Summary
Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.
Abstract
Postimplantasyon memeli embriyo kültürü yöntemleri genellikle verimsiz ve rahim dışı diseksiyon sonrası kısa sürelerle sınırlı olmuştur. Platformlar son zamanlarda yumurta silindir aşamalarından ileri organogenez kadar fare embriyolarının son derece sağlam ve uzun süreli ex utero kültürü için geliştirilmiştir. Bu platformlar, öngaztasyon embriyolarının (E5.5) arka ekstremite oluşum aşamasına (E11) kadar uygun ve sadık gelişimini sağlar. Geç gastrulating embriyoları (E7.5) bu ortamlarda dönen şişelerde yetiştirilirken, pregastrülasyon aşamalarından (E5.5 veya E6.5) genişletilmiş kültür statik ve dönen şişe kültürlerinin bir kombinasyonunu gerektirir. Ek olarak, O2 ve CO2 konsantrasyonunun hassas düzenlenmesi, gaz basıncı, glikoz seviyeleri ve belirli bir ex utero kültür ortamının kullanımı uygun embriyo gelişimi için kritik öneme sahiptir. Burada, genişletilmiş ex utero fare embriyo kültürü için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Normal fare embriyolarının gastrülasyondan organogeneze kadar ekstresini yetiştirme yeteneği, embriyonik gelişim sırasında farklı deneysel pertürbasyonların etkisini karakterize etmek için değerli bir aracı temsil eder.
Introduction
Memeli embriyosunun intrauterin gelişimi postimplantasyon gelişiminin erken evrelerinin incelenmesini sınırlamıştır1,2. Gelişmekte olan embriyonun erişilemezliği, embriyo uterusa implante ettikten sonra meydana gelen hayvan vücut planının oluşturulması, mikrop katmanlarının belirtimi veya doku ve organların oluşumu gibi temel gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını engeller. Ayrıca erken postimplane embriyonun çok küçük olması E103 öncesi rahim içi görüntüleme ile gözlem yapmayı zorlaştırır. Bu aşamalarda canlı embriyoların gözlemlenememesi ve manipüle edilmesi, erken postimplantasyon embriyogenezinin çalışmasını gelişim sırasında anlık görüntülerle kısıtlamıştır.
Preimplantasyon memeli embriyolarının in vitro kültürü için protokoller iyi kurulmuş, güvenilir ve düzenli olarak kullanılmaktadır4. Bununla birlikte, uygun memeli postimplantasyon embriyo büyümesini destekleyebilen ex utero kültür sistemleri kurma girişimleri sınırlı başarıya sahipti5. Bir asırdan fazla bir süredir, embriyoların geleneksel statik plakalarda 6,7,8 veya dönen şişelerde (silindir kültürleri)5,9,10 kült haline getirildiği için çeşitli kültür teknikleri önerilmiştir. Bu platformlar, normal embriyo sağkalımında oldukça verimsiz olmasına ve kısa sürelerle sınırlı olmasına rağmen, implantasyondan sonra memeli gelişimi hakkındaki bilginin genişletilmesinde yardımcı olduğunu kanıtladı11,12. Embriyolar kültüre başladıktan sonra 24-48 saat gibi erken bir sürede gelişim geriliği ve morfolojik anomaliler göstermeye başladı.
Bu çalışma, pregastrülasyondan ileri organogenez evrelerine kadar altı güne kadar postimplantasyon gelişimine kadar sürekli gelişime izin veren ex utero embriyo kültür sistemini kurmak için ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır13. Bu makalede, E7.5 embriyolarının (sinir plakası ve baş kat aşaması) arka ekskülasyon aşamasına (~E11) kadar büyümesini destekleyen geliştirilmiş silindir kültürü protokolü ve kültürü statik plakalar ve silindir kültürü platformlarında birleştirerek E5.5/E6.5'ten genişletilmiş kültür açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Weizmann Bilim Enstitüsü Hayvan Koruma Yönergelerine göre gerçeklendi ve ilgili Weizmann Enstitüsü IACUC tarafından onaylandı (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Sağlıklı hamile kadınlardan, Rambam Tıp Merkezi Helsinki Komitesi (#RMB-0452-15) tarafından onaylandığı gibi göbek kordonlarından kan toplamak için bilgilendirilmiş onay vermeleri istendi. Sağlıklı yetişkinlerden, Weizmann Bilim Enstitüsü Helsinki Komitesi'nin (#1566-3) yönergelerine göre kan toplanması için bilgilendirilmiş onayları istendi.
1. Medya hazırlığı
- Diseksiyon ortamını, %10 fetal sığır serumu, 5 mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş fenol kırmızısı ve L-glutamin içermeyen 500 mL Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kullanarak hazırlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin.
NOT: Diseksiyon ortamını 1 aya kadar 4 °C'de tutun. - Embriyonik ortamın %25'ini artı %50'sini sıçan serumu ve %25'ini insan göbek kordonu kan serumu (HCS) veya insan yetişkin kan serumu (HBS) kullanarak biyolojik bir davlumbazın içinde her kültür gününde ex utero embriyo kültürü ortamını (EUCM) taze olarak hazırlayın.
- Embriyonik ortamı hazırlamak için fenol kırmızısı ve L-glutamin olmadan 500 mL DMEM'de 5 mL glutamin, 5 mL HEPES ve 5 mL penisilin/streptomisin ekleyin. 10-15 mL aliquots hazırlayın ve iki aya kadar 4 °C'de saklayın.
NOT: Herhangi bir kirlenme yaşıyorsanız antibiyotik konsantrasyonu iki katına çıkarın. - Sıçan serumu 56 °C'de 30-45 dakika ısı inaktive edin ve 0,22 μm polivinylidene difluorid filtreden filtreleyin. Serumu aynı inaktivasyon gününde kültür için kullanın. HCS veya HBS'yi çözün ve deneyler için hemen kullanın.
NOT: Ticari sıçan serumu tutarlı sonuçlar sağlar (belirgin bir varyasyon olmadan en az 4 lot test edilmiştir). Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi şirket içinde yüksek kaliteli sıçan serumu elde edilebilir8,14. HCS kullanılamıyorsa, şirket içinde toplanan HBS ile değiştirin. Sıçan serumu, HCS ve HBS bir kez refrozen edilebilir ve farklı bir günde kullanılmak üzere -20 °C'de tutulabilir. Refrozen serumu daha büyük hacimli taze çözülmüş serumla çözün ve birleştirin ve yeniden çözmeyin.
2. İnsan göbek kordonu kan serumu ve insan yetişkin kan serumu koleksiyonu
- HCS'yi izole etmek için, planlanan sezaryen doğum gününde sağlıklı hamile kadınlardan göbek kordonu kanı toplayın.
- Göbek kordonu umbilicus'tan 5-7 cm uzakta çift kelepçeleyin ve bebeğin doğumundan hemen sonra kelepçeler arasında transect.
- Plasenta hemoliz izlerini önlemek için yerinde kalırken, büyük delikli 14 G iğne ve 50 mL şırıngayı doğrudan göbek damarından kullanarak manuel olarak kan çekin.
NOT: Bebek ameliyat alanından çıkarıldıktan sonra kan toplayın ve klinik testler için göbek kanı çekilmiştir.
- Toplanan kanı 5 mL prokoagülan steril test tüplerine dağıtın ve tam pıhtılaşmaya izin vermek için hemen 15 dakika boyunca 4 °C'ye aktarın. Pıhtılaşmış test tüplerini 2.500 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
- Hemoliz belirtileri gösteren tüpleri atın (pembe-kırmızı serum). Serumu (sarı renk) 5 mL pipet kullanarak toplayın ve 0,22 μm filtreden geçirin. Serumu 56 °C'lik bir su banyosunda 45 dakika boyunca hemen ısı inaktive edin.
- Inaktive serumun 1-1,5 mL aliquots'larını hazırlayın ve altı aya kadar -80 °C'de saklayın. Gerekirse kuru buz kullanarak -70 °C'de sevk edin.
- Yetişkin insan kanı serumu toplanması için, sağlıklı yetişkinlerden kan alıp göbek kordonu kan serumu için açıklanan aynı protokole uyarak serumu hemen izole edin. HBS'yi altı aya kadar -80 °C'de ısı inaktive edilmiş ve filtrelenmiş aliquots olarak saklayın.
NOT: Yeni olarak şirket içinde hazırlanan insan göbek kordonu serumu ve yetişkin insan serumu, piyasada bulunan seruma üstün sonuçlar verdi. Sezaryen doğum için planlanan 18 yaş üstü ve 40 yaşın altındaki sağlıklı kadınlardan HCS toplayın. Vajinal doğum yapan kadınları ve gestasyonel diyabet veya hipertansiyon da dahil olmak üzere herhangi bir kronik hastalığı veya aktif tıbbi durumu olan kadınları hariç tutun.
3. E7.5'ten E11'e kadar embriyoların ex utero silindir kültürü
- Silindir kültürü inkübatörü ve gaz regülatörü kuruluyor
- Silindir kültürü inkübatör sistemini kullanarak Kültür E7.5 veya daha ileri embriyolar. Embriyo diseksiyonlarından önce rotator'ı ve ısıtma ünitesini 37 °C'de en az 1 saat açın. Gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne otomatik olarak kapatılmış su ekleyin.
NOT: Dönen tamburun bitişiğinde bir termometre yerleştirin ve sık sık inkübatörün içindeki sıcaklığın kararlılığını kontrol edin. İnkübatörü mümkün olduğunca çabuk açın, uzun açılış süresi sıcaklığı artıracak ve embriyo gelişimini etkileyecektir. Gerektiğinde, kültür sırasında minimum yarı kapasitede tutmak için gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne daha fazla otoklavlı su ekleyin. Kuluçka makinesinin içindeki embriyoları bir bezle kaplayarak ışıktan koruyun. - Ana anahtara basarak ve daha sonra Oksijen/Nitrojen ve CO2 kontrolörlerini açarak gaz regülatör modülünü açın (Şekil 1A). İlgili kontrolörleri kullanarak oksijen ve CO2 değerlerini %5 olarak ayarlayın. Gaz regülatörünü açın ve basınç vericislerindeki voltaj anahtarını hareket ettirerek gaz basıncını inç kare başına ~6,5-7 pound (psi) olarak ayarlayın (Şekil 1B). Dijital basınç göstergesi kullanarak gaz basıncı değerini onaylayın.
- Hassas inkübatörün içine tahsis edilen çıkış suyu dolu test tüpünün içinde oluşturulan kabarcıkların oranını kontrol ederek gaz akışını izleyin. Su şişesinin kapağındaki gaz akış vanasını kapatarak/açarak uygun kabarcık oranını ayarlayın. Gaz akışının saniyede 2-4 kabarcık hızında kabarcık oluşumuna izin verdiğinden emin olun veya kabarcık akışını kabarcıklanmanın su dolu çıkış tüpüne çıktığı ilk noktada ayarlayın.
- Kültür şişelerini 2 mL kültür ortamı ile doldurun ve 1 saat önkoşul için oyulmuş dönen tambura takın. Şişeleri tambura kapatmak için oyulmuş silikon bung'ları kullanın. Katı maşaları kullanarak dönen tamburdaki boş alanları kapalı tutun.
NOT: Çıkış tüpünde kabarcık olmaması (sistemden gaz gelmemesi) veya son derece yüksek bir gaz akışı embriyo gelişimini etkileyebilir. Çıkış test tüpüne kabarcık akışının olmaması durumunda, tüm silikon bungların dönen tamburda ve sızdırmazlık sisteminde düzgün bir şekilde konumlandırılıp konumlandırılmadığını kontrol edin ve su şişesinin düzgün bir şekilde kapatıldığını ve tüm borunun doğru bağlandığını kontrol edin. Su şişesine gelen kabarcıklanma eksikliği, gaz regülatöründeki bir arızaya işaret edebilir.
- Silindir kültürü inkübatör sistemini kullanarak Kültür E7.5 veya daha ileri embriyolar. Embriyo diseksiyonlarından önce rotator'ı ve ısıtma ünitesini 37 °C'de en az 1 saat açın. Gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne otomatik olarak kapatılmış su ekleyin.
- Fare embriyolarının hamile farelerden diseksiyonu
- Diseksiyon ortamını 37 °C'de bir inkübatörün içinde ve % 5 CO2'de en az 1 saat boyunca önkoşul haline sokun. Gaz değişimine izin vermek için kapağı hafifçe açık bırakın.
- Hamile dişiyi servikal çıkık ile kurban edin, dişinin karnını% 70 etanol ile temizleyin ve cildi ve karın duvarını makasla kesin. Uterusun bir ucunun yerini bulun ve yumurtalık ile rahim arasındaki kavşakta kesin. Daha sonra, uterus boyunca diğer uca kadar kesin ve oda sıcaklığı Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile dolu 100 mm Petri kabına aktarın.
NOT: Hormon astarlı olmayan, doğal olarak çiftleştirilmiş kadınların kullanılması önerilir. - Kavramları DPBS'de hızlı bir şekilde yıkayın ve embriyo kullanımını kolaylaştırmak için çiftler halinde kesin. Tüm kavramsal çiftleri 60 mm Petri kabında önceden belirlenmiş diseksiyon ortamına taşıyın ve bireysel kavramlar halinde kesin.
- Bir çift brüt kümes gücü kullanarak uterus dokusunu yırtarak kavramüslerin rahim duvarını çıkarın. Armut şeklindeki yaprak dökenin ucunu kesmek için ince mikrocerrahi tokmaklar kullanın. Uzun eksenine paralel olarak embriyonun yanına tokaları yerleştirin ve yaprak dökenleri yarıya bölmek için tokaları açın.
- Son olarak, embriyoyu yaprak dökenden kavrayarak ve ince tokalar kullanarak parietal yumurta sarısı kesesini embriyodan soyarak yumurta silindirine bağlı sağlam ektoplacental koniyi bırakın.
NOT: Embriyoyu etkilememek için, maksimum 30-40 dakika içinde 37 °C'de bir ısıtma plakası ile donatılmış bir mikroskopta diseksiyonlar gerçekleştirin. Bir seferde bir çöp embriyo dozhele. - Diseksiyondan hemen sonra, embriyoların doku kalıntılarına yapışmasını önlemek için bir cam Pasteur pipet kullanarak embriyoları eşkenel diseksiyon ortamı ile dolu yeni bir plakaya aktarın.
- Epiblastta hasar göstermeyen sinir plakası/erken kafa katlama aşamasındaki embriyoları seçin ve şişe başına 5-6 embriyoyu önkoşulu cam kültür şişelerine aktarın.
NOT: Cam Pasteur pipeti hazırlamak için pipet açıklığı bir cam kesici kullanarak embriyolara uyacak kadar yeterli bir boyuta kesin ve kirlenmeyi önlemek için etanolde tutun. Embriyoları aktarmadan önce cam pipeti PBS ile yıkayın. Embriyoları kültür şişesine aktarırken, EUCM'nin seyreltilmesini önlemek için diseksiyon ortamının mümkün olduğunca az hacmini taşıdığından emin olun. - Şişeleri 37 °C'de dönen kültür sistemine% 5 O2 ve% 5 CO2 atmosferine yerleştirin.
- Kültürün her günü, embriyo gelişimini stereomikroskop altında değerlendirmek için şişeleri inkübatörden tek tek çıkarın. Bir şişeyi çıkarırken tamburdaki boş deliği katı bir bung ile kapattığınızdan emin olun. Embriyo boyutuna uyacak şekilde steril bir plastik Pasteur pipet ucunu kesin ve gözlemi kolaylaştırmak için embriyoları bir Petri kabına taşıyın. Embriyoların her zaman orta ile kaplı olduğundan emin olun.
NOT: Vücut ısısındaki düşüş nedeniyle embriyolarda zararlı etkilerden kaçınmak için embriyoların inkübatör dışında olduğu süreyi en aza indirin. Embriyo sağkalımını etkileyen yumurta sarısı kesesi kan damarlarının yırtılmasını önlemek için embriyoları dikkatlice ele alın. - Kültür 1. gününde (E8.5'e eşdeğer), 3 embriyodan oluşan grupları, ekstra 3 mg/mL D-glikoz ve %13 O2, %5 CO2 gaz karışımı içeren 2 mL taze ve önkoşullu EUCM içeren yeni bir şişeye aktarın.
- 48 saat sonra (E9.5'e eşdeğer), iki embriyodan oluşan grupları taze önceden ısıtılmış EUCM artı% 18 O2 ve% 5 CO2 gaz atmosferinde 3.5 mg / mL glikoz ile yeni bir şişeye aktarın.
- 72 saatlik kültürde (E10.5'e eşdeğer), her embriyonun 4 mg/ mL glikoz ve% 21 O2 ve% 5 CO2 gaz kaynağı ile desteklenmiş 1.5-2 mL taze ortam içeren ayrı bir şişeye taşıyın.
NOT: Embriyolar, 4. - Yumurta sarısı kesesini ve amnionunu çıkarmak için ince forseps kullanın ve embriyo morfolojisinin uygun şekilde gözlemlenmesi için göbek kordonunu ayırın. Gaz düzenleme modülunu ve hassas inkübatörü kapatın.
NOT: Embriyo aşamasına göre yeterli gaz atmosferine sahip silindir kültüründe bir cam şişenin içinde kuluçka yaparak kültür ortamını 1 saat önceden kesinleştirin. Kültür şişelerini ve tüm inkübatör cam eşyaları her kullanımdan sonra akan damıtılmış su ile üç yıkama ve ardından% 70 etanol içine batırılmış bir gece yıkama yaparak temizleyin. Damıtılmış su ile üç kez yeniden yıkayın, şişelerin bir gecede kurumasına izin verin ve otoklavla sterilize edin. Aynı şekilde, silikon fişleri düzenli olarak otoklavleyin. Tüm diseksiyon aletlerini% 70 etanol ile iyice temizleyin ve kuru sterilize edin.
4. Genişletilmiş embriyo kültürü E5.5/E6.5'ten E11'e
- Statik plakalarda erken somit evresine (E8.5) kadar kültür pregastrülasyonu (E5.5) ve erken gastrülasyon (E6.5) embriyoları.
- Diseksiyon ortamını 37 °C'de %5 CO2'ye sahip bir inkübatörde 1 saat boyunca önkoşul haline sokun.
NOT: Gaz değişimine izin vermek için tüpün kapağını tamamen kapatmayın. - Her kuyuya 250 μL taze hazırlanmış EUCM ekleyerek kültür plakalarını hazırlayın. Plakaları önkoşasyon için 37 °C'de bir CO2 inkübatörünün içine yerleştirin.
NOT: Embriyo büyümesi için 8 kuyu plakası çok uygun olsa da, plakanın büyüklüğüne göre ortamın hacmi ayarlanarak başka bir tabakta kültür yapılabilir. - Yumurta silindir embriyolarını E7.5 için açıklanan tekniği izleyerek rahim dışına serkt. Embriyonun parietal yumurta sarısı kesesini çıkarın ve sağlam ektoplacental koniyi yumurta silindirine bağlı bırakın.
- Bir mikropipette kullanarak 8 kuyulu plakanın her kuyusuna ayrı embriyoları aktarın ve plakayı 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübatörün içine yerleştirin.
- Embriyoları stereomikroskop altında görüntüleyin ve kültür için sadece iyi biçimlendirilmiş amniyotik boşluğa sahip olanları, belirgin bir hasar olmadan ve Reichert'in zarı olmadan seçin.
NOT: E5.5 embriyolarını transfer etmek için 20 μL pipet ucu ve E6.5 embriyoları transfer etmek için 200 μL uç kullanın. E6.5'ten başlayan kültürler söz konusu olduğunda, HCS yeni toplanan HBS ile değiştirilebilir. - Ortamın yarısını çıkarın ve 24 saat kültürden sonra 250 μL taze hazırlanmış önceden hazırlanmış EUCM ekleyin, embriyoların her zaman kültür ortamına daldırılmasını sağlayın. E5.5'ten başlayan kültürler söz konusu olduğunda, iki günlük kültürden sonra (E7.5'e eşdeğer), 200 μL'yi çıkarın ve 250 μL yeni EUCM ekleyin.
NOT: Statik kültür sırasında embriyolar plakaya (esas olarak plastik plakalar kullanırken) bağlanabilir ve bu da embriyo gelişimini ciddi şekilde tehlikeye atacaktır. Embriyonun plakaya bağlanması, E5.5 embriyolarının kültlemesinin ilk gününde daha sık görülür. Bağlanmayı önlemek için, ince, steril tokmaklar kullanarak embriyoları plaka yüzeyinden dikkatlice uzaklaştırın. Plakanın yüzeyine sadece ektoplacental koninin bağlı kaldığını doğrulayın. - Embriyoları erken somit aşamasında silindir kültürüne aktarın (4-7 somit; E5.5'te ekilen embriyolar için üç günlük kültürden sonra ve kültürler için iki gün E6.5'te başladı), daha önce E8.5 evre embriyolar için açıklanan endikasyonları takip edin.
NOT: Embriyoların yukarıda belirtilenden farklı somite aşamalarında silindir kültürüne aktarılması, daha fazla gelişmenin başarısız olmasına neden olur. E7.5 ex utero kültürlerinin aksine, embriyoları% 21 oksijen ve% 5 CO2 sabit bir atmosferde tutmak mümkündür, bu da dinamik oksijen konsantrasyonuna sahip atmosferlere göre embriyo gelişiminde biraz daha yüksek bir verimlilik sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E7.5 embriyoları için tanımlanan silindir kültürü koşulları (geç gastrülasyon evresi) 4 kültür gününden sonra ortalama %75'e yakın verimle sabit ve normal embriyo büyümesini destekler (Şekil 2 ve Tablo 1). Embriyo gelişiminin verimliliği çeşitli fare genetik geçmişlerine göre değişebilir, ancak sürekli olarak sağlamdır (Şekil 2C). HCS yerine HBS ile takviye, farelerin genetik arka planına bağlı olarak 4 günlük ex utero kültüründen sonra ~% 68 verimlilik sağlar (Şekil 2D ve Tablo 2). Embriyolar yaklaşık 44-somit evreye kadar ex utero rekapitulate uygun gelişim geliştirdi. Daha sonra, embriyolar allantoik plasantın yokluğuna bağlı embriyonik anormallikler sunar ve bu aşamada artan vücut büyüklüğü göz önüne alındığında yetersiz oksijenlenme ve besin kaynağı ile sonuçlanır.
Statik plakalarda E6.5 embriyolarının (erken çizgi) gelişimi, hem HCS hem de HBS (Şekil 3, Tablo 3 ve Tablo 4) ile EUCM kullanılarak erken somit evresi E8.5'e kadar% >90 verimlilikle doğru bir şekilde yeniden özetlenmiştir (E5.5 ila E8.5 arasında embriyo evrelemesinin ayrıntılı bir açıklaması için bkz. Gastrülasyondan ileri organogeneze kadar olan ex utero kültürü, kültürleri statik plakalarda birleştirerek sabit bir % 21 oksijen atmosferinde silindir kültürü, sırasıyla HCS ve HBS kullanarak 44 somit aşamasına% 55 ve% 26'lık uygun gelişim tahmini bir verimlilik sağlar (Şekil 3A, Tablo 3 ve Tablo 4). Bu embriyolarda rahimde geliştirilen embriyolara göre 1-2 somit çiftinin gecikmesi vardır. Verimlilikteki en büyük düşüş, eksenel tornalamanın ve sinir tüpünün kapanmasının başarısızlığı nedeniyle E8.5'ten E9.5'e geçişte gerçekleşir.
E5.5 pregastrulating embriyolarından başlayan kültürler, yaklaşık % 46'sının erken somite evresine (E8.5) uygun gelişimin verimliliğini gösterir ve embriyoların yaklaşık% 17'si silindir kültürüne transfer edildikten sonra altı günlük kültürden sonra uygun gelişimi tamamlayacaktır (Şekil 4 ve Tablo 5). Genişletilmiş ex utero kültürü embriyolardaki gelişimsel gecikmeyi uzatır, E5.5'te ekilen embriyolar in vivo embriyolara kıyasla 2-4 çift somit gecikme gösterir. Bununla birlikte, morfogenez ve doku gelişimi yaklaşık 42 somit evreye kadar düzgün bir şekilde ilerler.
E7.5, E6.5 ve E5.5'ten başlatılan kültürler için embriyolarda görülen en yaygın kusurlar Şekil 5A-C'de örneklenmiştir. Diseksiyon anında, epiblast veya ekstraembriyonik bölgede küçük hasarları olan embriyoların yanı sıra Reichert'in zarını koruyan embriyolar atılmalıdır. Aynı şekilde, erken embriyolar düzgün büyümeyecektir (ölü embriyolar için Şekil 5B'ye bakınız) veya ciddi gelişimsel gecikmeler göstermez (gecikmiş bir embriyo için Şekil 5B'ye bakın). Embriyonik epiblastın plaka yüzeyine bağlanması, bağlanmanın konumuna ve derecesine bağlı olarak gelişimi etkileyecektir. Epiblastın veya tüm embriyonun bir kısmının bağlanması daha fazla gelişmenin başarısızlığa neden olur (ekli bir embriyo için Şekil 5B'ye bakın).
E8.5'te (erken somit evresi) kusurlu embriyoların yüzdesinde gözlenen başlıca anormallikler, yumurta sarısı kesesi dışındaki arka bölgenin gelişimi veya nöral kıvrımların büyümesindeki kusurlardır (Şekil 5A,B). E5.5'te başlayan kültürler söz konusu olduğunda, sıklıkla gözlenen bir gelişimsel kusur, küçük, az gelişmiş bir epiblast varlığıdır (Şekil 5C). E9.5'e eşdeğer zamanda, nöral kıvrımların kapanmasındaki kusurlar, eksenel tornalama başarısızlığı veya beyin büyümesindeki bir eksiklik en sık gözlenen anormallikleri temsil eder (Şekil 5). E10.5/E11'de en sık gözlenen gelişimsel defektler baş bölgesindeki anomaliler, yumurta sarısı kesesinde normal kan dolaşımının bozulması ve perikardiyal efüzyondur (Şekil 5). Bir ana kan damarının yırtılması ve kan çıkışı embriyonun daha sonra ölümüne neden olabilir. Özellikle, belirgin yumurta sarısı kesesi dolaşımının yokluğunda bile embriyonun kendisinin uygun büyümesine ulaşılabilir. E11'e eşdeğer aşamanın ötesinde kültürde tutulan embriyolar, uygun doku oksijenasyonu eksikliği nedeniyle birkaç saat sonra vücut büzülmesi ve ölüm sergiler.
Şekil 1: Silindir kültürü inkübatörüne uyarlanmış gaz ve basınç düzenleme sistemi. (A) Silindir kültürü inkübatörüne bağlı gaz regülasyon modülünün üst görünümü. N2 ve CO2, oksijen/CO2 konsantrasyonlarının ve gaz basıncının hassas kontrolünü sağlamak için gaz regülatörüne girer. Gazlar, santrifüj üfleyici tarafından karıştırıldıkları ve pozitif basınç üreten bir pompa tarafından inkübatöre enjekte edildikleri karıştırma kutusuna yönlendirilir. Gaz girişten bir su şişesine ve daha sonra mühürlü şişelere akar. (B) Gaz ve basınç düzenlemesi için elektronik modülün dahili konfigürasyonu. Basınç vericisi üzerinde ayarlanan voltaj değeri, pompanın gaz karıştırma kutusunun içinde oluşturduğu basıncı düzenler (bu özel modelde 6-7 psi basınç elde etmek için 5-6 V). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ex utero kültür platformu, ileri organogeneze kadar E7.5 embriyolarının büyümesini destekler. (A) E7.5 ex utero embriyo kültür protokolünü gösteren diyagram. (B) Geç gastrülasyondan (E7.5) 44 somit evresine (E11) kadar 4 gün boyunca ekstre gelişen kültürlü embriyo gruplarının temsili parlak alan görüntüleri. Her 24 saat değerlendirilen somite sayısındaki tipik varyasyon belirtilir. Ölçek çubukları = 500 μm. (C, D) E7.5'ten başlayarak 1-4 günlük kültürde normalde geliştirilen embriyoların yüzdesi fare ebeveyn suşları ve serum takviyesi (C, insan göbek kordonu kan serumu; D, insan yetişkin kan serumu). Panel A 13'ten değiştirildi. Kısaltmalar: EUCM = ex utero embriyo kültürü ortamı; HCS = insan göbek kordonu kan serumu; HBS = insan yetişkin kan serumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Geç organogenez kadar E6.5 erken gastrulating fare embriyoları yetiştirmek için genişletilmiş ex utero kültür protokolü. (A) Statik plakaları ve dönen şişe sistemlerini birleştiren genişletilmiş ex utero kültür protokolünün şematik illüstrasyonu. (B) Embriyoların parlak alan görüntüleri, E6.5'ten 44 somit aşamasına kadar beş gün boyunca ex utero'ya kültüre edildi. Her 24 saat değerlendirilen somite sayısındaki tipik varyasyon belirtilir. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: E5.5'ten geç organogenez evrelerine kadar pregastrülasyon fare embriyolarının sürekli ex utero kültürü. (A) Ex utero kültürünün şematik tasviri E5.5 embriyoları için protokol. (B) E5.5'ten 42 somit aşamasına kadar altı gün boyunca eksp tesperi kültürlü embriyoların temsili parlak alan görüntüleri. Her 24 saat değerlendirilen somite sayısındaki tipik varyasyon belirtilir. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Embriyolarda gözlenen temsili gelişimsel kusurlar ex utero kültürlü. (A-C) E7.5 (A), E6.5 (B) veya E5.5 'ten (C) başlayarak ex utero yetiştirilen anormal fare embriyolarının parlak alan mikroskopi görüntüleri. Her görüntüde kusurun genel bir açıklaması sağlanır. Ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Koitum sonrası E7.5 gün izole embriyoların uygun gelişiminin etkinliği. Embriyolar EUCM'de 4 gün boyunca ex utero (%25 İnsan Göbek Kordonu Kan Serumu) kültüre edildi. [-] deneysel gereksinimler nedeniyle kültürlerin devam etmediğini gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: E7.5'te izole edilen embriyoların uygun gelişiminin verimliliği, 4 gün boyunca kültürlü ex utero, İnsan Göbek Kordonu Kan Serumu'nun yerine yeni izole edilmiş İnsan Yetişkin Kan Serumu. [-] deneysel gereksinimler nedeniyle kültürlerin devam etmediğini gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: E6.5'te izole edilen embriyoların (B6D2F1/ICR) doğru gelişiminin verimliliği ve EUCM (%25 İnsan Göbek Kordonu Kan Serumu) kullanılarak 5 gün boyunca ek rahim kültürü. Ex utero kültürü statik kültürde iki gün (%21 O2) ve ardından üç gün boyunca dönen şişelerde %21 O2'de yapıldı. [-] deneysel gereksinimler nedeniyle kültürlerin devam etmediğini gösterir. Kısaltma: NA = edinilmedi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: E6.5'te izole edilmiş embriyoların (B6D2F1/ICR) doğru gelişiminin verimliliği ve EUCM kullanılarak 5 gün boyunca kültürlü ex utero (İnsan Göbek Kordonu Kan Serumu'nun yeni izole edilmiş İnsan Yetişkin Kan Serumu ile değiştirilmesi). Embriyolar iki gün boyunca statik kültürde (%21 O2) ve ardından %21 O2'de dönen şişelerde üç gün geliştirilmiştir. [-] deneysel gereksinimler nedeniyle kültürlerin devam etmediğini gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 5: E5.5'te izole edilmiş embriyoların (B6D2F1/ICR) uygun gelişiminin etkinliği ve EUCM (%25 İnsan Göbek Kordonu Kan Serumu) kullanılarak 6 gün boyunca ek rahim kültürü. Embriyolar üç gün boyunca statik kültürde (%21 O2) ve ardından %21 O2'de dönen şişelerde üç gün geliştirilmiştir. [-] deneysel gereksinimler nedeniyle kültürlerin devam etmediğini gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan kültür protokolü, E5.5'ten E11'e kadar altı güne kadar uygun ve sürekli fare embriyosu geliştirme ex uterosunu sürdürebilir. Daha önce, bu gelişim aşamalarında embriyolar kültürde sadece kısa süreler için (48 saate kadar) normal olarak gelişebilirdi 15. Gaz regülasyon modülünün oksijen konsantrasyonunun ve hiperbarik gaz basıncının hassas kontrolü için silindir kültürü inkübatörüne kaplanması, burada açıklanan uygun fare embriyo kültürü için kritik öneme sahiptir. Gaz basıncının 7 psi'ye yükseltilmesi oksijen difüzyonunu artırarak, uzun vadede embriyoya zararlı olabilecek% 95 O216'nın daha önce kullanılan koşullarının aksine,% 21 O2 / 5% CO2'ye kadar bir atmosferde E11'e kadar embriyo gelişimine izin verir. Ayrıca, erken postimplantasyon embriyogenez hipoksik koşullar altında gerçekleştiği için oksijen konsantrasyonunun embriyonik gelişimde kritik bir rol oynadığı bilinmektedir17. Buna göre, geç gastratlama embriyolarının başarılı kültürü, embriyo büyüdükçe oksijen konsantrasyonunda dinamik bir artışla birlikte ilk% 5 O2 atmosferini gerektirir. Dikkat çekici bir şekilde, statik kültürde pre/erken gastrulating embriyoların %5 O2'de kült ederek uygun embriyo gelişiminin verimliliğini %21 O2'ye göre önemli ölçüde azalttı ve E9.5'e daha fazla gelişemediler. İkincisi, dönen şişelerdeki kültüre kıyasla statik kültürdeki embriyonik dokular aracılığıyla daha yavaş besin ve oksijen difüzyon oranı ile açıklanabilir1,10.
Ayrıca, sıçan ve insan göbek kordonu kan serumunun yüksek içeriği, erken postimplane embriyoların yetiştirilmesi için sadece sıçan serumu ile desteklenmiş medyaya göre daha tutarlı sonuçlar sağlar13,18. Daha da önemlisi embriyo kültürü için kullanılan serum taze çıkarılan kandan hazırlanmalıdır. Tüm embriyo kültürü için yüksek kaliteli sıçan serumu ticari olarak mevcut olmasına rağmen, insan serumu şirket içinde izole edilmelidir. İnsan göbek kordonu kan serumu ile takviye, yaygın olarak erişilebilen ve hala tutarlı ve verimli embriyo büyümesi sağlayan insan yetişkin kanından izole edilmiş serum ile değiştirilebilir.
Başarılı ve verimli embriyo gelişimi ex utero da doğru embriyo izolasyonuna oldukça bağlıdır. İlk olarak diseksiyon işlemi 37 °C'de ısıtılan diseksiyon ortamında yapılmalı ve kesilen embriyolar 30 dakika içinde kültür şişelerine/plakalarına aktarılmalıdır. İkinci olarak, yaprak döken yaprak dökenlerden kesin embriyo izolasyonu ve Epiblast'a zarar vermeden Reichert zarının çıkarılması, embriyo gelişiminin yüksek verimliliğini elde etmek için anahtardır. Üçüncüsü, erken/gecikmiş embriyolar düzgün büyümeyeceği için kültür için sadece yeterli aşamada embriyolar seçilmelidir.
Transfer sırasında embriyoların ele alınması, ek rahim kültürü sırasında, esas olarak embriyonik yumurta sarısı kesesinin gelişmesinden sonra bir başka önemli noktadır. Embriyolar dikkatli bir şekilde transfer edilmelidir, çünkü ana yumurta sarısı kesesi kan damarlarının hasarı uygun gelişimi etkileyebilir. Genel olarak, embriyo kültürünün süresi ne kadar uzunsa, normal embriyo gelişiminin verimliliği o kadar düşük olur, yani E7.5'te ekilen embriyolar E6.5 veya E5.5'te ekilenlerden daha yüksek verimle gelişir. Ayrıca, biyolojik bir davlumbazın içine tahsis edilen bir diseksiyon mikroskobu mevcut değilse, ortamda antibiyotiklerin varlığı kontaminasyonu önlemek için temeldir.
Diğer platformların, basınç düzeylerinin veya koşulların, mevcut protokolle elde edilen sonuçlarla benzer veya gelişmiş sonuçlara olanak sağlayabileceği göz ardı edilemez. Rahim içi gelişimin gözlemlediği embriyo gelişimine eşit bir verime ulaşmak için bu çalışmada açıklanan koşulların daha da optimize edilmesi gerekir. Ayrıca, tanımlanmış bir serumsuz ortamın gelecekteki gelişimi, memeli embriyo gelişimi sırasında spesifik metabolik ve kimyasal gereksinimleri tanımlamaya ve toplu serum değişkenliğini azaltmaya yardımcı olabilir. Mevcut ayarlarda dönen şişe kültürünü kullanarak E8.5'den sonra sürekli besin ve gaz karıştırma ihtiyacı, organogenez aşamalarında uzun süreli görüntüleme yeteneklerini sınırlar. Mikroskopi kurulumlarıyla birleştiğinde statik kültürde gaz ve besin karışımı sağlayan mikroakışkan cihazların gelecekteki gelişimi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı olabilir.
Embriyo kültürlü ex utero deneysel olarak manipüle edilebilir ve uterus dışındaki ileri organogenez aşamalarına kadar kültürde tutulabilir. Daha önce, elektroporasyon veya lentiviral enfeksiyon ile genetik manipülasyon, canlı görüntüleme, hücre greftleme ve teratojenik çalışmalar gibi embriyo geliştirmede çeşitli pertürbasyonlar getirme yeteneğini gösterdik13. Sonuçta, bu platform, altı güne kadar erken postimplantasyon gelişimi için canlı fare embriyolarında gerçek zamanlı deneylere izin vererek memelilerdeki hücre kaderi spesifikasyonlarını ve organ oluşum mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H.H, Biological Industries Ltd'nin danışmanıdır ve burada açıklanan silindir ve statik kültür koşullarını kapsayan bir patent başvurusunda bulunmuştur (J.H.H. ve Weizmann Bilim Enstitüsü tarafından yapılmıştır). Diğer yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Pascal ve Ilana Mantoux tarafından finanse edildi; Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Konseyi (FAMRI); İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF) profesörlüğü, BSF, Helen ve Martin Kimmel Kök Hücre Araştırmaları Enstitüsü, Helen ve Martin Kimmel Yenilikçi Araştırma Ödülü; İsrail Bilim Vakfı (ISF), Minerva, Sherman Tıbbi Kimya Enstitüsü, Nella ve Leon Benoziyo Nörolojik Hastalıklar Merkezi, David ve Fela Shapell Genetik Bozukluklar Araştırma Merkezi, Kekst Aile Tıbbi Genetik Enstitüsü, Dr. Beth Rom-Rymer Kök Hücre Araştırma Fonu, Edmond de Rothschild Vakıfları, Zantker Hayır Kurumu, Zvia Zeroni Mülkü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al.
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F.
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
