEC2의 성장을 지원합니다. ELT는 AEC2 및 폐포에 대한 기본 생물학적 연구를 촉진하면서 폐 조직 공학 전략의 개발을 지원해야하는 생리 학적 관련 3D 매트릭스 내에서 새로운 폐포 공동 배양 시스템을 나타냅니다.
Protocol
이 논문에 설명 된 모든 동물 실험 절차는 Yale Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 조직 배양 카세트 및 시딩 목욕탕 만들기
참고: 일단 만들어지면, 조직 배양 카세트와 시딩 욕조는 오토클레이브되어 ELT 배양의 반복 라운드에 재사용될 수 있습니다.
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조직 문화 카세트
- 레이저 커터를 사용하여 조직 배양 카세트 프레임과 클립을 보충 파일 1 및 보충 파일 2에 제공된 설계에 따라 3/ 32인치 두께의 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)에서 잘라냅니다. 레이저 커터를 사용하여 보충 파일 3에 따라 1/16인치 두께의 PTFE에서 조직 배양 카세트 탭을 절단합니다. 컷 윤곽선은 80% 전력과 15% 속도(30W 레이저 커터의 경우)를 사용합니다.
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씨뿌리기 목욕
- 시딩 목욕탕 CAD 파일(보충 파일 4 및 보충 파일 5)을 사용하여 클리어 레진을 사용하여 각각 시딩 목욕 몰드의 베이스와 링을 3D 프린팅합니다.
- PDMS 방출을 돕기 위해 사용하기 전에 증류수에 10% 폴록사머 407의 용액에 주형을 밤새 담그십시오. 공기를 건조시킨 다음 링을 금형의 바닥 위에 끼우고 유연한 플라스틱 필름으로 감싸서 누출을 방지하십시오.
- PDMS 엘라스토머를 경화제와 10:1 비율로 혼합하여 폴리디메틸실록산(PDMS)의 몰드당 최소 60g을 준비하고, 3D 프린트된 몰드에 부어준다. PDMS를 진공 데시케이터에서 30분 동안 탈기시켜 임의의 기포를 제거하였다.
- 시딩 욕조를 60°C에서 8시간 동안 굽는다.
2. 쥐 폐에서 정밀 절단 폐 조각의 제조
- 오르간 수확
- 그림 1에 그림과 같이 중력 및 펌프 구동 팔다리를 포함하는 분할 관류 시스템을 준비합니다. 1/2인치 길이의 LS 14 실리콘 튜브에 부착된 1/16인치 철조망 Y 커넥터와 3/32인치 암 루어-락 커넥터로 구성된 폐동맥(PA) 캐뉼라를 튜브 끝에 연결합니다( 그림 1 참조). 이때 캐뉼라에 체크 밸브를 부착하지 마십시오.
- 항응고 및 혈관 확장을 위해 각각 100 U/mL 헤파린 및 0.01 mg/mL 니트로프로시드 나트륨(SNP)을 함유하는 PBS로 라인을 프라임한다. 관류 펌프를 30 mL/분으로 미리 설정하십시오.
참고: 헤파린 용액에 신선한 SNP를 넣고 빛으로부터 보호하십시오. - 성인 (8-12 주령, 약 300-350 g) Sprague-Dawley 쥐에게 항응고를 위해 400 U / kg 헤파린을 복강 내 (IP) 주사 한 다음 마취를 위해 케타민 (75 mg / kg) 및 자일라진 (5 mg / kg)의 IP 주사를 투여하십시오. 유해한 자극 (발가락 꼬집음)에 대한 반응 부족을 통해 마취의 수술 평면을 확인하십시오.
- 머리카락 깎기를 사용하여 모피의 가슴과 복부를 다듬습니다. 그런 다음 70 % 에탄올로 스프레이하고 10 % 포비돈 요오드로 3x를 닦으십시오.
- 쥐 치아 집게로 횡격막 수준 아래의 피부를 잡으십시오. 그런 다음 미세한 뾰족한 가위로 피부에 1/2 인치 횡단 절개를하십시오. 포셉으로 노출 된 복부 근막을 잡고 근막에서 1/2 인치 횡방향 절개를 한 다음 상복부 너비를 가로 질러 피부와 근막을 통해 절개를 확장하십시오.
- 미세한 가위의 끝을 사용하여 전방 횡격막의 중앙에 작은 절개 (1/8 인치 이하)를 만들어 폐가 흉부에서 수축되도록하십시오. 횡격막의 절개를 가슴의 전체 너비에 걸쳐 연장하십시오.
- 흉곽의 전체 높이를 통해 목을 향해 두 개의 수직 절개를하고 폐가 손상되지 않도록주의하십시오. 왼쪽 갈비뼈를 통해 절개를 연장하여 쇄골을 자르고 목의 측면을 따라 후두 수준까지 잘라 기관을 노출시킵니다.
- 주변 결합 조직과 식도에서 벗어난 기관을 해부하십시오. 후두에 가까운 두 연골 고리 사이의 기관지의 전방 절반을 가로 질러 횡단 절개를하십시오. 절개 수준 아래에있는 기관 뒤에 4-0 폴리 프로필렌 봉합사를 실을 꿰매고 외과 의사의 매듭의 전반부를 두 개의 비틀기로 느슨하게 미리 묶습니다.
- 단방향 체크 밸브에 연결된 1/16인치 철조망 Y-커넥터와 3/32인치 암 루어락 커넥터가 있는 1/2인치 길이의 LS 14 실리콘 튜브( 그림 1 참조)로 구성된 캐뉼라를 Y 커넥터의 한쪽 사지를 폐 방향으로 기관 절개에 삽입하여 기관 내로 놓습니다.
- 삽입된 캐뉼라의 수준에서 기관 주위에 미리 묶인 봉합사 루프를 배치하고 삽입된 Y 커넥터 주위를 조여서 캐뉼라를 제자리에 고정시킵니다. 봉합사의 두 개의 단일 트위스트 던지기를 추가하여 매듭을 완성하십시오.
- 10 mL 주사기를 공기로 채우고 기관 캐뉼라의 루어 잠금 장치에 연결하십시오.
- 곡선 지혈제를 사용하여 횡격막에 가까운 열등한 정맥 카바를 클램프 한 다음 우심실 (RV)을 통해 150 U 헤파린 (1000 U / mL)으로 심장을 주입하십시오.
- 중력 라인 스톱콕을 부분적으로 열어서, 단계 2.1.1에서 제조된 PA 캐뉼라로부터 PBS/헤파린/SNP의 느리지만 꾸준한 드립을 생성한다.
- 4-0 폴리프로필렌 봉합사의 바늘을 RV를 빠져나가는 PA 기저부 뒤에 끼우십시오. 외과 의사의 매듭의 전반부를 사용하여 느슨한 봉합사 루프를 PA 기저부 주위에 미리 묶으십시오.
- 미세한 가위를 사용하여 RV의 바로 아래 및 PA에 수직인 작은 절개 (1/8 인치 이하)를 만든 다음 PA 캐뉼라 Y 커넥터의 한쪽 다리를 PA의 바닥에 삽입하십시오. 봉합사를 PA와 삽입된 커넥터 주위에 고정하고 단일 트위스트 던지기를 추가하여 외과의의 매듭을 완성합니다.
참고: 흐름 하에서 PA를 캐닝하면 폐의 적절한 제거를 배제할 수 있는 혈관구조로 기포가 유입되는 것을 방지할 수 있습니다. - PA 카테터 Y 커넥터의 다른 쪽 끝에 단방향 밸브를 부착 한 다음 심장의 정점을 차단하여 좌심실을 통한 혈류 유출을 허용합니다.
참고: 펌프를 통해 관류하기 전에 심장의 정점을 차단하지 않으면 혈액 가스 장벽이 손상되어 유체가 영공으로 누출 될 수 있습니다. - 두 라인을 연결하는 스톱콕을 사용하여 관류 라인을 펌프 측으로 전환 한 다음 30 mL / min에서 펌프를 켭니다. PA를 통해 폐를 관류하는 동안 약 10-15 회 호흡 / 분에서 10 mL 기관 주사기를 통해 폐를 수동으로 환기시켜 혈액의 폐를 쉽게 맑게하십시오. 폐가 대부분 흰색으로 변할 때까지 폐를 관류하며, 보통 40mL의 PBS/헤파린/SNP 이하가 필요합니다.
참고: 혈액의 폐를 부적절하게 제거하면 하류 탈세포화가 손상될 수 있습니다. - 기관 캐뉼라의 바로 위 기관지를 잘라 낸 다음 폐와 심장을 나머지 모든 결합 조직으로부터 해부하고 폐와 심장 엔 블록에서 추출하십시오.
- 페놀 레드가 없는 행크의 균형된 염 용액(HBSS)에 2% 저융점 아가로오스로 10 mL 주사기를 채우고, 42°C로 예열하였다.
참고: 필요한 아가로스의 정확한 부피는 폐 크기에 따라 다릅니다. 더 큰 폐 (즉, 400g보다 큰 래트로부터)는 10mL 이상의 아가로스를 필요로 할 것이다. - 추출된 폐를 기관 캐뉼라를 통해 10mL의 공기(즉, 대략 총 폐 용량까지)로 3배 수동으로 팽창시켜 붕괴된 실질종을 모집하는 데 도움을 준다.
- 폐 엽의 가장 원위 끝이 팽창 될 때까지 기관 캐뉼라를 통해 수동으로 아가로스를 약 40 mL / min의 속도로 주입하여 준비된 아가로스의 주사기로 즉시 폐를 팽창시킵니다. 폐의 원위 영역이 붕괴 된 채로 남아 있으면 추가로 1-2 mL의 아가로스를 주입하십시오.
- 4 방향 스톱콕의 흰색 캡을 기관 캐뉼라의 여성 루어 잠금 장치에 부착하여 기관을 캡핑하십시오. 폐를 얼음 위의 150mm 페트리 접시에 넣어 아가로스가 응고되도록 합니다.
참고 : 추출 직후 폐의 팽창은 폐 실질의 균일 한 충전과 성공적인 조직 슬라이싱을 보장하는 데 중요합니다. 폐가 매우 고르지 않게 팽창하면 슬라이스 품질이 좋지 않으므로 폐 슬라이스를 진행하지 마십시오.
- 폐 슬라이싱
참고: 정확한 슬라이싱 절차는 사용 중인 진동 마이크로톰(vibratome)에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 다양한 조직 슬라이서를 사용한 PCLS 제제의 추가적인 예가 이전에 공개되었다(32,33,34).- 금속 냉각 블록을 -20°C에서 미리 냉각시키고 슬라이싱 과정 전반에 걸쳐 사용하지 않을 때는 얼음 위에 보관한다.
- 시아 노 아크릴레이트 접착제의 작은 방울을 사용하여 블레이드 홀더에 블레이드를 부착하십시오. Allen 렌치를 사용하여 블레이드 홀더를 진동기에 조심스럽게 부착하여 버퍼 트레이에 삽입된 시편 튜브의 끝과 일치하도록 합니다.
- 페놀 레드가 없는 웰당 3mL의 멸균 빙냉 HBSS로 6웰 플레이트를 준비하여 조각을 수집합니다.
- 메스를 사용하여 폐 조직 조각을 약 1-1.5cm3로 자릅니다.
참고 : 폐 조직은 왼쪽 엽의 아래쪽과 중간 부분뿐만 아니라 오른쪽 중간 및 하단 엽에서 가장 쉽게 폐포 영역을 극대화하는 더 큰 조직 조각을 산출합니다. 팽창되지 않은 조직 영역 또는 결합 조직 영역이있는 경우이 조직을 가위로 자르거나 플런저 쪽으로 아래쪽으로 향하게하십시오. 이러한 조직은 깨끗하게 자르지 않는 경향이 있습니다. - 시안 노 아크릴레이트 접착제의 작은 방울을 시편 튜브의 플런저에 놓습니다. 과도한 수분을 제거하기 위해 종이에 폐 조직을 닦은 다음 한 쌍의 포셉을 사용하여 즉시 폐 조직을 플런저 위에 놓습니다.
- 시편 튜브의 금속 튜브를 조직 상단의 수준까지 밀어 넣고 플런저가 물러난 상태에서 제자리에 고정시킵니다. 피펫은 HBSS의 2% 아가로스를 튜브 상단으로 미리 예열하여 조직을 완전히 둘러쌌습니다.
- 얼음처럼 차가운 냉각 블록을 조직 주위에 약 1분 동안 두어 아가로스가 응고될 수 있도록 한다.
- 시편 튜브를 버퍼 트레이에 삽입합니다. 트레이를 얼음처럼 차가운 PBS로 채워 조직 블록 중간쯤에 놓습니다. 모터 박스 스위치를 빨리 감기 (FF)로 돌려 모터 박스 플런저를 전진시켜 시편 튜브의 바닥에 닿을 수 있도록하십시오.
- 슬라이스 두께, 절삭 속도 및 진동 주파수(예: 두께 450μm, 속도 4 및 진동 주파수 5)에 대해 원하는 설정을 설정합니다. 연속 모드를 선택한 다음 스위치를 켜 기로 전환하여 슬라이싱을 시작합니다.
- 조직 조각이 완충 트레이에 떨어지면 접종 루프 또는 주걱을 사용하여 준비된 6-웰 플레이트로 옮깁니다.
- ~ 2mm 두께의 조직이 시편 튜브에 남아있을 때 블레이드가 손상되거나 접착제가 포함 된 조직을 절단하지 않도록 슬라이싱을 중단하십시오.
- 위의 단계를 반복하여 필요에 따라 추가 폐 조직을 슬라이스하십시오.
- 스캐폴드 제제를 위해 슬라이스를 즉시 탈세포화하거나, 스냅-동결시키고 -80°C에서 최대 2개월 동안 보관한다. 얼리려면 4-6 조각을 35mm 페트리 접시에 옮기고 슬라이스 주변에서 과도한 액체를 조심스럽게 흡인하십시오. 접시를 드라이 아이스와 100% 에탄올의 욕조에 넣고 스냅-얼린 다음, 호일로 감싸고, 비닐 봉지에 밀봉하고, -80°C로 옮긴다.
참고: 비교적 느린 동결 속도로 인해 조직을 손상시킬 수 있는 얼음 결정이 형성될 수 있으므로 신선한 조각을 -80°C 냉동고에 직접 넣지 마십시오.
3. 폐조직스캐폴드의 제조
- 재료 및 탈세포화 솔루션의 제조
- 프레임, 클립 및 탭을 오토클레이브합니다.
- 표 1에 요약된 바와 같이 탈세포화 용액을 준비한다.
참고: 벤조나스 뉴클레아제를 사용 직전에 미리 예열된 완충액에 첨가하고 멸균 필터를 사용하십시오. 탈세포화 절차의 24-48 시간 이내에 Triton X-100 및 소듐 데옥시콜레이트 (SDC) 용액을 준비하십시오. 항생제 / 항균제 용액과 벤조 나 제 완충액을 최대 30 d까지 미리 준비하고 4 °C에서 보관하십시오.
- 폐 조각 절단 및 클리핑
참고: 절단 및 클리핑은 벤치탑에서 무균으로 수행될 수 있지만, 섹션 3.3의 탈세포화 단계 및 조직 스캐폴드의 모든 후속 취급은 층류 후드에서 수행되어야 합니다.- PBS로 약 삼분의 일 정도 가득 찬 100mm 페트리 접시를 채 웁니다. 포셉을 사용하여 카세트 (각각 두 개의 클립이 포함 된 프레임)와 탭을 접시에 옮깁니다.
- 냉동 슬라이스를 사용하는 경우, 실온 PBS를 접시에 붓고 한 번에 하나의 접시를 해동시켜 슬라이스를 덮는다. 남은 접시는 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 해동 된 슬라이스를 150mm 페트리 접시로 옮깁니다. 필요한 경우 미세한 포셉을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 펼쳐 평평하게 놓은 다음 조직 주변에서 과도한 PBS를 조심스럽게 흡인하십시오.
- 눈금자를 가이드로 사용하여 칼날의 전체 길이를 접시에 단단히 대고 블레이드 가장자리를 제자리에 고정하여 좌우로 약간 흔들어서 슬라이스에서 3mm 너비의 스트립을 자릅니다. 또는 3mm 맞춤형 스페이서(예: 아세탈[폴리옥시메틸렌]로 제작됨)로 분리된 2개의 평행 블레이드로 개조된 회전 커터를 사용하여 조직 스트립을 절단합니다. 눈물, 구멍, 큰 기도나 혈관 또는 두꺼운 결합 조직을 피하십시오.
참고: 클리핑에 성공하려면 스트립의 길이가 9mm 이상이어야 합니다. - 포셉을 사용하여 조직 스트립을 준비된 100 mm 페트리 접시로 옮깁니다.
- 티슈 스트립을 카세트에 클립: 카세트 위에 티슈를 띄우고 티슈를 중앙에 배치하여 양쪽 끝의 클립에 구멍을 뚫습니다. 미세한 집게로 탭을 한쪽 끝의 구멍에 부분적으로 놓고 조직을 부드럽게 곧게 펴고 두 번째 탭을 놓습니다. 각 손에 포셉을 사용하여 각 탭을 완전히 눌러 조직을 고정시킵니다.
참고 : 클리핑 전에 조직을 제자리에 유지하는 데 어려움이있는 경우 접시에서 PBS를 흡입하여 유체 수준을 낮추십시오. 두 번째 클립을 배치 할 때 조직이 늘어나지 않도록주의하십시오.이 클립은 찢어질 수 있습니다. - 원하는 만큼 많은 조직에 대해 3.2.2-3.2.6 단계의 해동, 절단 및 클리핑 절차를 반복합니다.
- 슬라이스 탈세포화
- 모든 슬라이스가 클리핑되면 카세트가 들어있는 100mm 접시를 층류 후드로 옮깁니다.
- 탈세포화 프로토콜의 1단계 시작(표 2 참조): 곡선형 지혈제를 사용하여 각 카세트의 노치 측면을 파악하고, 웰당 PBS + 이온 + 항생제/항균제 3mL로 채워진 6웰 플레이트( 2개의 조직/웰)로 카세트를 옮깁니다( 표 1의 용액 레시피 참조).
- 웰 플레이트를 30rpm의 오비탈 쉐이커에 10분 동안 놓습니다.
- 탈세포화 프로토콜의 단계 2로 계속하십시오 ( 표 2 참조): 각 웰로부터 유체를 흡인한 다음, 3 mL/웰 PBS+ 이온으로 교체하고, 플레이트를 30 rpm의 오비탈 진탕기 상에 놓고, 5분 동안 인큐베이션한다.
- 표 2의 탈세포화 프로토콜에 설명된 대로 각 용액 및 해당 기간에 대해 3.3.4단계를 반복합니다.
- PBS+항생제/항균제로 최종 헹굼 단계 후(표 2의 단계 20), 조직을 신선한 PBS + 항생제/항균제와 함께 멸균된 6-웰 플레이트로 옮기고, 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 항생제/항균제로 멸균한 후, 폐 조직 스캐폴드를 즉시 시딩하거나 4°C에서 최대 30d까지 보관할 수 있습니다.
4. 슬라이스 재세포화 및 배양
참고: 도 2 는 조직 시딩 및 배양을 위한 제안된 타임라인을 보여주며, 여기서 슬라이스는 래트 폐 미세혈관 내피 세포와 함께 먼저 시딩되고 저혈청 내피 배지에서 배양된다; 이어서, 래트 AEC2s 및 래트 폐 섬유아세포를 무혈청 AEC2 성장 배지로 시딩하였다 (Jacob et al.13 및 You et al.35로부터 적응됨); 표 3의 결과 및 배양 배지 세부사항에 사용된 세포 공급원에 대한 추가 노트를 참조한다. 이 전략은 AEC2 단층을 포함하는 폐포와 같은 구조를 산출합니다.
- 시딩을 위한 티슈 스캐폴드 준비(-4일 또는 -3일)
- 4°C에서 저장된 조직 스캐폴드를 사용하는 경우, 시딩 전에 스캐폴드를 신선한 PBS + 항생제/항균제(10% 페니실린/스트렙토마이신, 4% 암포테리신 B, PBS 중 0.4% 겐타미신)와 함께 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 스캐폴드를 멸균 PBS (5 mL/웰)로 3x 헹구고, 각각 5분간 헹구십시오.
- 스캐폴드를 5x 배율로 위상차 현미경으로 검사하여 시딩할 조직을 선택합니다.
참고 : 파종을위한 최고의 비계에는 눈물이나 구멍이 없으며 큰기도나 혈관이 포함되어 있지 않습니다. 특징을 가진 스캐폴드가 성공적으로 시드 될 수 있지만, 재 모집 패턴은 폐포 지역에서 관찰 된 것과 다를 수 있습니다.
- 내피 세포 시딩 (Day -3)
- 혈구분석기를 사용하여 내피 세포를 계수하고, 슬라이스 당 500,000개의 내피 세포를 시드하기에 충분한 세포와 함께 5 x 10 6 cells/mL의 내피 배지 (표 3 참조)에서 내피 세포 현탁액을 준비한다 (예를 들어, 12 슬라이스의 경우, 1.2 mL 배지에6 x 106 세포를 재현탁).
- 오토클레이브 시드 욕조를 100mm 페트리 접시에 넣으십시오. 헹굼 된 스캐폴드를 거꾸로 뒤집어 씨를 뿌리는 욕조로 옮기십시오 : 미세한 곡선 지혈제를 사용하여 노치가있는 측면으로 카세트를 잡고 직선 지혈제 또는 포셉을 사용하여 카세트의 한쪽 끝을 잡고 (조직 자체를 만지지 않도록주의하십시오) 뒤집은 다음 노치가있는 측면을 따라 구멍을 통해 미세한 구부러진 지혈제의 끝으로 카세트를 다시 잡으십시오. 씨를 뿌리는 목욕탕에 잘 두십시오. 나머지 카세트에 대해 반복하십시오.
참고: 올바르게 배치하면 스캐폴드가 각 웰의 바닥에 거꾸로 중앙에 배치됩니다. 필요한 경우 지혈제 끝으로 카세트 모서리를 부드럽게 눌러 카세트가 우물에 평평하게 앉았는지 확인하십시오. 카세트의 부적절한 좌석은 가난한 조직 파종으로 이어질 수 있습니다. 웰이 소량의 PBS를 함유하는 경우 허용가능하다. - 제조된 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이 치며 혼합한 다음, 수동 피펫을 사용하여 웰의 기저부에서 각 조직의 상부에 직접 100 μL 세포를 피펫한 후, 피펫 팁으로 조직이 손상되지 않도록 주의한다.
- 시딩된 조직을 37°C/5% CO2의 세포 배양 배양기로옮긴다.
- 2시간 후, 수동 피펫을 사용하여 900 μL 미리 가온된 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 인큐베이터로 복귀시킨다. 매체를 추가할 때 카세트가 앉지 않게되면(플로트) 피펫 팁이 있는 카세트 모서리를 부드럽게 눌러 우물에 평평하게 놓이도록 합니다.
- -2 일에 매체를 변경하십시오. 페트리 접시를 기울이고 카세트가 방해받지 않도록 우물 구석에 가볍게 놓인 피펫 팁으로 수동으로 피펫팅하여 매체를 제거하십시오. 웰 당 1mL의 신선한 내피 배지로 교체하십시오.
- AEC2 및 섬유아세포 시딩 및 조직 배양(Day 0)
- 혈구분석기를 사용하여 AEC2s 및 섬유아세포를 계수합니다. AEC2 성장 배지 (상피 염기 배지 + AEC2 보충물; 표 3 참조)에서 AEC2s 및 섬유아세포의 1:1 세포 현탁액을 5 x 10 6 총 세포/mL로 준비하고, 슬라이스 당 500,000 세포 (250,000 AEC2s 및 250,000 섬유아세포)를 시드하기에 충분한 세포와 함께 준비한다 (예를 들어, 12 슬라이스의 경우, 3 x 10 6 AEC2s + 3 x 10 6 섬유아세포를 1.2 mL 배지에 함께 재현탁시킨다).
- 단계 4.2.6에 기재된 바와 같이 시딩 배쓰의 각 웰로부터 배지를 피펫 아웃한다. 제조된 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이 치며 혼합한 다음, 100 μL 세포를 웰의 기저부에서 각 조직의 상부에 직접 피펫한다.
참고: AEC2/섬유아세포 시딩 전에 소량의 내피 배지가 우물에 남아 있는 경우 허용됩니다. - 시딩된 조직을 37°C/5% CO2의 세포 배양 배양기로옮긴다.
- 2시간 후, 900 μL 미리 가온된 AEC2 성장 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 인큐베이터로 복귀시킨다.
- 24시간의 배양 후(1일째), 카세트 당 웰 당 1 mL의 예비가온된 AEC2 성장 배지로 12-웰 플레이트를 제조하였다.
- 시딩 욕조의 각 웰로부터 배지 800 μL를 피펫한다. 씨딩 욕조에서 카세트를 제거하십시오 : 노치면을 따라 구멍을 통해 미세한 곡선 지혈제로 각각을 잡고 직선 지혈제 또는 포셉으로 옮겨 한쪽 끝의 카세트를 잡고 뒤집은 다음 구부러진 지혈제를 사용하여 노치면을 통해 카세트를 잡고 웰 당 하나씩 오른쪽 위로 이동하여 준비된 12 웰 플레이트로 옮깁니다.
- 7일째까지 또는 원하는 배양 길이를 위해 격일로 12-웰 플레이트에서 배양 배지를 변경: 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 웰로부터 배지를 흡인하고, 조직에 닿지 않도록 주의하십시오; 웰 당 1 mL의 신선한 AEC2 성장 배지 중의 피펫.
주: 조직 재집단의 정도는 배양 기간 동안 5x 배율에서 위상차 현미경을 통해 모니터링될 수 있다.
5. 조직 수확 및 샘플 분석
- 조직학 및 면역형광 염색을 위한 ELT를 고정시키기 위해, 조직 배양 카세트를 10% 중성 완충 포르말린으로 옮기고 로커 상에서 실온에서 3-4시간 동안 인큐베이션한다. 미세한 포셉의 끝을 사용하여 카세트에서 조직을 제거하여 탭과 만나는 조직을 자릅니다. 파라핀 임베딩 및 조직학을 위한 일상적인 방법에 따라 조직을 처리하고; 특별한 기술이 필요하지 않습니다.
- qRT-PCR용 ELT를 처리하려면 PBS 2x의 카세트로 조직을 헹구고 조직을 제거하고 동결 스냅하거나 RNA 추출을 위해 용해를 진행하십시오.
참고: 1 x 10 6 세포로 시딩하고 7일 동안 배양한 적어도 2개의 슬라이스를 풀링하면 다운스트림 PCR 분석을 위한 충분한 RNA가 생성된다.
Representative Results
ELTs를 생성하는 공정의 개요 - 폐 슬라이싱, 슬라이스 클리핑 및 탈세포화, 및 스캐폴드 재집단을 포함하는 - 이 도 3에 제시된다. 여기에 제시된 ELTs를 일차 래트 폐 미세혈관 내피 세포 (표 문헌 참조), 신생아 래트 AEC2s, 및 리포섬유아세포-농축 신생아 래트 폐 섬유아세포36을 사용하여 배양하였다. AEC2s는 앞서 기술된 바와 같이 자성 비드-기반 분류를 통해 신선하게 분리되었다(37); 대안적인 격리 프로토콜은 상세하고 다른 곳에서 논의되었다38,39,40. 분리된 래트 AEC2s의 순도는 래트 특이적 AEC2 표면 마커 RTII-7041에 대한 유세포 분석기를 통해 또는 RTII-70 또는 프로-계면활성제 단백질 C(pSPC)에 대한 세포원심분리된 세포 샘플의 염색을 통해 평가될 수 있다. 쥐 폐 섬유아세포를 공개된 프로토콜42의 적응에 따라 출생 후 7-9 래트 새끼로부터 단리하고 계대 1-2에서 사용하였다; 대안적인 격리 프로토콜들은 다른 곳에서 설명되었다(43,44). 분리된 섬유아세포의 순도는 중간엽 마커 비멘틴에 대한 배양 또는 세포원심분리된 세포의 염색을 통해 평가될 수 있고, 리포섬유아세포 농축은 Oil RedO45에 대한 염색을 통해 평가될 수 있다.
폐 조직이 아가로오스로 균일하게 팽창될 때, 조직 조각은 전략적으로 선택되고 총 및 실질 조직 면적을 최대화하기 위해 슬라이싱을 위해 배향될 때, 한 마리의 래트 폐는 >100개의 폐포 ELT를 위한 조직을 산출할 수 있다. PCLS 스트립은 찢어짐의 사례가 거의 없는 조직 카세트로 클리핑되기에 충분한 기계적 무결성을 나타내<(그림 3B).
폐 절편을 탈세포화하기 위한 프로토콜은 이전에 발표된 전체 폐 탈세포화 프로토콜에 밀접하게 기초하고 있으며, 이는 정량적 프로테오믹스에 의해 천연 폐22의 것과 크게 다르지 않은 수준에서 많은 ECM 성분을 보존하는 것으로 입증되었다. 탈세포화된 슬라이스 스캐폴드는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(도 4A,B) 및 위상차 현미경(도 4C)으로 볼 때 폐포의 토착 구조를 보존한다. 우리는 일반적으로 큰 기도나 혈관(그림 4D) 또는 눈물을 포함하는 스캐폴드를 제외하지만, 연구자가 관심을 갖는 경우 전자를 포함할 수 있습니다. 탈세포화는 이중 가닥 DNA에 대한 분석으로 측정시 조직 DNA 함량의 96% 감소를 초래한다(표 참조; 0.50 μg/mg ± 0.073 μg/mg 대 0.018 μg/mg ± 0.0035 μg/mg vs 0.0035 μg/mg vs 0.0035 μg/mg 대 천연 및 탈세포화된 조직에서는 각각 평균 ± SEM)(도 5A), 헤마톡실린 염색으로 보이는 DNA는 없다(도 4B). 탈세포화된 스캐폴드의 조직학적 및 면역형광성 염색은 ECM 단백질 콜라겐, 엘라스틴, 콜라겐 IV 및 라미닌이 천연 폐 절편에서와 유사한 구조 및 양을 갖는 유지를 보여준다(도 5B-E). 네이티브 조직의 핵은 트리코메 (콜라겐 용) 및 EVG (엘라스틴 용) 얼룩으로 파란색 / 검은 색으로 염색됩니다. 면역형광 염색은 조직37을 염색하기 위한 표준 방법을 사용하여, 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. 사용된 항체 및 이들의 각각의 농도는 표 4에 열거되어 있다.
성공적인 스캐폴드 재집단은 7일 후에 고도의 세포 ELT로 이어지며, 광현미경으로 볼 수 있는 폐포와 같은 재집단 패턴이 보인다(그림 6A-C). 어떤 경우에는 매우 높은 세포성으로 오가노이드형 구조가 보일 수 있습니다 (그림 6A, B). 실패한 조직 시딩은 배양 동안 위상차 현미경으로 시각화할 수 있습니다(도 6C). AEC2s, 섬유아세포 및 내피 세포로 조직 스캐폴드를 배양한 후, ELT는 세 개의 세포 계통을 모두 포함하는 폐포 유사 구조로 조밀하게 재채워진다(도 6D, E). 7 또는 8일째에, AEC2s는 AEC1s로의 유의한 분화의 증거 없이 입방체 형태를 유지하고 계면활성제 단백질-B(SPB) 및 라멜라체 단백질 ABCA3을 발현한다(도 6E, F). AEC2s는 10 μM에서 2 h 펄스에 이어 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU) 혼입에 의해 입증된 바와 같이 ELT에서 고도로 증식한다 (도 6G).
도 1: 폐 추출 및 제거를 위한 관류 시스템의 개략도. (A) 관류 시스템은 유동 하의 폐동맥의 초기 캐뉼레이션에 사용되는 중력 구동 사지를 포함한다; 및 펌프 구동 사지, 초기 캐뉼레이션 후 폐를 효율적으로 청소하는 데 사용됩니다. 펌프 라인에는 펌프로 인한 압력의 스파이크를 감쇠시키는 "펄스 댐퍼"가 포함되어 있습니다. 기관 및 폐 동맥 캐뉼라의 디자인은 왼쪽에 자세히 설명되어 있습니다. SNP = 니트로프로시드 나트륨. (B) 펄스 감쇠기 어셈블리의 세부 사항. BPT와 실리콘은 튜브의 유형을 나타냅니다. (C) 폐 추출 중에 놓인 기관 및 폐 동맥 캐뉼라의 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 삼계보 재세포화를 위한 배양 타임라인. 삼상 시딩의 타이밍을 포함하여 삼계보 ELT 시딩 및 배양을 위한 제안된 타임라인. 각 단계에 대한 시딩 및 배양 배지에 대한 세포 번호가 표시된다. 배양 배지 세부사항은 표 3을 참조한다. AEC2 = 폐포 상피 유형 2 세포. EC = 내피 세포. FB = 섬유아세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 조작된 폐 조직 제제의 개략도. (A) 천연 폐 조직은 비브라톰을 사용하여 조각으로 절단된다. (B) 정밀 절단된 폐 조각은 표준화된 3mm 너비의 스트립으로 절단되고, 폴리테트라플루오에틸렌(PTFE) 조직-배양 카세트로 클리핑되고, 세제-탈세포화되어 무세포 세포외 매트릭스 스캐폴드를 수득한다. (C) 스캐폴드는 시딩 영역을 조직의 영역으로 제한하는 특수 파종 욕조에서 재시딩한 다음, 표준 웰 플레이트에서 배양한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 탈세포화된 폐 스캐폴드의 구조. 천연 (A) 및 탈세포화 (B) 폐 조각의 H & E 염색은 탈세포화 후 폐포 구조의 보존을 보여줍니다. (C,D) 위상차 현미경에 의해 5x 배율로 보이는 탈세포화된 ECM 스캐폴드의 예는 주로 폐포 조직(C) 또는 큰 분지화 기도 및 혈관(D, 검정 및 적색 화살촉)을 함유한다. 스케일 바, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 탈세포화된 폐 스캐폴드에서의 DNA 제거 및 매트릭스 보존. (A) 천연 및 탈세포화된 폐 절편에서의 DNA의 정량화 (SEM± 평균, n = 5). 웰치의 t 테스트, **P < 0.01. 디셀 = 탈세포화. (B,C) 콜라겐 (B) 및 엘라스틴 (C)에 대한 천연 및 탈세포화 폐 절편의 조직학적 염색. 화살촉, 탈세포화 된 조직의 폐포 입구 고리에 보존 된 엘라스틴. (D,E) 콜라겐 IV (D) 및 라미닌 (E)에 대한 천연 및 탈세포화 폐 절편의 면역형광 염색. 스케일 바, 50 μm. 모든 패널에서 점선 상자는 각 패널에서 오른쪽으로 확대되는 이미지 영역을 윤곽선으로 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 조작된 폐 조직의 세포 재집단. (A-C) 배양 7일째에 재세포화된 ELTs의 예는, 배양 동안 위상차 현미경에 의해 시각화된 바와 같다. 재세포화 패턴은 조직의 폐포 구조를 반영합니다. 높은 세포성의 일부 영역에서, 오가노이드-유사 구조(화살촉)가 형성될 수 있다. (A) 및 (B)는 성공적인 세포 재집단을 나타내는 반면, (C)는 배양 7일 후의 불량한 수준의 재세포화를 나타낸다. (D-G) 배양 7일째 또는 8일째에 재세포화된 ELTs의 염색. (d) 폐포 셉타의 세포 재집단을 보여주는 H&E 염색. (e) 면역형광 염색 라벨 그래프팅된 프로콜라겐Iα1+ 섬유아세포, ABCA3+ AEC2s 및 CD31+ 내피 세포. (F) Tissues는 풍부한 SPB + AEC2를 포함하지만 이러한 조건 하에서 RTI-40 (포도 플라닌) + AEC1은 거의 포함하지 않습니다. (G) 많은 AEC2가 EdU 통합에 의해 측정되는 ELT에서 증식하고 있다. 스케일 바, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 탈세포화 용액. 탈세포화 용액에 대한 준비 세부 사항. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 탈세포화 프로토콜. 폐 조각을 탈세포화하기 위한 프로토콜의 세부사항. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 배양 배지. 내피 및 AEC2 성장 배지에 대한 준비 세부 사항. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 면역염색에 사용되는 항체. 면역 염색에 사용되는 항체 및 그의 농도에 대한 세부 사항. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 레이저 절단 조직 배양 카세트 프레임을위한 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 레이저 절단 조직 배양 카세트 클립을위한 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : 레이저 절단 조직 배양 카세트 탭을위한 디자인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: 목욕 금형베이스를 시드하기위한 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5 : 목욕 몰드 링을 시드하기위한 CAD 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문은 다계보 폐포와 같은 구조를 포함하는 시험관 내에서 조작 된 폐 조직을 생성하기위한 플랫폼으로 탈세포화 된 정밀 절단 폐 슬라이스의 사용을 설명합니다. 전체 폐 공학22,31을 위해 고충실도 무세포 ECM 폐 스캐폴드를 재채우기 위해 이전에 개발한 전략과 소규모 엔지니어링 심장 조직(30)을 배양하기 위한 강력한 시스템을 결합함으로써, 이 프로토콜은 반복 가능하고 중간 처리량 방식으로 생리학적으로 관련된 폐 ECM을 조직 배양 기질로 사용할 수 있게 합니다.
여기에 제시된 방법은 쉽게 얻을 수 있는 래트 폐로부터의 ELT 스캐폴드 제제를 상세히 설명하며, 아가로스 인플레이션을 위한 온전한 기도에 직접 접근하여 엔블록 으로 추출될 수 있으며, 마우스 폐보다 크기가 더 크다. 그러나, 아가로오스로 팽창될 수 있고 적어도 9mm 길이의 슬라이스를 수득할 수 있는 임의의 폐 조직이 이 시스템 내에서 사용될 수 있다. 조직 공급원에 관계없이, 아가로스를 사용한 폐 조직의 균일한 팽창은 하류 조직 슬라이싱, 클리핑 및 조직 처리의 성공을 보장하기 위한 가장 중요한 단계입니다. 과소 팽창 된 폐 조직은 깨끗하게 슬라이스되지 않는 경향이 있으며, 지나치게 팽창 된 조직은 클리핑 중에 찢어질 수 있습니다. 아가로스 겔화 후, 적절하게 팽창된 조직 영역은 단단하지만 포셉으로 부드럽게 눌렀을 때 약간의 부여를 제공한다. 손상되지 않은 쥐 폐의 경우, 우리는 추출 된 폐를 공기로 여러 번 미리 팽창시킨 다음 추출 후 가능한 한 빨리 아가로스 인플레이션을 일으켜 최상의 슬라이싱 결과와 결과 조직 스캐폴드의 최상의 품질을 초래한다는 것을 발견했습니다. 적절한 양의 아가로스는 경험적으로 최적화되어야합니다. 래트 폐의 경우 폐를 총 폐 용량으로 팽창시키는 데 필요한 부피는 약 30 mL/kg 동물 질량이다(예를 들어, 350 g 래트의 폐에 대해 10.5 mL 아가로스). 기도 접근이 덜 간단한 더 큰 절제된 폐 조직(예: 인간 기증자로부터의 조직)의 경우, 기관지(32)를 통해 조직을 팽창시키기 위해 몇 가지 추가적인 트러블슈팅이 필요할 수 있다. 후속 폐 슬라이싱 동안, 플런저 상의 조직의 선택 및 배향은 1) 슬라이스가 조직 배양 카세트로 클리핑될 수 있는 조직 스트립을 생성하기에 충분히 크도록 보장하고, 2) 큰 기도 또는 혈관을 제외한 실질(alveolar) 조직 영역을 최대화하는 또 다른 중요한 단계이다.
PCLS를 조직 배양 카세트로 클리핑하는 것은 처음에는 어려운 단계가 될 수 있지만 카세트는 탈세포화 및 시딩 중에 조직 취급을 크게 단순화합니다. 발생할 수 있는 두 가지 잠재적인 문제는 조직 찢어짐(클리핑 과정 중 또는 탈세포화 동안) 또는 불량한 다운스트림 시딩을 초래하는 클립에서의 조직 위치(예를 들어, 시딩 없음, 또는 단지 끝에서 시딩)이다. 찢어짐은 아가로오스 과팽창, 탭 삽입 중 조직의 과도한 스트레칭, 또는 탭을 삽입할 때 적절한 조직 그립을 제공하기 위해 너무 적은 오버행을 남기는 결과일 수 있습니다. 한 클립 끝에서 찢어지는 조각은 성공적으로 시딩될 수 있지만, 조직이 평평하지 않기 때문에 배양 중에 현미경으로 시각화하기가 어렵습니다. 불량한 조직 시딩( 그림 6C에서와 같은)은 슬라이스가 두 클립 사이에 평평하게 놓여 있지 않은 결과일 가능성이 높으며, 따라서 거꾸로 뒤집을 때 시딩 배쓰의 베이스와 잘 접촉하지 못하게 된다. 또 다른 가능한 원인은 파종 목욕의 바닥에있는 카세트의 부적절한 좌석입니다. 클리핑 측면에서 두 번째 클립을 평평하게 놓을 때 조직에 약간 더 많은 장력을 가하여 평평하게 눕히도록 하십시오. 일부 조각에는 약간의 오목함이 있습니다. 이 경우 볼록한 면을 위로 향하게 하여 슬라이스를 클립합니다. 연습을 통해 우리는 일반적으로 슬라이스의 2 % 미만으로 시드가 실패하는 것을 경험합니다.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 ELT 준비를 위한 초기 재료를 생성하기 위해 레이저 커터 및 3D 프린터와 같은 일부 특수 장비에 대한 요구 사항입니다. 그러나 조직 배양 카세트와 시딩 욕조가 만들어지면 추가 특수 재료가 필요하지 않습니다. ELT 스캐폴드 제제의 폐 슬라이싱 및 탈세포화 단계는 적당히 시간이 소요되고; 그러나, 이들 단계들은 사전에 수행될 수 있거나, 또는 동시에 다수의 실험을 준비하기에 충분한 숫자로 수행될 수 있다. 많은 PCLS (실질 영역에 최적화하는 경우 >100)는 단일 폐에서 절단하고 나중에 사용하기 위해 스냅 냉동 할 수 있습니다. 단일 동결-해동 사이클이 ECM46에 경미한 초구조적 손상을 야기할 수 있지만, 심지어 다수의 동결-해동 사이클조차도 ECM 23,47에서 상당한 손실을 야기하지 않는 것으로 입증되었다. PCLS는 또한 실험 전에 클리핑되고 탈세포화될 수 있으며, 한 달 이내에 사용될 수 있다. (주목할 만하게, 기술된 탈세포화 프로토콜은 대략 6시간 내에 달성될 수 있으며, 이는 하루 이상의27,28을 필요로 하는 앞서 기술된 방법들에 비해 상당한 이점을 나타낸다.) 일단 스캐폴드가 준비되면, 세포 시딩 과정은 간단하고 빠르며, ELTs의 배양은 특별한 기술을 필요로 하지 않는다.
기술된 ELT 방법의 주의사항은 영역-특이적 시딩의 결여, 즉, AEC2s를 폐포 공간으로의 특이적으로 전달하거나, 혈관 공간으로의 내피 세포로의 특이적인 전달이다. 그럼에도 불구하고, 세포는 단순히 조직 스캐폴드의 상부에 시딩되지만, 재세포화의 패턴은 무작위적이지 않으며, 상피 고리를 포함한 폐포 유사 조직의 일부 유사성이 있다. 우리는 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 ECM 조성 및 기하학20,21의 국부적 차이가 관찰 된 재세포 화 패턴에 기여할 가능성이 있다고 의심합니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해, 섬유아세포가 탈세포화된 폐 절편에 비특이적으로 시딩된 이전에 발표된 연구에서, 조직 재집단 및 관련 세포 표현형의 패턴이 현미경적 조직 영역 및 ECM 스캐폴드 공급원(예를 들어, 건강한 대 병든 것)에 의해 유의하게 변화한다는 것을 입증하였다27. 섬유아세포는 또한 간질로 침입하는 것으로 관찰되었다 - 그들이 토착 폐 조직에 거주하는 위치 1,27. 진정한 영역 특이적 방식으로 폐 조각에서 세포를 배양하는 것을 상상할 수있는 주요 대안 방법은 기도31,48 및 혈관 구획 49,50을 통해 손상되지 않은 탈세포화 된 폐를 시딩 한 다음 재세포 화 된 조직을 슬라이싱하는 것을 수반합니다. 그러나, 이러한 대안 1)은 상당히 더 많은 비용-, 시간-, 및 자원-집약적이다; 2) 처리량이 낮다. 3) 동물의 수를 늘려야합니다. 4) 전체 폐 배양의 도전 및 시드 된 폐의 후속 슬라이싱으로 인한 오염 위험 증가와 관련이 있습니다. 네이티브 세포 조직의 모든 측면을 되풀이하지는 않지만, ELT 플랫폼은 생리학적으로 관련된 ECM 기질 상에서 폐 세포 배양을 가능하게 하며, 이는 더 많은 실험실에서 접근할 수 있는 방식으로 가능하다.
ELT 시스템의 유연성은 이러한 플랫폼의 주요 이점이며, 관심있는 임의의 수의 조직 스캐폴드, 세포 또는 배양 배지와 함께 소규모 폐 조직 배양을 허용해야 한다. 병든 조직 또는 손상 모델로부터 유래된 스캐폴드의 사용은 질병-변경된 ECM 27,29,51의 설정에서 세포-세포 또는 세포-매트릭스 상호작용의 연구를 허용할 수 있다. 그러나, 탈세포화 프로토콜은 종(52) 사이의 매트릭스 차이를 설명하기 위해 적응될 필요가 있을 수 있다는 점에 유의한다. 기술된 시딩 전략은 임의의 세포 유형에 사용될 수 있고, 배양 타임라인은 연구자의 요구에 적합하도록 적응된다. 시작점으로, 스캐폴드 당 1 x 106 세포는 배양 후 7 일 이내에 높은 세포 조직을 산출해야하는 반면, 1 x 105 총 세포는 불량한 세포성을 초래합니다. 타임라인의 임의의 적응에서, 조직 배양 카세트는 마지막 조직 시딩 후 24시간 후에 시딩 배쓰로부터 제거되어야 한다. 여기에서는 폐 폐포의 세포 복잡성 중 일부를 모델링하는 것을 목표로 적어도 7 일 동안 폐포 유사 구조에서 잘 분화 된 신생아 AEC2s의 유지를 지원하는 삼중 배양 재세포화 전략을 설명합니다. 우리의 결과는 또한 ELT 내에서 섬유아세포와 내피 세포의 성공적인 생착을 입증하며, 배양 기질의 광범위한 적용 가능성과 공동 배양 연구에 대한 적합성을 강조합니다. ELTs에서 성체 세포를 시딩하는 것은 더 정동작 폐포 구조의 모델링을 용이하게 할 수 있는 반면, 유전자 변형을 갖는 것을 포함하는 인간 PSC 유래 AEC2s를 시딩하는 것은 인간 질병13,53의 번역 연구를 용이하게 할 수 있다. 일반적으로, ELT 플랫폼에 의해 활성화된 상향식 접근법은 AEC2 증식 또는 분화 상태와 같은 관심있는 판독에 대한 특정 세포 유형의 기여를 조사할 기회를 제공한다.
요약하면, 이 프로토콜은 무세포 ECM 폐 슬라이스 스캐폴드 내의 AEC2s, 섬유아세포 및 내피 세포의 공동 배양 연구를 위한 조작된 폐 조직을 생성하기 위한 견고한 시스템을 개략적으로 설명합니다. ELT는 일차 AEC2s에 대한 새로운 3D 배양 전략을 나타내며, 현재까지 잘 분화 된 표현형 6,11,12를 유지하기 위해 덜 생리학적인 겔형 매트릭스에 의존해 왔다. 현재의 플랫폼은 탈세포화 된 폐 절편24,25,26,27,28,29의 재 집단에 대한 이전 연구를 기반으로하지만 몇 가지 이점을 제공합니다 : 1) 탈세포화, 시딩 및 배양 중에 ELT 처리를 용이하게하는 조직 배양 카세트 시스템; 2) 각 슬라이스 스캐폴드 상에 공지된 수의 세포를 정확하게 시드하기 위한 맞춤형 시딩 배쓰; 3) 상피, 중간엽 및 내피 세포로 폐포 조직 재집단을 가능하게하는 삼중 배양 재 시딩 전략. 따라서, ELT는 천연 폐포 및 AEC2 줄기 세포 틈새 시장의 세포 및 기질 복잡성을 포착하는 재현 가능한 시험관내 모델을 만들기 위한 중요한 진전을 나타낸다.
Disclosures
L.E.N.은 재생 의학 회사인 Humacyte, Inc.의 설립자이자 주주입니다. Humacyte는 혈관 수술을 위해 동종 평활근 세포로부터 조작 된 혈관을 생산합니다. L.E.N.의 배우자는 Humacyte에 대한 지분을 가지고 있으며, L.E.N.은 Humacyte의 이사회에서 활동하고 있습니다. L.E.N.은 Humacyte에 허가되고 L.E.N. L.E.N.에 대한 로열티를 생산하는 특허에 대한 발명가로서 예일의 실험실에서 연구를 지원하기 위해 무제한 연구 선물을 받았습니다. Humacyte는이 보고서의 발견에 대한 행동, 설명 또는 해석에 영향을 미치지 않았습니다.
Acknowledgments
저자들은 로렌조 세와난과 호르헤 누네즈가 이 프로토콜에 사용된 조직 배양 카세트 디자인을 개발하고, 비브라토메를 사용하기 위한 카민스키 실험실, 폐 슬라이싱에 도움을 준 마우리치오 치오키올리와 제시카 누스, 초기 파일럿 실험에 도움을 준 앨리 라로코, 프로토콜을 주의 깊게 읽은 홍키안에게 감사를 표하고 싶다. 이 연구는 NIH 보조금 F30HL143880 (K.L.L.), 의료 과학자 교육 프로그램 교육 보조금 T32GM136651 (K.L.L.), U01HL145567 (L.E.N.)에 의해 지원되었습니다. Humacyte Inc. (L.E.N.)의 무제한 연구 선물에 의해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| 8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
| Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
| Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
| Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
| CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
| Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
| Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
| Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
| Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
| Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
| Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
| Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
| KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
| Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
| Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
| Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
| MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
| Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
| NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
| Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
| PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
| Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
| Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
| Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
| PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
| PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
| Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
| Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
| Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
| Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
| Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
| Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
| Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
| Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
| Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
| Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
| Transferrin human | Sigma | T8158 | |
| Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
| Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
| Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
| Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |
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