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Biology

未知の フザリウム・オキシスポラム f.spの人種を決定するために使用された3つの接種技術の対照。 ニベウム 分離

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

スイカのフザリウムのしおれを管理するには、存在する病原体種族の知識が必要です。ここでは、病原性真菌 Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon)のレースタイピングにおけるそれらの有効性を実証するために、根浸漬、寄生カーネル播種、および改変トレイディップ接種法について説明する。

Abstract

フザリウム・オキシスポラム・f・sp・ニベウム(Fon)によって引き起こされるスイカ(Citrullus lanatus)のフザリウム萎凋病は、米国南東部、特にフロリダ州で主要な生産制約として再浮上している。人種特異的な耐性品種などの統合害虫管理戦略を展開するには、栽培者の畑における病原体の多様性と個体群密度に関する情報が必要です。病原体分離株を同定するための分子診断ツールの開発にはいくらかの進歩があるものの、人種決定にはしばしばバイオアッセイアプローチが必要である。

レースタイピングは、4つのスイカディファレンシャル(ブラックダイヤモンド、チャールストングレー、カルフーングレー、植物紹介296341-FR)のそれぞれを用いて、ルートディップ接種、寄生カーネル播種法、および改変トレイディップ法によって実施した。分離株は、接種後5週間で疾患発生率の計算によって人種指定が割り当てられる。特定の品種の植物の33%未満が症候性であった場合、それらは耐性として分類された。発生率が33%を超える品種は感受性とみなされた。本稿では、種族、根浸漬、寄生核、および改変トレイディップ接種を確かめるための3つの異なる接種方法について説明するが、その接種方法は実験計画によって異なる。

Introduction

フザリウム・オキシスポラム種複合体(FOSC)を構成する土壌媒介性真菌は、多様な作物において重篤な病害および収量損失を引き起こす可能性のある、影響力のある半生物栄養性植物病原体である1。F. oxysporum f. sp. niveum(Fon)によって引き起こされるスイカのフザリウム萎凋病は、過去数十年で世界中で範囲、発生率、および重症度が増加しています2,3。苗木では、フザリウムの萎凋病の症状はしばしば減衰に似ています。古い植物では、葉は灰色、クロロチック、および壊死性になります。最終的に、植物のしおれは完全な植物崩壊および死に進行する4。直接的な収量損失は、症状および植物死のために起こり得、一方、間接的な収量損失は、葉面キャノピー5の除去によって引き起こされる太陽の損傷のために起こり得る。有性生殖および関連する生殖構造は、F. oxysporumにおいて観察されたことがない。しかし、病原体は、マイクロコニジアとマクロコニジアの2種類の無性胞子と、クラミドス胞子と呼ばれるより大きく長期的な生存構造を産生し、土壌中で長年生存することができます6。

FOSCは、観察された宿主範囲に基づいてフォルマ科特異種に分類され、通常は1種または数種の宿主種に限定される1。最近の研究は、この種複合体が15種の異なる種の複合体である可能性があることを示しているが、スイカに感染する特定の種は現在不明である7。F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) は、シトルラス・ラナトゥスまたは家畜化されたスイカ 8,9 に排他的に感染する系統のグループの名前です。ほとんどの病原性フォルマ科の特殊動物に属するF. oxysporum株は、宿主種に対する遺伝的構成要素および毒性に関して一定レベルの多様性を示す。例えば、ある株は宿主のすべての品種に感染するかもしれないが、別の株はより感受性の高い品種にのみ感染するかもしれない。このような変動を説明するために、これらのグループは、進化的関係または共通の表現型特性に基づいて非公式に人種に分類される。Fon内では、4つの種族(0、1、2、および3)が、選択されたスイカ品種のセットに対する病原性に基づいて特徴付けられており、最近10の種族3の発見が起こった。

この見かけ上の多様性にもかかわらず、胞子または菌糸の形態はフォン種族の種族間で区別できないため、単離物の固有の種族を同定するためには分子または表現型アッセイが必要である11。分子研究は、いくつかの遺伝的な違いを特定しました。例えば、Secreted in Xylem(SIX)エフェクターの役割は、F. oxysporumにおいて長年にわたって研究されており、これらのエフェクターのいくつかは、水平遺伝子導入中に交換される染色体上に配置されている12。たとえば、SIX6 は Fon レース 0 と 1 には見られますが、レース 213 には見つかりません。SIXエフェクターは、トマトおよびバナナにフザリウム萎凋病を引き起こすF. oxysporum f. sp. lycopersiciおよびF. oxysporum f. sp. cubenseの病原性に関与している14,15,16,17。ホウレンソウのフザリウム萎凋病原体であるF. oxysporum f. sp. spiniciaeの系統間のSIXエフェクタープロファイルの解析により、遺伝的および表現型の多様性を正確に反映した分類が可能になった18。しかし、Fon種族の病原性メカニズムの違いは現在完全には理解されておらず、その使用時に開発された分子アッセイは一貫性のない不正確な結果を示している19。したがって、感染アッセイからの表現型結果は、現在、分離株を分類するための最良の方法である。

F. oxysporumは、最初に根を通って宿主に感染し、その後、木部20を登る。これは、所与の宿主品種の根の直接接種をレースタイピングを行うための有効な方法とし、ルートディップおよびトレイディップ接種方法21の基礎となる。宿主に感染していないとき、F. oxysporumは土壌に存在し、何年も休眠状態のままにすることができます。関心のある畑から土壌中に影響を受けやすいスイカ栽培品種を栽培することは、Fonの存在をテストする1つの方法です。故意にFonを蔓延させた土壌中に異なる既知のレベルの抵抗性の品種を含めるようにこの方法を拡張することも、レースタイピングを行う良い方法であり(表1)、寄生カーネル播種法の基礎である。修正トレイディップ法は、オリジナルのトレイディップ法のバリエーションであり、多くの植物や畑の分離株を迅速に調査できるハイスループットのレースタイピングを可能にします22。迅速かつ成功したレースタイピングバイオアッセイの重要な要素には、異なる病原体種に対する耐性の違いを文書化した品種の使用、接種物が感染時に生物学的に活性で豊富であることを保証すること、病原体と宿主の両方を助長する環境を維持すること、および疾患の重症度または発生率について一貫した評価システムを使用することが含まれる。本稿では、上記の原理に基づく表現型レースタイピングのためのルートディップ23,24、寄生カーネルシーディング25,26、および修正トレイディップ22法について説明する。

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Protocol

1. ルートディップ法(RDM)による人種の決定

  1. 実験環境の整備
    1. 症状発現は環境条件に大きく依存するため、管理区域で植物を維持する。相対湿度、温度、光周期、および光強度を監視します(図1)。
      1. 温度を26〜28°C、相対湿度を50〜75%に設定し、16時間の光周期を設定して、植物の成長と健康を確保します。
        注:低酸素症、苗のしおれ、および/または種子の腐敗を防ぐために、苗の周りに水をやり過ぎたり、水を放置したりしないでください。
      2. 光合成の成長をサポートするために、少なくとも1850ルーメンの光と2,800 Kの色温度を持つ2つの蛍光管ライトを使用してください。
      3. 地域を清潔に保ち、害虫の被害や偶発的な感染を防ぐために、廃土や植物の破片の除去などの衛生的な慣行を使用してください。
    2. 植え付け条件
      1. 8 x 16セル(幅25 cm x 長さ50 cm)のスタートフラットに植栽用培地を充填し、タップダウンして土壌をわずかに圧縮します(図2)。
      2. ブラックダイヤモンド/シュガーベイビー、チャールストングレイ/オールスイート/ディキシーリー、カルフーングレイ、PI-296341-FRの4つの異なる品種の種子を入手してください。
      3. その頂点(尖った端)が長さに等しい深さまで上を向いて種を蒔きます。種子を蒔いた後、埋もれた種子を含む培地を100%フラーズアースまたは他のベントナイト粘土で0.3175〜0.635cmの深さに覆う。
      4. 平らな部分を霧状にして、水を立たせたり溜めたりせずに培地を湿らせます。その後、180分ごとに20秒間霧を塗るか、種子が発芽するまで1日1回手で散水してメディアを湿らせてください。発芽後、1日1回、必要に応じて水を入れて苗の成長を支えます。
    3. メディアの準備
      注:両方の培地は、表面をこすり取ることによって胞子の収穫を可能にするために、余分な粒状寒天でしっかりと作られています。
      1. 清澄化されたV8ジュース培地(V8)
        1. 100mLの清澄化V8オリジナル100%野菜ジュースと1%CaCO3を400mLの蒸留水に加えることによって、500mLの清澄化V8ジュース培地(V8)27を調製する。
        2. 7.5gの粒状寒天を加える。
        3. 材料をよく混ぜ、オートクレーブし、滅菌ペトリ皿に注ぐ前に50°Cに冷却する。
      2. 4分の1強度ジャガイモデキストロース寒天培地(qPDA)
        1. 500 mLの蒸留水に造粒寒天4.5 gを加え、ジャガイモデキストロース寒天3.8 gを加えてqPDA培地を調製する。
        2. 材料をよく混ぜ、オートクレーブで、50°Cまで冷却してから、滅菌ペトリ皿に12〜15mLを注ぐ。
  2. 実験的治療法の準備
    1. 接種剤を準備する。
      1. 植え付けから5日後(dpp)、好ましいF. oxysporum分離物を含む浸潤したペーパーディスク(直径1〜1.25cm)を1枚のV8プレートおよび1枚のqPDAプレート上に置き、それらをインキュベーター(〜28°C)に8日間保存する(図3A)。
      2. 真菌の増殖の8日目および接種の前日(セクション1.3.2を参照)に、V8およびqPDAプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移す。
      3. 各分離株について、滅菌脱イオン水6mLを各V8およびqPDA培養プレートに分配する。
      4. 培地表面を横切って滅菌細胞スプレッダーを掻き取ることによって分生子を脱落させる(図3B)。液体分生子懸濁液をプールし、滅菌50mL培養管に移す(図3C)。
      5. 50 mL培養管内の分生子懸濁液の総液体体積が約12 mLになるまでこのプロセスを繰り返す。
      6. 別の分離液に進む前に、作業領域と細胞スプレッダーをアルコールで表面滅菌します。セルスプレッダーを≥70%エタノールに浸した後、ブンゼンバーナーに通して滅菌します。
      7. 液体分生子懸濁液がすべての分離株の培養管に移されたら、胞子数を定量する。まず、個々の50mL培養チューブをボルテックスし、血球計器の各チャンバーに10μLを分注する。そして、前述のように血球計数器29で胞子数を算出する。
      8. 計算された容量を106 +10%の別の滅菌培養チューブに移すことによって最終的な接種液を調製し、滅菌脱イオン水を加えて全容量を30mLにする。
      9. これらの培養チューブを8±1°Cで一晩保存する。
        注:これは、未発表のデータによって示されるように、分生子の生存率を失うことなく行うことができる。
  3. 接種
    1. 接種を準備する。
      1. 接種の日の前に、13日齢の苗木を土壌運搬能力にしっかりと水やりする。
      2. 試験する分離株、スイカ品種、接種日などの関連情報をステークに事前にラベル付けします。
      3. 10%の漂白剤で消毒してよくすすぎ、接種した植物を受け取るために、6 x 12セル(幅20 cm x 長さ40 cm)の発泡スチロールフラットを置きます。
      4. 必要なすべての材料を前置します( 材料表を参照)。
    2. 植物の根に接種する。
      1. 接種を開始する数時間前に植物にしっかりと水をまきます。散水後少なくとも2時間後に、8 x 16セルの発泡スチロールの平らから小植物を取り除き、根をすすぎ、付着した植え付け材料微粒子を除去する。
      2. 使用時まで水道水でリンスした植物を清潔な容器に一時的に保管し、栽培品種を互いに分離したままにする(図4A)。小植物を6人のグループに分け、乾燥を防ぐために、苗木のグループを濡れたペーパータオルで包んだままラボトレイに置きます。
      3. 6 x 12アレイ発泡スチロールトレイの各セルの底に25〜30cm3 の土壌を置き、ホヤボトルを使用して、目に見えて湿るまで土壌を濡らします。
      4. ブラックダイヤモンド、チャールストングレイ、カルフーングレイ、そしてPI 296341 01 FRが左から右に植えられるように、植物に接種し、品種に従って順番に植え替えます。
      5. 健康な対照から始めて、同じ品種の6つの損傷を受けていない苗木のグループを接種物を含む50mLチューブに入れる。健康なコントロールの場合は、胞子懸濁液の代わりに水道水を使用してください。最後に植物にポジティブコントロール(Fon race 3)を接種する。
      6. チューブに入ったら、植物の根が接種物(水道水)に到達し、さらされていることを確認してください。
      7. 小植物の根でチューブを30秒間沈めて渦を巻く(図4B)。ボルテックスの後、6 x 12の発泡スチロールのフラットにセルごとに1つのプラントレットを置きます。同じ品種の植物をトレイの同じ列に置きます。
      8. 配置後、手袋をはめた手を0.7%の塩素溶液の入ったバケツに30秒間入れて消毒し、水道水ですすぎを1分間行います。
      9. その後、置いたプランレットを植え付け培地で覆い、穏やかにセットします。シリンジまたはピペットを使用して、飛沫を避けながら、プランレットあたり20mLでプランレットに慎重に水をやります。
      10. 次の植物セットに進む前に、塩素溶液と水道水ですすぎを使用して手袋をはめた手をもう一度消毒してください。
      11. すべてのプランレットが植え直されたら、接種剤の流出を防ぐために、それらを最小限に水やりします。
      12. 27°C (78 °F) の平均温度の密閉された暗い環境で植物を一晩保持する。 翌日、植物を温室に移し、平均温度を27°Cに保ちます。
  4. 接種植物の維持管理・管理
    1. 余剰水の溢れを防ぐために、植物が安定するまで4〜5日間、1日3回、平らに軽く水をやります。
    2. 少なくとも3日間、トレイを毎日2〜3回チェックして、散水が適切かつ均一であることを確認してください。
    3. 日光やシェーディングによる乾燥を避けて、フラットを回転させたり、必要に応じて追加のシェーディング/散水を行ったりしてください。
    4. 3dppで、20-20-20速放性肥料(10g / 3.78L)で植物を水1リットルあたり3〜6mLの割合で施肥する。
    5. 毎週3〜4週間受精させる。
    6. このステップ全体を通して、同じ照明と環境条件を維持します。

2. 侵入カーネル法(IKM)による人種の決定

  1. カーネルの侵入
    1. 接種剤を準備する。
      1. 保存されたサンプルまたは新しく収集されたサンプルから、目的の F. oxysporum f. sp. niveum 株をqPDAのプレート上で単離し、その成長がプレートの半分を覆うまで培養する。
        注:これは、それが活性で実行可能であることを示しており、後のステップで穀物の実質的な侵入に必要です。
    2. カーネルを準備します。
      1. スケールで、ライ麦(Secale spp.)果実(またはMaxie var. wheat (Triticum spp.)カーネル)200gを十分に大きな容器で測定し、1つ以上の1Lガラス三角フラスコに注ぎます。フラスコに滅菌水道水を加えて、少なくとも5cmまでの穀物を完全に覆います(図5A)。
      2. カーネルを室温(〜24°C)で2時間浸します。フラスコから水を排水する。チーズクロスで包まれた綿ロールで開口部を塞ぐ。開口部をアルミホイルラップで覆います(図5B)。
    3. カーネルを除染する。穀物が水を吸収したら、接種前に他の不要な微生物を殺すために、2つの異なる方法でオートクレーブします。
      1. 初めて、調製したフラスコ内の穀物を重力サイクル(121.2°C、1.06kg/cm2)で5分間乾燥時間で1時間オートクレーブ処理する。フラスコを室温まで冷却する。
      2. 2回目のオートクレーブ処理の前に、0.5μmのフィルターを備えた小さなキノコ栽培バッグに穀物を移します。袋から空気を取り除き、余分なプラスチックを袋の周りに折りたたみます。
      3. バッグをプラスチック製のオートクレーブで安全なビンに入れます。アルミホイルラップでビンを覆います(図5C)。
        メモ:袋の中の穀物をオートクレーブ処理するときは、袋が溶ける可能性があるため、金属製のビンを使用しないでください。
      4. ビンを5分間の乾燥時間で1時間の重力サイクルでオートクレーブし、以前と同じサイクルにする。
        注:バッグを2回オートクレーブすると、フィルターとポートが損なわれる可能性があるため、バッグを2回目ではなく2回目のみオートクレーブします。オートクレーブから取り外す前にバッグをゆっくりと完全に冷却することで、フィルターの結露を防ぎます。
    4. カーネルに接種します。
      1. バイオセーフティキャビネット内の培養プレートとバッグを操作し、滅菌#4サイズのコルクボアで培養プレート上の活発な成長ゾーンから直径6mmの寒天ディスクを切り取ります。バッグを広げます。厳格な滅菌技術を使用して、5枚の寒天ディスクを袋に入れます。滅菌50 mLメスシリンダーを使用して、35 mLの滅菌水道水を測定し、バッグに追加します。
      2. 袋の開口部をやや転がしてから、70%エタノールを外側にスプレーして表面殺菌します。
        注:湿気もフィルターを危険にさらしますので、フィルターをスプレーしないでください。
      3. 角を中央に向かって折りたたみ、フィルターの上に2回以上折りたたんでバッグを閉じます。バッグクランプとメーカー提供の透明なビニールチューブでバッグを固定します。
        メモ: クランプは再利用可能です。
      4. バイオセーフティキャビネットからバッグを取り出します。
    5. 成長のために病原体を保管する。
      1. バッグを直立して保管してください。フィルターがバッグの反対側から引き離され、最大限のガス交換が可能になるようにします(図5D)。
      2. 材料を室温で約3週間インキュベートする。病原体の均一な成長を確実にするために、穀物を定期的に再分配する。
        メモ:バッグは再使用できません。
  2. スイカの苗木の寄生穀物の感染
    1. 先に記載したようにスイカ種子を原料とする。
    2. 実験グループを決定する。
      注:必要な病原体の唯一の株は、人種識別のために試験されている分離株です。しかし、陰性対照と陽性対照は、感染していない植物や特定のレベルの感染がある植物と比較するのに役立ちます。
      1. ネガティブコントロールを調製するには、前述の方法に従って滅菌された小麦核を使用するが、接種は行わない。
      2. 陽性対照を調製するには、未知の分離株との比較のために、既に分類された株を接種した小麦核を使用する。
    3. 土と穀物を組み合わせる。
      1. 14粒の寄生カーネルを大きなビニール袋に入れて測定します(図5E)。プラスチック製のポット(直径15 cm x 高さ10 cm)にポッティングミックスを入れて、必要なミックスの量を測定します。ミックスを袋に入れます。バッグにエアクッションを作り、ひねったり密封したりして閉じます。
      2. 袋を数回反転させてカーネルと土壌を混ぜる。ネガティブコントロールの場合は、クリーンなカーネルを使用して別のバッグで同じプロセスを実行します。陽性対照の場合、比較株に寄生したカーネルを有する別のバッグ内で同じプロセスを実行する。
      3. 表面滅菌された4つのポットに、蔓延した土壌混合物を充填する。ネガティブコントロールの場合は、Fonに汚染された土壌を処理する前に、その混合物をポットに入れてください。
    4. スイカの種を蒔く。
      1. 各鉢に6つの種を蒔く。各ポットに1つの品種の種子のみが含まれていることを確認してください。種子の頂点端を上に向けて種子を配置し、出現時に適切な成長を可能にする(図6A)。
      2. スプレーボトルを使用して、上部0.3〜0.6cmの土壌を水で濡らします。透明なプラスチック製の皿(直径15cm)を各ポットの下と上に置き、種子の発芽のための湿気の多い環境を作り出します(図6B)。
    5. 生育条件を確立する。
      1. 種子が発芽するまで(約5日間)流出することなく濁りを維持するために、スプレーボトルで1日3回ポットに水をやる。
        注:水の使用量は、植物の大きさと鉢の大きさとともに増加します。
      2. 種子が発芽したら、上の皿を鍋の下側に移動します。
      3. 最適な植物の成長のために、必要に応じて毎日植物に水をやります。前述のものと同様の照明条件下および温度27°C(±1°C)で植物を16時間の光周期にさらす。

3. 修正トレイディップ法(MTDM)によるレースの決定

  1. 接種用材料の調製
    1. 植え付け条件を確立する。
      1. 48セル(幅3.68 cm x 長さ5.98 cm x 深さ4.69 cm)のインサートを蒸気低温殺菌砂:泥炭:バーミキュライト(4:1:1)で塗りつぶし、土をわずかに圧縮するためにタップダウンします。カバーをプラスチックトレイ(幅27.9 cm x 長さ53.3 cm x 奥行き5.1 cm)に入れます。
      2. その頂点(近位端)が長さに等しい深さまで上を向いて種を蒔きます。
      3. 前述のように種子を調達します。
      4. その後、180分ごとに20秒間ミストを塗るか、1日1回手で散水してメディアを湿らせてください。
      5. 発芽後(約5日間)、1日1回、必要に応じて水を与えて苗の成長を支えます。
    2. メディアを準備します。
      1. 500 mLの蒸留水に5.625 gの粒状寒天を加えてqPDA培地を調製する。ジャガイモデキストロース寒天培地4.875gを加える。材料をよく混ぜ、オートクレーブで、滅菌ペトリ皿に注ぐ前に50°Cに冷却した。ペトリ皿をパラフィルムで密封し、使用時まで冷蔵庫(4°C)にプレートを保管する。
      2. ブロス培地を調製するために、24gのジャガイモデキストロースを1Lボトルに計量して加える。ボトルに蒸留水を加えて混合物を1000mLにし、ボトルをホットプレートの上に置き、溶解するまで攪拌する。100 mLのブロスを250 mLの三角フラスコに分配する。チーズクロスを使用してフラスコとオートクレーブを密封します。
    3. 接種剤を準備する。
      1. 植え付けの7日前に、5枚のqPDAプレートに浸潤紙28 を接種し、14時間/ 10時間の暗サイクル22で8日間インキュベートされた領域に保管する。
      2. 7日目に、2つの1cm2 寒天プラグを100mLジャガイモデキストロースを含む各250mL三角フラスコに移す。三角フラスコをベンチトップシェーカーに200rpmで置き、14時間/10時間の明暗サイクルで7日間置きます。
      3. 接種日(播種後14日目)に、4層の滅菌チーズクロスを通して接種物を濾過することによって胞子を収穫する。
      4. 前述のように血球計数器を用いてフラスコ内の微小分生子濃度を決定する。プラスチック製の浴槽(幅40.6 cm x 長さ67.3 cm x 深さ16.8 cm)に7 Lの接種剤懸濁液を調製し、正しい容量の胞子懸濁液を滅菌水に移し、最終胞子濃度が1 × 106 mL-1 になるようにします(図7A)。
  2. 接種
    1. 播種後14日後(少なくとも最初の真の葉の段階)、苗木と一緒にセルインサートをウェッブトレイ(幅26.9 cm x 長さ53.7 cm x 深さ6.28 cm)に移します。苗の入ったウェッブトレイを、7Lの接種剤懸濁液を入れたプラスチック製の浴槽にそっと入れます。各トレイを一度に1つずつ接種する(図7B)。
    2. 苗を15分間邪魔されずに接種物に残す。15分後、接種した苗を含むセルインサートを穴のないトレイ(幅27.9cm×長さ53.3cm×深さ5.1cm)に静かに移す。トレイごとにこのプロセスを繰り返します。
    3. 穴のないトレイを温室のベンチに置き、必要に応じて水を注ぎます。ルートディップバイオアッセイで説明したのと同じ照明および環境条件を維持します。

4. 疾病評価

  1. 評価の時間間隔を選択します。
    1. ルートディップ法および改変トレイディップ法では、小植物が接種されてから1週間後に評価を開始し、さらに4週間毎週続けます。
      注: 結合されたデータセットには、この期間中の観測値の 5 セットが含まれます。
    2. カーネル方式を使用している間は、苗木が出現した後にのみ評価を開始し、毎週合計6つの評価を継続します。
  2. 発生率を観察し、計算します。
    1. 各評価中に、デジタル画像を撮影して病気の進行を記録します。
    2. しおれや植物の死の発生率を報告する。健康な対照と比較した症候性植物と枯れた植物の数の合計を、その品種の植物の総数の割合として取ることによって発生率を計算する。
  3. 結果を分析します。品種間および対照を使用した場合の実験群間の感染パターンを比較する。

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Representative Results

これらの実験は、一般的に栽培されている品種の相対的な耐性を定義するのに役立ちます(表1)。この情報は、地元のフォン個体数に基づいて管理上の推奨事項を導くために使用できます。言い換えれば、人種0または1が商業分野に存在することが知られている場合、農家はカルフーングレイ、サンシュガー、または同等の「耐性」品種を栽培する傾向があるかもしれません。すべての方法を用いたバイオアッセイの結果は、苗木がレース1分離株に感染したとき、ブラックダイヤモンドおよびチャールストングレイ品種が死亡または重篤な症状を示したのに対し、カルフーングレイおよびPI品種は耐性を示したことを示している(表2 および 図8A)。

すべての方法は、苗木がRace 3分離株に感染すると、すべての品種のほぼすべての植物が死亡または重篤な症状を示したことを示した(図8B)。これらの結果は、両方の接種方法を用いたバイオアッセイがFonの種族間をうまく区別する方法を実証している。罹患した植物の出現は、すべての方法で同じでなければならない。唯一の違いは、品種が空間的にグループ化される方法です。ルートディップ法と修正ドレイディップ法では、栽培品種はトレイの列によって編成されますが、カーネル法では、栽培品種は独自のポットにグループ化されます。

Figure 1
図1:RDMの実験領域 相対湿度、温度、光周期、光強度などの環境条件に大きく依存する症状変動性のため、規制された実験領域を維持することが重要です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:RDM用の開始フラットの準備 8 x 16セル(幅25 cm x 長さ50 cm)のスタートフラットを植え付け用培地で満たし、タップダウンして土壌をわずかに圧縮します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:RDM用の分生子懸濁液の調製。 (a)単離及び培養。保存または新たに収集されたサンプルから、目的の F. oxysporum f. sp. niveum 株をqPDAのプレート上で単離および培養し、その成長がプレートの半分を覆うまで培養する。これは、それが活性で実行可能であることを示しており、これは後のステップで穀物の実質的な侵入に必要である。(B)分生子を脱臼する。培地表面を横切って滅菌細胞スプレッダーを掻き取ることによって分生子を脱落させる。(C)停止宣誓供述。液体分生子懸濁液をプールし、滅菌50mL培養チューブに移す。略号:qPDA=ジャガイモデキストロース寒天培地の4分の1強度。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:RDMのための苗木の組織化と渦 巻き(A)品種の分離。すすぎた植物は、使用時まで水道水で清潔な容器に一時的に保管し、栽培品種を別々に保ちます。(B)苗の渦巻き。6 x 12の発泡スチロールのフラットに細胞ごとに1つのプラントレットを植えるために、30秒間沈めたプラントレットの根でチューブを渦巻きます。同じ品種の植物をトレイの同じ列に入れます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:IKMのためのカーネルの準備と侵入 (A)ライ麦果実の吸収。スケールで、ライ麦(Secale spp.)果実(またはMaxie var. wheat (Triticum spp.)カーネル)200gを十分に大きな容器で測定し、1つ以上の1Lガラス三角フラスコに注ぎます。フラスコに滅菌水道水を加えて、少なくとも5cmまでの穀物を完全に覆う(B)フラスコを排水する。フラスコから水を排出し、チーズクロスで包まれた綿ロールで開口部を塞ぎ、開口部をアルミホイルラップで覆います。(C) オートクレーブのセットアップ。バッグをプラスチック製のオートクレーブで安全なビンに入れます。袋の中の穀物をオートクレーブ処理するときは、袋が溶ける可能性があるため、金属製のビンを使用しないでください。アルミホイルラップでビンを覆います。(D)袋の保管。バッグを直立して保管してください。フィルターがバッグの反対側から引き離されていることを確認し、最大限のガス交換を可能にします。(E)大きなビニール袋に14粒の寄生カーネルを測定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:スイカ種子の播種と発芽。 (A)品種の種を鉢に播種する。各鉢に6つの種を蒔く。各ポットに1つの品種の種子のみが含まれていることを確認してください。種子の頂点端を上に向けて種子を配置し、出現時に適切な成長を可能にする。(B)種子の発芽。スプレーボトルを使用して、上部0.3〜0.6cmの土壌を水で濡らします。透明なプラスチック皿(直径15cm)を各ポットの下と上に置き、種子の発芽のための湿気の多い環境を作ります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:MTDMの接種剤調製と苗接種 (a)接種剤の調製。前述のように血球計数器を用いてフラスコ内の微小分生子濃度を決定する。プラスチック製の浴槽(幅40.6cm、長さ67.3cm×深さ16.8cm)に7Lの種菌懸濁液を調製し、正しい容積の胞子懸濁液を滅菌水に移し、最終胞子濃度が1×106mL−1×した。(b)苗に接種する工程。播種後14日後(少なくとも最初の真の葉の段階)、苗木と一緒にセルインサートをウェッブトレイ(幅26.9cm×長さ53.7cm×深さ6.28cm)に移す。苗の入ったウェッブトレイを、7Lの接種剤懸濁液を入れたプラスチック製の浴槽にそっと入れます。各トレイに一度に1つずつ接種します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:人種同定方法の表現型結果。 (A) レース1の結果。(A)すべての方法を用いたバイオアッセイの結果は、苗木がRace 1分離株に感染したとき、ブラックダイヤモンドおよびチャールストングレイ品種が死亡または重篤な症状を示し、カルフーングレイおよびPI品種が耐性を示したことを示している。(B)レース3の結果。すべての方法は、苗木がRace 3分離株に感染すると、すべての品種のほぼすべての植物が死亡または重篤な症状を示したことを示した。(罹患した植物の出現は、すべての方法で同じでなければならない。矢印で示す植え付けの順序(左から右):ブラックダイヤモンド(青い矢印)、チャールストングレー(紫色の矢印)、カルフーングレー(茶色の矢印)、植物紹介296341-FR(緑色の矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

品種 レース0 レース1 レース2 レース3
シュガーベイビー、ブラックダイヤモンド S S S S
チャールストングレイ、オールスウィート、ディキシーリー R S S S
カルフーン・グレイ、サンシュガー R R S S
PI - 296341 - FR R R R S

表1:フザリウム・オキシスポラムの種族 f. sp. ニベウム。Fusarium oxysporum f. sp. niveumの種族は、一連のスイカの差に対する感受性または耐性の反応によって決定される。各行にリストされている品種は、分離株の人種の評価中に各レベルの耐性を表すために最も使用されます。このテーブルは 4 から変更されています。略語: S = 影響を受けやすい;R = 耐性。

隔離する 方式 ティッカー ティッカー カルG. 円周率 競走
S として S として S として S として
X ディップ 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X カーネル 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X ティッカー 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y ディップ 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y カーネル 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y ティッカー 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = 症候性;AS = 無症候性

表2:人種の識別 この表で使用される値は、健康な対照と比較した発生率または症候性植物の数、およびその品種中の植物の総数に対する割合としての死滅植物の数を反映する。各細胞の数値は、観察期間の終了時に報告された発生率を反映しています。品種は、その品種の植物の少なくとも1/3または33%が症候性または死 んでいる場合に感受性とみなされる。病原体の人種は、どの品種が感受性であるとみなされたかに基づいて決定される。言い換えれば、病原体が抵抗性の増加とともに品種に対してどのように作用するかによって、分離株の人種が決まる。これらの結果は実際の試験からのものではなく、むしろこれらの方法の結果から人種がどのように識別されるかを伝えることが示されている。略語: MTD = 修正トレイドリップ法;BD = ブラックダイヤモンド;CH. G = チャールストン・グレイ;カルG.=カルフーングレイ;PI = プラント導入 296341-FR;S = 症候性;AS = 無症候性。

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Discussion

レースタイピングの3つの方法が提示されている。これらの方法のそれぞれは、特定の質問および実験条件に最も適している。寄生カーネル接種法(土壌侵入)は、おそらくより単純でより単純であり、病原性の評価に特に有用である30。この方法を単純なレースタイピングに使用すると、非常に効果的です。しかし、各植物が同じ程度の感染または曝露に直面しない可能性があり、目的の品種の耐性をテストするために同等の高レベルの病気が必要になる可能性があることを考えると、特定の品種の耐性を決定するためにこの方法を適用することは困難であり得る。これは、このようにして産生された接種物が十分に定量化されておらず、生存可能なプロパグルの割合、または根ゾーンに到達する感染性プロパグルの数が十分に調節されていないためである31。さらに、この方法は、植え付けられたカーネルのルートゾーンへの近接性の不整合によって制限されます。遠すぎると、胞子が発芽しないか、菌糸が根に達するほど発達しないことがあります。

ルートディップ法32,33は、より面倒で時間がかかる。しかし、植物と相互作用する生存可能な繁殖物の量がより正確に測定されるため、宿主抵抗をより正確に記述することができ、抵抗スクリーニングが容易になる。さらに、同じ人種内の病原性の違いをより容易に検出することができる。この方法は、一般に、植物がカーネル法よりも早く、より表現力豊かに症候性になるという追加の利点を有する。分生子の代わりに接種剤懸濁液中のクラミドス胞子を用いる根浸漬法の1つの変形は、この利点6を欠いている可能性がある。同様に、改変トレイ浸漬法22は、労働集約的であるが、多くの分離株および苗木をスクリーニングする必要がある場合に、ハイスループット表現型決定を可能にする。

3つの方法に共通する要因には、品種の選択、生育条件、衛生上の要件などがあります。市販されているものに応じて、特定の品種を21、34に置換することができる。シュガーベイビーとブラックダイヤモンドはどちらもレース0の分離を決定するために使用できますが、チャールストングレイ、オールスイート、ディキシーリーはレース0には耐性がありますが、レース1の影響を受けやすいと説明されています。カルフーン・グレイとサンシュガーはレース0と1に耐性があり、レース2と3の影響を受けやすい。フォン病の発症は温度に大きく依存します。実験条件がこの変数に対して制御されるように注意が払われるべきである。植え付け培地を選択する場合、ピートモスおよび/または石膏を含み、良好な通気を可能にする一般的な市販の混合物は満足のいくものでなければならない。両方の方法で、特にソースバッグからの植え付け媒体の交差汚染を防ぐために予防措置を講じる必要があります。

記載された方法の1つを使用した後、疾患は正確かつ一貫して評価されなければならない。以前の研究者は、通常、植物が感受性または耐性のいずれかに分類される閾値を決定している35,36。例えば、特定の品種の植物の33%未満が症候性であった場合、その品種は、品種の感受性プロファイルに関連して定義された分離物で耐性として分類される。設定されたしきい値は、研究者と彼らが対処したい質問によって定義されます。植物間の評価者間および同一評価者による変動性は、広く報告されている37、38。使用される種子の品質、土壌品質、接種物密度、分離株の貯蔵年齢、および評価者バイアス39、40などの要因はすべて、この変動性8に寄与する。接種およびPI品種応答におけるこの変動性のために、複数の実験的複製が必要である。理想的には、少なくとも3つから5つのレプリケーションが推奨され、品種ごとにレプリケーションあたり6つのプラントが推奨されます。

Fon分離株41,42,43を検出するための分子アッセイが開発されているが、F. oxysporumの多系統性の性質および種複合体の地理的およびゲノム的変動性44,45,46のために、結果は一貫していない。さらに、先行研究は、完全な毒性におけるキシレム分泌(SIX)エフェクターの重要性を確立しているが、Fon分離株の人種構造を定義するエフェクターの正確な補完物はまだ決定されていない13。人種の分子診断はまだ開発中であり、これらの表現型技術は、Fonレースタイピングにおけるその正確性と有用性を評価するために不可欠です19,47。

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Disclosures

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgments

アリ博士と植物分子診断研究所、ジョージア大学の平盛智博士のリーダーシップと支援がFonプログラムの確立に貢献したことに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

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References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

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生物学 第176号
未知の <em>フザリウム・オキシスポラム</em> f.spの人種を決定するために使用された3つの接種技術の対照。 <em>ニベウム</em> 分離
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Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

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