Summary
Protokollen beskriver en metode for studiet av ekstracellulær matriseviskoelastisitet og dens avhengighet av proteinsammensetning eller miljøfaktorer. Matrisesystemet som er målrettet er musesonule. Utførelsen av metoden er demonstrert ved å sammenligne den viskoelastiske oppførselen til ville zonulære fibre med de som mangler mikrofibril-assosiert glykoprotein-1.
Abstract
Elastisitet er avgjørende for funksjonen til vev som blodkar, muskler og lunger. Denne egenskapen er hovedsakelig avledet fra den ekstracellulære matrisen (ECM), proteinnettverket som binder celler og vev sammen. Hvordan de elastiske egenskapene til et ECM-nettverk forholder seg til sammensetningen, og om avslappingsegenskapene til ECM spiller en fysiologisk rolle, er spørsmål som ennå ikke er fullstendig adressert. En del av utfordringen ligger i den komplekse arkitekturen til de fleste ECM-systemer og vanskeligheten med å isolere ECM-komponenter uten å gå på kompromiss med strukturen. Et unntak er zonule, et ECM-system som finnes i øynene til vertebrater. Zonule består av fibre hundrevis til tusenvis av mikrometer i lengde som spenner over det cellefrie rommet mellom linsen og øyeveggen. I denne rapporten beskriver vi en mekanisk teknikk som utnytter den svært organiserte strukturen til zonule for å kvantifisere sine viskoelastiske egenskaper og for å bestemme bidraget av individuelle proteinkomponenter. Metoden innebærer disseksjon av et fast øye for å eksponere linsen og zonule og bruker en pull-up teknikk som strekker zonulære fibrene likt mens spenningen overvåkes. Teknikken er relativt billig, men likevel følsom nok til å oppdage endringer i viskoelastiske egenskaper til zonulære fibre hos mus som mangler spesifikke zonulære proteiner eller med aldring. Selv om metoden som presenteres her først og fremst er designet for å studere okulær utvikling og sykdom, kan den også fungere som en eksperimentell modell for å utforske bredere spørsmål om de viskoelastiske egenskapene til elastiske ECM-er og rollen til eksterne faktorer som ionisk konsentrasjon, temperatur og interaksjoner med signalmolekyler.
Introduction
Øyet til en virveldyr inneholder en levende optisk linse som hjelper til med å fokusere bilder på netthinnen1. Linsen er suspendert på den optiske aksen av et system med delikate, radialorienterte fibre, som illustrert i figur 1A. I den ene enden festes fibrene til linseekvator og i den andre til overflaten av ciliary kroppen. Lengdene spenner over avstander fra 150 μm hos mus til 1 mm hos mennesker. Samlet er disse fibrene kjent som zonule av Zinn2, ciliary zonule, eller bare zonule. Okulære traumer, sykdom og visse genetiske lidelser kan påvirke integriteten til zonulære fibre3, noe som resulterer i deres eventuelle svikt og tilhørende tap av syn. Hos mus har fibrene en kjerne som hovedsakelig består av proteinfibrillin-2, omgitt av en mantel rik på fibrillin-14. Selv om zonulære fibre er unike for øyet, har de mange likheter med elastinbaserte ECM-fibre som finnes andre steder i kroppen. Sistnevnte er dekket av en fibrillin-1 mantel5 og har lignende dimensjoner som zonulære fibre6. Andre proteiner, som latent-transformerende vekstfaktor β-bindende proteiner (LTBPer) og mikrofibril-assosiert glykoprotein-1 (MAGP-1), finnes i forbindelse med begge typer fibre7,8,9,10,11. Den elastiske modulen av zonulære fibre er i området 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, sammenlignbar med elastinbaserte fibre (0,3-1,2 MPa)17. Disse arkitektoniske og mekaniske likhetene får oss til å tro at enhver innsikt i rollene til zonule-assosierte proteiner kan bidra til å belyse deres roller i andre ECM elastiske fibre.
Hovedformålet med å utvikle metoden beskrevet her er å få innsikt i rollen som spesifikke zonulære proteiner i utviklingen av arvelig øyesykdom. Den generelle tilnærmingen er å sammenligne de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre i ville mus med mus som bærer målrettede mutasjoner i gener som koder zonulære proteiner. Mens flere metoder tidligere har blitt brukt til å måle de elasto-mekaniske egenskapene til zonulære fibre, ble alle designet for øynene til mye større dyr12,13,14,15,16. Som slike modeller er ikke genetisk gjennomførbare; vi forsøkte å utvikle en eksperimentell metode som var bedre egnet til musens små og delikate øyne.
Metoden vi utviklet for å vurdere viskoelastisiteten til musezonulære fibre er en teknikk vi refererer til som pull-up-analysen4,18, som oppsummeres visuelt i figur 1. En detaljert beskrivelse av pull-up-metoden og analysen av resultatene er gitt nedenfor. Vi begynner med å beskrive konstruksjonen av apparatet, inkludert de tredimensjonale (3D)-trykte delene som brukes i prosjektet. Deretter detaljerer vi protokollen som brukes til å skaffe og forberede øynene til eksperimentet. Til slutt gir vi trinnvise instruksjoner om hvordan du får tak i data for bestemmelse av de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre. I delen Representative Results deler vi tidligere upubliserte data innhentet med vår metode på de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre fra mus som mangler MAGP-119, samt et kontrollsett hentet fra alderstilpassede villdyr. Til slutt konkluderer vi med generelle bemerkninger om fordelene og begrensningene ved metoden, og forslag til potensielle eksperimenter som kan belyse hvordan miljømessige og biokjemiske faktorer påvirker de viskoelastiske egenskapene til ECM-fibre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av Washington University Animal Studies Committee og fulgte ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
1. Fabrikasjon av spesialiserte deler og bygging av apparater
- Fabrikasjon av spesialiserte deler
- Sonde fabrikasjon. Hold en glasskapillær i en vinkel som vist på venstre panel i figur 2A. Plasser en flamme fra en sigarettenner ca. 2 cm fra den ene enden og hold den der til enden bøyes med 90°, som vist i høyre panel i figur 2A.
- Prøveplattform fabrikasjon. Bruk programvare for 3D-tegning til å utforme en plattform som måler 30 x 30 x 5 mm og inneholder halvkuleformede innrykk på 2,0, 2,5 og 3,0 mm i diameter, som vist i figur 2B.
- Sondeholder fabrikasjon. Bruk 3D-tegningsprogramvaren til å designe en brakett som holder kapillærsonden og feste den til en mikromanipulator (se figur 2C).
MERK: En prøve 3D-fil for plattform fabrikasjon og sondeholder fabrikasjon i STL-format er tilgjengelig på forespørsel fra den tilsvarende forfatteren. - Negativ linseenhet. Plasser en negativ sylindrisk linse (-75 mm i brennvidde og ca. 50 mm i høyde og lengde) som vist i figur 1C og figur 1D for å korrigere forvrengningen forårsaket av tilsetning av væske til Petri-parabolen (tilsetning av væske forvrenger synet på det dissekerte øyet når det er avbildet fra siden).
- Fest det negative objektivet til en av de 2-spors basene (se figur 2D for plassering av objektivet på sokkelen).
- Monter de resterende delene som vist i figur 2D.
- Juster høyden på stiften slik at objektivet knapt svever over vekten og stram skruen i etterholderen.
- Bygging av apparater
- Installer på en datamaskin loggingsprogrammet som følger med skalaen, mikroskopkameraprogramvaren og det motoriserte mikrometerkontrollerprogrammet.
- Koble det motoriserte mikrometeret til servomotorkontrolleren og sistnevnte til datamaskinen. Start motorstyringsapplikasjonen og rediger motorinnstillingene.
MERK: Motorinnstillingene, som er oppført nedenfor, ble valgt etter foreløpige eksperimenter som avslørte at stress slapper av på en tidsskala på 10-20 s. Basert på denne bestemmelsen valgte vi en hastighet og akselerasjon som tillot motoren å fullføre en 50 μm forskyvning på en tid mindre enn avslapningstiden, men ikke for kort for å unngå å støte prøven. Her valgte vi en fortrengningstid på ca 5-10 s. - Sett maksimal hastighet til 0,01 mm/s og akselerasjonen til 0,005 mm/s2.
- Installer kameraet i inspeksjonsmikroskopet og test kameraets bildebehandlingsprogramvare.
- Plasser vekten på benkeplassen viet til apparatet.
- Lim en 3D-trykt plattform (fra trinn 1.1.2) til en Petri-tallerken og tilsett en 2-3 mm glassperle til en av brønnene. Plasser Petri-parabolen på skalaen slik at perlen ligger nær midten av pannen.
- Bytt ut det manuelle mikrometeret fra mikromanipulatoren med den motoriserte.
- Skru de to 4-40 skruene inn i probeholderen. Fest probeholderen til manipulatoren som vist i figur 1C.
- Forbered en sonde som vist i figur 2A, plasser den inne i probeholderen med den bøyde delen vendt ned, og stram skruene.
- Plasser mikromanipulatoren på bordet slik at spissen av sonden er over perlen på plattformen. Fest mikromanipulatoren til bordet for å forhindre utilsiktet bevegelse under eksperimentet.
- Plasser sidemikroskopet på bordet slik at perlen er i midten av synsfeltet og i fokus.
2. Prøveforberedelse og datainnsamling
- Øyefiksering og avhandling
- Vedlikehold villtypemus og Magp1-null dyr på en identisk C57/BL6J-bakgrunn. Avlivet 1 måned gamle eller 1 år gamle mus ved CO2-innånding .
- Fjern øynene med fine tang og fest de enucleated globusene ved 4 °C over natten i 4 % paraformaldehyd/fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4). Oppretthold et positivt trykk på 15-20 mmHg i øyet under fikseringsprosessen, som beskrevet6.
MERK: Eksperimenter utføres på hannmus, for å kontrollere mulige kjønnsrelaterte forskjeller i størrelsen på okulærkulen. Det positive trykket sikrer at kloden forblir oppblåst, og bevarer gapet mellom linsen og øyets vegg som spenner over de zonulære fibrene. - Vask øynene i 10 min i PBS. Ved hjelp av oftalmisk kirurgisk saks og arbeid under et stereomikroskop, gjør du et snitt i full tykkelse i øyets vegg nær synsnervehodet.
- Utvid kuttet fremover til ekvator, og deretter rundt ekvatoriale omkretsen av øyet. Pass på å spare de delikate ciliary prosessene og tilhørende zonulære fibre.
- Fjern baksiden av kloden, og eksponer den bakre overflaten av linsen.
- Bruk tangene til å fjerne et dissekert øye fra bufferløsningen og legg den på en tørr oppgaveserviett med hornhinnen vendt ned. Dra hornhinnen forsiktig over overflaten av tørken for å tørke den.
- Tilsett 3 μL øyeblikkelig lim til plattformbrønnene som vil imøtekomme øyet i Petri-parabolen.
- Plasser parabolen på stereomikroskopets sceneplate slik at brønnen med limet er i sikte.
- Overfør øyet fra tørk til kanten av brønnen som inneholder lim. Dra deretter øyet forsiktig inn i brønnen og juster retningen raskt slik at baksiden av linsen er øverst.
- Tørk den eksponerte siden av linsen ved å forsiktig blåse den opp med hjørnet av en tørr klut.
- Påfør en dab øyeblikkelig lim på bunnen av en 50 mm Petri-tallerken og sement plattformen til den.
- Måling av zonulær viskoelastisk respons
- Slå på vekten, start skaleringsloggingsprogrammet og kameraprogramvaren. Forsikre deg om at loggingsprogrammet kan skaffe data i 30 minutter, da noen forsøk kan vare så lenge.
- Slå på servomotorkontrolleren og start kontrollerapplikasjonen på datamaskinen. Kontroller at kontrolleren er satt til å bevege seg i trinn på 50 μm ved hjelp av bevegelsesparametere som ligner de som er beskrevet i MERKNAD i trinn 1.2.2.
- Lag en 90° bøyning i en kapillærstang som beskrevet i trinn 1.1.1.
- Sett den bøyde kapillæren inn i kapillærsonden og stram festeskruene.
MERK: For å minimere prøvedehydrering anbefaler vi at trinn 1-4 fullføres før eller under øyeavhandlingen. - Tilsett en liten (~1 mm) perle av UV-herdelim på spissen av kapillæren.
- Bruk de manuelle justeringene på manipulatoren til å flytte spissen av kapillærsonden slik at den er rett over midten av objektivet. Kontroller om den nederste delen av UV-limet er sentrert over toppen av objektivet når det vises fra forsiden (ved visuell inspeksjon) og siden (gjennom mikroskopkameraet).
- Mens du ser gjennom kameraet, senk probespissen til UV-limet kommer i kontakt med linsen og dekker en tredjedel til halvparten av den øvre overflaten.
- Bruk en lyskilde med lav intensitet (~ 1 mW), retningsmessig, nesten synlig UV-lyskilde (380-400 nm) til å herde limet.
MERK: Disse spesifikasjonene er nok til å kurere limet på noen få sekunder mens du minimerer potensialet for å indusere proteinkrysskobling. UV-lyskildene som leveres med kommersielle UV-limpenner oppfyller disse spesifikasjonene. - Tilsett PBS-oppløsning på parabolen til øyet er dekket av væske til en dybde på minst 2 mm.
- Plasser den sylindriske linsen foran inspeksjonsmikroskopet og så nært petriskålen som mulig uten å berøre den.
- Start loggingsprogrammet og et tidtakerprogram samtidig. Ta et bilde av øyet/sonden ved hjelp av kameraet.
- Etter 60 s, start en annen 50 μm forskyvning, og deretter hver 60 s til eksperimentet er fullført, det vil si til alle fibrene er ødelagt. Vær oppmerksom på at signalet ikke vil gå tilbake til baseline nivåer på grunn av bufferfordampning under eksperimentet. Korriger den påfølgende driften i målingene under dataanalysen, som eksemplifisert i trinn 2.2.14.
- Når du har fullført en løpetur, lagrer du skaleringsloggingsdataene og eksporterer dem til et format som er kompatibelt med regnearket, for eksempel et .csv-format. Lagre objektivbildene som ble samlet inn under løpeturen.
- Importere data til et regneark. Bruk den første og siste skalaavlesningen til å interpolere driften i bakgrunnsavlesningen over tid på grunn av fordampning (se figur 3). Trekk den interpolerte avlesningen fra avlesningen ved hvert tidspunkt.
MERK: Hvis du bruker et regneark, kan interpoleringen utføres automatisk ved å skrive inn formelen = B2 - $B $ 2 + ($B $ 2 - @INDIRECT ("B"&COUNTA(B:B))))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 i cellen til høyre for den første skalaavlesningen, og deretter flytte markøren til høyre nedre hjørne av cellen og dra den ned til den siste verdien. Formelen forutsetter at dataene er ordnet i en kolonne med det første datapunktet som vises i celle B2. Om ønskelig kan dataene som behandles i trinn 2.2.14 analyseres med den kvasi-elastiske viskoelastiske modellen utviklet av en av medforfatterne, Dr. Matthew Riley4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pull-up teknikken beskrevet her gir en grei tilnærming for å bestemme viskoelastiske egenskaper av zonulære fibre hos mus. Kort sagt, museøyet blir først bevart ved injeksjon av et fikseringsmiddel ved fysiologisk intraokulært trykk. Denne tilnærmingen opprettholder øyets naturlige inflasjon og holder fibrene riktig forspentet (fiksering ble ansett som akseptabelt etter at foreløpige eksperimenter viste at det ikke endret elastisiteten eller styrken til fibrene betydelig). Baksiden av museøyet fjernes deretter ved disseksjon for å eksponere linsen og de zonulære fibrene som suspenderer den. Forsiden av øyet er festet til en plattform og plassert inne i en Petri-tallerken som hviler på en digital skala. Deretter sementeres en glasskapillær festet til en mikromanipulator til linsens bakre overflate. Linsen heves deretter i trinn på 50 μm mens kraften på vekten registreres. En reduksjon i den tilsynelatende vekten av preparatet gir informasjon om kreftene som strekker fibrene. Hver forskyvning etterfølges av en likevektsperiode som varer ca. 1 min for å observere enhver avslapning av stresset forårsaket av forskyvningen. Til slutt analyseres resultatene ved hjelp av en kvasi-lineær viskoelastisk modell designet spesielt for geometrien til musens zonulære fibre og retningen av trekket inn for analysen4.
Typiske viskoelastiske data innhentet med vår metode er vist i figur 3. Kurven vises invertert (negativ) siden løftekraften på linsen reduserer vekten på parabolen/plattformen/øyeenheten på vekten med en tilsvarende mengde. Responsen inkluderer øyeblikkelige kraftspisser i løpet av hver av de 50 μm vertikale forskyvningene til linsen, etterfulgt av en avslapningsfase med en levetid på 10 s. En lignende stressavslapping har blitt observert for storfe zonulære fibre12. Størrelsen på de øyeblikkelige og avslappede kreftene øker med hvert trinn opp til ca 1000 s (~ 800 μm total forskyvning) og begynner deretter å falle når fibre begynner å mislykkes. Zonule-feilen fullføres med 1500 s-tidspunktet (~1,25 mm total forskyvning). Vær oppmerksom på at på grunn av fordampning av buffer i løpet av eksperimentet, går kurven ikke tilbake til den første avlesningen etter at linsen er frigjort fra øyet.
Figur 4 kontrasterer svarene som oppnås for en Magp-1 knockout-mus (rød kurve) og et alderstilpasset dyr av vill type (blå kurve). Disse kurvene er korrigert for fordampning, invertert, og de rå målingene av masse (se figur 3) uttrykkes nå som kraft (med enheter av mN). Den første viskoelastiske responsen til Magp-1-utarmet zonule (tid 0-600 s) ligner på den ville typen, noe som tyder på at de viskoelastiske egenskapene til zonule ikke ble vesentlig endret av fraværet av Magp-1. Fibrene ser imidlertid ut til å sprekke ved en mye lavere spenning sammenlignet med deres ville motparter.
For å illustrere påliteligheten til metoden samlet vi inn data fra flere dyr på maksimal øyeblikkelig kraft som ble påført øynene før fibrene deres sprakk. Resultatene vises i figur 5. Dataene for 1 måned gamle mus viser svært små verdier for standardfeilen av gjennomsnittet (SEM) til tross for det relativt lave antallet prøver som brukes (n = 5 eller 6), noe som tyder på høy reproduserbarhet. Resultatene indikerer at styrken på fibrene varierer betydelig mellom de to genotypene (p-verdi = 2,4 x 10-6). Resultater som ikke er vist i tallene tyder også på at det er en subtil, men statistisk signifikant økning i bruddkraftstyrke med alder for villdyr (p-verdi = 0,024).
Pull-up-metoden kan også generere kvantitative estimater av de viskoelastiske parametrene som står for de observerte variasjonene i temporale responser. Tabell 1 oppsummerer best-fit parametere til våre MAGP-1 data, oppnådd med en kvasi-lineær viskoelastisk modell beskrevet tidligere4. Resultatene viser at både MAGP-1-sletting og aldring kan ha svært betydelige konsekvenser for noen av de mekaniske egenskapene til zonulære fibre.
Figur 1: Et visuelt sammendrag av pull-up-metoden. (A) Tverrsnittsvisning av et virveldyrøye som viser linsen og de zonulære fibrene som suspenderer den. (B) En generell tilnærming for å bestemme viskoelastisk oppførsel i zonulære fibre ved å fortrenge linsen oppover (vekk fra hornhinnen). (C) Faktisk visning av et dissekert øye limt på en plattform med linsen trukket oppover av en glasssonde festet til en mikromanipulator. (D) Skjematisk for hele apparatet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fabrikasjon av ulike deler. (A) Fabrikasjon av glasssonden. En glasskapillær holdes i en vinkel og en flamme påføres på et sted omtrent 2 cm fra den ene enden. I løpet av få sekunder begynner slutten av kapillæren å falle. Flammen fjernes når enden av kapillæren er bøyd ved ca. 90°. (B) Fabrikasjon av øyeplattformen. Delen er fremstilt med en 3D stereolitografiskriver (SLA). Den måler 30 x 30 x 5 mm og inneholder tre halvkuleformede innrykk med 2,0, 2,5 og 3,0 mm diametre der dissekerte øyne av forskjellige størrelser limes. (C) Fabrikasjon av sondeholder. Denne delen ble også fremstilt med en 3D SLA-skriver. Den består av to ortogonale, 7,3 mm diameter stenger. Den nedre stangen inneholder en boring på 1,5 mm og to 2,5 mm gjennom hull på ytterflaten for å imøtekomme metallskruer som fester kapillærsonden på plass. (D) Negativ linseenhet. Bilder tatt av sidemikroskopet inneholder en astigmatisk forvrengning på grunn av krumningen i Petri-parabolen og bufferløsningen. Linseenheten er utformet for å kompensere for forvrengningen, slik at sidemikroskopet kan ta bilder i skarpt fokus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Typiske rådata innhentet med analysen. Grafen som ble vist ble registrert med loggingsprogramvare som registrerer data fra en digital skala med en nøyaktighet på 0,01 g. Den venstre kanten av grafen (tid 0) gjenspeiler vekten av prøven uten løftekraft. Y-aksen skildrer masse i g. Linsen løftes deretter i trinn på 50 μm til alle zonulære fibre er ødelagt og Petri-parabolen igjen hviler helt på vekten. Legg merke til at sluttavlesningen er forskjøvet fra den første avlesningen. Forskyvningen skyldes gradvis fordampning av bufferløsningen i løpet av eksperimentet og kan redegjøres for under dataanalyse, som beskrevet i trinn 2.2.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative zonulære kraftforskyvningskurver for villtype og MAGP-1-mangelfulle mus. Grafen sammenligner den viskoelastiske responsen oppnådd etter diskrete forskyvninger av linsen bort fra likevektsposisjonen. Responsen fra et øye fra en MAGP-1 knockout (KO) mus sporer det av et alderstilpasset villtype dyr opp til det punktet hvor fibrene i knockout-musen bryter for tidlig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Zonular fiber bryte krefter oppnådd med pull-up metoden for MAGP-1 KO versus wild-type mus og i to aldre. Alle målinger som vises er basert på n = 5 eller 6 øyne, med feilfelt som representerer standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). Forkortelser: WT = wild-type; KO = MAGP-1 knockout. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Genotype/alder | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (sek) | σ f (Pa) | |
| WT 1-måneder | BETY | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1-måneders | BETY | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p verdier | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 år | BETY | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95% Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1 år | BETY | 1,70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95% Cl | 1,78E+04 | 1,58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p verdier | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p verdier, alder | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabell 1: Viskoelastiske egenskaper oppnådd med en kvasi-lineær viskoelastisk (QLV) modell. Dataskanninger som de som vises i figur 4 , ble analysert med en QLV-modell utviklet spesielt for pull-up-analysen og muszonule. Best fit parametere for instantaneous (G0) og likevekt (G∞) stivheter, avslapningstid konstant (τ), og den ultimate strekkfasthet (σ f) vises. Forkortelser: SD = standardavvik; CI = konfidensintervall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zonule er et uvanlig ECM-system der fibrene er ordnet symmetrisk og kan manipuleres identisk ved å fortrenge øyelinsen langs den optiske aksen. Plassen kan også lett nås uten cellulær forstyrrelse, slik at fibrene kan studeres i et miljø nær sin opprinnelige tilstand. Pull-up-teknikken drar nytte av denne ECM-presentasjonen for å manipulere de delikate fibrene fra mus, et genetisk gjennomførbart system og nøyaktig kvantifisere deres mekaniske egenskaper. Dette har gjort det mulig for oss å undersøke bidraget fra viktige ECM-proteiner (fibrillin-118, LTBP-24 og MAGP-1 rapportert her) til de biomekaniske egenskapene til de zonulære fibrene. Vår analyse av fibrillin-1-mangelfulle mus avslørte at zonulære fibre som mangler fibrillin-1 svekkes med alderen og til slutt brister, noe som fører til forskyvning av linsen i øyet (hos mennesker, en tilstand kjent som ektopia lentis). Signifikant er objektivdislokasjon også en vanlig forekomst hos pasienter med Marfan syndrom, en sykdom forårsaket av mutasjoner i FBN1-genet20. Dermed gir pull-up-analysen en mulighet til å modellere aspekter av menneskelig bindevevssykdom hos mus. Hos mus som mangler LTPB-2 (et protein som antas å være involvert i dannelsen av mikrofibriler), var vi i stand til å demonstrere at zonulære fibre ble produsert i fravær av det proteinet, men revnet ved betydelig lavere påkjenninger og til slutt oppløst med alder4. Disse resultatene tyder på at LTBP-2 bidrar til fiberens levetid i stedet for syntesen. I den nåværende studien bestemte vi oss for at MAGP-1-mangelfulle fibre hadde lignende viskoelastiske egenskaper som ville fiber, men revnet ved lavere påkjenninger, uten tegn til ytterligere aldersrelatert nedbrytning. Dette vil være i samsvar med en modell der fibre som mangler MAGP-1 er iboende svakere så snart de utvikler seg.
Vi merker oss at de ultimate strekkfasthetene som er oppført i tabell 1 , anslås under forutsetning av at fibrene bryter et sted midt i spennet. Vi kan imidlertid ikke utelukke muligheten for at fibersvikt skyldes løsrivelse fra forankringspunkter på linseoverflaten eller ciliary kroppen. Hvis dette var tilfellet, kan fiberens bruddstrekkstyrke være høyere enn verdiene som er oppført i tabell 1. Mikroskopisk analyse vil være nødvendig for å skille mellom disse mulighetene. Slike analyser er langt fra trivielle siden de involverte fibrene er svært tynne (~ 0,5-0,6 μm i bredde) og nesten indekstilpasset vann, noe som gjør dem i hovedsak usynlige. I mangel av denne tilleggsinformasjonen kan vi bare si at de ultimate strekkfasthetene som er oppført i tabell 1 , representerer deres nedre grenser. Det ville også være interessant i prinsippet å sjekke om kraftmålingene varierer avhengig av hvilken retning linsen trekkes. I praksis vil det imidlertid kreve å trekke linsen fra den fremre siden for å fjerne iris uten å skade de zonulære fibrene som ligger rett under. En slik presis disseksjon er utenfor det vi for tiden kan oppnå med museøyet.
Den relative enkelheten i metoden og den høye reproduserbarheten av resultatene er ønskelige kvaliteter for komparative studier av ECM mekaniske egenskaper. I tillegg, som vist her, er det også mulig å bruke pull-up-analysen for å oppnå absolutte verdier av viskoelastiske parametere ved å anta en viskoelastisk modell og tilpasse tidskurvene til den. For eksempel, ved hjelp av en standard kvasi-lineær viskoelastisk (QLV) modell, var vi i stand til å trekke ut verdier for øyeblikkelig (G0) og likevekt (G∞) stivheter, avslapningstid konstant (τ), og den ultimate strekkfastheten (σ f) av zonulære fibre fra ville mus, samt de som mangler LTBP-24 eller MAGP-1. G0- og G∞-verdiene oppnådd for villdyr i begge studiene varierer fra 6,7 x 104 Pa til 2,3 x 105 Pa, et område som er bredt sammenlignbart med de som finnes i mye større fibre avledet fra menneskelige, bovine og porcine zonules (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. Denne avtalen blant arter antyder at dette er universelle trekk ved disse fibrene, og gir oss tillit til at meningsfulle viskoelastiske parametere kan ekstraheres med vår metode.
Et kritisk skritt for å oppnå kvalitetsviskoelastiske responser er orienteringen av det dissekerte øyet limt til plattformen (trinn 2.1.9). Mindre vippe (mindre enn 10°) ser ikke ut til å påvirke resultatene betydelig. Eksperimenter som utføres utenfor denne grensen, kan generere kurver med figurer som avviker fra de som vises i figur 4. For eksempel kan noen av disse kurvene ha to brede topper i stedet for en.
Ideelt sett ville prosedyren skissert i dette papiret ha blitt utført uten fiksering av øynene, noe som begrenser vår evne til å vurdere de sanne viskoelastiske parametrene til friske zonulære fibre. Men etter at våre foreløpige eksperimenter ikke viste noen signifikant forskjell mellom paraformaldehydfaste og ferske prøver, bestemte vi oss for å vedta fiksering da det ga flere fordeler. Som nevnt i protokollen, bidrar bruken av faste vev til å bevare den innfødte strekningen av fibrene for pull-up-eksperimenter. I tillegg fant vi ut at fiksering fremmet større vedheft av UV-limet til øyekapselen, og dermed redusere sjansene for at sonden løsnet fra linsen under pull-up-handlingen, som ofte oppleves med friske prøver (sondeavløsning kan lett gjenkjennes som en plutselig retur av kraften til et basislinjenivå). Fikseringen forhindret også spenne av øyeveggen i retning av trekket. Til tross for denne begrensningen gir vår metode en robust tilnærming for å bestemme det relative bidraget av proteinkomponenter til de viskoelastiske egenskapene til de zonulære fibrene.
Selv om vårt arbeid til dags dato har fokusert på bidrag av spesifikke proteiner, kan metoden lett tilpasses for å studere effekten av faktorer utenfor fibrene på deres mekaniske egenskaper. Slike faktorer inkluderer temperatur, pH, kalsiumkonsentrasjon og tilstedeværelse eller fravær av krysskoblingsenzymer. Høypresisjonsmålinger kan oppnås ved hjelp av vår metode i differensialmodus, det vil si ved å forspenning av zonulære fibre med en innledende belastning / belastning, og deretter lese forskjellen i spenning som følger når eksterne forhold endres. Noen av disse intervensjonene kan tenkes å påvirke elastisiteten til vevet som omgir zonule og dermed produsere endringer i spenning som konkurrerer med de som genereres i zonule. Kontrollmålinger med isolert vev ville være nødvendig for å vurdere deres relevans for de foreslåtte forsøkene. Vi forventer at slike effekter kan være ubetydelige, basert på observasjoner med sidekameraet som viser at sammenhengende vev oppfører seg som svært stive materialer som i hovedsak ikke gjennomgår deformasjon selv når zonulære fibre er helt strukket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 EY029130 (S.B.) og P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 og Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation, og et ubegrenset tilskudd til Department of Ophthalmology and Visual Sciences ved Washington University fra J.R. fikk også stipend fra University of Health Sciences and Pharmacy til støtte for dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
