Summary
El manejo del marchitamiento por Fusarium de la sandía requiere el conocimiento de las razas de patógenos presentes. Aquí, describimos los métodos de inoculación de inmersión de raíz, semilla de grano infestado y inoculación de inmersión en bandeja modificados para demostrar su eficacia en la tipificación racial del hongo patógeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Abstract
El marchitamiento por Fusarium de sandía (Citrullus lanatus), causado por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ha resurgido como una importante restricción de producción en el sureste de los Estados Unidos, especialmente en Florida. El despliegue de estrategias integradas de manejo de plagas, como los cultivares resistentes específicos de la raza, requiere información sobre la diversidad y la densidad de población del patógeno en los campos de los cultivadores. A pesar de algunos avances en el desarrollo de herramientas de diagnóstico molecular para identificar aislados de patógenos, la determinación de la raza a menudo requiere enfoques de bioensayo.
La tipificación de la raza se llevó a cabo mediante inoculación por inmersión de raíz, método de siembra de grano infestado y el método modificado de inmersión en bandeja con cada uno de los cuatro diferenciales de sandía (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). A los aislados se les asigna una designación de raza mediante el cálculo de la incidencia de la enfermedad cinco semanas después de la inoculación. Si menos del 33% de las plantas de un cultivar en particular eran sintomáticas, se clasificaban como resistentes. Aquellos cultivares con incidencia superior al 33% fueron considerados susceptibles. Este artículo describe tres métodos diferentes de inoculación para determinar la raza, la inmersión de la raíz, el núcleo infestado y la inoculación modificada de la inmersión en bandeja, cuyas aplicaciones varían según el diseño experimental.
Introduction
Los hongos transmitidos por el suelo que componen el complejo de especies de Fusarium oxysporum (FOSC) son patógenos hemibiotróficos de plantas impactantes que pueden causar enfermedades graves y pérdida de rendimiento en una amplia gama de cultivos1. El marchitamiento por Fusarium de la sandía, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), ha aumentado en alcance, incidencia y gravedad en todo el mundo en las últimas décadas 2,3. En las plántulas, los síntomas del marchitamiento por Fusarium a menudo se asemejan a la amortiguación. En las plantas más viejas, el follaje se vuelve gris, clorótico y necrótico. Eventualmente, el marchitamiento de las plantas progresa hasta el colapso total de la planta y la muerte4. La pérdida directa de rendimiento se produce debido a los síntomas y la muerte de la planta, mientras que la pérdida indirecta de rendimiento puede ocurrir debido al daño solar causado por la eliminación del dosel foliar5. La reproducción sexual y las estructuras reproductivas asociadas nunca se han observado en F. oxysporum. Sin embargo, el patógeno produce dos tipos de esporas asexuales, micro y macroconidios, así como estructuras de supervivencia más grandes a largo plazo llamadas clamidosporas, que pueden sobrevivir en el suelo durante muchos años6.
El FOSC se clasifica en formae speciales en función de los rangos de huéspedes observados, generalmente limitados a una o unas pocas especies huésped1. Aunque investigaciones recientes han indicado que este complejo de especies puede ser un compuesto de 15 especies diferentes, las especies particulares que infectan la sandía son actualmente desconocidas7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) es el nombre de los grupos de cepas que infectan exclusivamente a Citrullus lanatus o a la sandía domesticada 8,9. Las cepas de F. oxysporum dentro de la mayoría de las formas especiales patógenas muestran ciertos niveles de diversidad con respecto a sus componentes genéticos y virulencia hacia una especie huésped. Por ejemplo, una cepa puede infectar a todos los cultivares de un huésped, mientras que otra solo puede infectar a los cultivares más susceptibles. Para dar cuenta de tal variación, estos grupos se clasifican informalmente en razas basadas en relaciones evolutivas o características fenotípicas comunes. Dentro de Fon, se han caracterizado cuatro razas (0, 1, 2 y 3) en función de su patogenicidad contra un conjunto de cultivares de sandía seleccionados, con el descubrimiento de la raza 3 ocurriendo recientemente10.
A pesar de esta aparente diversidad, las morfologías de las esporas o hifas no son distinguibles entre las razas de las razas Fon, lo que significa que se necesitan ensayos moleculares o fenotípicos para identificar la raza única de un aislado11. La investigación molecular ha identificado algunas diferencias genéticas. Por ejemplo, el papel de Secreted en los efectores del xilema (SIX) se ha estudiado durante años en F. oxysporum, y algunos de estos efectores se han localizado en los cromosomas intercambiados durante la transferencia horizontalde genes 12. Por ejemplo, SIX6 se encuentra en las carreras Fon 0 y 1, pero no en la carrera 213. SEIS efectores han sido implicados en la patogenicidad de F. oxysporum f. sp. lycopersici y F. oxysporum f. sp. cubense, que causan marchitamiento por Fusarium en tomate y plátano, respectivamente 14,15,16,17. El análisis de seis perfiles efectores entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, el patógeno del marchitamiento por Fusarium en espinacas, ha permitido una clasificación que refleja con precisión la diversidad genética y fenotípica18. Sin embargo, las diferencias entre los mecanismos de virulencia de las razas Fon actualmente no se comprenden completamente, y los ensayos moleculares desarrollados sobre su uso han mostrado resultados inconsistentes e inexactos19. Por lo tanto, los resultados fenotípicos de los ensayos de infección son actualmente la mejor manera de clasificar los aislados.
F. oxysporum inicialmente infecta a los huéspedes a través de las raíces antes de abrirse camino hacia el xilema20. Esto hace que la inoculación directa de las raíces de un cultivar huésped dado sea una forma efectiva de realizar la tipificación de la raza y es la base de los métodos de inoculación de inmersión de raíz y inmersión en bandeja21. Cuando no infecta a un huésped, F. oxysporum reside en el suelo y puede permanecer inactivo durante años. Cultivar cultivares de sandía susceptibles en el suelo de un campo de interés es una forma de probar la presencia de Fon. Ampliar este método para incluir cultivares de diferentes niveles conocidos de resistencia en suelos que están infestados deliberadamente con Fon también es una buena manera de realizar la tipificación de razas (Tabla 1) y es la base del método de siembra de granos infestados. El método modificado de inmersión en bandeja es una variación del método original de inmersión en bandeja que permite una tipificación de carrera de alto rendimiento donde muchas plantas y aislados de campo se pueden investigar rápidamente22. Los factores importantes de un bioensayo rápido y exitoso de tipificación de razas incluyen el uso de cultivares que han documentado diferencias en la resistencia a las diferentes razas de patógenos, asegurando que el inóculo sea biológicamente activo y abundante durante la infección, manteniendo un ambiente que sea propicio para el patógeno y el huésped, y utilizando un sistema de calificación consistente para la gravedad o incidencia de la enfermedad. Este artículo describe los métodosroot-dip 23,24, infested kernel seeding25,26 y modified tray-dip22 métodos para la tipificación fenotípica de razas basados en los principios descritos anteriormente.
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Protocol
1. Determinación de la raza por el método de inmersión de la raíz (RDM)
- Preparación del entorno experimental
- Debido a que la expresión de los síntomas depende en gran medida de las condiciones ambientales, mantenga las plantas en un área controlada. Monitoree la humedad relativa, la temperatura, el fotoperíodo y la intensidad de la luz (Figura 1).
- Ajuste la temperatura a 26-28 ° C, la humedad relativa a 50-75% y establezca un fotoperíodo de 16 h para garantizar el crecimiento y la salud adecuados de las plantas.
NOTA: Para prevenir la hipoxia, el marchitamiento de las plántulas y / o la pudrición de las semillas, no riegue en exceso ni permita que el agua estancada alrededor de las plántulas. - Use dos luces de tubo fluorescente, cada una con al menos 1850 lúmenes de luz y una temperatura de color de 2,800 K por banco de luces para apoyar el crecimiento fotosintético.
- Mantenga el área limpia y use prácticas higiénicas, incluida la eliminación de desechos de tierra y restos de plantas, para prevenir el daño por plagas y la infección incidental.
- Ajuste la temperatura a 26-28 ° C, la humedad relativa a 50-75% y establezca un fotoperíodo de 16 h para garantizar el crecimiento y la salud adecuados de las plantas.
- Condiciones de plantación
- Llene 8 x 16 celdas (25 cm de ancho x 50 cm de largo) comenzando planos con medio de siembra y toque hacia abajo para comprimir ligeramente el suelo (Figura 2).
- Obtenga semillas de los cuatro cultivares diferenciales: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey y PI-296341-FR.
- Siembre semillas con su ápice (extremo puntiagudo) apuntando hacia arriba a una profundidad igual a su longitud. Después de sembrar las semillas, cubra el medio que contiene las semillas enterradas con 100% Tierra de Fuller u otra alternativa de arcilla de bentonita a una profundidad de 0.3175-0.635 cm.
- Rocíe los pisos para humedecer el medio sin crear agua de pie o de piscina. Después, mantenga el medio húmedo nebulizando durante 20 s cada 180 minutos, o regando a mano una vez al día hasta la germinación de la semilla durante aproximadamente 5 días. Después de la germinación, riegue una vez al día y según sea necesario para apoyar el crecimiento de las plántulas.
- Preparación de medios
NOTA: Ambos medios se hacen firmes con agar granulado adicional para permitir la recolección de esporas raspando la superficie.- Medio de jugo V8 clarificado (V8)
- Preparar 500 mL de jugo V8 clarificado medio (V8)27 agregando 100 mL de jugo de vegetales 100% original V8 clarificado con 1% CaCO3 a 400 mL de agua destilada.
- Añadir 7,5 g de agar granulado.
- Mezclar bien los ingredientes, autoclave, y dejar enfriar a 50 °C antes de verterlos en placas de Petri estériles.
- Medio de agar dextrosa de patata de un cuarto de fuerza (qPDA)
- Prepare el medio qPDA agregando 4.5 g de agar granulado a 500 ml de agua destilada, agregue 3.8 g de agar dextrosa de papa.
- Mezclar bien los ingredientes, autoclave, y dejar enfriar a 50 °C antes de verter 12-15 mL en placas de Petri estériles.
- Medio de jugo V8 clarificado (V8)
- Debido a que la expresión de los síntomas depende en gran medida de las condiciones ambientales, mantenga las plantas en un área controlada. Monitoree la humedad relativa, la temperatura, el fotoperíodo y la intensidad de la luz (Figura 1).
- Preparación de tratamientos experimentales
- Preparar el inóculo.
- Cinco días después de la siembra (dpp), coloque discos de papel infiltrados (1-1.25 cm de diámetro) que contengan el aislado de F. oxysporum preferido en una placa V8 y una placa qPDA y guárdelos en una incubadora (~ 28 ° C) durante ocho días28 (Figura 3A).
- En el octavo día de crecimiento de hongos y el día anterior a la inoculación (ver sección 1.3.2), transfiera las placas V8 y qPDA de la incubadora a un gabinete de bioseguridad.
- Para cada aislado, dispense 6 ml de agua desionizada esterilizada en cada placa de cultivo V8 y qPDA.
- Desaloje los conidios raspando un esparcidor celular estéril a través de la superficie media (Figura 3B). Agrupe la suspensión conidial líquida y transfiérala a un tubo de cultivo estéril de 50 ml (Figura 3C).
- Repita este proceso hasta que el volumen total de suspensión conidial líquida en el tubo de cultivo de 50 ml sea de aproximadamente 12 ml.
- Antes de proceder a otro aislado, esterilice en superficie el área de trabajo y el esparcidor celular con alcohol. Esterilice el esparcidor celular pasándolo a través de un quemador Bunsen después de sumergirlo en etanol ≥70%.
- Una vez que las suspensiones conidiales líquidas se han transferido a los tubos de cultivo para todos los aislamientos, cuantifique los recuentos de esporas. Primero, vórtice un tubo de cultivo individual de 50 ml y dispense 10 μL en cada cámara de un hemacitómetro. Luego, calcule el número de esporas en el hemaciómetro como se describió anteriormente29.
- Prepare la solución final de inóculo transfiriendo el volumen calculado para 106 + 10% a otro tubo de cultivo estéril y lleve el volumen total a 30 ml agregando agua desionizada estéril.
- Guarde estos tubos de cultivo durante la noche a 8 ± 1 °C.
NOTA: Esto se puede hacer sin pérdida de viabilidad conidial, como lo indican los datos no publicados.
- Preparar el inóculo.
- Inoculación
- Preparar la inoculación.
- Antes del día de la inoculación, riegue robustamente las plántulas de trece días de edad hasta la capacidad de carga del suelo.
- Preetiquete las estacas con la información pertinente, incluido el aislado a probar, el cultivar de sandía y la fecha de inoculación.
- Colocar 6 x 12 celdas (20 cm de ancho x 40 cm de largo) planos de espuma de poliestireno, previamente higienizados con lejía al 10% y bien enjuagados, para recibir las plantas inoculadas.
- Preposicione todos los materiales necesarios (ver la Tabla de Materiales).
- Inocular las raíces de la planta.
- Riegue robustamente las plantas varias horas antes de comenzar la inoculación. Al menos 2 h después del riego, retire las plántulas de los planos de espuma de poliestireno de 8 x 16 celdas y enjuague sus raíces para eliminar las partículas de material de siembra adheridas.
- Almacene temporalmente las plantas enjuagadas en recipientes limpios con agua del grifo hasta su uso, manteniendo los cultivares separados entre sí (Figura 4A). Separe las plántulas en grupos de seis individuos y mantenga los grupos de plántulas envueltos en toallas de papel húmedas en una bandeja de laboratorio para evitar la desecación.
- Coloque 25-30 cm3 de tierra en el fondo de cada celda de la bandeja de espuma de poliestireno de 6 x 12 matrices y use una botella de chorro para humedecer el suelo hasta que esté visiblemente húmedo.
- Inocular las plantas y replantarlas en orden según el cultivar, de modo que Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey y luego PI 296341 01 FR se planten de izquierda a derecha.
- Comenzando con el control saludable, coloque un grupo de seis plántulas no dañadas del mismo cultivar en los tubos de 50 ml que contienen el inóculo. En el caso del control saludable, use agua del grifo en lugar de una suspensión de esporas. Inocular las plantas con el control positivo (Fon raza 3) último.
- Una vez dentro del tubo, asegúrese de que las raíces de la planta alcancen y estén expuestas al inóculo (agua del grifo).
- Vórtice los tubos con raíces de plántulas sumergidos durante 30 s (Figura 4B). Después del vórtice, coloque una sola plántula por celda en los pisos de espuma de poliestireno de 6 x 12. Coloque las plantas del mismo cultivar en la misma columna en la bandeja.
- Después de la colocación, desinfecte las manos enguantadas sosteniéndolas en cubos de solución de cloro disponible al 0.7% durante 30 s, seguido de un enjuague con agua del grifo durante 1 min.
- Después, cubra las plántulas colocadas con el medio de siembra y cuaje suavemente. Usando una jeringa o pipeta, riegue cuidadosamente las plántulas con 20 ml por plántula mientras evita salpicaduras.
- Antes de pasar al siguiente conjunto de plantas, desinfecte las manos enguantadas nuevamente con solución de cloro y un enjuague con agua del grifo.
- Después de que todas las plántulas hayan sido replantadas, riegue de nuevo mínimamente para evitar la escorrentía del inóculo.
- Mantenga las plántulas durante la noche en un ambiente cerrado y oscuro con una temperatura promedio de 27 ° C. Al día siguiente, transfiera las plantas al invernadero, manteniendo la temperatura promedio en 27 ° C.
- Preparar la inoculación.
- Mantenimiento y cuidado de plantas inoculadas
- Para evitar el desbordamiento del excedente de agua, riegue los pisos ligeramente tres veces al día durante 4-5 días hasta que las plantas se estabilicen.
- Revise las bandejas 2-3 veces al día durante al menos tres días para garantizar una cobertura adecuada y uniforme del riego.
- Evite el secado debido a la luz solar o al sombreado girando los pisos y / o proporcionando sombreado / riego suplementario según sea necesario.
- A 3 dpp, fertilizar las plantas con un fertilizante de liberación rápida 20-20-20 (10 g / 3.78 L) a una velocidad de 3-6 ml por litro de agua.
- Fertilizar semanalmente durante 3-4 semanas.
- Mantenga las mismas condiciones de iluminación y ambientales a lo largo de este paso.
2. Determinación de la raza por el método del kernel infestado (IKM)
- Infestación de los granos
- Preparar el inóculo.
- Ya sea a partir de una muestra almacenada o recién recolectada, aísle y cultive una cepa de F. oxysporum f. sp. niveum de interés en una placa de qPDA hasta el punto de que su crecimiento cubra la mitad de la placa.
NOTA: Esto demuestra que es activo y viable, lo cual es necesario para una infestación sustancial del grano en pasos posteriores.
- Ya sea a partir de una muestra almacenada o recién recolectada, aísle y cultive una cepa de F. oxysporum f. sp. niveum de interés en una placa de qPDA hasta el punto de que su crecimiento cubra la mitad de la placa.
- Preparar los núcleos.
- En una escala, mida 200 g de bayas de centeno (Secale spp.) (o granos de trigo Maxie var. (Triticum spp.)) en cualquier recipiente suficientemente grande y viértalos en uno o más matraces Erlenmeyer de vidrio de 1 L. Agregue agua del grifo estéril a los matraces para cubrir completamente los granos hasta al menos 5 cm (Figura 5A).
- Remoje los granos a temperatura ambiente (~24 °C) durante 2 h. Drenar el agua de los matraces; tapar la abertura con un trozo de rollo de algodón envuelto en una gasa; y cubra la abertura con una envoltura de papel de aluminio (Figura 5B).
- Descontaminar los granos. Una vez que el grano haya bebido agua, autoclave dos veces de dos maneras distintas para matar a otros microbios no deseados antes de la inoculación.
- Durante la primera vez, autoclave el grano en los matraces preparados en un ciclo de gravedad (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) durante 1 h con un tiempo de secado de 5 min. Deje que los matraces se enfríen a temperatura ambiente.
- Antes de autoclave la segunda vez, transfiera los granos a una pequeña bolsa de cultivo de hongos con un filtro de 0,5 μm. Retire el aire de la bolsa y luego doble el exceso de plástico alrededor de la bolsa.
- Coloque la bolsa en un contenedor de plástico seguro para autoclave. Cubra el contenedor con una envoltura de papel de aluminio (Figura 5C).
NOTA: No use un contenedor de metal al autoclave los granos en las bolsas, ya que eso puede hacer que las bolsas se derritan. - Autoclave el contenedor en un ciclo de gravedad durante 1 h con 5 min de tiempo de secado, el mismo ciclo que antes.
NOTA: Solo autoclave la bolsa la segunda vez, no la primera, ya que el filtro y el puerto pueden verse comprometidos si las bolsas se colocan en autoclave dos veces. Evite la condensación en el filtro permitiendo que las bolsas se enfríen lenta y completamente antes de retirarlas del autoclave porque el filtro de la bolsa de cultivo se verá comprometido si se moja.
- Inocular los granos.
- Trabajando con la placa de cultivo y la bolsa en un gabinete de bioseguridad, corte discos de agar, de 6 mm de diámetro, de la zona de crecimiento activo en la placa de cultivo con un orificio de corcho estéril de tamaño # 4. Despliega la bolsa. Usando una técnica estéril estricta, coloque 5 discos de agar en la bolsa. Use un cilindro graduado estéril de 50 ml para medir 35 ml de agua del grifo estéril y agréguelo a la bolsa.
- Enrolle un poco la abertura de la bolsa y luego rocíe el exterior con etanol al 70% para esterilizar la superficie.
NOTA: No rocíe el filtro, ya que la humedad también lo comprometerá. - Cierre la bolsa doblando las esquinas hacia el centro y luego más del doble por encima del filtro. Asegure la bolsa con abrazaderas de bolsa y tubos de vinilo transparente proporcionados por el fabricante.
NOTA: Las abrazaderas son reutilizables. - Retire la bolsa del gabinete de bioseguridad.
- Almacene el patógeno para el crecimiento.
- Guarde la bolsa en posición vertical. Asegúrese de que el filtro se aleje del lado opuesto de la bolsa para permitir el máximo intercambio de gases (Figura 5D).
- Incubar los materiales a temperatura ambiente durante aproximadamente tres semanas. Redistribuya los granos regularmente para asegurar un crecimiento uniforme del patógeno.
NOTA: Las bolsas no son reutilizables.
- Preparar el inóculo.
- Infección de plántulas de sandía con grano infestado
- Fuente de semillas de sandía como se describió anteriormente.
- Determinar los grupos experimentales.
NOTA: Las únicas cepas del patógeno requeridas son los aislados que se están probando para la identificación de la raza. Sin embargo, los controles negativos y positivos ayudarán a hacer comparaciones con plantas sin infección o con un nivel específico de infección.- Para preparar un control negativo, use granos de trigo esterilizados de acuerdo con el método mencionado anteriormente pero sin inoculación.
- Para preparar un control positivo, use granos de trigo inoculados con una cepa ya clasificada para compararlos con el aislado desconocido.
- Combine el suelo y el grano.
- Mida 14 granos de granos infestados en una bolsa de plástico grande (Figura 5E). Llene las macetas de plástico (15 cm de diámetro x 10 cm de altura) con una mezcla para macetas para medir la cantidad de mezcla necesaria. Vacíe la mezcla en la bolsa. Cree un cojín de aire en la bolsa y gire o selle cerrado.
- Mezcle los granos y el suelo invirtiendo la bolsa varias veces. Para un control negativo, realice el mismo proceso en una bolsa diferente con granos limpios. Para un control positivo, realice el mismo proceso en una bolsa diferente con granos infestados con la cepa de comparación.
- Llene cuatro macetas esterilizadas en la superficie con la mezcla de tierra infestada. Para un control negativo, coloque esa mezcla antes de manipular cualquier suelo contaminado con Fon.
- Siembra las semillas de sandía.
- Siembra seis semillas en cada maceta. Asegúrese de que cada maceta solo contenga semillas de un cultivar. Coloque las semillas con el extremo del ápice de la semilla hacia arriba para permitir un crecimiento adecuado durante la emergencia (Figura 6A).
- Usando una botella de spray, humedezca los 0.3-0.6 cm superiores de tierra con agua. Coloque un plato de plástico transparente (15 cm de diámetro) debajo y sobre cada maceta para crear un ambiente húmedo para la germinación de las semillas (Figura 6B).
- Establecer condiciones de cultivo.
- Riegue las macetas tres veces al día con una botella de spray para mantener la turgencia sin escorrentía hasta que las semillas hayan germinado (aproximadamente 5 días).
NOTA: La cantidad de agua utilizada aumentará con el tamaño de la planta y el tamaño de la maceta. - Una vez que las semillas hayan germinado, mueva el plato superior a la parte inferior de la maceta.
- Riegue las plantas diariamente según sea necesario para el crecimiento óptimo de las plantas. Exponer las plantas a un fotoperíodo de 16 h en condiciones de iluminación similares a las descritas anteriormente y a una temperatura de 27 °C (± 1 °C).
- Riegue las macetas tres veces al día con una botella de spray para mantener la turgencia sin escorrentía hasta que las semillas hayan germinado (aproximadamente 5 días).
3. Determinación de la raza por el método de inmersión en bandeja modificado (MTDM)
- Preparación de los materiales para inoculaciones
- Establecer condiciones de siembra.
- Llene los insertos de 48 celdas (3,68 cm de ancho x 5,98 cm de largo x 4,69 cm de profundidad) con arena pasteurizada al vapor: turba: vermiculita (4:1:1) y golpee hacia abajo para comprimir ligeramente el suelo. Coloque los insertos en bandejas de plástico (27,9 cm de ancho x 53,3 cm de largo x 5,1 cm de profundidad).
- Siembre las semillas con su ápice (extremo proximal) apuntando hacia arriba a una profundidad igual a su longitud.
- Obtenga las semillas como se describió anteriormente.
- Después, mantenga el medio húmedo nebulizando durante 20 s cada 180 minutos o regando a mano una vez al día.
- Después de la germinación (aproximadamente 5 días), riegue una vez al día y según sea necesario para apoyar el crecimiento de las plántulas.
- Preparar los medios de comunicación.
- Preparar el medio qPDA añadiendo 5.625 g de agar granulado a 500 mL de agua destilada; añadir 4.875 g de agar dextrosa de patata. Mezcle bien los ingredientes, en autoclave y enfríe a 50 ° C antes de verterlos en placas de Petri estériles. Selle las placas de Petri con parafilm y guarde las placas en un refrigerador (4 °C) hasta su uso.
- Para preparar el caldo medio, pesa y añade 24 g de dextrosa de patata en una botella de 1 L. Lleve la mezcla a 1000 ml agregando agua destilada a la botella, y coloque la botella en una placa caliente y revuelva hasta que se disuelva. Dispensar 100 ml del caldo en matraces Erlenmeyer de 250 ml. Use una gasa para sellar los matraces y el autoclave.
- Preparar el inóculo.
- Siete días antes de plantar, inocular cinco placas qPDA con papel infiltrado28 y almacenarlas en un área incubada durante ocho días en un ciclo oscuro de 14 h / 10 h22.
- En el séptimo día, transfiera dos tapones de agar de 1 cm2 a cada matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 100 ml de dextrosa de papa. Coloque los matraces Erlenmeyer en un agitador de sobremesa a 200 rpm durante 7 días en un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h.
- El día de la inoculación (14 días después de la siembra), cosecha las esporas filtrando el inóculo a través de cuatro capas de gasa estéril.
- Determinar la concentración microconidial en los matraces utilizando un hemocitómetro como se describió anteriormente. Prepare una suspensión de inóculo de 7 L en una tina de plástico (40,6 cm de ancho x 67,3 cm de largo x 16,8 cm de profundidad) transfiriendo el volumen correcto de suspensión de esporas a agua estéril para una concentración final de esporas de 1 × 106 mL−1 (Figura 7A).
- Establecer condiciones de siembra.
- Inoculación
- Catorce días después de la siembra (al menos la primera etapa de hoja verdadera), transfiera los insertos celulares con las plántulas a bandejas palmeadas (26,9 cm de ancho x 53,7 cm de largo x 6,28 cm de profundidad). Coloque suavemente las bandejas palmeadas con las plántulas en una tina de plástico que contenga la suspensión de inóculo de 7 L. Inocular cada bandeja de una en una (Figura 7B).
- Permita que las plántulas permanezcan en el inóculo sin ser molestadas durante 15 minutos. Después de 15 minutos, transfiera suavemente los insertos celulares que contienen las plántulas inoculadas en bandejas sin agujeros (27,9 cm de ancho x 53,3 cm de largo x 5,1 cm de profundidad). Repita este proceso para cada bandeja.
- Coloque las bandejas sin agujeros en el banco del invernadero y riegue según sea necesario. Mantenga las mismas condiciones de iluminación y ambientales que se describen para el bioensayo de inmersión radicular.
4. Clasificación de la enfermedad
- Seleccione intervalos de tiempo para la calificación.
- Para los métodos de inmersión en raíz y inmersión en bandeja modificada, comience la calificación una semana después de que se inoculen las plántulas y continúe semanalmente durante cuatro semanas más.
NOTA: El conjunto de datos combinado incluirá cinco conjuntos de observaciones durante este período. - Mientras usa el método del núcleo, solo comience las calificaciones una vez que surjan las plántulas y continúe semanalmente para un total de seis calificaciones.
- Para los métodos de inmersión en raíz y inmersión en bandeja modificada, comience la calificación una semana después de que se inoculen las plántulas y continúe semanalmente durante cuatro semanas más.
- Observar y calcular la incidencia.
- Durante cada calificación, tome imágenes digitales para documentar el progreso de la enfermedad.
- Informar la incidencia de marchitez y muerte de las plantas. Calcule la incidencia tomando la suma de plantas sintomáticas en comparación con el control sano y el número de plantas muertas como proporción del número total de plantas en ese cultivar.
- Analizar los resultados. Comparar los patrones de infección entre los cultivares y entre los grupos de experimentos si se utilizaron controles.
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Representative Results
Estos experimentos ayudan a definir la resistencia relativa de los cultivares comúnmente cultivados (Tabla 1). Esta información se puede utilizar para guiar las recomendaciones de gestión basadas en las poblaciones locales de Fon. En otras palabras, si se sabe que la raza 0 o 1 está presente en un campo comercial, entonces el agricultor puede estar inclinado a cultivar una variedad "resistente" como Calhoun Gray, Sunsugar o equivalente. Los resultados de los bioensayos utilizando todos los métodos muestran que cuando las plántulas fueron infectadas con un aislado de Raza 1, los cultivares Black Diamond y Charleston Grey murieron o mostraron síntomas graves, mientras que los cultivares Calhoun Grey y PI mostraron resistencia (Tabla 2 y Figura 8A).
Todos los métodos mostraron que cuando las plántulas se infectaron con un aislado de Raza 3, casi todas las plantas de todos los cultivares murieron o mostraron síntomas graves (Figura 8B). Estos resultados demuestran cómo los bioensayos que utilizan ambos métodos de inoculación diferencian con éxito entre razas de Fon. La apariencia de las plantas enfermas debe ser la misma para todos los métodos. La única diferencia está en cómo se agrupan espacialmente los cultivares. Para los métodos root-dip y dray-dip modificados, los cultivares se organizarán por columnas de la bandeja, mientras que en el método kernel, los cultivares se agruparán en sus propias macetas.
Figura 1: Área experimental para RDM. Debido a la variabilidad de los síntomas, que depende en gran medida de las condiciones ambientales como la humedad relativa, la temperatura, el fotoperíodo y la intensidad de la luz, es importante mantener un área experimental regulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de los pisos de partida para RDM. Llene 8 x 16 celdas (25 cm de ancho x 50 cm de largo) comenzando planos con medio de siembra y toque hacia abajo para comprimir ligeramente el suelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de la suspensión conidial para RDM. (A) Aislamiento y cultivo. Ya sea a partir de una muestra almacenada o recién recolectada, aísle y cultive una cepa de F. oxysporum f. sp. niveum de interés en una placa de qPDA hasta el punto de que su crecimiento cubra la mitad de la placa. Esto demuestra que es activo y viable, lo cual es necesario para una infestación sustancial del grano en pasos posteriores. B) Desalojo de conidios. Desaloje los conidios raspando un esparcidor celular estéril a través de la superficie media. C) Deposición en suspensión. Agrupe la suspensión líquida de conidios y transfiérala a un tubo de cultivo estéril de 50 ml. Abreviatura: qPDA = medio de agar dextrosa de patata de un cuarto de fuerza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Organización y vórtice de plántulas para RDM. (A) Separación de cultivares. Almacene temporalmente las plantas enjuagadas en recipientes limpios con agua del grifo hasta su uso, manteniendo los cultivares separados. (B) Vórtice de plántulas. Vórtice los tubos con raíces de plántulas sumergidos durante 30 s para plantar una sola plántula por celda en los planos de espuma de poliestireno de 6 x 12. Las plantas del mismo cultivar se colocan en la misma columna en la bandeja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Preparación e infestación de granos para IKM. (A) Imbibición de bayas de centeno. En una escala, mida 200 g de bayas de centeno (Secale spp.) (o granos de trigo Maxie var. (Triticum spp.)) en cualquier recipiente suficientemente grande y viértalos en uno o más matraces Erlenmeyer de vidrio de 1 L. Agregue agua del grifo estéril en los matraces para cubrir completamente los granos hasta al menos 5 cm. (B) Drenaje de los matraces. Escurra el agua de los matraces, tapone la abertura con un trozo de rollo de algodón envuelto en una gasa y cubra la abertura con una envoltura de papel de aluminio. (C) Configuración del autoclave. Coloque la bolsa en un contenedor de plástico seguro para autoclave. No use un contenedor de metal cuando coloque los granos en autoclave en las bolsas, ya que eso puede hacer que las bolsas se derritan. Cubra el contenedor con una envoltura de papel de aluminio. D) Almacenamiento de bolsas. Guarde la bolsa en posición vertical. Asegúrese de que el filtro se aleje del lado opuesto de la bolsa para permitir el máximo intercambio de gases. (E) Mida 14 granos de granos infestados en una bolsa de plástico grande. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Siembra y germinación de semillas de sandía. (A) Siembra de semillas de cultivar en macetas. Siembra seis semillas en cada maceta. Asegúrese de que cada maceta solo contenga semillas de un cultivar. Coloque las semillas con el extremo del ápice de la semilla hacia arriba para permitir un crecimiento adecuado durante la emergencia. (B) Germinación de semillas. Usando una botella de spray, humedezca los 0.3-0.6 cm superiores de tierra con agua. Coloque un plato de plástico transparente (15 cm de diámetro) debajo y sobre cada maceta para crear un ambiente húmedo para la germinación de las semillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Preparación de inóculos e inoculación de plántulas para MTDM. (A) Preparación de inóculo. Determinar la concentración microconidial en los matraces utilizando un hemocitómetro como se describió anteriormente. Prepare una suspensión de inóculo de 7 L en una tina de plástico (40,6 cm de ancho × 67,3 cm de largo × 16,8 cm de profundidad) transfiriendo el volumen correcto de suspensión de esporas a agua estéril para una concentración final de esporas de 1 × 106 ml−1. (B) Inocular las plántulas. Catorce días después de la siembra (al menos la primera etapa de hoja verdadera), transfiera los insertos celulares con las plántulas a bandejas palmeadas (26,9 cm de ancho × 53,7 cm de largo × 6,28 cm de profundidad). Coloque suavemente las bandejas palmeadas con las plántulas en una tina de plástico que contenga la suspensión de inóculo de 7 L. Inocular cada bandeja de una en una. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Resultados fenotípicos de los métodos de identificación de razas. (A) Resultados de la Carrera 1. Los resultados de los bioensayos utilizando (A) todos los métodos muestran que cuando las plántulas fueron infectadas con un aislado de Raza 1, los cultivares Black Diamond y Charleston Grey murieron o mostraron síntomas graves, mientras que los cultivares Calhoun Grey y PI mostraron resistencia. (B) Resultados de la Carrera 3. Todos los métodos mostraron que cuando las plántulas se infectaron con un aislado de Raza 3, casi todas las plantas de todos los cultivares murieron o mostraron síntomas graves. (La apariencia de las plantas enfermas debe ser la misma para todos los métodos. Orden de plantación (de izquierda a derecha) mostrado por flechas: Diamante Negro (flecha azul), Gris Charleston (flecha púrpura), Gris Calhoun (flecha marrón), Introducción a la planta 296341-FR (flecha verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cultivar | Carrera 0 | Carrera 1 | Carrera 2 | Carrera 3 |
| Sugar Baby, Diamante Negro | S | S | S | S |
| Charleston Gray, Allsweet, Dixielee | R | S | S | S |
| Calhoun Gray, Sunsugar | R | R | S | S |
| PI-296341-FR | R | R | R | S |
Tabla 1: Raza de Fusarium oxysporum f. sp. Niveum. La raza de Fusarium oxysporum f. sp. niveum está determinada por reacciones susceptibles o resistentes a un conjunto de diferenciales de sandía. Los cultivares enumerados en cada fila son los más utilizados para representar cada nivel de resistencia durante la evaluación de la raza de un aislado. Esta tabla ha sido modificada de 4. Abreviaturas: S = susceptible; R = resistente.
| Aislar | Método | BD | CH. G | Cal G. | PI | Raza | ||||
| S | COMO | S | COMO | S | COMO | S | COMO | |||
| X | Zambullida | 6 | 0 | 6 | 0 | 0 | 6 | 0 | 6 | 1 |
| X | Núcleo | 6 | 0 | 6 | 0 | 0 | 6 | 0 | 6 | 1 |
| X | MTD | 6 | 0 | 6 | 0 | 0 | 6 | 0 | 6 | 1 |
| Y | Zambullida | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 3 |
| Y | Núcleo | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 3 |
| Y | MTD | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 6 | 0 | 3 |
| S = sintomático; AS = Asintomático | ||||||||||
Tabla 2: Identificación de razas. Los valores utilizados en esta tabla reflejan la incidencia o el número de plantas sintomáticas, en comparación con el control sano, y el número de plantas muertas como proporción del número total de plantas en ese cultivar. Los números en cada célula reflejan la incidencia reportada al final del período de observación. Un cultivar se considera susceptible cuando al menos 1/3 o 33% de las plantas de ese cultivar son sintomáticas o muertas. La raza del patógeno se determina entonces en función de qué cultivares se han considerado susceptibles. En otras palabras, el rendimiento del patógeno contra los cultivares con resistencia creciente determina la raza del aislado. Estos resultados no son de un ensayo real y se muestra que transmiten cómo se identifican las razas a partir de los resultados de estos métodos. Abreviaturas: MTD = método de goteo de bandeja modificado; BD = Diamante Negro; CH. G = Charleston Grey; Cal G. = Calhoun Gris; PI = Introducción a la planta 296341-FR; S = sintomático; AS = asintomático.
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Discussion
Se han presentado tres métodos de tipificación de razas. Cada uno de estos métodos se adapta mejor a preguntas particulares y condiciones experimentales. El método de inoculación del grano infestado (infestación del suelo) es quizás más simple y directo, por lo que es especialmente útil para la evaluación de la patogenicidad30. El uso de este método para escribir carreras simples es altamente efectivo. Sin embargo, aplicar el método para determinar la resistencia de un cultivar específico podría ser un desafío, dado que cada planta puede no enfrentar el mismo grado de infección o exposición, y pueden ser necesarios niveles igualmente altos de enfermedad para probar la resistencia de los cultivares de interés. Este es el caso porque el inóculo producido de esta manera no está bien cuantificado, y la proporción de propágulos viables, o el número de propágulos infecciosos que llegan a la zona radicular, no está bien regulada31. Además, este método está limitado por inconsistencias en la proximidad de los granos plantados a la zona radicular. Si están demasiado distantes, las esporas pueden no germinar, o las hifas pueden no desarrollarse lo suficiente como para llegar a las raíces.
El método de inmersión de raíz32,33 es más laborioso y requiere mucho tiempo; sin embargo, debido a que la cantidad de propágulos viables que interactúan con la planta se mide con mayor precisión, la resistencia del huésped se puede describir con mayor precisión, lo que facilita la detección de resistencia. Además, las diferencias en la virulencia dentro de la misma raza se pueden detectar más fácilmente. Este método tiene el beneficio adicional de que, en general, las plantas se vuelven sintomáticas antes y de manera más expresiva que en el método del núcleo. Una variante del método de inmersión radicular que utiliza clamidosporas en la suspensión del inóculo en lugar de conidios puede carecer de este beneficio6. Del mismo modo, el método modificado de inmersión en bandeja22 requiere mucha mano de obra, pero permite el fenotipado de alto rendimiento cuando se necesitan cribar muchos aislados y plántulas.
Los factores compartidos para los tres métodos incluyen la selección de cultivares, las condiciones de crecimiento y los requisitos de higiene. Dependiendo de lo que esté disponible comercialmente, ciertos cultivares pueden ser sustituidos21,34. Sugar Baby y Black Diamond se pueden usar para determinar los aislados de raza 0, mientras que Charleston Gray, Allsweet y Dixielee se han descrito como resistentes a la raza 0 pero susceptibles a la raza 1. Calhoun Gray y Sunsugar son resistentes a las razas 0 y 1 y susceptibles a las razas 2 y 3. El desarrollo de la enfermedad de Fon depende en gran medida de la temperatura. Se debe tener cuidado para garantizar que las condiciones experimentales controlen esta variable. Al elegir un medio de siembra, las mezclas comerciales generales que incluyen musgo de turba y / o yeso y permiten una buena aireación deben ser satisfactorias. Se deben tomar precauciones para evitar la contaminación cruzada de los medios de siembra en ambos métodos, especialmente de la bolsa de origen.
Después de usar uno de los métodos descritos, la enfermedad debe evaluarse de manera precisa y consistente. Los investigadores anteriores generalmente han decidido un umbral en el que las plantas se clasifican como susceptibles o resistentes35,36. Por ejemplo, si menos del 33% de las plantas de un cultivar específico fueran sintomáticas, entonces ese cultivar se clasificaría como resistente con el aislado definido en relación con el perfil susceptible del cultivar. El umbral establecido es definido por el investigador y la pregunta que desea abordar. La variabilidad entre evaluadores y por el mismo evaluador entre plantas ha sido ampliamente reportada37,38. Factores como la calidad de la semilla utilizada, la calidad del suelo, la densidad del inóculo, la edad de almacenamiento de los aislados y el sesgo del evaluador39,40 contribuyen a esta variabilidad8. Debido a esta variabilidad en la inoculación y las respuestas de los cultivares PI, se necesitan múltiples replicaciones experimentales; idealmente, se recomiendan al menos tres pero cinco replicaciones, con 6 plantas por replicación por variedad.
Si bien se han desarrollado ensayos moleculares para detectar aislados de Fon 41,42,43, los resultados no han sido consistentes debido a la naturaleza polifilética de F. oxysporum y la variabilidad geográfica y genómica del complejo de especies 44,45,46. Además, aunque investigaciones previas han establecido la importancia de los efectores Secreted in Xylem (SIX) en plena virulencia, el complemento exacto de efectores que definen la estructura racial de los aislados de Fon aún no se ha determinado13. Todavía se están desarrollando diagnósticos moleculares para la raza, para lo cual estas técnicas fenotípicas son críticas para evaluar su precisión y utilidad en la tipificación de la raza Fon19,47.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer al Dr. Ali y al Laboratorio de Diagnóstico Molecular de Plantas, así como al Dr. Pingsheng Ji de la Universidad de Georgia, cuyo liderazgo y apoyo ayudaron a establecer nuestro programa Fon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
| 1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| 50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
| 50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
| Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
| Bleach | Walmart | 587192290 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
| CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
| cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
| Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
| Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
| Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
| Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
| Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
| granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
| Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
| hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
| Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
| Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
| Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
| Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
| Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
| P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
| Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
| Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
| Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
| Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
| Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
| Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
| Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
| Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
| Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
| Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
| Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
| Timer | Walmart | TM-01 | |
| V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
| vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
| Watermelon Seed - Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
| Watermelon Seed - Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
| Watermelon Seed - Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
| Watermelon Seed - PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
| Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |
References
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