Summary
En förbättrad plattform för helembryonkultur möjliggör kontinuerlig och robust ex utero-utveckling av postimplantationmusembryon i upp till sex dagar, från pregastrulationsstadier till avancerad organogenes. I detta protokoll beskriver vi standardproceduren för framgångsrik embryokultur med statiska plattor och roterande flasksystem.
Abstract
Postimplantation däggdjur embryo kultur metoder har i allmänhet varit ineffektiva och begränsade till korta perioder efter dissekering ut ur livmodern. Plattformar har nyligen utvecklats för mycket robust och långvarig ex utero kultur av musembryon från äggcylinderstadier till avancerad organogenes. Dessa plattformar möjliggör lämplig och trogen utveckling av förgastrullerande embryon (E5.5) fram till bildandet av bakben (E11). Sena gastrulaterande embryon (E7.5) odlas i roterande flaskor i dessa miljöer, medan utökad odling från förgastrulationsstadier (E5.5 eller E6.5) kräver en kombination av statiska och roterande flaskkulturer. Dessutom är känslig reglering av O2- och CO2-koncentration, gastryck, glukosnivåer och användning av ett specifikt ex utero-odlingsmedium avgörande för korrekt embryoutveckling. Här tillhandahålls ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för utökad ex utero-musembryonkultur. Förmågan att odla normala musembryon ex utero från gastrulation till organogenes representerar ett värdefullt verktyg för att karakterisera effekten av olika experimentella störtben under embryonal utveckling.
Introduction
Intrauterin utveckling av däggdjursembryon har begränsat studien av de tidiga stadierna av postimplantation utveckling1,2. Det utvecklande embryots otillgänglighet hindrar förståelsen av viktiga utvecklingsprocesser som uppstår efter embryoimplantaten i livmodern, såsom upprättandet av djurkroppsplanen, specifikation av bakterieskikten eller bildandet av vävnader och organ. Dessutom gör den mycket lilla storleken på det tidiga postimplanterade embryot det svårt att observera genom intravital avbildning in utero före E103. Oförmågan att observera och manipulera levande embryon i dessa skeden har begränsat studien av tidig postimplantation embryogenesis till ögonblicksbilder under utvecklingen.
Protokoll för in vitro-kultur av preimplantation däggdjur embryon är väl etablerade, tillförlitliga och regelbundet används4. Försök att upprätta ex utero kultur system som kan stödja korrekt däggdjur postimplantation embryo tillväxt hade dock begränsad framgång5. En mängd olika kulturtekniker har föreslagits i över ett sekel, främst genom att odla embryona i konventionella statiska plattor6,7,8 eller roterande flaskor (rullkulturer)5,9,10. Dessa plattformar visade sig vara till hjälp för att utöka kunskapen om däggdjursutveckling efter implantation11,12, trots att de var mycket ineffektiva för normal embryoöverlevnad och begränsade till korta perioder. Embryona började visa utvecklingsmässiga retardation och morfologiska anomalier så tidigt som 24-48 h efter kulturinitiering.
Denna studie ger en detaljerad beskrivning för att inrätta ex utero embryo kultursystem som möjliggör kontinuerlig utveckling från pregastrulation till avancerade organogenes stadier under upp till sex dagar av postimplantation utveckling13. Detta dokument beskriver det förbättrade rullkulturprotokollet som stöder tillväxten av E7.5 embryon (neurala plattor och huvudfold-stadium) fram till bakbenet bildas scenen (~ E11) och den utökade kulturen från E5.5/E6.5 genom att kombinera kultur på statiska plattor och rullkultur plattformar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt Weizmann Institute of Science:s djurskyddsriktlinjer och godkändes av relevanta Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Friska gravida kvinnor ombads att ge sitt informerade samtycke till att samla in blod från navelsträngen, vilket godkändes av Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Friska vuxna ombads att få sitt informerade samtycke till att få blod samlat enligt riktlinjerna från Weizmann Institute of Science Helsinki Committee (#1566-3).
1. Medieförberedelse
- Förbered dissekeringsmediet med 500 ml Dulbeccos modifierade eaglemedium (DMEM) utan fenolrött och L-glutamin, kompletterat med 10% fetalt bovinserum, 5 ml penicillin/streptomycin och filtersterilisering med ett 0,22 μm-filter.
OBS: Håll dissekeringsmediet vid 4 °C i upp till 1 månad. - Förbered ex utero embryokulturmedium (EUCM) färskt varje kulturdag inuti en biologisk huva med 25% embryonalt medium plus 50% råttserum och 25% humant navelsträngsblodserum (HCS) eller humant vuxenblodserum (HBS).
- För att förbereda embryonalt medium, tillsätt 5 ml glutamin, 5 ml HEPES och 5 ml penicillin/streptomycin i 500 ml DMEM utan fenolrött och L-glutamin. Förbered 10-15 ml alikvoter och förvara dem vid 4 °C i upp till två månader.
OBS: Fördubbla antibiotikakoncentrationen om den upplever någon kontaminering. - Värmeinaktivera råttserumet vid 56 °C i 30-45 min och filtrera genom ett 0,22 μm polyvinylidendifluoridfilter. Använd serumet för odling samma inaktiveringsdag. Tina HCS eller HBS och använd det omedelbart för experiment.
OBS: Kommersiellt råttserum ger konsekventa resultat (minst 4 partier testades utan uppenbar variation). Alternativt kan högkvalitativt råttserum erhållas internt enligt beskrivningen tidigare8,14. Om HCS inte är tillgängligt, byt ut det mot internt uppsamlat HBS. Råttserum, HCS och HBS kan frysas om en gång och hållas vid -20 °C för användning en annan dag. Tina och kombinera det refrozen serumet med en större volym nyupptinat serum och frys inte det igen.
2. Insamling av humant navelsträngsblodserum och humant blodserum hos vuxna
- För att isolera HCS, samla navelsträngsblod från friska gravida kvinnor på dagen för den planerade caesarian leverans.
- Dubbelklämma navelsträngen 5-7 cm från navelsträngen och transect mellan klämmorna omedelbart efter leverans av barnet.
- Dra manuellt blod med en storhålig 14 G nål och en 50 ml spruta direkt från navelvenen medan moderkakan förblir på plats för att undvika spår av hemolys.
OBS: Samla blod efter att barnet har avlägsnats från operationsområdet, och navelblod har dragits för kliniska tester.
- Dosera det uppsamlade blodet till 5 ml prokoagulantia sterila provrör och överför dem omedelbart till 4 °C i 15 minuter för att möjliggöra fullständig koagulering. Centrifugera de koagulerade provrören vid 2 500 × g i 10 min vid 4 °C.
- Kassera rör som visar tecken på hemolys (rosarött serum). Samla serumet (gul färg) med en 5 ml pipett och filtrera det genom ett 0,22 μm-filter. Värm in serumet omedelbart i ett 56 °C vattenbad i 45 minuter.
- Förbered 1-1,5 ml alikvoter av det inaktiverade serumet och förvara dem vid -80 °C i upp till sex månader. Om det behövs, skicka vid -70 °C med torris.
- För vuxna mänskliga blod serum samling, dra blod från friska vuxna och omedelbart isolera serum enligt samma protokoll beskrivs för navelsträng blod serum. Förvara HBS som värmeinaktiverade och filtrerade alikvoter vid -80 °C i upp till sex månader.
OBS: Human navelsträng serum och vuxna mänskliga serum beredda ny-house gav överlägsna resultat till kommersiellt tillgängliga serum. Samla HCS från friska kvinnor, över 18 år och under 40 år planerade för cesarian avsnitt leverans. Exkludera kvinnor som fött vaginalt och kvinnor med kronisk sjukdom eller aktiva medicinska tillstånd, inklusive graviditetsdiabetes eller högt blodtryck.
3. Ex utero rullkultur av embryon från E7.5 till E11
- Inrätta rullkulturinkubator och gasregulator
- Kultur E7.5 eller mer avancerade embryon med hjälp av rullodlingsinkubatorsystemet. Sätt på rotatorn och värmeenheten vid 37 °C i minst 1 timme före embryodissektionerna. Tillsätt autoklaverat vatten till gasinloppsflaskan och utloppsteströret.
OBS: Placera en termometer intill den roterande trumman och kontrollera ofta temperaturens stabilitet inuti inkubatorn. Öppna inkubatorn så snabbt som möjligt eftersom långvarig öppningstid ökar temperaturen och påverkar embryoutvecklingen. Tillsätt vid behov mer autoklaverat vatten till gasinloppsflaskan och utloppsteströret för att hålla dem till ett minimum av halv kapacitet under kulturen. Skydda embryona inuti inkubatorn från ljus genom att täcka inkubatorn med en trasa. - Slå på gasregulatormodulen genom att trycka på huvudbrytaren och sedan slå på syre-/kväve- och CO2-styrenheterna (figur 1A). Ställ in syre- och CO2-värdena till 5 % med respektive styrenheter. Öppna gasregulatorn och ställ in gastrycket på ~6,5-7 pund per kvadrattum (psi) genom att flytta spänningsomkopplaren i trycksändaren (bild 1B). Bekräfta gastrycksvärdet med hjälp av en digital tryckmätare.
- Övervaka gasflödet genom att kontrollera hastigheten på bubblor som skapas inuti utloppsvattenfyllda provröret som tilldelats inuti precisionsinkubatorn. Ställ in rätt bubbelhastighet genom att stänga/öppna gasflödesventilen på vattenflaskans lock. Se till att gasflödet möjliggör bildandet av bubblor med en hastighet av 2-4 bubblor per sekund eller ställ in bubbelflödet vid den första punkten där bubblande kommer ut till det vattenfyllda utloppsröret.
- Fyll odlingsflaskorna med 2 ml odlingsmedium och anslut dem till den ihåliga roterande trumman för preequilibration i 1 h. Använd de ihåliga silikonbuggarna för att försegla flaskorna till trumman. Håll de tomma utrymmena förseglade i den roterande trumman med hjälp av de fasta bungsna.
OBS: Frånvaron av bubblor i utloppsröret (ingen gas som kommer genom systemet) eller ett exceptionellt högt gasflöde kan påverka embryoutvecklingen. Vid brist på bubbelflöde till utloppsteströret, kontrollera att alla silikonbryn är korrekt placerade i den roterande trumman och försegla systemet och kontrollera att vattenflaskan är ordentligt stängd och att alla slangar är korrekt anslutna. Brist på bubblande som kommer in i vattenflaskan kan tyda på ett fel i gasregulatorn.
- Kultur E7.5 eller mer avancerade embryon med hjälp av rullodlingsinkubatorsystemet. Sätt på rotatorn och värmeenheten vid 37 °C i minst 1 timme före embryodissektionerna. Tillsätt autoklaverat vatten till gasinloppsflaskan och utloppsteströret.
- Dissekering av musembryon från dräktiga möss
- Förskriv dissekeringsmediet inuti en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i minst 1 tim. Lämna locket något öppet för att tillåta gasutbyte.
- Offra den gravida kvinnan genom livmoderhalscancer förskjutning, rengör kvinnans buk med 70% etanol och skär huden och bukväggen med sax. Hitta ena änden av livmodern och skär vid korsningen mellan äggstocken och livmodern. Skär sedan längs livmodern till andra änden och överför den till en 100 mm Petri-skål fylld med rumstemperatur Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
OBS: Användning av icke-hormon-primed, naturligt parade kvinnor rekommenderas. - Tvätta snabbt conceptuses i DPBS och skär i par för att underlätta embryohantering. Flytta alla par konceptanvändar till förelibrerat dissekeringsmedium i en 60 mm Petriskål och skär i individuella konceptanvändningar.
- Ta bort livmoderväggen i conceptuses genom att riva livmodervävnaden med ett par grova tångar. Använd fina mikrokirurgiska tångar för att skära spetsen på den päronformade decidua. Sätt in tången bredvid embryot parallellt med dess långa axel och öppna tångarna för att dela decidua i halvor.
- Slutligen lämna den intakta ectoplacental konen fäst vid äggcylindern genom att ta tag i embryot från decidua och skala parietalula säcken av embryot med hjälp av fina tångar.
OBS: För att undvika att påverka embryot, utför dissektioner på ett mikroskop utrustat med en värmeplatta vid 37 °C inom högst 30-40 min. Dissekera en kull embryon i taget. - Omedelbart efter dissekering, överför embryona till en ny tallrik fylld med ekvilibrerat dissekeringsmedium med hjälp av en pasteurpipeett av glas för att förhindra att embryona fastnar på vävnadsskräpet.
- Välj de embryon i neuralplattan/det tidiga huvudvecket som inte visar någon skada i epiblasten och överför 5-6 embryon per flaska till de preekvilibrerade glasodlingsflaskorna.
OBS: För att förbereda pasteurpipetten i glas, skär pipettens öppning till en lämplig storlek för att passa embryona med en glasskärare och förvara den i etanol för att undvika förorening. Tvätta glaspipetten med PBS innan du överför embryon. När du överför embryona till odlingsflaskan, se till att överföra så liten volym av dissekeringsmediet som möjligt för att undvika utspädning av EUCM. - Placera flaskorna i det roterande odlingssystemet vid 37 °C, i en atmosfär av 5% O2 och 5% CO2.
- Varje kulturdag, ta bort flaskorna en efter en från inkubatorn för att utvärdera embryoutveckling under ett stereomikroskop. Var noga med att stänga det tomma hålet i trumman med en fast bung när du tar bort en flaska. Skär spetsen på en steril pasteurpipeett av plast för att passa embryostorleken och flytta embryona till en Petri-maträtt för att underlätta observation. Se till att embryona alltid täcks av medium.
OBS: Minimera den tid under vilken embryona är utanför inkubatorn för att undvika skadliga effekter i embryona på grund av en minskning av kroppstemperaturen. Hantera embryona noggrant för att undvika bristning av äggula säck blodkärl, vilket påverkar embryots överlevnad. - På odlingsdag 1 (motsvarande E8.5) överför grupper om 3 embryon till en ny flaska med 2 ml färskt och förekvivalent EUCM innehållande extra 3 mg/ml D-glukos och en gasblandning på 13% O2, 5% CO2.
- Efter 48 timmar (motsvarande E9.5) överför grupper om två embryon till en ny flaska med färsk förvärmd EUCM plus 3,5 mg/ml glukos i en gasatmosfär på 18% O2 och 5% CO2.
- Vid 72 timmar kultur (motsvarande E10.5) flytta varje embryo till en enskild flaska som innehåller 1,5-2 ml färskt medium kompletterat med 4 mg/ml glukos och en gastillförsel på 21% O2 och 5% CO2.
OBS: Embryon når sin maximala tillväxt vid midnatt av kulturdag 4. - Använd fina tångar för att ta bort äggula säcken och amnion, och lossa navelsträngen för korrekt observation av embryomorfologi. Stäng av gasregleringsmodulen och precisionsinkubatorn.
OBS: Preequilibrate odlingsmediet i 1 timme genom inkubation inuti en glasflaska i rullkulturen med en tillräcklig gasatmosfär enligt embryostadiet. Rengör odlingsflaskorna och alla inkubatorglas efter varje användning genom att utföra tre tvättar med rinnande destillerat vatten följt av en natttvätt nedsänkt i 70% etanol. Tvätta om tre gånger med rinnande destillerat vatten, låt flaskorna torka över natten och sterilisera med autoklav. På samma sätt autoklaverar du silikonpluggarna regelbundet. Rengör noggrant alla dissekeringsverktyg med 70% etanol och torrsterilisera dem.
4. Utökad embryokultur från E5.5/E6.5 till E11
- Odlingsförbeläggande (E5.5) och tidig gastrulation (E6.5) embryon fram till det tidiga somitstadiet (E8.5) i statiska plattor.
- Förelibrera dissekeringsmediet i 1 h i en inkubator med 5% CO2 vid 37 °C.
OBS: För att tillåta gasväxling, stäng inte locket på röret helt. - Förbered odlingsplattorna genom att tillsätta 250 μL nyberedd EUCM till varje brunn. Placera plattorna inuti en CO2-inkubator vid 37 °C för förundersökning.
OBS: Även om 8-brunnsplattor är väl lämpade för embryotillväxt, kan kultur göras i vilken annan tallrik som helst genom att justera mediets volym efter plattans storlek. - Dissekera äggcylinderembryon ur livmodern enligt den teknik som beskrivs för E7.5. Ta bort embryots parietala äggula och lämna den intakta ectoplacental konen fäst vid äggcylindern.
- Överför enskilda embryon till varje brunn på 8-brunnsplattan med hjälp av en mikropipette och placera plattan inuti inkubatorn med 5% CO2 vid 37 °C.
- Avbilda embryona under ett stereomikroskop och välj endast de med en välformad fosterhinnan, utan uppenbar skada och utan Reicherts membran.
OBS: Använd 20 μL pipettspetsar för att överföra E5.5-embryon och 200 μL-tips för att överföra E6.5-embryon. När det gäller kulturer som börjar vid E6.5 kan HCS ersättas med nyuppsamlad HBS. - Ta bort hälften av mediet och tillsätt 250 μL nyberedd förvarnad EUCM efter 24 timmars kultur, så att embryona alltid är nedsänkta i odlingsmediet. När det gäller kulturer som börjar vid E5.5, efter två dagars odling (motsvarande E7.5), avlägsna 200 μL och tillsätt 250 μL nytt EUCM.
OBS: Under statisk odling kan embryon fästas på plattan (främst vid användning av plastplattor), vilket allvarligt äventyrar embryoutvecklingen. Fastsättning av embryot på plattan är vanligare på den första dagen av odling av E5,5 embryon. För att förhindra fastsättning, tryck försiktigt embryona bort från plåtytan med fina, sterila tångar. Kontrollera att endast den ectoplacentala konen förblir fastsatt på plattans yta. - Överför embryona till rullkulturen i det tidiga somitstadiet (4-7 somiter; efter tre dagars odling för embryon som explanterats vid E5.5 och två dagar för kulturer som började vid E6.5), efter samma indikationer som tidigare beskrivits för E8.5-stegembryon.
OBS: Överföring av embryona till rullkulturen i somitstadier som skiljer sig från vad som anges ovan resulterar i misslyckande med vidareutveckling. I motsats till E7.5 ex utero kulturer är det möjligt att upprätthålla embryona i en konstant atmosfär av 21% syre och 5% CO2, vilket ger en något högre effektivitet av embryoutveckling än atmosfärer med dynamisk syrekoncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De rullodlingsförhållanden som beskrivs för E7,5-embryon (sent gastrulationsstadium) stöder konstant och normal embryotillväxt med en genomsnittlig effektivitet nära 75% efter 4 kulturdagar (figur 2 och tabell 1). Effektiviteten i embryoutvecklingen kan variera mellan olika musgenetiska bakgrunder men är genomgående robust (figur 2C). Tillskott med HBS istället för HCS ger en effektivitet på ~ 68% efter 4 dagars ex utero-kultur , beroende på mössens genetiska bakgrund (figur 2D och tabell 2). Embryona utvecklade ex utero rekapitulera korrekt utveckling tills ungefär 44-somite scenen. Efteråt presenterar embryona embryonala avvikelser på grund av frånvaron av den allantoic moderkakan, vilket resulterar i otillräcklig syresättning och näringstillförsel med tanke på den ökade kroppsstorleken i detta skede.
Utvecklingen av E6.5-embryon (tidig streckning) i statiska plattor rekapituleras korrekt med en effektivitet på >90 % fram till början av E8.5 i somite-stadiet, med hjälp av EUCM med både HCS och HBS (figur 3, tabell 3 och tabell 4) (se8,13 för en detaljerad beskrivning av embryo iscensättning mellan E5.5 och E8.5). Ex utero-odling från gastrulation till avancerad organogenes genom att kombinera kulturer på statiska plattor följt av rullkulturen i en konstant 21% syreatmosfär ger en uppskattad effektivitet av korrekt utveckling på 55% och 26% till 44-somite-stadiet, med hjälp av HCS respektive HBS (figur 3A, tabell 3 och tabell 4). Det finns en fördröjning av 1-2 somitpar i dessa embryon jämfört med embryon som utvecklats in utero. Den största effektivitetsminskningen sker vid övergången från E8.5 till E9.5 på grund av misslyckande med axiell vridning och stängning av neuralröret.
Kulturer från E5.5 pregastrulaterande embryon visar en effektiv utveckling till det tidiga somitstadiet (E8.5) på cirka 46 %, och nästan 17 % av embryona kommer att slutföra en korrekt utveckling efter sex dagars kultur efter att ha överförts till rullkulturen (figur 4 och tabell 5). Utökad ex utero-kultur förlänger den utvecklingsmässiga fördröjningen i embryona, med embryon som explanteras vid E5.5 och visar en fördröjning på 2-4 par somiter jämfört med in vivo-embryon . Ändå fortsätter morfogogenes och vävnadsutveckling ordentligt tills ungefär 42-somite-stadiet.
De vanligaste defekterna i embryon för kulturer som initierats från E7.5, E6.5 och E5.5 exemplifieras i figur 5A-C. Vid tidpunkten för dissekering bör embryon med ännu mindre skador på epiblasten eller den extraembryonic regionen, liksom embryon som behåller Reicherts membran, kasseras. På samma sätt kommer tidiga embryon inte att växa ordentligt (se figur 5B för döda embryon) eller uppvisa allvarliga utvecklingsförseningar (se figur 5B för ett försenat embryo). Fastsättning av den embryonala epiblasten på plattans yta kommer att påverka utvecklingen beroende på fästets position och grad. Fastsättning av en del av epiblasten eller hela embryot kommer att orsaka att vidareutveckling misslyckas (se figur 5B för ett bifogat embryo).
De viktigaste avvikelserna som observerats i andelen defekta embryon vid E8,5 (tidigt somitstadium) är utvecklingen av den bakre regionen utanför äggula säcken eller defekter i tillväxten av neurala veck (figur 5A,B). När det gäller kulturer som börjar vid E5.5 är en ofta observerad utvecklingsdefekt förekomsten av en liten, underutvecklad epiblast (figur 5C). Vid den tidpunkten motsvarande E9.5 utgör defekter i stängningen av neurala veck, misslyckande av axiell vridning eller en brist i hjärnans tillväxt de vanligaste observerade avvikelserna (figur 5). De vanligaste observerade utvecklingsdefekterna vid E10,5/E11 är avvikelser i huvudregionen, störningar av normal blodcirkulation i äggula och perikardiell utgjutning (figur 5). Bristning av ett huvudblodkärl och blodflöde kan orsaka embryots efterföljande död. I synnerhet kan korrekt tillväxt av själva embryot uppnås även i avsaknad av uppenbar äggula säckcirkulation. Embryon som hålls i kultur bortom det stadium som motsvarar E11 uppvisar kroppskrympning och död efter några timmar på grund av brist på korrekt vävnadssyrning.
Bild 1: Gas- och tryckregleringssystem anpassat till en rullkulturinkubator. (A) Ovanifrån av gasregleringsmodulen ansluten till rullodlingsinkubatorn. N2 och CO2 kommer in i gasregulatorn för att möjliggöra exakt kontroll av syre-/CO2-koncentrationerna och gastrycket. Gaserna riktas mot blandningslådan, där de blandas av en centrifugalblåsare och injiceras i inkubatorn av en pump som genererar positivt tryck. Gasen strömmar genom inloppet till en vattenflaska och senare till de förseglade flaskorna. B) Intern konfiguration av den elektroniska modulen för gas- och tryckreglering. Spänningsvärdet som sätts på trycksändaren reglerar trycket som genereras av pumpen inuti gasblandningsboxen (5-6 V för att uppnå ett tryck på 6-7 psi i denna specifika modell). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Ex utero kulturplattform stöder tillväxt av E7.5 embryon fram till avancerad organogenes. A) Diagram som visar E7.5 ex utero embryoodlingsprotokoll. (B) Representativa ljusfältsbilder av grupper av odlade embryon som utvecklar ex utero under fyra dagar, från sen gastrulation (E7.5) till 44-somitstadiet (E11). Den typiska variationen i somitnummer som bedöms var 24: e timme anges. Skalstänger = 500 μm. (C, D) Procentandel av normalt utvecklade embryon vid 1-4 dagars odling från E7.5 dividerat med mus föräldrastammar och serumtillskott (C, humant navelsträngsblodserum; D, humant blodserum för vuxna). Panel A har ändrats från 13. Förkortningar: EUCM = ex utero embryokultur medium; HCS = humant navelsträngsblodserum; HBS = humant blodserum hos vuxna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3. Utökat ex utero kultur protokoll för odling E6.5 tidiga gastrulaterande musembryon tills sen organogenes. (A) Schematisk illustration av det utvidgade ex utero-odlingsprotokollet som kombinerar statiska plattor och roterande flasksystem. (B) Ljusfältsbilder av embryon odlade ex utero i fem dagar från E6.5 till 44-somitstadiet. Den typiska variationen i somitnummer som bedöms var 24: e timme anges. Skalningsstaplar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kontinuerlig ex uterokultur av pregastrulationsmusmbryon från E5.5 till sena organogenessteg. A) Schematisk skildring av ex uterokulturen protokollet för E5.5-embryon. (B) Representativa ljusfältsbilder av embryon odlade ex utero i sex dagar från E5.5 till 42-somitstadiet. Den typiska variationen i somitnummer som bedöms var 24: e timme anges. Skalningsstaplar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa utvecklingsfel som observerats hos embryon som odlas ex utero. (A-C) Ljusfältsmikroskopibilder av onormala musembryon som odlas ex utero från E7.5 (A), E6.5 (B) eller E5.5 (C). En allmän beskrivning av defekten finns på varje bild. Skalningsstaplar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Effektiv utveckling av embryon som isolerats vid E7,5 dagar efter coitum. Embryona odlades ex utero i 4 dagar i EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). [-] indikerar att kulturer inte fortsatte på grund av experimentella krav. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Effektiv korrekt utveckling av embryon som isolerats vid E7.5, odlad ex utero i 4 dagar och ersätter humant navelsträngsblodserum med nyisolerat humant vuxenblodsserum. [-] indikerar att kulturer inte fortsatte på grund av experimentella krav. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3: Effektiv utveckling av embryon (B6D2F1/ICR) som isolerats vid E6.5 och odlats ex utero i 5 dagar med eucm (25% humant navelsträngsblodserum). Ex utero-kulturen gjordes i statisk kultur i två dagar (21% O2) följt av tre dagar i roterande flaskor vid 21% O2. [-] indikerar att kulturer inte fortsatte på grund av experimentella krav. Förkortning: NA = ej förvärvad. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 4: Effektiv korrekt utveckling av embryon (B6D2F1/ICR) isolerade vid E6.5 och odlade ex utero i 5 dagar med eucm (ersätter humant navelsträngsblodserum med nyisolerat humant blodseroserum för vuxna). Embryona utvecklades i statisk kultur i två dagar (21% O2) följt av tre dagar i roterande flaskor vid 21% O2. [-] indikerar att kulturer inte fortsatte på grund av experimentella krav. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 5: Effektiv utveckling av embryon (B6D2F1/ICR) som isolerats vid E5.5 och odlat ex utero i 6 dagar med eucm (25% humant navelsträngsblodserum). Embryona utvecklades i statisk kultur i tre dagar (21% O2) följt av tre dagar i roterande flaskor vid 21% O2. [-] indikerar att kulturer inte fortsatte på grund av experimentella krav. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Odlingsprotokollet som presenteras häri kan upprätthålla korrekt och kontinuerlig utveckling av musembryon ex utero i upp till sex dagar, från E5.5 till E11. Tidigare kunde embryon i dessa utvecklingsstadier utvecklas normalt i kultur endast under korta perioder (upp till 48 h)15. Kopplingen av gasregleringsmodulen till rullodlingsinkubatorn för exakt kontroll av syrekoncentration och övertrycksgastryck är avgörande för den korrekta musembryonkulturen som beskrivs häri. Att öka gastrycket till 7 psi ökar syrediffusionen, vilket möjliggör embryoutveckling upp till E11 i en atmosfär på upp till 21% O2/5% CO2, i motsats till de tidigare använda förhållandena på 95% O216, vilket kan vara skadligt för embryot på lång sikt. Vidare är syrekoncentrationen känd för att spela en kritisk roll i embryonal utveckling, eftersom tidig postimplantation embryogenes äger rum under hypoxiska förhållanden17. Följaktligen kräver den framgångsrika kulturen av sena gastrulaterande embryon en initial 5% O2-atmosfär, med en dynamisk ökning av syrekoncentrationen när embryot växer. Anmärkningsvärt nog minskade odling av embryon före/tidig gastrulatation i statisk kultur vid 5% O2 drastiskt effektiviteten av korrekt embryoutveckling jämfört med 21% O2, och de kunde inte utvecklas vidare till E9.5. Det senare kan förklaras av den långsammare hastigheten av näringsämnen och syrediffusion genom embryonala vävnader i den statiska kulturen jämfört med kulturen i roterande flaskor1,10.
Dessutom ger det höga innehållet av råtta och humant navelsträngsblodserum mer konsekventa resultat för odling av tidiga postimplanterade embryon än media kompletterade med endast råttserum13,18. Viktigt är att serumet som används för embryokultur bereds av nyutvunnit blod. Även om högkvalitativt råttserum för hela embryokulturen är kommersiellt tillgängligt, bör humant serum isoleras internt. Tillskott med mänskliga navelsträng blod serum kan ersättas av serum isoleras från mänskliga vuxna blod, som är allmänt tillgängliga och fortfarande ger konsekvent och effektiv embryo tillväxt.
Framgångsrik och effektiv embryoutveckling ex utero är också mycket beroende av noggrann embryoisolering. För det första bör dissekeringsförfarandet utföras i dissekeringsmedium som värms upp vid 37 °C, och de dissekerade embryona bör överföras till odlingsflaskorna/odlingsplattorna inom 30 minuter. För det andra är exakt embryoisolering från decidua och avlägsnande av Reicherts membran utan att skada epiblasten avgörande för att uppnå hög effektivitet i embryoutvecklingen. För det tredje bör endast embryon i lämpligt skede väljas ut för odling, eftersom tidiga/fördröjda embryon inte kommer att växa ordentligt.
Hantering av embryona under överföringen är en annan viktig punkt under ex utero-kulturen , främst efter utvecklingen av den embryonala äggulasäcken. Embryon bör överföras försiktigt eftersom skador på större äggula säck blodkärl kan påverka korrekt utveckling. I allmänhet kommer ju längre embryokulturen är, desto lägre blir effektiviteten i normal embryoutveckling, dvs. Dessutom är förekomsten av antibiotika i mediet grundläggande för att förhindra förorening om ett dissekeringsmikroskop som tilldelats inuti en biologisk huva inte är tillgängligt.
Det kan inte uteslutas att andra plattformar, trycknivåer eller villkor kan möjliggöra liknande eller förbättrade resultat som de resultat som erhålls med det nuvarande protokollet. Ytterligare optimering av de villkor som beskrivs i denna studie behövs för att uppnå en effektivitet av embryoutveckling som är lika med den som observerats av intrauterin utveckling. Dessutom kan framtida utveckling av ett definierat serumfritt medium bidra till att definiera de specifika metaboliska och kemiska kraven under utveckling av däggdjursembryon och minska variationen i serum från parti till parti. Behovet av konstant närings- och gasblandning efter E8.5 med hjälp av den roterande flaskkulturen i de nuvarande inställningarna begränsar de långsiktiga bildåtergivningskapaciteterna under organogenessteg. Framtida utveckling av mikrofluidiska enheter som möjliggör gas- och näringsblandning i statisk kultur kopplad till mikroskopiinställningar kan hjälpa till att övervinna denna utmaning.
Embryon odlade ex utero kan experimentellt manipuleras och hållas i kultur upp till avancerade organogenes stadier utanför livmodern. Vi har tidigare visat förmågan att införa olika störtlinjer i utvecklingen av embryon, såsom genetisk manipulation genom elektroporation eller lentiviral infektion, levande imaging, cell ympning och teratogenic studier13. I slutändan kan denna plattform hjälpa till att avslöja cell öde specifikation och organbildning mekanismer hos däggdjur genom att tillåta realtidsexperiment i levande musembryon för upp till sex dagar av tidig postimplantation utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H.H är rådgivare till Biological Industries Ltd och har lämnat in en patentansökan som täcker de roller- och statiska odlingsvillkor som beskrivs häri (inlämnade av J.H.H. och Weizmann Institute of Science). Andra författare förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av Pascal och Ilana Mantoux; Europeiska forskningsrådet (ERC-Cog-2016 726497-cellnaivety); Flygvärdinnans medicinska forskningsråd (FAMRI); Professur i Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen och Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen och Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella och Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David och Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al.
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F.
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
