Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تباين بين ثلاث تقنيات تلقيح تستخدم لتحديد جنس الفيوزاريوم أوكسيسبوروم f.sp غير المعروف. نيفيوم يعزل

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

تتطلب إدارة ذبول الفيوزاريوم للبطيخ معرفة الأجناس المسببة للأمراض الموجودة. هنا ، نصف تراجع الجذر ، وبذر النواة الموبوءة ، وطرق التلقيح المعدلة بالدرج لإثبات فعاليتها في كتابة العرق للفطريات المسببة للأمراض Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

عاد ذبول البطيخ الفيوزاريوم (Citrullus lanatus) ، الناجم عن Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon) ، إلى الظهور كقيد إنتاج رئيسي في جنوب شرق الولايات المتحدة الأمريكية ، وخاصة في فلوريدا. ويتطلب نشر استراتيجيات الإدارة المتكاملة للآفات، مثل الأصناف المقاومة الخاصة بالعرق، معلومات عن تنوع العامل الممرض وكثافته السكانية في حقول المزارعين. على الرغم من إحراز بعض التقدم في تطوير أدوات التشخيص الجزيئي لتحديد عزلات مسببات الأمراض، فإن تحديد العرق غالبا ما يتطلب نهج الفحص البيولوجي.

تم إجراء كتابة السباق عن طريق التلقيح الجذري ، وطريقة بذر النواة الموبوءة ، وطريقة غمس الدرج المعدلة مع كل من فروق البطيخ الأربعة (Black Diamond ، Charleston Grey ، Calhoun Grey ، Plant Introduction 296341-FR). يتم تعيين العزلات تسمية سباق عن طريق حساب حدوث المرض بعد خمسة أسابيع من التلقيح. إذا كان أقل من 33٪ من النباتات لصنف معين من الأعراض ، فقد تم تصنيفها على أنها مقاومة. واعتبرت تلك الأصناف التي يزيد معدل حدوثها عن 33٪ عرضة للإصابة. تصف هذه الورقة ثلاث طرق مختلفة للتلقيح للتأكد من العرق ، وتراجع الجذر ، والنواة الموبوءة ، والتلقيح المعدل بالدرج ، والتي تختلف تطبيقاتها وفقا للتصميم التجريبي.

Introduction

الفطريات المنقولة بالتربة التي تشكل مركب أنواع Fusarium oxysporum (FOSC) هي مسببات أمراض نباتية نصف حيوية مؤثرة يمكن أن تسبب مرضا خطيرا وفقدان الغلة في مجموعة متنوعة من المحاصيل1. ذبول الفيوزاريوم من البطيخ ، الناجم عن F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) ، يزداد في النطاق والإصابة والشدة في جميع أنحاء العالم في العقود القليلة الماضية 2,3. في الشتلات ، غالبا ما تشبه أعراض ذبول الفيوزاريوم التخميد. في النباتات القديمة ، تصبح أوراق الشجر رمادية وكلوروتيكية ونخرية. في نهاية المطاف ، يتطور ذبول النباتات إلى انهيار النبات بالكامل والموت4. يحدث فقدان الغلة المباشر بسبب الأعراض وموت النبات ، في حين يمكن أن يحدث فقدان الغلة غير المباشر بسبب أضرار أشعة الشمس الناجمة عن القضاء على المظلة الورقية5. لم يلاحظ أبدا التكاثر الجنسي والهياكل التناسلية المرتبطة به في F. oxysporum. ومع ذلك ، ينتج العامل الممرض نوعين من الجراثيم اللاجنسية ، micro- و macroconidia ، بالإضافة إلى هياكل البقاء على قيد الحياة الأكبر والطويلة الأجل تسمى chlamydospores ، والتي يمكن أن تعيش في التربة لسنوات عديدة6.

يتم تصنيف FOSC إلى أشكال خاصة بناء على نطاقات المضيف المرصودة ، وعادة ما تقتصر على واحد أو عدد قليل من الأنواع المضيفة1. على الرغم من أن الأبحاث الحديثة قد أشارت إلى أن هذا النوع المركب قد يكون مركبا من 15 نوعا مختلفا ، إلا أن الأنواع المعينة التي تصيب البطيخ غير معروفة حاليا7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) هو اسم لمجموعات السلالات التي تصيب حصريا Citrullus lanatus أو البطيخ المستأنس 8,9. F. تظهر سلالات أوكسيسبوروم داخل معظم الأنواع المسببة للأمراض مستويات معينة من التنوع فيما يتعلق بمكوناتها الوراثية وضراوتها تجاه الأنواع المضيفة. على سبيل المثال ، قد تصيب سلالة واحدة جميع أصناف المضيف ، في حين أن سلالة أخرى قد تصيب فقط الأصناف الأكثر عرضة للإصابة. لتفسير هذا الاختلاف ، يتم تصنيف هذه المجموعات بشكل غير رسمي إلى أجناس بناء على العلاقات التطورية أو الخصائص الظاهرية المشتركة. داخل فون ، تم تمييز أربعة أجناس (0 و 1 و 2 و 3) بناء على إمراضها ضد مجموعة من أصناف البطيخ المختارة ، مع اكتشاف السباق 3 الذي حدث مؤخرا10.

على الرغم من هذا التنوع الواضح ، لا يمكن التمييز بين مورفولوجيا الجراثيم أو hyphae بين أجناس أعراق Fon ، مما يعني أن هناك حاجة إلى فحوصات جزيئية أو مظهرية لتحديد العرق الفريدللمعزول 11. حددت الأبحاث الجزيئية بعض الاختلافات الجينية. على سبيل المثال ، تمت دراسة دور المستجيبات Secreted in Xylem (SIX) لسنوات في F. oxysporum ، وتم تحديد موقع بعض هذه المستجيبات على الكروموسومات المتبادلة أثناء نقل الجينات الأفقي12. على سبيل المثال ، تم العثور على SIX6 في سباقات Fon 0 و 1 ولكن ليس في السباق 213. وقد تورطت ستة مؤثرات في إمراض F. oxysporum f. sp. lycopersici و F. oxysporum f. sp. cubense ، والتي تسبب ذبول Fusarium على الطماطم والموز ، على التوالي14،15،16،17. وقد مكن تحليل ملامح المستجيبات SIX بين سلالات F. oxysporum f. sp. spiniciae ، ممرض ذبول الفيوزاريوم على السبانخ ، من التصنيف الذي يعكس بدقة التنوع الجيني والمظهري18. ومع ذلك ، فإن الاختلافات بين آليات الضراوة في سباقات فون ليست مفهومة تماما حاليا ، وقد أظهرت الفحوصات الجزيئية التي تم تطويرها عند استخدامها نتائج غير متسقة وغير دقيقة19. لذلك ، فإن نتائج النمط الظاهري من فحوصات العدوى هي حاليا أفضل طريقة لتصنيف العزلات.

F. أوكسيسبوروم يصيب المضيفين في البداية من خلال الجذور قبل أن يشق طريقه إلى xylem20. وهذا يجعل التلقيح المباشر لجذور صنف مضيف معين طريقة فعالة لأداء كتابة العرق وهو أساس طرق التلقيح الجذري وتراجع الدرج21. عندما لا تصيب مضيف ، يقيم F. oxysporum في التربة ويمكن أن يظل نائما لسنوات. زراعة أصناف البطيخ الحساسة في التربة من حقل الاهتمام هي إحدى الطرق لاختبار وجود فون. إن توسيع هذه الطريقة لتشمل أصنافا ذات مستويات مختلفة معروفة من المقاومة في التربة الموبوءة عمدا ب Fon هو أيضا طريقة جيدة لأداء كتابة العرق (الجدول 1) وهو أساس طريقة بذر النواة الموبوءة. طريقة غمس الدرج المعدلة هي اختلاف عن طريقة غمس الدرج الأصلية التي تسمح بكتابة سباق عالية الإنتاجية حيث يمكن التحقيق في العديد من النباتات والعزلات الميدانية بسرعة22. وتشمل العوامل الهامة للفحص الحيوي السريع والناجح لكتابة العرق استخدام الأصناف التي لديها اختلافات موثقة في مقاومة الأجناس المسببة للأمراض المختلفة، وضمان أن يكون اللقاح نشطا بيولوجيا ووفيرا أثناء العدوى، والحفاظ على بيئة مواتية للممرض والمضيف على حد سواء، واستخدام نظام تصنيف متسق لشدة المرض أو حدوثه. تصف هذه الورقة طرق تراجع الجذر23,24 ، وبذر النواة الموبوءة 25,26 ، وطرق الغمس 22 المعدلة لكتابة السباق المظهره بناء على المبادئ الموضحة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد العرق عن طريق طريقة الجذر تراجع (RDM)

  1. إعداد البيئة التجريبية
    1. نظرا لأن التعبير عن الأعراض يعتمد بشكل كبير على الظروف البيئية ، حافظ على النباتات في منطقة خاضعة للرقابة. راقب الرطوبة النسبية ودرجة الحرارة والفترة الضوئية وشدة الضوء (الشكل 1).
      1. اضبط درجة الحرارة على 26-28 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية على 50-75٪ ، وقم بتعيين فترة ضوئية لمدة 16 ساعة لضمان نمو النبات وصحته بشكل كاف.
        ملاحظة: لمنع نقص الأكسجة و/أو ذبول الشتلات و/أو تعفن البذور، لا تفرط في الماء أو تسمح بالمياه الراكدة حول الشتلات.
      2. استخدم مصباحين من أنابيب الفلورسنت، لكل منهما 1850 لومن على الأقل من الضوء ودرجة حرارة لون تبلغ 2800 كلفن لكل بنك من الأضواء لدعم نمو التمثيل الضوئي.
      3. حافظ على نظافة المنطقة واستخدم الممارسات الصحية ، بما في ذلك إزالة نفايات التربة وحطام النبات ، لمنع تلف الآفات والعدوى العرضية.
    2. ظروف الزراعة
      1. املأ 8 × 16 خلية (عرض 25 سم × طول 50 سم) بدءا من المسطحات بوسط الزراعة واضغط لأسفل لضغط التربة قليلا (الشكل 2).
      2. احصل على بذور الأصناف الأربعة التفاضلية: Black Diamond / Sugar Baby و Charleston Grey / Allsweet / Dixielee و Calhoun Grey و PI-296341-FR.
      3. زرع البذور مع قمتها (نهاية مدببة) تشير إلى أعلى إلى عمق يساوي طولها. بعد زرع البذور ، قم بتغطية الوسط الذي يحتوي على البذور المدفونة بأرض فولر بنسبة 100٪ أو بديل آخر من طين البنتونيت على عمق 0.3175-0.635 سم.
      4. قم برش المسطحات لترطيب الوسط دون إنشاء مياه دائمة أو مجمعة. بعد ذلك ، حافظ على رطوبة الوسائط عن طريق التغشية لمدة 20 ثانية كل 180 دقيقة ، أو الري باليد مرة واحدة يوميا حتى إنبات البذور لمدة 5 أيام تقريبا. بعد الإنبات ، الماء مرة واحدة يوميا وحسب الحاجة لدعم نمو الشتلات.
    3. الإعداد الإعلامي
      ملاحظة: كلا الوسائطين مصنوعتان من الأجار المحبب الإضافي لتمكين حصاد الجراثيم عن طريق كشط السطح.
      1. عصير V8 منقى متوسط (V8)
        1. تحضير 500 مل من عصير V8 المصفى المتوسط (V8)27 عن طريق إضافة 100 مل من عصير الخضار الأصلي V8 المصفى 100٪ مع 1٪ CaCO3 إلى 400 مل من الماء المقطر.
        2. أضف 7.5 غرام من الأجار المحبب.
        3. اخلطي المكونات جيدا ، والأوتوكلاف ، واتركيها تبرد إلى 50 درجة مئوية قبل سكبها في أطباق بتري معقمة.
      2. وسائط أجار سكر العنب البطاطس ربع القوة (qPDA)
        1. تحضير وسط qPDA عن طريق إضافة 4.5 غرام من أجار المحبب إلى 500 مل من الماء المقطر ، إضافة 3.8 غرام من أجار سكر العنب البطاطس.
        2. اخلطي المكونات جيدا ، والأوتوكلاف ، واتركيها تبرد إلى 50 درجة مئوية قبل صب 12-15 مل في أطباق بتري معقمة.
  2. إعداد العلاجات التجريبية
    1. تحضير اللقاح.
      1. بعد خمسة أيام من الزراعة (dpp) ، ضع الأقراص الورقية المخترقة (قطرها 1-1.25 سم) التي تحتوي على F. oxysporum المعزول المفضل على لوحة V8 واحدة ولوحة qPDA واحدة وتخزينها في حاضنة (~ 28 درجة مئوية) لمدة ثمانية أيام28 (الشكل 3A).
      2. في اليوم الثامن من نمو الفطريات واليوم السابق للتلقيح (انظر القسم 1.3.2) ، انقل لوحات V8 و qPDA من الحاضنة إلى خزانة السلامة الأحيائية.
      3. لكل عزلة، وزع 6 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات على كل لوحة من لوحات ثقافة V8 وqPADA.
      4. إزاحة كونيديا عن طريق كشط موزع خلية معقمة عبر السطح المتوسط (الشكل 3B). قم بتجميع التعليق المخروطي السائل ونقله إلى أنبوب استزراع معقم سعة 50 مل (الشكل 3C).
      5. كرر هذه العملية حتى يبلغ إجمالي حجم التعليق المخروطي السائل في أنبوب الاستزراع 50 مل حوالي 12 مل.
      6. قبل الشروع في عزل آخر ، قم بتعقيم منطقة العمل وموزع الخلايا بالكحول. قم بتعقيم موزع الخلايا عن طريق تمريره عبر موقد بنسن بعد غمسه في ≥70٪ من الإيثانول.
      7. بمجرد نقل المعلقات المخروطية السائلة إلى أنابيب الاستزراع لجميع العزلات ، قم بتحديد عدد البوغ. أولا ، دوامة أنبوب زراعة فردي سعة 50 مل وتوزيع 10 ميكرولتر في كل غرفة من مقياس الدم. ثم احسب عدد الجراثيم في مقياس الدم كما هو موضح سابقا29.
      8. تحضير محلول التلقيح النهائي عن طريق نقل الحجم المحسوب ل 106 + 10٪ إلى أنبوب زراعة معقم آخر ورفع الحجم الإجمالي إلى 30 مل عن طريق إضافة ماء معقم منزوع الأيونات.
      9. قم بتخزين أنابيب الاستزراع هذه بين عشية وضحاها عند 8 ± 1 درجة مئوية.
        ملاحظة: يمكن القيام بذلك دون فقدان الجدوى المخروطية ، كما هو موضح في البيانات غير المنشورة.
  3. تلقيح
    1. تحضير التلقيح.
      1. قبل يوم التلقيح ، قم بسقي الشتلات التي يبلغ عمرها ثلاثة عشر يوما بقوة إلى القدرة على تحمل التربة.
      2. قم بتسمية الرهانات مسبقا بالمعلومات ذات الصلة ، بما في ذلك العزل المراد اختباره ، وصنف البطيخ ، وتاريخ التلقيح.
      3. ضع 6 × 12 خلية (عرض 20 سم × طول 40 سم) مسطحات من الستايروفوم ، تم تعقيمها مسبقا باستخدام 10٪ من المبيض وشطفها جيدا ، لتلقي النباتات الملقحة.
      4. وضع جميع المواد المطلوبة بحرف الجر (انظر جدول المواد).
    2. تلقيح جذور النباتات.
      1. سقي النباتات بقوة قبل عدة ساعات من بدء التلقيح. بعد 2 ساعة على الأقل من الري ، قم بإزالة النباتات من مسطحات الستايروفوم المكونة من 8 × 16 خلية وشطف جذورها لإزالة أي جسيمات مواد زراعة ملتصقة.
      2. قم بتخزين النباتات المغسولة مؤقتا في حاويات نظيفة بمياه الصنبور حتى الاستخدام ، مع الحفاظ على الأصناف منفصلة عن بعضها البعض (الشكل 4A). افصل النباتات إلى مجموعات من ستة أفراد واحتفظ بمجموعات الشتلات ملفوفة بمناشف ورقية مبللة على صينية المختبر لمنع الجفاف.
      3. ضع 25-30 سم3 من التربة في الجزء السفلي من كل خلية من صينية الستايروفوم 6 × 12 الصفيف واستخدم زجاجة بخاخ لترطيب التربة حتى تصبح رطبة بشكل واضح.
      4. قم بتلقيح النباتات وإعادة زراعتها بالترتيب وفقا للصنف ، بحيث يتم زرع Black Diamond و Charleston Grey و Calhoun Grey ثم PI 296341 01 FR من اليسار إلى اليمين.
      5. بدءا من التحكم الصحي ، ضع مجموعة من ست شتلات غير تالفة من نفس الصنف في أنابيب 50 مل التي تحتوي على اللقاح. في حالة التحكم الصحي ، استخدم ماء الصنبور بدلا من تعليق البوغ. تطعيم النباتات مع السيطرة الإيجابية (Fon race 3) الماضي.
      6. بمجرد الدخول إلى الأنبوب ، تأكد من وصول جذور النباتات وتعرضها للتلقيح (ماء الصنبور).
      7. دوامة الأنابيب مع جذور النباتات المغمورة لمدة 30 ثانية (الشكل 4B). بعد الدوامة ، ضع نبتة واحدة لكل خلية في شقق الستايروفوم 6 × 12. ضع نباتات نفس الصنف في نفس العمود في الدرج.
      8. بعد التنسيب ، قم بتعقيم أيدي القفازات عن طريق الاحتفاظ بها في دلاء من محلول الكلور المتاح بنسبة 0.7٪ لمدة 30 ثانية ، يليه شطف بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
      9. بعد ذلك ، قم بتغطية النباتات الموضوعة بوسط الزراعة واضبطها بلطف. باستخدام حقنة أو ماصة ، قم بسقي النباتات بعناية مع 20 مل لكل نبات مع تجنب الرش.
      10. قبل الانتقال إلى المجموعة التالية من النباتات ، قم بتعقيم أيدي القفازات مرة أخرى باستخدام محلول الكلور وشطف ماء الصنبور.
      11. بعد إعادة زراعة جميع النباتات ، قم بسقيها مرة أخرى بالحد الأدنى لمنع الجريان السطحي للتطعيم.
      12. امسك النباتات بين عشية وضحاها في بيئة مغلقة ومظلمة بمتوسط درجة حرارة 27 درجة مئوية. في اليوم التالي ، انقل النباتات إلى الدفيئة ، مع الحفاظ على متوسط درجة الحرارة عند 27 درجة مئوية.
  4. صيانة ورعاية النباتات الملقحة
    1. لمنع فيضان المياه الزائدة ، قم بسقي المسطحات بخفة ثلاث مرات في اليوم لمدة 4-5 أيام حتى تستقر النباتات.
    2. تحقق من الصواني 2-3 مرات يوميا لمدة ثلاثة أيام على الأقل لضمان تغطية كافية وحتى للري.
    3. تجنب التجفيف بسبب أشعة الشمس أو التظليل عن طريق تدوير الشقق و / أو توفير تظليل / سقي إضافي حسب الضرورة.
    4. عند 3 ديسيبل ، قم بتخصيب النباتات بسماد سريع الإطلاق 20-20-20 (10 جم / 3.78 لتر) بمعدل 3-6 مل لكل لتر من الماء.
    5. تسميد أسبوعيا لمدة 3-4 أسابيع.
    6. حافظ على نفس الإضاءة والظروف البيئية طوال هذه الخطوة.

2. تحديد العرق بطريقة النواة الموبوءة (IKM)

  1. الإصابة بالحبات
    1. تحضير اللقاح.
      1. إما من عينة مخزنة أو تم جمعها حديثا ، قم بعزل وزراعة سلالة F. oxysporum f. sp. niveum ذات الأهمية على صفيحة من qPDA لدرجة أن نموها يغطي نصف اللوحة.
        ملاحظة: هذا يدل على أنه نشط وقابل للحياة ، وهو أمر ضروري للإصابة الكبيرة بالحبوب في خطوات لاحقة.
    2. تحضير الحبوب.
      1. على نطاق واسع ، قم بقياس 200 غرام من التوت الجاودار (Secale spp.) (أو حبات القمح Maxie var. (Triticum spp.) في أي حاوية كبيرة بما فيه الكفاية وصبها في واحد أو أكثر من قوارير Erlenmeyer الزجاجية سعة 1 لتر. أضف ماء الصنبور المعقم إلى القوارير لتغطية الحبوب بالكامل حتى 5 سم على الأقل (الشكل 5A).
      2. نقع الحبات في درجة حرارة الغرفة (~ 24 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة. استنزاف الماء من القوارير. قم بتوصيل الفتحة بقطعة من لفائف القطن ملفوفة بالقماش القطني ؛ وتغطية الفتحة مع التفاف رقائق الألومنيوم (الشكل 5B).
    3. تطهير الحبوب. بمجرد أن تشرب الحبوب الماء ، قم بتعقيمه مرتين بطريقتين متميزتين لقتل الميكروبات الأخرى غير المرغوب فيها قبل التلقيح.
      1. خلال المرة الأولى ، قم بتعقيم الحبوب في القوارير المحضرة في دورة جاذبية (121.2 درجة مئوية ، 1.06 كجم / سم2) لمدة 1 ساعة مع 5 دقائق من وقت التجفيف. اترك القوارير لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      2. قبل التعقيم في المرة الثانية ، انقل الحبوب إلى كيس صغير ينمو بالفطر مع مرشح 0.5 ميكرومتر. أخرج الهواء من الكيس ثم قم بطي البلاستيك الزائد حول الحقيبة.
      3. ضع الكيس في صندوق بلاستيكي آمن للأوتوكلاف. قم بتغطية الصندوق بغلاف رقائق الألومنيوم (الشكل 5C).
        ملاحظة: لا تستخدم صندوقا معدنيا عند تعقيم الحبوب في الأكياس، لأن ذلك قد يتسبب في ذوبان الأكياس.
      4. قم بتعقيم الصندوق على دورة الجاذبية لمدة 1 ساعة مع 5 دقائق من وقت التجفيف ، وهي نفس الدورة كما كان من قبل.
        ملاحظة: قم بتعقيم الحقيبة فقط في المرة الثانية ، وليس الأولى ، حيث قد يتعرض الفلتر والمنفذ للخطر إذا تم تعقيم الأكياس مرتين. منع التكثيف على الفلتر عن طريق السماح للأكياس أن تبرد ببطء وبشكل كامل قبل إزالتها من الأوتوكلاف لأن مرشح كيس النمو سيصبح معرضا للخطر إذا أصبح مبللا.
    4. تطعيم الحبوب.
      1. من خلال العمل مع لوحة الاستزراع والكيس في خزانة السلامة البيولوجية ، قم بقطع أقراص أجار ، قطرها 6 مم ، من منطقة النمو النشط على لوحة الاستزراع باستخدام تجويف فلين معقم # 4 أحجام. افتح الحقيبة. باستخدام تقنية معقمة صارمة ، ضع 5 أقراص أجار في الحقيبة. استخدم أسطوانة متدرجة معقمة سعة 50 مل لقياس 35 مل من ماء الصنبور المعقم وأضفها إلى الحقيبة.
      2. لف فتحة الكيس إلى حد ما ثم رش الخارج بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيم السطح.
        ملاحظة: لا ترش الفلتر لأن هذه الرطوبة ستؤثر عليه أيضا.
      3. أغلق الكيس عن طريق طي الزوايا باتجاه الوسط ثم أكثر من مرتين فوق الفلتر. قم بتأمين الحقيبة بمشابك الأكياس وأنابيب الفينيل الشفافة التي توفرها الشركة المصنعة.
        ملاحظة: المشابك قابلة لإعادة الاستخدام.
      4. قم بإزالة الكيس من خزانة السلامة الأحيائية.
    5. تخزين العامل الممرض للنمو.
      1. قم بتخزين الحقيبة في وضع مستقيم. تأكد من سحب الفلتر بعيدا عن الجانب الآخر من الكيس لتمكين الحد الأقصى لتبادل الغاز (الشكل 5D).
      2. احتضان المواد في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة أسابيع تقريبا. إعادة توزيع الحبوب بانتظام لضمان نمو متساو للممرض.
        ملاحظة: الأكياس غير قابلة لإعادة الاستخدام.
  2. عدوى شتلات البطيخ بالحبوب الموبوءة
    1. مصدر بذور البطيخ كما هو موضح سابقا.
    2. تحديد المجموعات التجريبية.
      ملاحظة: السلالة (السلالات) الوحيدة من العامل الممرض المطلوب هي العزلات التي يتم اختبارها لتحديد العرق. ومع ذلك ، فإن الضوابط السلبية والإيجابية ستساعد في إجراء مقارنات مع النباتات التي لا توجد بها عدوى أو مستوى معين من العدوى.
      1. لإعداد تحكم سلبي ، استخدم حبات القمح المعقمة وفقا للطريقة المذكورة سابقا ولكن دون تلقيح.
      2. لإعداد تحكم إيجابي ، استخدم حبات القمح الملقحة بسلالة مصنفة بالفعل للمقارنة مع العزلة غير المعروفة.
    3. الجمع بين التربة والحبوب.
      1. قم بقياس 14 حبة من الحبوب الموبوءة في كيس بلاستيكي كبير (الشكل 5E). املأ الأواني البلاستيكية (قطرها 15 سم × ارتفاعها 10 سم) بمزيج الأواني لقياس كمية المزيج المطلوب. أفرغ المزيج في الحقيبة. قم بإنشاء وسادة هوائية في الكيس وقم بلفها أو إغلاقها.
      2. امزج الحبات والتربة عن طريق عكس الكيس عدة مرات. للحصول على تحكم سلبي ، قم بإجراء نفس العملية في كيس مختلف مع حبات نظيفة. للحصول على تحكم إيجابي ، قم بإجراء نفس العملية في كيس مختلف مع حبات موبوءة بسلالة المقارنة.
      3. املأ أربعة أواني معقمة على السطح بخليط التربة الموبوء. للحصول على تحكم سلبي ، ضع هذا الخليط قبل التعامل مع أي تربة ملوثة بالفونات.
    4. زرع بذور البطيخ.
      1. زرع ست بذور في كل وعاء. تأكد من أن كل وعاء يحتوي فقط على بذور من صنف واحد. ضع البذور مع نهاية قمة البذور متجهة لأعلى للسماح بالنمو السليم أثناء الظهور (الشكل 6A).
      2. باستخدام زجاجة رذاذ ، بلل الجزء العلوي من التربة 0.3-0.6 سم بالماء. ضع طبقا بلاستيكيا شفافا (قطره 15 سم) تحت وفوق كل وعاء لخلق بيئة رطبة لإنبات البذور (الشكل 6 ب).
    5. إنشاء ظروف النمو.
      1. سقي الأواني ثلاث مرات في اليوم بزجاجة رذاذ للحفاظ على التورجيدية دون الجريان السطحي حتى تنبت البذور (حوالي 5 أيام).
        ملاحظة: ستزداد كمية المياه المستخدمة مع حجم النبات وحجم الوعاء.
      2. بمجرد أن تنبت البذور ، حرك الطبق العلوي إلى الجانب السفلي من الوعاء.
      3. سقي النباتات يوميا حسب الحاجة لنمو النبات الأمثل. تعريض النباتات لفترة ضوئية مدتها 16 ساعة تحت ظروف إضاءة مماثلة لتلك الموصوفة سابقا ودرجة حرارة 27 درجة مئوية (± 1 درجة مئوية).

3. تحديد العرق عن طريق طريقة تراجع الدرج المعدلة (MTDM)

  1. إعداد المواد اللازمة للتطعيم
    1. تحديد ظروف الزراعة.
      1. املأ 48 خلية (عرض 3.68 سم × طول 5.98 سم × عمق 4.69 سم) برمال مبستر بالبخار: الخث: الفيرميكوليت (4:1:1) واضغط لأسفل لضغط التربة قليلا. ضع الإدخالات في صواني بلاستيكية (عرض 27.9 سم × طول 53.3 سم × عمق 5.1 سم).
      2. زرع البذور مع قمتها (النهاية القريبة) تشير إلى أعلى إلى عمق يساوي طولها.
      3. مصدر البذور كما هو موضح سابقا.
      4. بعد ذلك ، حافظ على رطوبة الوسائط عن طريق التغشية لمدة 20 ثانية كل 180 دقيقة أو الري باليد مرة واحدة في اليوم.
      5. بعد الإنبات (حوالي 5 أيام) ، الماء مرة واحدة في اليوم وحسب الحاجة لدعم نمو الشتلات.
    2. إعداد وسائل الإعلام.
      1. تحضير وسط qPDA عن طريق إضافة 5.625 غرام من الآجار المحبب إلى 500 مل من الماء المقطر ؛ إضافة 4.875 غرام من أجار سكر العنب البطاطا. تخلط المكونات جيدا ، والأوتوكلاف ، وتبرد إلى 50 درجة مئوية قبل سكبها في أطباق بتري معقمة. أغلق أطباق بتري باستخدام البارافيلم وخزن الأطباق في الثلاجة (4 درجات مئوية) حتى الاستخدام.
      2. لتحضير وسط المرق ، قم بوزن وإضافة 24 جم من سكر العنب البطاطس إلى زجاجة سعة 1 لتر. اجلب الخليط إلى 1000 مل عن طريق إضافة الماء المقطر إلى الزجاجة ، وضع الزجاجة على صفيحة ساخنة وحرك حتى يذوب. وزع 100 مل من المرق في قوارير Erlenmeyer سعة 250 مل. استخدم القماش القطني لإغلاق القوارير والأوتوكلاف.
    3. تحضير اللقاح.
      1. قبل سبعة أيام من الزراعة ، قم بتلقيح خمس لوحات qPDA بورق تسلل28 وتخزينها في منطقة محتضنة لمدة ثمانية أيام في دورة مظلمة 14 ساعة / 10 ساعات22.
      2. في اليوم السابع ، انقل قابسين من أجار 1 سم2 إلى كل قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل تحتوي على 100 مل من سكر العنب البطاطا. ضع قوارير Erlenmeyer على شاكر على الطاولة عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 7 أيام في دورة ضوئية / مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات.
      3. في يوم التلقيح (بعد 14 يوما من البذر) ، قم بحصاد الجراثيم عن طريق تصفية اللقاح من خلال أربع طبقات من القماش القطني المعقم.
      4. حدد تركيز microconidial في القوارير باستخدام مقياس الدم كما هو موضح سابقا. قم بإعداد معلق تلقيحي سعة 7 لتر في حوض بلاستيكي (عرض 40.6 سم × طول 67.3 سم × عمق 16.8 سم) عن طريق نقل الحجم الصحيح لتعليق البوغ إلى ماء معقم للحصول على تركيز بوغ نهائي من 1 × 106 مل −1 (الشكل 7A).
  2. تلقيح
    1. بعد أربعة عشر يوما من البذر (على الأقل أول مرحلة حقيقية للأوراق) ، انقل إدخالات الخلية مع الشتلات إلى صواني شبكية (عرض 26.9 سم × طول 53.7 سم × عمق 6.28 سم). ضع الصواني الشبكية بلطف مع الشتلات في حوض بلاستيكي يحتوي على تعليق التلقيح سعة 7 لترات. قم بتلقيح كل صينية واحدة تلو الأخرى (الشكل 7B).
    2. اسمح للشتلات بالبقاء في اللقاح دون إزعاج لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، انقل برفق إدخالات الخلية التي تحتوي على الشتلات الملقحة إلى صواني خالية من الثقوب (عرض 27.9 سم × طول 53.3 سم × عمق 5.1 سم). كرر هذه العملية لكل درج.
    3. ضع الصواني الخالية من الثقوب على مقعد الدفيئة والماء حسب الحاجة. الحفاظ على نفس الإضاءة والظروف البيئية كما هو موضح للفحص الحيوي لتراجع الجذر.

4. تصنيف المرض

  1. حدد الفواصل الزمنية للتقييم.
    1. بالنسبة لطرق غمس الجذر وطرق غمس الدرج المعدلة ، ابدأ في التصنيف بعد أسبوع واحد من تلقيح النباتات واستمر أسبوعيا لمدة أربعة أسابيع أخرى.
      ملاحظة: ستشمل مجموعة البيانات المجمعة خمس مجموعات من الملاحظات خلال هذه الفترة.
    2. أثناء استخدام طريقة kernel ، ابدأ التقييمات فقط بمجرد ظهور الشتلات وتستمر أسبوعيا لما مجموعه ستة تقييمات.
  2. مراقبة وحساب الحدوث.
    1. خلال كل تصنيف، التقط صورا رقمية لتوثيق تقدم المرض.
    2. الإبلاغ عن حدوث الذبول وموت النبات. احسب معدل الإصابة عن طريق أخذ مجموع النباتات التي تظهر عليها الأعراض مقارنة بالسيطرة الصحية وعدد النباتات الميتة كنسبة من إجمالي عدد النباتات في هذا الصنف.
  3. تحليل النتائج. قارن أنماط العدوى بين الأصناف وبين مجموعات التجارب إذا تم استخدام عناصر التحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تساعد هذه التجارب في تحديد المقاومة النسبية للأصناف المزروعة بشكل شائع (الجدول 1). ويمكن بعد ذلك استخدام هذه المعلومات لتوجيه توصيات الإدارة استنادا إلى مجموعات فون. بمعنى آخر ، إذا كان من المعروف أن العرق 0 أو 1 موجود في حقل تجاري ، فقد يميل المزارع إلى زراعة مجموعة متنوعة "مقاومة" مثل Calhoun Gray أو Sunsugar أو ما يعادلها. تظهر نتائج المقايسات الحيوية باستخدام جميع الطرق أنه عندما أصيبت الشتلات بعزل Race 1 ، مات صنفا Black Diamond و Charleston Grey أو أظهرا أعراضا خطيرة ، في حين أظهر صنفا Calhoun Grey و PI مقاومة (الجدول 2 والشكل 8A).

أظهرت جميع الطرق أنه عندما أصيبت الشتلات بعزل Race 3 ، ماتت جميع النباتات تقريبا من جميع الأصناف أو ظهرت عليها أعراض خطيرة (الشكل 8B). توضح هذه النتائج كيف أن الفحوصات الحيوية باستخدام طريقتي التلقيح تفرق بنجاح بين أجناس فون. يجب أن يكون مظهر النباتات المريضة هو نفسه لجميع الطرق. الفرق الوحيد هو في كيفية تجميع الأصناف مكانيا. بالنسبة لطرق الغمس الجذري وطرق الغمس الجاف المعدلة ، سيتم تنظيم الأصناف بواسطة أعمدة الدرج ، بينما في طريقة النواة ، سيتم تجميع الأصناف في الأواني الخاصة بها.

Figure 1
الشكل 1: المنطقة التجريبية ل RDM. نظرا لتقلب الأعراض ، والذي يعتمد بشكل كبير على الظروف البيئية مثل الرطوبة النسبية ودرجة الحرارة والفترة الضوئية وشدة الضوء ، فإن الحفاظ على منطقة تجريبية منظمة أمر مهم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد شقق البدء ل RDM. املأ 8 × 16 خلية (عرض 25 سم × طول 50 سم) بدءا من المسطحات بوسط الزراعة واضغط لأسفل لضغط التربة قليلا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعداد التعليق المخروطي ل RDM. (أ) العزلة والثقافة. إما من عينة مخزنة أو تم جمعها حديثا ، قم بعزل وزراعة سلالة F. oxysporum f. sp. niveum ذات الأهمية على صفيحة من qPDA لدرجة أن نموها يغطي نصف اللوحة. هذا يدل على أنه نشط وقابل للحياة ، وهو أمر ضروري للإصابة الكبيرة بالحبوب في خطوات لاحقة. (ب) إزاحة الكونيديا. إزاحة كونيديا عن طريق كشط موزع خلايا معقمة عبر السطح المتوسط. (جيم) إيداع التعليق. قم بتجميع تعليق كونيديا السائل ونقله إلى أنبوب زراعة معقم بسعة 50 مل. اختصار: qPDA = ربع قوة البطاطس سكر العنب أجار المتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تنظيم ودوامة الشتلات ل RDM . (أ) فصل الأصناف. قم بتخزين النباتات التي تم شطفها مؤقتا في حاويات نظيفة بمياه الصنبور حتى الاستخدام ، مع الحفاظ على فصل الأصناف. (ب) دوامة الشتلات. دوامة الأنابيب مع جذور النباتات مغمورة لمدة 30 ثانية لزراعة نبات واحد لكل خلية في شقق الستايروفوم 6 × 12. يتم وضع النباتات من نفس الصنف في نفس العمود في الدرج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إعداد وإصابة حبات IKM . (أ) شرب التوت الجاودار. على نطاق واسع ، قم بقياس 200 غرام من التوت الجاودار (Secale spp.) (أو حبات القمح Maxie var. (Triticum spp.) في أي حاوية كبيرة بما فيه الكفاية وصبها في واحد أو أكثر من قوارير Erlenmeyer الزجاجية سعة 1 لتر. أضف ماء الصنبور المعقم إلى القوارير لتغطية الحبوب بالكامل حتى 5 سم على الأقل. (ب) استنزاف القوارير. صفي الماء من القوارير ، وقم بتوصيل الفتحة بقطعة من لفائف القطن ملفوفة بالقماش القطني ، وقم بتغطية الفتحة بغلاف من رقائق الألومنيوم. (ج) إعداد الأوتوكلاف. ضع الكيس في صندوق بلاستيكي آمن للأوتوكلاف. لا تستخدم صندوقا معدنيا عند تعقيم الحبوب في الأكياس ، لأن ذلك قد يتسبب في ذوبان الأكياس. قم بتغطية الصندوق بغلاف رقائق الألومنيوم. (د) تخزين الحقائب. قم بتخزين الحقيبة في وضع مستقيم. تأكد من سحب الفلتر بعيدا عن الجانب الآخر من الكيس لتمكين أقصى قدر من تبادل الغازات. (ه) قياس 14 حبة من حبات الموبوءة في كيس بلاستيكي كبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: بذر وإنبات بذور البطيخ. (أ) بذر بذور الصنف في الأواني. زرع ست بذور في كل وعاء. تأكد من أن كل وعاء يحتوي فقط على بذور من صنف واحد. ضع البذور مع نهاية قمة البذور متجهة لأعلى للسماح بالنمو السليم أثناء الظهور. (ب) إنبات البذور. باستخدام زجاجة رذاذ ، بلل الجزء العلوي من التربة 0.3-0.6 سم بالماء. ضع طبقا بلاستيكيا شفافا (قطره 15 سم) تحت وفوق كل وعاء لخلق بيئة رطبة لإنبات البذور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحضير التلقيح وتلقيح الشتلات من أجل MTDM. (أ) تحضير اللقاح. حدد تركيز microconidial في القوارير باستخدام مقياس الدم كما هو موضح سابقا. قم بإعداد تعليق تلقيحي سعة 7 لتر في حوض بلاستيكي (بعرض 40.6 سم × طول 67.3 سم × عمق 16.8 سم) عن طريق نقل الحجم الصحيح لتعليق البوغ إلى ماء معقم للحصول على تركيز بوغ نهائي يبلغ 1 × 106 مل −1. (ب) تلقيح الشتلات. بعد أربعة عشر يوما من البذر (على الأقل أول مرحلة أوراق حقيقية ، انقل إدخالات الخلية مع الشتلات إلى صواني شبكية (عرض 26.9 سم × 53.7 سم × عمق 6.28 سم). ضع الصواني الشبكية بلطف مع الشتلات في حوض بلاستيكي يحتوي على تعليق التلقيح سعة 7 لترات. قم بتلقيح كل صينية واحدة تلو الأخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: النتائج المظهرية لطرق تحديد العرق. (أ) نتائج السباق 1. تظهر نتائج المقايسات الحيوية باستخدام (أ) جميع الطرق أنه عندما أصيبت الشتلات بعزل Race 1 ، مات صنفا Black Diamond و Charleston Grey أو أظهرا أعراضا خطيرة ، بينما أظهر صنفا Calhoun Grey و PI مقاومة. (ب) نتائج السباق 3. أظهرت جميع الطرق أنه عندما أصيبت الشتلات بعزل Race 3 ، ماتت جميع النباتات تقريبا من جميع الأصناف أو ظهرت عليها أعراض خطيرة. (يجب أن يكون مظهر النباتات المريضة هو نفسه لجميع الطرق. ترتيب الزراعة (من اليسار إلى اليمين) موضح بالأسهم: الماس الأسود (السهم الأزرق) ، رمادي تشارلستون (سهم أرجواني) ، كالهون غراي (سهم بني) ، مقدمة النبات 296341-FR (سهم أخضر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صنف السباق 0 السباق 1 السباق 2 السباق 3
سكر بيبي، الماس الأسود S S S S
تشارلستون غراي، ألسويت، ديكسيل R S S S
كالهون غراي، صن شوغر R R S S
PI-296341-FR R R R S

الجدول 1: سباق الفيوزاريوم أوكسيسبوروم f. sp. نيفيوم. يتم تحديد سباق Fusarium oxysporum f. sp. niveum من خلال تفاعلات حساسة أو مقاومة لمجموعة من فروق البطيخ. الأصناف المدرجة في كل صف هي الأكثر استخداما لتمثيل كل مستوى من مستويات المقاومة أثناء تقييم سباق العزلة. تم تعديل هذا الجدول من 4. الاختصارات: S = عرضة ؛ R = مقاوم.

عزل أسلوب دينار بحريني الفصل زاي كال جي. مؤشر الأداء سباق
S مثل S مثل S مثل S مثل
X تراجع 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X نواة 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X إم تي دي 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y تراجع 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y نواة 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y إم تي دي 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = أعراض; AS = بدون أعراض

الجدول 2: تحديد الأعراق. وتعكس القيم المستخدمة في هذا الجدول معدل الإصابة أو عدد النباتات التي تظهر عليها أعراض، مقارنة بالمراقبة الصحية، وعدد النباتات الميتة كنسبة من العدد الإجمالي للنباتات في ذلك الصنف. وتعكس الأرقام في كل خلية معدل الإصابة المبلغ عنه في نهاية فترة الرصد. يعتبر الصنف عرضة للإصابة عندما يكون ما لا يقل عن 1/3أو 33٪ من نباتات هذا الصنف مصابة بأعراض أو ميتة. ثم يتم تحديد جنس العامل الممرض بناء على الأصناف التي اعتبرت عرضة للإصابة. وبعبارة أخرى ، فإن كيفية أداء العامل الممرض ضد الأصناف ذات المقاومة المتزايدة تحدد سباق العزلة. هذه النتائج ليست من تجربة فعلية بل تظهر لنقل كيفية تحديد الأجناس من نتائج هذه الأساليب. الاختصارات: MTD = طريقة التنقيط بالدرج المعدلة ؛ BD = الماس الأسود; CH. G = تشارلستون غراي; Cal G. = كالهون غراي; PI = مقدمة النبات 296341-FR; S = أعراض; AS = بدون أعراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تقديم ثلاث طرق لكتابة العرق. كل من هذه الطرق هي الأنسب لأسئلة معينة وظروف تجريبية. ربما تكون طريقة تلقيح النواة الموبوءة (الإصابة بالتربة) أبسط وأكثر وضوحا ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص لتقييم الإمراض30. يعد استخدام هذه الطريقة لكتابة السباق البسيطة فعالا للغاية. ومع ذلك ، فإن تطبيق الطريقة لتحديد مقاومة صنف معين قد يكون تحديا ، بالنظر إلى أن كل نبات قد لا يواجه نفس الدرجة من العدوى أو التعرض ، وقد تكون هناك حاجة إلى مستويات عالية من المرض لاختبار مقاومة الأصناف ذات الاهتمام. هذا هو الحال لأن التلقيح المنتج بهذه الطريقة لا يتم تحديده كميا بشكل جيد ، ونسبة البروباغولات القابلة للحياة ، أو عدد البروباغولات المعدية التي تصل إلى منطقة الجذر ، ليست منظمة تنظيما جيدا31. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه الطريقة محدودة بسبب التناقضات في قرب الحبات المزروعة من منطقة الجذر. إذا كانت بعيدة جدا ، فقد لا تنبت الجراثيم ، أو قد لا تتطور hyphae بما يكفي للوصول إلى الجذور.

طريقة الجذر تراجع32,33 هي أكثر شاقة وتستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، نظرا لأن كمية البروباغولات القابلة للحياة التي تتفاعل مع النبات يتم قياسها بدقة أكبر ، يمكن وصف مقاومة المضيف بدقة أكبر ، مما يسهل فحص المقاومة. علاوة على ذلك ، يمكن اكتشاف الاختلافات في الضراوة داخل نفس السباق بسهولة أكبر. هذه الطريقة لها فائدة إضافية تتمثل في أن النباتات تصبح بشكل عام أعراضا في وقت مبكر وأكثر تعبيرا مما كانت عليه في طريقة النواة. قد يفتقر أحد المتغيرات من طريقة غمس الجذر باستخدام الكلاميدوسبورات في تعليق التلقيح بدلا من كونيديا إلى هذه الفائدة6. وبالمثل ، فإن طريقة غمس الدرجالمعدلة 22 كثيفة العمالة ولكنها تسمح بالنمط الظاهري عالي الإنتاجية عندما تحتاج العديد من العزلات والشتلات إلى الفحص.

تشمل العوامل المشتركة للطرق الثلاث اختيار الأصناف وظروف النمو ومتطلبات النظافة. اعتمادا على ما هو متاح تجاريا ، يمكن استبدال أصناف معينة21,34. يمكن استخدام كل من Sugar Baby و Black Diamond لتحديد عزلات العرق 0 ، في حين تم وصف Charleston Gray و Allsweet و Dixielee بأنها مقاومة للسباق 0 ولكنها عرضة للسباق 1. كالهون غراي و Sunsugar مقاومان للأجناس 0 و 1 وعرضة للأعراق 2 و 3. يعتمد تطور مرض فون بشكل كبير على درجة الحرارة. يجب توخي الحذر لضمان التحكم في الظروف التجريبية لهذا المتغير. عند اختيار وسط زراعة ، يجب أن تكون الخلطات التجارية العامة التي تشمل طحلب الخث و / أو الجبس وتسمح بالتهوية الجيدة مرضية. يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع التلوث المتبادل لوسائط الزراعة في كلتا الطريقتين ، خاصة من كيس المصدر.

بعد استخدام إحدى الطرق الموصوفة ، يجب تقييم المرض بدقة وثبات. قرر الباحثون السابقون عادة عتبة يتم عندها تصنيف النباتات على أنها إما عرضة أو مقاومة35,36. على سبيل المثال ، إذا كان أقل من 33٪ من النباتات من صنف معين أعراضا ، تصنيف هذا الصنف على أنه مقاوم مع تعريف العزل فيما يتعلق بالمظهر الجانبي الحساس للصنف. يتم تحديد مجموعة العتبة من قبل الباحث والسؤال الذي يرغب في معالجته. تم الإبلاغ على نطاق واسع عن التباين بين المقيمين ونفس المقيم بين النباتات37,38. عوامل مثل جودة البذور المستخدمة ، وجودة التربة ، وكثافة التلقيح ، وعمر تخزين العزلات ، وانحياز التقييم39,40 كلها تساهم في هذا التباين8. بسبب هذا التباين في التلقيح واستجابات أصناف PI ، هناك حاجة إلى العديد من النسخ التجريبية ؛ من الناحية المثالية ، يوصى بثلاثة على الأقل ولكن خمسة نسخ متماثلة ، مع 6 نباتات لكل تكرار لكل صنف.

في حين تم تطوير الفحوصات الجزيئية للكشف عن عزلات فون 41،42،43 ، إلا أن النتائج لم تكن متسقة بسبب الطبيعة المتعددة للفيزياء F. oxysporum والتباين الجغرافي والجينومي لمجمع الأنواع 44،45،46. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن الأبحاث السابقة قد أثبتت أهمية المستجيبات المفرزة في Xylem (SIX) في الضراوة الكاملة ، إلا أن المكمل الدقيق للمؤثرات التي تحدد البنية العرقية لعزلات Fon لم يتم تحديده بعد13. لا يزال يجري تطوير التشخيص الجزيئي للعرق ، حيث تعتبر تقنيات النمط الظاهري هذه حاسمة لتقييم دقتها وفائدتها في كتابة سباق فون19,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية منافسة.

Acknowledgments

نود أن نشيد بالدكتور علي ومختبر التشخيص الجزيئي النباتي وكذلك الدكتور بينغشنغ جي في جامعة جورجيا ، الذي ساعدت قيادته ودعمه في إنشاء برنامج Fon الخاص بنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

علم الأحياء ، العدد 176 ،
تباين بين ثلاث تقنيات تلقيح تستخدم لتحديد جنس <em>الفيوزاريوم أوكسيسبوروم</em> f.sp غير المعروف. <em>نيفيوم</em> يعزل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter