Summary
Il protocollo descrive un metodo per lo studio della viscoelasticità della matrice extracellulare e della sua dipendenza dalla composizione proteica o da fattori ambientali. Il sistema di matrice bersaglio è la zonula del topo. Le prestazioni del metodo sono dimostrate confrontando il comportamento viscoelastico delle fibre zonulari wild-type con quelle prive di glicoproteina-1 associata alle microfibrille.
Abstract
L'elasticità è essenziale per la funzione di tessuti come vasi sanguigni, muscoli e polmoni. Questa proprietà deriva principalmente dalla matrice extracellulare (ECM), la rete proteica che lega insieme cellule e tessuti. Come le proprietà elastiche di una rete ECM si relazionano alla sua composizione, e se le proprietà di rilassamento dell'ECM svolgono un ruolo fisiologico, sono domande che devono ancora essere completamente affrontate. Parte della sfida risiede nella complessa architettura della maggior parte dei sistemi ECM e nella difficoltà di isolare i componenti ECM senza comprometterne la struttura. Un'eccezione è la zonule, un sistema ECM che si trova nell'occhio dei vertebrati. La zonula comprende fibre da centinaia a migliaia di micrometri di lunghezza che coprono lo spazio privo di cellule tra la lente e la parete oculare. In questo rapporto, descriviamo una tecnica meccanica che sfrutta la struttura altamente organizzata della zonula per quantificare le sue proprietà viscoelastiche e per determinare il contributo dei singoli componenti proteici. Il metodo prevede la dissezione di un occhio fisso per esporre la lente e la zonula e impiega una tecnica di pull-up che allunga le fibre zonulari allo stesso modo mentre la loro tensione viene monitorata. La tecnica è relativamente economica ma abbastanza sensibile da rilevare alterazioni nelle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari in topi privi di proteine zonulari specifiche o con l'invecchiamento. Sebbene il metodo qui presentato sia progettato principalmente per studiare lo sviluppo e la malattia oculare, potrebbe anche servire come modello sperimentale per esplorare domande più ampie riguardanti le proprietà viscoelastiche degli ECM elastici e il ruolo di fattori esterni come la concentrazione ionica, la temperatura e le interazioni con le molecole di segnalazione.
Introduction
L'occhio di un vertebrato contiene una lente ottica vivente che aiuta a mettere a fuoco le immagini sulla retina1. La lente è sospesa sull'asse ottico da un sistema di fibre delicate e orientate radialmente, come illustrato nella Figura 1A. Ad un'estremità, le fibre si attaccano all'equatore della lente e, all'altra, alla superficie del corpo ciliare. Le loro lunghezze coprono distanze che vanno da 150 μm nei topi a 1 mm negli esseri umani. Collettivamente, queste fibre sono conosciute come la zonula di Zinn2, la zonula ciliare o semplicemente la zonula. Traumi oculari, malattie e alcune malattie genetiche possono influenzare l'integrità delle fibre zonulari3, con conseguente eventuale fallimento e conseguente perdita della vista. Nei topi, le fibre hanno un nucleo composto principalmente dalla proteina fibrillina-2, circondata da un mantello ricco di fibrillina-14. Sebbene le fibre zonulari siano uniche per l'occhio, hanno molte somiglianze con le fibre ECM a base di elastina che si trovano altrove nel corpo. Questi ultimi sono coperti da un mantello fibrillin-15 e hanno dimensioni simili alle fibre zonulari6. Altre proteine, come le proteine leganti β che trasformano il latente e la glicoproteina-1 associata alle microfibrille (MAGP-1), si trovano in associazione con entrambi i tipi di fibre7,8,9,10,11. Il modulo elastico delle fibre zonulari è nell'intervallo di 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, paragonabile a quello delle fibre a base di elastina (0,3-1,2 MPa)17. Queste somiglianze architettoniche e meccaniche ci portano a credere che qualsiasi intuizione sui ruoli delle proteine associate agli zonuli possa aiutare a chiarire i loro ruoli in altre fibre elastiche ECM.
Lo scopo principale dello sviluppo del metodo qui descritto è quello di ottenere informazioni sul ruolo di specifiche proteine zonulari nella progressione della malattia ereditaria degli occhi. L'approccio generale è quello di confrontare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi wild-type con quelle dei topi portatori di mutazioni mirate nei geni che codificano per le proteine zonulari. Mentre diversi metodi sono stati utilizzati in precedenza per misurare le proprietà elasto-meccaniche delle fibre zonulari, tutti sono stati progettati per gli occhi di animali molto più grandi12,13,14,15,16. In quanto tali modelli non sono geneticamente trattabili; abbiamo cercato di sviluppare un metodo sperimentale che fosse più adatto agli occhi piccoli e delicati dei topi.
Il metodo che abbiamo sviluppato per valutare la viscoelasticità delle fibre zonulari di topo è una tecnica a cui ci riferiamo come pull-up assay4,18, che è riassunto visivamente nella Figura 1. Di seguito viene fornita una descrizione dettagliata del metodo pull-up e l'analisi dei risultati. Iniziamo descrivendo la costruzione dell'apparato, comprese le parti tridimensionali (stampate in 3D) utilizzate nel progetto. Successivamente, descriviamo in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere e preparare gli occhi per l'esperimento. Infine, forniamo istruzioni dettagliate su come ottenere dati per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari. Nella sezione Risultati rappresentativi, condividiamo dati precedentemente non pubblicati ottenuti con il nostro metodo sulle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari di topi privi di MAGP-119 e un set di controllo ottenuto da animali selvatici di pari età. Infine, concludiamo con osservazioni generali sui vantaggi e i limiti del metodo e suggerimenti per potenziali esperimenti che possano chiarire come i fattori ambientali e biochimici influenzano le proprietà viscoelastiche delle fibre ECM.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per gli studi sugli animali della Washington University e hanno aderito alla Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Fabbricazione di parti specializzate e costruzione di apparecchi
- Fabbricazione di parti specializzate
- Fabbricazione di sonde. Tenere un capillare di vetro ad angolo, come mostrato nel pannello di sinistra della Figura 2A. Posizionare una fiamma da un accendisigari a circa 2 cm da un'estremità e tenerla lì fino a quando l'estremità si piega di 90°, come mostrato nel pannello di destra della Figura 2A.
- Esempio di fabbricazione della piattaforma. Utilizzando un software di disegno 3D, progettare una piattaforma di 30 x 30 x 5 mm e contenente rientranze emisferiche di diametro 2,0, 2,5 e 3,0 mm, come mostrato nella Figura 2B.
- Fabbricazione portasonde. Utilizzando il software di disegno 3D, progettare un supporto che contenga la sonda capillare e collegarla a un micromanipolatore (vedere la Figura 2C).
NOTA: un file 3D di esempio per la fabbricazione della piattaforma e la fabbricazione del supporto della sonda in formato STL è disponibile su richiesta presso l'autore corrispondente. - Assemblaggio lente negativa. Posizionare una lente cilindrica negativa (-75 mm di lunghezza focale e circa 50 mm di altezza e lunghezza) come mostrato in Figura 1C e Figura 1D per correggere la distorsione causata dall'aggiunta di fluido alla capsula di Petri (l'aggiunta di fluido distorce la vista dell'occhio sezionato quando viene ripreso di lato).
- Incollare l'obiettivo negativo a una delle basi a 2 fessure (vedere la Figura 2D per il posizionamento dell'obiettivo sulla base).
- Assemblate le parti rimanenti come illustrato nella Figura 2D.
- Regolare l'altezza del palo in modo che l'obiettivo passi a malapena sopra la bilancia e stringere la vite nel supporto del palo.
- Costruzione di apparecchi
- Installare su un computer il programma di registrazione fornito con la bilancia, il software della telecamera del microscopio e l'applicazione del controller micrometrico motorizzato.
- Collegare il micrometro motorizzato al controller del servomotore e quest'ultimo al computer. Avviare l'applicazione del controller del motore e modificare le impostazioni del motore.
NOTA: Le impostazioni motorie, elencate di seguito, sono state scelte a seguito di esperimenti preliminari che hanno rivelato che le sollecitazioni si rilassano su una scala temporale di 10-20 s. Sulla base di questa determinazione, abbiamo selezionato una velocità e un'accelerazione che hanno permesso al motore di completare uno spostamento di 50 μm in un tempo inferiore al tempo di rilassamento, ma non troppo breve per evitare di scuotere il campione. Qui abbiamo scelto un tempo di spostamento di circa 5-10 s. - Impostare la velocità massima a 0,01 mm/s e l'accelerazione a 0,005 mm/s2.
- Installare la telecamera nel microscopio di ispezione e testare il software di imaging della telecamera.
- Posizionare la bilancia sullo spazio del banco dedicato all'apparecchio.
- Incolla una piattaforma stampata in 3D (dal passaggio 1.1.2) a una piastra di Petri e aggiungi una perla di vetro da 2-3 mm a uno dei pozzetti. Posizionare la piastra di Petri sulla bilancia in modo che la perla si trovi vicino al centro della padella.
- Sostituire il micrometro manuale dal micromanipolatore con quello motorizzato.
- Avvitare le due viti 4-40 nel portasonda. Collegare il supporto della sonda al manipolatore come illustrato nella Figura 1C.
- Preparare una sonda come illustrato nella Figura 2A, posizionarla all'interno del supporto della sonda con la parte piegata rivolta verso il basso e stringere le viti.
- Posizionare il micromanipolatore sul tavolo in modo tale che la punta della sonda sia sopra il tallone sulla piattaforma. Applicare il micromanipolatore al tavolo per evitare movimenti accidentali durante l'esperimento.
- Posizionare il microscopio laterale sul tavolo in modo che il tallone sia al centro del suo campo visivo e a fuoco.
2. Preparazione del campione e acquisizione dati
- Fissazione e dissezione degli occhi
- Mantenere topi wild-type e animali Magp1-null su uno sfondo identico C57 / BL6J. Eutanasia topi di 1 mese o 1 anno per inalazione di CO2 .
- Rimuovere gli occhi con una pinza fine e fissare i globi enucleati a 4 °C durante la notte in soluzione salina tamponata con paraformaldeide/fosfato al 4% (PBS, pH 7,4). Mantenere una pressione positiva di 15-20 mmHg nell'occhio durante il processo di fissazione, come descritto6.
NOTA: Gli esperimenti sono condotti su topi maschi, per controllare possibili differenze legate al sesso nella dimensione del globo oculare. La pressione positiva assicura che il globo rimanga gonfiato, preservando lo spazio tra la lente e la parete dell'occhio attraversata dalle fibre zonulari. - Lavare gli occhi per 10 minuti in PBS. Usando le forbici chirurgiche oftalmiche e lavorando sotto uno stereomicroscopio, fai un'incisione a tutto spessore nella parete dell'occhio vicino alla testa del nervo ottico.
- Estendere il taglio in avanti fino all'equatore e quindi intorno alla circonferenza equatoriale dell'occhio. Fare attenzione a risparmiare i delicati processi ciliari e le fibre zonulari associate.
- Rimuovere il retro del globo, esponendo la superficie posteriore della lente.
- Utilizzare la pinza per rimuovere un occhio sezionato dalla soluzione tampone e posizionarlo su una salvietta asciutta con la cornea rivolta verso il basso. Trascinare delicatamente la cornea sulla superficie della salvietta per asciugarla.
- Aggiungere 3 μL di colla istantanea ai pozzetti della piattaforma che ospiteranno l'occhio nella capsula di Petri.
- Posizionare il piatto sulla piastra del palco dello stereomicroscopio in modo che il pozzo con la colla sia in vista.
- Trasferire l'occhio dalla salvietta al bordo del pozzetto che contiene la colla. Quindi, trascina con attenzione l'occhio nel pozzo e regola rapidamente il suo orientamento in modo che la parte posteriore dell'obiettivo sia più in alto.
- Asciugare il lato esposto della lente tamponandola delicatamente con l'angolo di una salvietta asciutta.
- Applicare un tampone di colla istantanea sul fondo di una piastra di Petri da 50 mm e cementare la piattaforma ad esso.
- Misurazione della risposta viscoelastica zonulare
- Accendere la bilancia, avviare il programma di registrazione della bilancia e il software della fotocamera. Assicurarsi che il programma di registrazione possa acquisire dati per 30 minuti, poiché alcune prove possono durare così a lungo.
- Accendere il controller del servomotore e avviare l'applicazione del controller sul computer. Assicurarsi che il controller sia impostato per muoversi con incrementi di 50 μm utilizzando parametri di movimento simili a quelli descritti nella NOTA nel passaggio 1.2.2.
- Create una piegatura di 90° in un'asta capillare come descritto al punto 1.1.1.
- Far scivolare il capillare piegato nel portasonda capillare e stringere le viti di fissaggio.
NOTA: per ridurre al minimo la disidratazione del campione, si consiglia di completare i passaggi da 1 a 4 prima o durante la dissezione oculare. - Aggiungere una piccola perla (~ 1 mm) di colla a polimerizzazione UV sulla punta del capillare.
- Utilizzando le regolazioni manuali sul manipolatore, spostare la punta della sonda capillare in modo che sia direttamente sopra il centro dell'obiettivo. Verificare se la parte inferiore della colla UV appare centrata sopra la parte superiore dell'obiettivo se vista dalla parte anteriore (mediante ispezione visiva) e laterale (attraverso la fotocamera del microscopio).
- Mentre si guarda attraverso la fotocamera, abbassare la punta della sonda fino a quando la colla UV non entra in contatto con l'obiettivo e copre da un terzo a metà della sua superficie superiore.
- Utilizzare una sorgente luminosa UV (380-400 nm) a bassa intensità (~ 1 mW), direzionale e quasi visibile per polimerizzare la colla.
NOTA: queste specifiche sono sufficienti per polimerizzare la colla in pochi secondi riducendo al minimo il potenziale di indurre la reticolazione proteica. Le sorgenti di luce UV fornite con penne per colla UV commerciali soddisfano queste specifiche. - Aggiungere la soluzione pbs al piatto fino a quando l'occhio è coperto da liquido ad una profondità di almeno 2 mm.
- Posizionare la lente cilindrica davanti al microscopio di ispezione e il più vicino possibile alla capsula di Petri senza toccarla.
- Avviare contemporaneamente il programma di registrazione e un programma timer. Scatta una foto dell'occhio / sonda usando la fotocamera.
- Dopo 60 s, iniziare un altro spostamento di 50 μm, e successivamente ogni 60 s fino a quando l'esperimento è completo, cioè fino a quando tutte le fibre sono state rotte. Si noti che il segnale non tornerà ai livelli basali a causa dell'evaporazione del buffer durante l'esperimento. Correggere la deriva che ne deriva nelle letture durante l'analisi dei dati, come esemplificato nel passaggio 2.2.14.
- Al termine di un'esecuzione, salvare i dati di registrazione della scala ed esportarli in un formato compatibile con il foglio di calcolo, ad esempio un formato .csv. Salvare le immagini dell'obiettivo raccolte durante la corsa.
- Importare i dati in un foglio di calcolo. Utilizzare la prima e l'ultima lettura della scala per interpolare la deriva nella lettura di fondo nel tempo dovuta all'evaporazione (vedere la Figura 3). Sottrarre la lettura interpolata dalla lettura in ogni punto temporale.
NOTA: se si utilizza un foglio di calcolo, l'interpolazione può essere eseguita automaticamente inserendo la formula = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B)))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 nella cella a destra della prima lettura della scala, quindi spostando il cursore nell'angolo destro inferiore della cella e trascinandolo verso il basso fino all'ultimo valore di dati. La formula presuppone che i dati siano organizzati in una colonna con il primo punto dati visualizzato nella cella B2. Se lo si desidera, i dati elaborati nella fase 2.2.14 possono essere analizzati con il modello viscoelastico quasi elastico sviluppato da uno dei coautori, il Dr. Matthew Riley4.
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Representative Results
La tecnica di pull-up qui descritta fornisce un approccio semplice per determinare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi. In breve, l'occhio del topo viene prima preservato mediante iniezione di un fissativo alla pressione intraoculare fisiologica. Questo approccio mantiene l'inflazione naturale dell'occhio e mantiene le fibre correttamente pretensionate (la fissazione è stata ritenuta accettabile dopo che esperimenti preliminari hanno dimostrato che non alterava significativamente l'elasticità o la forza delle fibre). La parte posteriore dell'occhio del mouse viene quindi rimossa mediante dissezione per esporre la lente e le fibre zonulari che la sospendono. La parte anteriore dell'occhio è fissata a una piattaforma e posizionata all'interno di una capsula di Petri che poggia su una scala digitale. Successivamente, un capillare di vetro attaccato a un micromanipolatore viene cementato sulla superficie posteriore della lente. La lente viene quindi sollevata con incrementi di 50 μm mentre viene registrata la forza sulla scala. Una riduzione del peso apparente del preparato fornisce informazioni sulle forze che allungano le fibre. Ad ogni spostamento segue un periodo di equilibratura della durata di circa 1 min per osservare l'eventuale rilassamento dello stress indotto dallo spostamento. Infine, i risultati vengono analizzati utilizzando un modello viscoelastico quasi lineare progettato specificamente per la geometria delle fibre zonulari del topo e la direzione dell'attrazione per il test4.
I dati viscoelastici tipici ottenuti con il nostro metodo sono mostrati nella Figura 3. La curva appare invertita (negativa) poiché la forza di sollevamento sulla lente riduce il peso del gruppo piatto/piattaforma/occhio sulla bilancia di una quantità equivalente. La risposta include picchi di forza istantanei durante ciascuno degli spostamenti verticali di 50 μm della lente, seguiti da una fase di rilassamento con una durata dell'ordine di 10 s. Un simile rilassamento dello stress è stato osservato per le fibre zonulari bovine12. L'entità delle forze istantanee e rilassate aumenta ad ogni passo fino a circa 1000 s (~ 800 μm di spostamento totale) e poi inizia a scendere quando le fibre iniziano a fallire. Il cedimento della zonula è completato dal punto temporale di 1.500 s (~ 1,25 mm di spostamento totale). Si noti che a causa dell'evaporazione del buffer nel corso dell'esperimento, la curva non ritorna alla lettura iniziale dopo che la lente è stata liberata dall'occhio.
La Figura 4 mette a confronto le risposte ottenute per un topo knockout Magp-1 (curva rossa) e un animale selvatico di tipo adatto all'età (curva blu). Queste curve sono state corrette per evaporazione, invertite, e le misurazioni grezze della massa (vedi Figura 3) sono ora espresse come forza (con unità di mN). La risposta viscoelastica iniziale della zonula impoverita di Magp-1 (tempo 0-600 s) assomiglia molto a quella del wild-type, suggerendo che le proprietà viscoelastiche della zonule non sono state significativamente alterate dall'assenza di Magp-1. Tuttavia, le fibre sembrano rompersi a una tensione molto più bassa rispetto alle loro controparti wild-type.
Per illustrare l'affidabilità del metodo, abbiamo raccolto dati da più animali sulla massima forza istantanea applicata agli occhi prima che le loro fibre si rompessero. I risultati sono mostrati nella Figura 5. I dati per i topi di 1 mese mostrano valori molto piccoli per l'errore standard della media (SEM) nonostante il numero relativamente basso di campioni utilizzati (n = 5 o 6), suggerendo un'elevata riproducibilità. I risultati indicano che la forza delle fibre differisce significativamente tra i due genotipi (valore p = 2,4 x 10-6). I risultati non mostrati nelle figure suggeriscono anche che c'è un aumento sottile ma statisticamente significativo della forza di rottura con l'età per gli animali selvatici (valore p = 0,024).
Il metodo pull-up può anche generare stime quantitative dei parametri viscoelastici che tengono conto delle variazioni osservate nelle risposte temporali. La Tabella 1 riassume i parametri più adatti ai nostri dati MAGP-1, ottenuti con un modello viscoelastico quasi lineare descritto in precedenza4. I risultati mostrano che sia la delezione MAGP-1 che l'invecchiamento possono avere impatti molto significativi su alcune delle proprietà meccaniche delle fibre zonulari.
Figura 1: Riepilogo visivo del metodo pull-up. (A) Vista in sezione trasversale di un occhio vertebrato che mostra la lente e le fibre zonulari che la sospendono. (B) Un approccio generale per determinare il comportamento viscoelastico nelle fibre zonulari spostando la lente verso l'alto (lontano dalla cornea). (C) Vista effettiva di un occhio sezionato incollato su una piattaforma con la sua lente tirata verso l'alto da una sonda di vetro collegata a un micromanipolatore. (D) Schema dell'intero apparato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fabbricazione di varie parti. (A) Fabbricazione della sonda di vetro. Un capillare di vetro viene tenuto ad angolo e una fiamma viene applicata in un punto a circa 2 cm da un'estremità. Entro pochi secondi, la fine del capillare inizia a cadere. La fiamma viene rimossa quando l'estremità del capillare è piegata a circa 90°. (B) Fabbricazione della piattaforma oculare. La parte è fabbricata con una stampante stereolitografica 3D (SLA). Misura 30 x 30 x 5 mm e contiene tre rientranze emisferiche con diametri 2,0, 2,5 e 3,0 mm in cui sono incollati occhi sezionati di varie dimensioni. (C) Fabbricazione del portasonda. Questa parte è stata anche fabbricata con una stampante SLA 3D. È costituito da due aste ortogonali di diametro 7,3 mm. L'asta inferiore contiene un alesaggio di 1,5 mm e due fori passanti da 2,5 mm sulla superficie esterna per ospitare viti metalliche che fissano la sonda capillare in posizione. (D) Assemblaggio lenti negative. Le immagini catturate dal microscopio laterale contengono una distorsione astigmatica dovuta alla curvatura della capsula di Petri e della soluzione tampone. Il gruppo obiettivo è progettato per compensare la distorsione, consentendo al microscopio laterale di catturare immagini con messa a fuoco nitida. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati grezzi tipici ottenuti con il test. Il grafico mostrato è stato registrato con un software di registrazione che registra i dati da una bilancia digitale con una precisione di 0,01 g. Il bordo sinistro del grafico (tempo 0) riflette il peso del campione senza una forza di sollevamento. L'asse y raffigura la massa in g. La lente viene quindi sollevata in passi di 50 μm fino a quando tutte le fibre zonulari sono rotte e la capsula di Petri riposa di nuovo completamente sulla scala. Si noti che la lettura finale è sfalsata dalla lettura iniziale. L'offset è dovuto alla graduale evaporazione della soluzione tampone durante il corso dell'esperimento e può essere preso in considerazione durante l'analisi dei dati, come indicato nella fase 2.2.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curve di spostamento della forza zonulare rappresentative per topi wild-type e carenti di MAGP-1. Il grafico confronta la risposta viscoelastica ottenuta dopo spostamenti discreti della lente lontano dalla sua posizione di equilibrio. La risposta di un occhio da un topo knockout (KO) MAGP-1 traccia quella di un animale selvatico abbinato all'età fino al punto in cui le fibre nel topo knockout si rompono prematuramente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Forze di rottura delle fibre zonulari ottenute con il metodo pull-up per MAGP-1 KO rispetto a topi wild-type e a due età. Tutte le misurazioni mostrate sono basate su n = 5 o 6 occhi, con barre di errore che rappresentano l'errore standard della media (SEM). Abbreviazioni: WT = wild-type; KO = MAGP-1 KNOCKOUT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Genotipo/età | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (sec) | σ f (Pa) | |
| WT 1 mese | SIGNIFICARE | 2,34E+05 | 9,33E+04 | 16.3 | 9,61E+05 |
| SD | 2,83E+04 | 2,94E+04 | 3.4 | 1,25E+05 | |
| 95% Cl | 5,55E+04 | 5,76E+04 | 6.7 | 2,45E+05 | |
| KO 1 mese | SIGNIFICARE | 2,73E+05 | 6,74E+04 | 17.6 | 4,44E+05 |
| SD | 6,30E+04 | 2,06E+04 | 3.8 | 7,85E+04 | |
| 95% Cl | 1,23E+05 | 4,03E+04 | 7.5 | 1,54E+05 | |
| valori p | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 anno | SIGNIFICARE | 1,98E+05 | 7,42E+04 | 17 | 1,41E+06 |
| SD | 1,17E+05 | 2,39E+04 | 9.1 | 2,44E+05 | |
| 95% Cl | 2,29E+05 | 4,69E+04 | 17.9 | 4,79E+05 | |
| KO 1 anno | SIGNIFICARE | 1,70E+04 | 2,46E+04 | 12.9 | 5,05E+05 |
| SD | 9,06E+03 | 8,04E+03 | 7.4 | 1,48E+05 | |
| 95% Cl | 1,78E+04 | 1,58E+04 | 14.4 | 2,91E+05 | |
| valori p | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| valori p, età | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabella 1: Proprietà viscoelastiche ottenute con un modello viscoelastico quasi lineare (QLV). Scansioni di dati come quelle mostrate nella Figura 4 sono state analizzate con un modello QLV sviluppato appositamente per il test pull-up e la zonula del topo. Vengono mostrati i parametri di adattamento migliori per le rigidità istantanee (G0) ed di equilibrio (G∞), la costante del tempo di rilassamento (τ) e la resistenza alla trazione finale (σ f). Abbreviazioni: SD = deviazione standard; CI = intervallo di confidenza.
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Discussion
La zonula è un insolito sistema ECM in cui le fibre sono disposte simmetricamente e possono essere manipolate in modo identico spostando la lente dell'occhio lungo l'asse ottico. Lo spazio può anche essere facilmente accessibile senza interruzioni cellulari, consentendo alle fibre di essere studiate in un ambiente vicino al loro stato nativo. La tecnica pull-up sfrutta questa presentazione ECM per manipolare le fibre delicate dei topi, un sistema geneticamente trattabile, e quantificare con precisione le loro proprietà meccaniche. Questo ci ha permesso di esaminare il contributo delle proteine chiave ECM (fibrillina-118, LTBP-24 e MAGP-1 qui riportate) alle proprietà biomeccaniche delle fibre zonulari. La nostra analisi dei topi carenti di fibrillina-1 ha rivelato che le fibre zonulari prive di fibrillina-1 si indeboliscono con l'età e alla fine si rompono, portando allo spostamento della lente all'interno dell'occhio (negli esseri umani, una condizione nota come ectopia lentis). Significativamente, la lussazione del cristallino è anche un evento comune nei pazienti con sindrome di Marfan, una malattia causata da mutazioni nel gene FBN120. Pertanto, il test pull-up offre l'opportunità di modellare aspetti della malattia del tessuto connettivo umano nei topi. Nei topi privi di LTPB-2 (una proteina che si pensa sia coinvolta nella genesi delle microfibrille), siamo stati in grado di dimostrare che le fibre zonulari sono state prodotte in assenza di quella proteina, ma si sono rotte a stress significativamente più bassi e alla fine si sono disintegrate con l'età4. Questi risultati suggeriscono che LTBP-2 contribuisce alla longevità delle fibre piuttosto che alla loro sintesi. Nel presente studio, abbiamo determinato che le fibre carenti di MAGP-1 avevano proprietà viscoelastiche simili alle fibre wild-type, ma si rompevano a sollecitazioni inferiori, senza alcun segno di ulteriore degradazione legata all'età. Ciò sarebbe coerente con un modello in cui le fibre prive di MAGP-1 sono intrinsecamente più deboli non appena si sviluppano.
Notiamo che le resistenze alla trazione finali elencate nella Tabella 1 sono stimate nell'ipotesi che le fibre si rompano da qualche parte a metà campata. Tuttavia, non possiamo escludere la possibilità che il guasto della fibra sia dovuto al distacco dai punti di ancoraggio sulla superficie della lente o sul corpo ciliare. Se questo fosse il caso, la resistenza alla trazione della frattura della fibra potrebbe essere superiore ai valori elencati nella Tabella 1. L'analisi microscopica sarà necessaria per distinguere tra queste possibilità. Tale analisi è tutt'altro che banale poiché le fibre coinvolte sono molto sottili (~ 0,5-0,6 μm di larghezza) e quasi indicizzate all'acqua, rendendole essenzialmente invisibili. In assenza di queste informazioni aggiuntive, possiamo solo affermare che le resistenze alla trazione finali elencate nella Tabella 1 rappresentano i loro limiti inferiori. Sarebbe anche interessante, in linea di principio, verificare se le misurazioni della forza differiscono a seconda della direzione in cui viene tirata la lente. In pratica, tuttavia, tirare la lente dal lato anteriore richiederebbe la rimozione dell'iride senza danneggiare le fibre zonulari che si trovano immediatamente sotto. Tale dissezione precisa è al di là di ciò che possiamo attualmente ottenere con l'occhio del topo.
La relativa semplicità del metodo e l'elevata riproducibilità dei suoi risultati sono qualità desiderabili per studi comparativi delle proprietà meccaniche ECM. Inoltre, come dimostrato qui, è anche possibile utilizzare il test pull-up per ottenere valori assoluti dei parametri viscoelastici assumendo un modello viscoelastico e adattando le curve temporali ad esso. Ad esempio, utilizzando un modello viscoelastico quasi lineare standard (QLV), siamo stati in grado di estrarre valori per rigidità istantanee (G0) ed equilibrio (G∞), la costante del tempo di rilassamento (τ) e la resistenza alla trazione finale (σ f) delle fibre zonulari da topi wild-type, così come quelli privi di LTBP-24 o MAGP-1. I valori G0 e G∞ ottenuti per gli animali selvatici in entrambi gli studi variano da 6,7 x 104 Pa a 2,3 x 105 Pa, un intervallo ampiamente paragonabile a quelli trovati in fibre molto più grandi derivate da zonule umane, bovine e suine (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. Questo accordo tra le specie suggerisce che queste sono caratteristiche universali di queste fibre e ci dà la certezza che parametri viscoelastici significativi possono essere estratti con il nostro metodo.
Un passo fondamentale per ottenere risposte viscoelastiche di qualità è l'orientamento dell'occhio sezionato incollato alla piattaforma (passo 2.1.9). L'inclinazione minore (inferiore a 10°) non sembra influenzare significativamente i risultati. Gli esperimenti eseguiti al di fuori di questo limite possono generare curve con forme che si discostano da quelle mostrate nella Figura 4. Ad esempio, alcune di queste curve possono possedere due grandi picchi invece di uno.
Idealmente, la procedura descritta in questo documento sarebbe stata eseguita senza fissazione degli occhi, il che limita la nostra capacità di valutare i veri parametri viscoelastici delle fibre zonulari fresche. Tuttavia, dopo che i nostri esperimenti preliminari non hanno mostrato alcuna differenza significativa tra i campioni fissati alla paraformaldeide e quelli freschi, abbiamo deciso di adottare la fissazione in quanto offriva diversi vantaggi. Come accennato nel Protocollo, l'uso di tessuti fissi aiuta a preservare l'allungamento nativo delle fibre per gli esperimenti di pull-up. Inoltre, abbiamo scoperto che la fissazione promuoveva una maggiore adesione della colla UV alla capsula oculare, riducendo così le possibilità che la sonda si staccasse dalla lente durante l'azione di pull-up, come comunemente sperimentato con campioni freschi (il distacco della sonda può essere facilmente riconosciuto come un improvviso ritorno della forza a un livello basale). La fissazione ha anche impedito la deformazione della parete oculare nella direzione della trazione. Nonostante questa limitazione, il nostro metodo fornisce un approccio robusto per determinare il contributo relativo dei componenti proteici alle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari.
Sebbene il nostro lavoro fino ad oggi si sia concentrato sul contributo di proteine specifiche, il metodo potrebbe essere prontamente adattato per studiare l'effetto di fattori esterni alle fibre sulle loro proprietà meccaniche. Tali fattori includono temperatura, pH, concentrazione di calcio e presenza o assenza di enzimi reticolanti. Misurazioni ad alta precisione potrebbero essere ottenute utilizzando il nostro metodo in modalità differenziale, cioè pretensionando le fibre zonulari con una sollecitazione / deformazione iniziale e quindi leggendo la differenza di tensione che ne consegue quando le condizioni esterne vengono alterate. Alcuni di questi interventi possono plausibilmente influenzare l'elasticità dei tessuti che circondano la zonula e quindi produrre cambiamenti di tensione che competono con quelli generati nella zonula. Sarebbero necessarie misurazioni di controllo con tessuti isolati per valutare la loro rilevanza per gli esperimenti proposti. Ci aspettiamo che tali effetti possano essere trascurabili, sulla base di osservazioni con la telecamera laterale che mostrano che i tessuti contigui si comportano come materiali altamente rigidi che non subiscono essenzialmente alcuna deformazione anche quando le fibre zonulari sono completamente tese.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EY029130 (S.B.) e P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 e Dalla Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), dalla Marfan Foundation, e da una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive della Washington University da Research to Prevent Blindness. J.R. ha anche ricevuto una sovvenzione dall'Università di Scienze della Salute e Farmacia a sostegno di questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
