Summary
O protocolo descreve um método para o estudo da viscoelasticidade da matriz extracelular e sua dependência da composição proteica ou fatores ambientais. O sistema de matriz alvo é o zonule do rato. O desempenho do método é demonstrado comparando o comportamento viscoelástico das fibraszonulares do tipo selvagem com as que não possuem glicoproteína associada a microfibril-1.
Abstract
A elasticidade é essencial para a função de tecidos como vasos sanguíneos, músculos e pulmões. Esta propriedade é derivada principalmente da matriz extracelular (ECM), a malha proteica que une células e tecidos. Como as propriedades elásticas de uma rede ECM se relacionam com sua composição, e se as propriedades de relaxamento do ECM desempenham um papel fisiológico, são questões que ainda não foram totalmente abordadas. Parte do desafio está na arquitetura complexa da maioria dos sistemas ECM e na dificuldade em isolar componentes ECM sem comprometer sua estrutura. Uma exceção é o zonule, um sistema ECM encontrado no olho de vertebrados. O zonule compreende fibras de centenas a milhares de micrômetros de comprimento que abrangem o espaço livre de células entre a lente e a parede do olho. Neste relatório, descrevemos uma técnica mecânica que aproveita a estrutura altamente organizada do zonule para quantificar suas propriedades viscoelásticas e determinar a contribuição de componentes proteicos individuais. O método envolve dissecção de um olho fixo para expor a lente e o zonule e emprega uma técnica de puxar para cima que estica as fibras zonulares igualmente enquanto sua tensão é monitorada. A técnica é relativamente barata, mas sensível o suficiente para detectar alterações nas propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos sem proteínas zonulares específicas ou com envelhecimento. Embora o método aqui apresentado seja projetado principalmente para estudar o desenvolvimento ocular e doenças, também poderia servir como um modelo experimental para explorar questões mais amplas sobre as propriedades viscoelásticas dos ECM elásticos e o papel de fatores externos como concentração iônica, temperatura e interações com moléculas de sinalização.
Introduction
O olho de um vertebrado contém uma lente óptica viva que ajuda a focar imagens na retina1. A lente é suspensa no eixo óptico por um sistema de fibras delicadas e radialmente orientadas, conforme ilustrado na Figura 1A. Em uma extremidade, as fibras se prendem ao equador da lente e, na outra, à superfície do corpo ciliar. Seus comprimentos abrangem distâncias que variam de 150 μm em camundongos a 1 mm em humanos. Coletivamente, essas fibras são conhecidas como o zonule de Zinn2, o zonule ciliar, ou simplesmente o zonule. Traumas oculares, doenças e certos distúrbios genéticos podem afetar a integridade das fibras zonulares3, resultando em sua eventual falha e perda de visão. Em camundongos, as fibras possuem um núcleo composto principalmente pela fibrillina-2 proteica, cercada por um manto rico em fibrillin-14. Embora as fibraszonulares sejam únicas aos olhos, elas possuem muitas semelhanças com as fibras ECM baseadas em elastina encontradas em outros lugares do corpo. Estes últimos são cobertos por um manto de fibrillina-15 e têm dimensões semelhantes às fibraszonulares6. Outras proteínas, como o fator de crescimento transformador latente β proteínas de ligação (LTBPs) e a glicoproteína associada à microfibril-1 (MAGP-1), são encontradas em associação com ambos os tipos de fibras7,8,9,10,11. O módulo elástico das fibraszonulares está na faixa de 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, comparável ao das fibras à base de elastina (0,3-1,2 MPa)17. Essas semelhanças arquitetônicas e mecânicas nos levam a acreditar que qualquer visão sobre os papéis das proteínas associadas ao zonule pode ajudar a elucidar seus papéis em outras fibras elásticas ECM.
O principal objetivo do desenvolvimento do método descrito aqui é obter insights sobre o papel de proteínaszonulares específicas na progressão da doença ocular hereditária. A abordagem geral é comparar as propriedades viscoelásticas das fibraszonulares em camundongos do tipo selvagem com as de camundongos portadores de mutações direcionadas em genes que codificam proteínaszonulares. Embora vários métodos tenham sido utilizados anteriormente para medir as propriedades elasto-mecânicas das fibraszonulares, todos foram projetados para os olhos de animais muito maiores12,13,14,15,16. Como tais modelos não são geneticamente tratáveis; buscamos desenvolver um método experimental mais adequado aos pequenos e delicados olhos dos ratos.
O método que desenvolvemos para avaliar a viscoelasticidade das fibraszonulares do camundongo é uma técnica a que chamamos de ensaio de puxar para cima4,18, que é resumido visualmente na Figura 1. Uma descrição detalhada do método pull-up e a análise dos resultados são fornecidas abaixo. Começamos descrevendo a construção do aparelho, incluindo as peças tridimensionais (3D) impressas usadas no projeto. Em seguida, detalhamos o protocolo usado para a obtenção e preparação dos olhos para o experimento. Por fim, fornecemos instruções passo a passo sobre como obter dados para a determinação das propriedades viscoelásticas das fibras zonulares. Na seção Resultados Representativos, compartilhamos dados inéditos obtidos com nosso método sobre as propriedades viscoelásticas de fibras zonulares de camundongos sem MAGP-119, bem como um conjunto de controle obtido a partir de animais do tipo selvagem com correspondência etária. Por fim, concluímos com observações gerais sobre as vantagens e limitações do método, e sugestões de potenciais experimentos que possam elucidar como fatores ambientais e bioquímicos afetam as propriedades viscoelásticas das fibras ECM.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.
1. Fabricação de peças especializadas e construção de aparelhos
- Fabricação de peças especializadas
- Fabricação da sonda. Segure um capilar de vidro em um ângulo como mostrado no painel esquerdo da Figura 2A. Coloque uma chama de um isqueiro a cerca de 2 cm de uma extremidade e mantenha-a lá até que a extremidade se dobre em 90°, como mostrado no painel direito da Figura 2A.
- Fabricação de plataforma de amostra. Utilizando software de desenho 3D, projete uma plataforma de 30 x 30 x 5 mm e contendo recuos hemisféricos de 2.0, 2,5 e 3,0 mm de diâmetro, como mostrado na Figura 2B.
- Fabricação do suporte da sonda. Usando o software de desenho 3D, projete uma montagem que segure a sonda capilar e anexe-a a um micromanipulador (ver Figura 2C).
NOTA: Um arquivo 3D amostra para fabricação da plataforma e fabricação do suporte do teste em formato STL está disponível apenas a pedido do autor correspondente. - Montagem negativa da lente. Coloque uma lente cilíndrica negativa (-75 mm na distância focal e aproximadamente 50 mm em altura e comprimento) como mostrado na Figura 1C e Figura 1D para corrigir a distorção causada pela adição de fluido à placa de Petri (a adição de fluido distorce a visão do olho dissecado quando visualizado do lado).
- Cole a lente negativa a uma das bases de 2 ranhuras (ver Figura 2D para posicionamento da lente na base).
- Monte as peças restantes conforme mostrado na Figura 2D.
- Ajuste a altura do poste para que a lente mal paire sobre a balança e aperte o parafuso no suporte do post.
- Construção de aparelhos
- Instale em um computador o programa de registro fornecido com a escala, o software de câmera de microscópio e o aplicativo do controlador de micrometer motorizado.
- Conecte o micrômetro motorizado ao controlador do motor servo e o último ao computador. Inicie a aplicação do controlador do motor e edite as configurações do motor.
NOTA: As configurações do motor, listadas abaixo, foram escolhidas após experimentos preliminares que revelaram que as tensões relaxadas em uma escala de tempo de 10 a 20 s. Com base nessa determinação, selecionamos uma velocidade e aceleração que permitiu ao motor completar um deslocamento de 50 μm em um tempo menor do que o tempo de relaxamento, mas não muito curto para evitar sacudir a amostra. Aqui escolhemos um tempo de deslocamento de cerca de 5-10 s. - Defina a velocidade máxima para 0,01 mm/s e a aceleração para 0,005 mm/s2.
- Instale a câmera no microscópio de inspeção e teste o software de imagem da câmera.
- Coloque a balança no espaço de banco dedicado ao aparelho.
- Cole uma plataforma impressa em 3D (a partir do passo 1.1.2) a uma placa de Petri e adicione uma conta de vidro de 2-3 mm a um dos poços. Coloque a placa de Petri na balança para que a conta esteja localizada perto do centro da panela.
- Substitua o micrometro manual do micromanípulo pelo motorizado.
- Enrosque os dois parafusos 4-40 no suporte da sonda. Conecte o suporte da sonda ao manipulador conforme mostrado na Figura 1C.
- Prepare uma sonda ilustrada na Figura 2A, coloque-a dentro do suporte da sonda com a porção dobrada voltada para baixo e aperte os parafusos.
- Posicione o micromanipulador sobre a mesa de tal forma que a ponta da sonda esteja sobre a conta na plataforma. Fixar o micromanipulador na mesa para evitar o movimento acidental durante o experimento.
- Posicione o microscópio lateral sobre a mesa para que a conta esteja no centro de seu campo de visão e em foco.
2. Preparação de amostras e aquisição de dados
- Fixação e dissecção dos olhos
- Mantenha camundongos de tipo selvagem e animais magp1-nulos em um fundo C57/BL6J idêntico. Eutanize camundongos de 1 mês ou 1 ano por inalação de CO2 .
- Remova os olhos com fórceps finos e fixe os globos enucleados a 4 °C durante a noite em 4% de paraformaldeído/salina tamponada de fosfato (PBS, pH 7.4). Mantenha uma pressão positiva de 15-20 mmHg no olho durante o processo de fixação, conforme descrito6.
NOTA: Experimentos são realizados em camundongos machos, para controlar possíveis diferenças relacionadas ao sexo no tamanho do globo ocular. A pressão positiva garante que o globo permaneça inflado, preservando a distância entre a lente e a parede do olho atravessada pelas fibraszonulares. - Lave os olhos por 10 minutos na PBS. Usando tesoura cirúrgica oftálmica e trabalhando sob um estereomicroscópio, faça uma incisão de espessura total na parede do olho perto da cabeça do nervo óptico.
- Estenda o corte para a frente para o equador, e depois em torno da circunferência equatorial do olho. Tome cuidado para poupar os delicados processos ciliares e fibraszonulares associadas.
- Remova a parte de trás do globo, expondo a superfície posterior da lente.
- Use as fórceps para remover um olho dissecado da solução tampão e coloque-o em uma limpeza de tarefa seca com a córnea virada para baixo. Arraste suavemente a córnea sobre a superfície da limpeza para secá-la.
- Adicione 3 μL de cola instantânea aos poços da plataforma que acomodarão o olho na placa de Petri.
- Coloque o prato na placa do palco do estereoscópio para que o poço com a cola esteja à vista.
- Transfira o olho da limpeza para a borda do poço que contém cola. Em seguida, arraste cuidadosamente o olho para o poço e ajuste rapidamente sua orientação para que a parte de trás da lente fique mais alta.
- Seque o lado exposto da lente, borrando-a suavemente com o canto de uma limpeza seca.
- Aplique um pouco de cola instantânea na parte inferior de uma placa de Petri de 50 mm e cimente a plataforma para ela.
- Medição da resposta viscoelástica zonular
- Ligue a escala, inicie o programa de registro de escala e o software da câmera. Certifique-se de que o programa de registro pode adquirir dados por 30 minutos, pois alguns testes podem durar tanto tempo.
- Ligue o controlador do motor servo e inicie a aplicação do controlador no computador. Certifique-se de que o controlador está configurado para mover-se em incrementos de 50 μm usando parâmetros de movimento semelhantes aos descritos no NOTE na etapa 1.2.2.
- Crie uma curva de 90° em uma haste capilar, conforme descrito na etapa 1.1.1.
- Coloque o capilar dobrado no suporte da sonda capilar e aperte os parafusos de fixação.
NOTA: Para minimizar a desidratação da amostra, recomendamos que as etapas 1-4 sejam concluídas antes ou durante a dissecção dos olhos. - Adicione uma pequena (~1 mm) de cola de cura UV na ponta do capilar.
- Usando os ajustes manuais no manipulador, mova a ponta da sonda capilar para que ela fique diretamente sobre o centro da lente. Verifique se a parte inferior da cola UV aparece centrada na parte superior da lente quando vista da frente (por inspeção visual) e do lado (através da câmera do microscópio).
- Ao olhar através da câmera, baixe a ponta da sonda até que a cola UV faça contato com a lente e cubra de um terço a metade de sua superfície superior.
- Use uma fonte de luz de baixa intensidade (~ 1 mW), direcional, quase visível (380-400 nm) para curar a cola.
NOTA: Essas especificações são suficientes para curar a cola em poucos segundos, minimizando o potencial de indução de 30% de ligação entre proteínas. As fontes de luz UV fornecidas com canetas comerciais de cola UV atendem a essas especificações. - Adicione a solução PBS ao prato até que o olho esteja coberto por fluido a uma profundidade de pelo menos 2 mm.
- Coloque a lente cilíndrica em frente ao microscópio de inspeção e o mais próximo possível da placa de Petri sem tocá-la.
- Inicie simultaneamente o programa de registro e um programa de temporizador. Tire uma foto do olho/sonda usando a câmera.
- Depois dos 60, inicie outro deslocamento de 50 μm, e depois a cada 60 s até que o experimento esteja completo, ou seja, até que todas as fibras tenham sido quebradas. Observe que o sinal não retornará aos níveis de linha de base devido à evaporação do buffer durante o experimento. Corrija a deriva resultante nas leituras durante a análise dos dados, conforme exemplificado na etapa 2.2.14.
- Após a conclusão de uma execução, salve os dados de registro de escala e exporte-os em um formato compatível com a planilha, por exemplo, um formato .csv. Guarde as imagens das lentes coletadas durante a execução.
- Importar dados em uma planilha. Use a leitura da primeira e última escala para interpolar a deriva na leitura de fundo ao longo do tempo devido à evaporação (ver Figura 3). Subtraia a leitura interpolada da leitura em cada ponto de tempo.
NOTA: Se usar uma planilha, a interpolação pode ser realizada automaticamente inserindo a fórmula = B2 - $B$2 + ($B$2 - @INDIRECT("B"&COUNTA(B:B))/(COUNTA(B:B)-2) * A2 na célula à direita da leitura da primeira escala, em seguida, movendo o cursor para o canto inferior direito da célula e arrastando-o para o último valor de dados. A fórmula pressupõe que os dados estão organizados em uma coluna com o primeiro ponto de dados aparecendo na célula B2. Se desejar, os dados processados na etapa 2.2.14 podem ser analisados com o modelo viscoelástico quase elástico desenvolvido por um dos coautores, Dr. Matthew Riley4.
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Representative Results
A técnica de pull-up descrita aqui fornece uma abordagem simples para determinar propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos. Resumindo, o olho do rato é primeiro preservado pela injeção de um fixador na pressão intraocular fisiológica. Essa abordagem mantém a inflação natural do olho e mantém as fibras adequadamente pré-tensionadas (a fixação foi considerada aceitável após experimentos preliminares demonstrarem que não alterou significativamente a elasticidade ou força das fibras). A parte de trás do olho do rato é então removida por dissecção para expor a lente e as fibras zonulares que a suspendem. A frente do olho é afixada em uma plataforma e colocada dentro de uma placa de Petri que repousa em uma escala digital. Em seguida, um capilar de vidro ligado a um micromanipulador é cimentado à superfície posterior da lente. A lente é então levantada em incrementos de 50 μm enquanto a força na escala é registrada. A redução do peso aparente da preparação fornece informações sobre as forças que esticam as fibras. Cada deslocamento é seguido por um período de equilíbrio que dura cerca de 1 min para observar qualquer relaxamento do estresse induzido pelo deslocamento. Finalmente, os resultados são analisados utilizando-se um modelo viscoelástico quase linear projetado especificamente para a geometria das fibraszonulares do rato e a direção da tração para o ensaio4.
Dados viscoelásticos típicos obtidos com nosso método são mostrados na Figura 3. A curva aparece invertida (negativa) uma vez que a força de elevação na lente reduz o peso do conjunto de pratos/plataforma/olho na escala em uma quantidade equivalente. A resposta inclui picos de força instantâneos durante cada um dos deslocamentos verticais de 50 μm da lente, seguido de uma fase de relaxamento com uma vida inteira na ordem de 10 s. Observou-se relaxamento de estresse semelhante para fibraszonulares bovinas12. A magnitude das forças instantâneas e relaxadas aumenta a cada passo até cerca de 1000 s (~800 μm de deslocamento total) e então começa a cair à medida que as fibras começam a falhar. A falha do zonule é completa pelo ponto de tempo de 1.500 s (~1,25 mm de deslocamento total). Observe que devido à evaporação do buffer no curso do experimento, a curva não retorna à leitura inicial após a lente ser liberada do olho.
A Figura 4 contrasta as respostas obtidas para um rato de nocaute Magp-1 (curva vermelha) e um animal do tipo selvagem (curva azul). Estas curvas foram corrigidas para evaporação, invertedas, e as medidas brutas de massa (ver Figura 3) são agora expressas como força (com unidades de mN). A resposta viscoelástica inicial do zonule diluido magp-1 (tempo 0-600 s) se assemelha muito à do tipo selvagem, sugerindo que as propriedades viscoelásticas do zonule não foram significativamente alteradas pela ausência de Magp-1. No entanto, as fibras parecem romper em uma tensão muito menor em comparação com suas contrapartes do tipo selvagem.
Para ilustrar a confiabilidade do método, coletamos dados de vários animais sobre a força instantânea máxima aplicada aos olhos antes que suas fibras se rompessem. Os resultados são mostrados na Figura 5. Os dados para camundongos de 1 mês de idade apresentam valores muito pequenos para o erro padrão da média (SEM) apesar do número relativamente baixo de amostras utilizadas (n = 5 ou 6), sugerindo alta reprodutibilidade. Os resultados indicam que a força das fibras difere significativamente entre os dois genótipos (p-valor = 2,4 x 10-6). Os resultados não apresentados nos números também sugerem que há um aumento sutil, mas estatisticamente significativo, na força de quebra da força com a idade para animais do tipo selvagem (p-valor = 0,024).
O método de tração também pode gerar estimativas quantitativas dos parâmetros viscoelásticos que respondem pelas variações observadas nas respostas temporais. A Tabela 1 resume os parâmetros mais adequados aos nossos dados MAGP-1, obtidos com um modelo viscoelástico quase linear descrito anteriormente4. Os resultados mostram que tanto a exclusão do MAGP-1 quanto o envelhecimento podem ter impactos altamente significativos em algumas das propriedades mecânicas das fibraszonulares.
Figura 1: Um resumo visual do método pull-up. (A) Visão transversal de um olho vertebrado mostrando a lente e as fibras zonulares que a suspendem. (B) Uma abordagem geral para determinar o comportamento viscoelástico nas fibraszonulares deslocando a lente para cima (longe da córnea). (C) Visão real de um olho dissecado colado em uma plataforma com sua lente sendo puxada para cima por uma sonda de vidro presa a um micromanipulador. (D) Esquema de todo o aparelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fabricação de várias partes. (A) Fabricação da sonda de vidro. Um capilar de vidro é mantido em um ângulo e uma chama é aplicada em um local a cerca de 2 cm de uma extremidade. Em poucos segundos, o fim do capilar começa a cair. A chama é removida quando o fim do capilar é dobrado em cerca de 90°. (B) Fabricação da plataforma ocular. A peça é fabricada com uma impressora estereolítografia 3D (SLA). Mede 30 x 30 x 5 mm e contém três recuos hemisféricos com diâmetros de 2,0, 2,5 e 3,0 mm nos quais olhos dissecados de vários tamanhos são colados. (C) Fabricação do suporte da sonda. Esta peça também foi fabricada com uma impressora SLA 3D. Consiste em duas hastes ortogonais de 7,3 mm de diâmetro. A haste inferior contém um furo de 1,5 mm e dois 2,5 mm através de furos na superfície externa para acomodar parafusos metálicos que prendem a sonda capilar no lugar. (D) Montagem negativa da lente. As imagens capturadas pelo microscópio lateral contêm uma distorção astigmática devido à curvatura da placa de Petri e da solução tampão. O conjunto da lente foi projetado para compensar a distorção, permitindo que o microscópio lateral capture imagens em foco nítido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados brutos típicos obtidos com o ensaio. O gráfico mostrado foi gravado com software de registro que registra dados de uma escala digital com uma precisão de 0,01 g. A borda esquerda do gráfico (tempo 0) reflete o peso da amostra sem uma força de elevação. O eixo y retrata a massa em g. A lente é então levantada em passos de 50 μm até que todas as fibras zonulares sejam quebradas e a placa de Petri repousa novamente na balança. Observe que a leitura final é compensada da leitura inicial. O deslocamento deve-se à evaporação gradual da solução tampão durante o curso do experimento e pode ser contabilizado durante a análise dos dados, conforme descrito na etapa 2.2.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curvas representativas de deslocamento de força zonular para ratos com deficiência de tipo selvagem e MAGP-1. O gráfico compara a resposta viscoelástica obtida após deslocamentos discretos da lente longe de sua posição de equilíbrio. A resposta de um olho de um rato magp-1 knockout (KO) rastreia a de um animal selvagem com correspondência etária até o ponto em que as fibras do rato nocaute quebram prematuramente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Forças de quebra de fibras zonulares obtidas com o método de puxar para KO MAGP-1 versus ratos do tipo selvagem e em duas idades. Todas as medidas mostradas são baseadas em n = 5 ou 6 olhos, com barras de erro representando o erro padrão da média (SEM). Abreviaturas: WT = tipo selvagem; KO = nocaute MAGP-1 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Genótipo/idade | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (seg) | σ f (Pa) | |
| WT 1 mês | SIGNIFICAR | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2.83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% | 5.55E+04 | 5.76E+04 | 6.7 | 2.45E+05 | |
| KO 1 mês | SIGNIFICAR | 2.73E+05 | 6.74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7.85E+04 | |
| 95% | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p valores | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1 ano | SIGNIFICAR | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95% | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1-Year | SIGNIFICAR | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95% | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p valores | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p valores, idade | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabela 1: Propriedades viscoelásticas obtidas com um modelo viscoelástico quase linear (QLV). Os dados como os mostrados na Figura 4 foram analisados com um modelo QLV desenvolvido especificamente para o ensaio de puxar para cima e para o zonule do mouse. Parâmetros mais adequados para as rigidezs instantâneas (G0) e equilíbrio (G∞), a constante de tempo de relaxamento (τ) e a força de tração final (σ f) são mostrados. Abreviaturas: SD = desvio padrão; CI = intervalo de confiança.
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Discussion
O zonule é um sistema ECM incomum onde as fibras são organizadas simetricamente e podem ser manipuladas de forma idêntica deslocando a lente ocular ao longo do eixo óptico. O espaço também pode ser facilmente acessado sem interrupção celular, permitindo que as fibras sejam estudadas em um ambiente próximo ao seu estado natal. A técnica de pull-up aproveita esta apresentação de ECM para manipular as fibras delicadas de camundongos, um sistema geneticamente tratável, e quantificar com precisão suas propriedades mecânicas. Isso nos permitiu examinar a contribuição das principais proteínas ECM (fibrillin-118, LTBP-24 e MAGP-1 relatadas aqui) para as propriedades biomecânicas das fibraszonulares. Nossa análise de camundongos deficientes de fibrillina-1 revelou que as fibraszonulares que não possuem fibrillina-1 enfraquecem com a idade e eventualmente se rompem, levando ao deslocamento da lente dentro do olho (em humanos, uma condição conhecida como lentis ectopia). Significativamente, a luxação das lentes também é uma ocorrência comum em pacientes com síndrome de Marfan, doença causada por mutações no gene FBN120. Assim, o ensaio pull-up oferece uma oportunidade de modelar aspectos da doença do tecido conjuntivo humano em camundongos. Em camundongos sem LTPB-2 (proteína considerada envolvida na gênese de microfibrilas), pudemos demonstrar que as fibraszonulares foram produzidas na ausência dessa proteína, mas romperam com tensões significativamente menores e eventualmente se desintegraram com a idade4. Esses resultados sugerem que o LTBP-2 contribui para a longevidade das fibras em vez de sua síntese. No presente estudo, determinamos que as fibras deficientes magp-1 tinham propriedades viscoelásticas semelhantes às fibras do tipo selvagem, mas rompiam-se em tensões mais baixas, sem sinal de maior degradação relacionada à idade. Isso seria consistente com um modelo no qual as fibras que não possuem MAGP-1 são intrinsecamente mais fracas assim que se desenvolvem.
Notamos que os pontos fortes de tração finais listados na Tabela 1 são estimados sob a suposição de que as fibras quebram em algum lugar no intervalo médio. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de que a falha de fibra seja devido ao descolamento de pontos de ancoragem na superfície da lente ou no corpo ciliar. Se esse fosse o caso, a resistência à tração da fibra poderia ser maior do que os valores listados na Tabela 1. A análise microscópica será necessária para diferenciar essas possibilidades. Tal análise está longe de ser trivial, uma vez que as fibras envolvidas são muito finas (~0,5-0,6 μm de largura) e quase indexadas à água, tornando-as essencialmente invisíveis. Na ausência dessas informações adicionais, só podemos afirmar que os pontos fortes de tração finais listados na Tabela 1 representam seus limites inferiores. Também seria interessante, em princípio, verificar se as medidas de força diferem dependendo de qual direção a lente é puxada. Na prática, no entanto, puxar a lente do lado anterior exigiria a remoção da íris sem danificar as fibraszonulares imediatamente abaixo. Tal dissecção precisa está além do que podemos alcançar atualmente com o olho do rato.
A relativa simplicidade do método e a alta reprodutibilidade de seus resultados são qualidades desejáveis para estudos comparativos de propriedades mecânicas ECM. Além disso, como demonstrado aqui, também é possível usar o ensaio de puxar para obter valores absolutos de parâmetros viscoelásticos assumindo um modelo viscoelástico e encaixando as curvas de tempo a ele. Por exemplo, usando um modelo de viscoelástico quase linear padrão (QLV), conseguimos extrair valores para rigidezs instantâneas (G0) e de equilíbrio (G∞), a constante de tempo de relaxamento (τ), e a força de tração final (σ f) de fibraszonulares de camundongos do tipo selvagem, bem como aquelas que não possuem LTBP-24 ou MAGP-1. Os valores G0 e G∞ obtidos para animais do tipo selvagem em ambos os estudos variam de 6,7 x 104 Pa a 2,3 x 105 Pa, uma gama amplamente comparável às encontradas em fibras muito maiores derivadas de zonulos humanos, bovinos e suínos (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13, 14,15,16. Este acordo entre as espécies sugere que essas são características universais dessas fibras, e nos dá confiança de que parâmetros viscoelásticos significativos podem ser extraídos com nosso método.
Um passo crítico para obter respostas viscoelásticas de qualidade é a orientação do olho dissecado colado à plataforma (passo 2.1.9). A inclinação menor (menos de 10°) não parece afetar significativamente os resultados. Experimentos realizados fora desse limite podem gerar curvas com formas que se desviam das mostradas na Figura 4. Por exemplo, algumas dessas curvas podem possuir dois picos largos em vez de um.
Idealmente, o procedimento descrito neste artigo teria sido realizado sem fixação dos olhos, o que limita nossa capacidade de avaliar os verdadeiros parâmetros viscoelásticos de fibraszonulares frescas. No entanto, depois que nossos experimentos preliminares não mostraram diferença significativa entre as amostras fixas e frescas paraformaldeídas, decidimos adotar a fixação, pois ela proporcionava várias vantagens. Como aludido ao Protocolo, o uso de tecidos fixos ajuda a preservar o trecho nativo das fibras para os experimentos de pull-up. Além disso, descobrimos que a fixação promoveu maior adesão da cola UV à cápsula ocular, reduzindo assim as chances da sonda se desprender da lente durante a ação de puxar para cima, como comumente experimentado com amostras frescas (o destacamento da sonda pode ser facilmente reconhecido como um retorno repentino da força a um nível de linha de base). A fixação também impediu a fivela da parede ocular na direção da tração. Apesar dessa limitação, nosso método fornece uma abordagem robusta para determinar a contribuição relativa dos componentes proteicos para as propriedades viscoelásticas das fibras zonulares.
Embora nosso trabalho até agora tenha focado na contribuição de proteínas específicas, o método poderia ser prontamente adaptado para estudar o efeito de fatores externos às fibras em suas propriedades mecânicas. Tais fatores incluem temperatura, pH, concentração de cálcio e a presença ou ausência de enzimas transversais. Medições de alta precisão poderiam ser obtidas usando nosso método no modo diferencial, ou seja, pré-tensionando as fibraszonulares com um estresse/tensão inicial e, em seguida, lendo a diferença de tensão que se segue quando as condições externas são alteradas. Algumas dessas intervenções podem afetar a elasticidade dos tecidos que circundam o zonule e, portanto, produzir mudanças na tensão que competem com as geradas no zonule. Medidas de controle com tecidos isolados seriam necessárias para avaliar sua relevância para os experimentos propostos. Esperamos que tais efeitos possam ser insignificantes, com base em observações com a câmera lateral mostrando que tecidos contíguos se comportam como materiais altamente rígidos que não sofrem essencialmente nenhuma deformação mesmo quando as fibraszonulares estão totalmente esticadas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 EY029130 (S.B.) e P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 e pela Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), a Fundação Marfan, e uma bolsa irrestrita ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Washington de Pesquisa para Prevenir a Cegueira. J.R. também recebeu uma bolsa da Universidade de Ciências da Saúde e Farmácia em apoio a este projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
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