우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.
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방법 논문
과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사
이 논문에서
요약
초록
신진 대사는 세포 생활에서 중요한 과정의 기초입니다. 생체 조직에서 대사 네트워크가 어떻게 기능하는지 특성화하면 질병의 메커니즘을 이해하고 치료법을 설계하는 데 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 역행성 관류된 마우스 심장에서 세포 내 대사 활동을 실시간으로 연구하기 위한 절차와 방법론을 설명합니다. 심장은 심근 허혈을 최소화하기 위해 심정지와 함께 현장에서 분리되었고 핵자기 공명(NMR) 분광계 내부에서 관류되었습니다. 분광계에서 그리고 연속 관류 하에서, 과분극 [1-13 C] 피루브산이 심장에 투여되었고, 후속 과분극 [1-13 C] 젖산 및 [13C] 중탄산염 생성 속도는 실시간으로 젖산 탈수소 효소 및 피루 베이트 탈수소 효소 생산 속도를 결정하는 역할을했습니다. 과분극된 [1-13C]피루브산의 이러한 대사 활성은 생성물 선택적 포화-여기 획득 접근법을 사용하여 모델 자유 방식으로 NMR 분광법으로 정량화되었습니다. 31 P 분광법은 심장 에너지 및 pH를 모니터링하기 위해 과분극 획득 사이에 적용되었습니다. 이 시스템은 건강하고 병든 쥐의 심장에서 대사 활동을 연구하는 데 매우 유용합니다.
서론
심장 대사의 변화는 다양한 심근병증과 관련이 있으며 종종 근본적인 병태생리학적 메커니즘의 기초를 형성합니다1. 그러나 대부분의 생화학적 분석에는 조직의 균질화와 세포 용해 및/또는 방사능 추적이 필요하기 때문에 살아있는 조직의 대사를 연구하는 데는 많은 장애물이 있습니다. 따라서 생체 조직에서 심근 대사를 조사하기 위한 새로운 도구가 절실히 필요합니다. 과분극된 13C-표지 기질의 자기 공명(MR)은 표지된 부위의 MR 신호 대 잡음비(SNR) 비율을 몇 배나 증가시킴으로써 이온화 방사선을 사용하지 않고 생체 조직2의 대사를 실시간으로 측정할 수있습니다. 여기에서 우리는 분리된 마우스 심장의 빠른 대사를 연구하기 위한 실험 설정, 획득 접근 방식 및 분석적 접근 방식을 설명하고 동시에 일반적인 조직 에너지 및 산도의 지표를 제시합니다. 심장 pH는 심근 허혈, 부적응 비대, 심부전과 같은 심장 질환 및 상태의 초기 단계에서 산-염기 균형이 깨지기 때문에 중요한 지표이다6.
과분극 [1-13C]젖산염 및 [13C]과분극 [1-1....
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프로토콜
히브리 대학교와 하다사 메디컬 센터의 공동 윤리 위원회(IACUC)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-19-15827-1)을 승인했습니다.
1. Krebs-Henseleit 완충액 준비
- 실험 하루 전에 Krebs-Henseleit 완충액(KHB)26의 수정된 버전을 준비합니다. 처음에, 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM 피루브산, 1.2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3, 및 1.2 mM KH2PO4를 이중-증류된 H2O에 용해시킨다.
- 이 혼합물을 95%/5% O 2/CO2로 20분 동안 버블링한 다음 1.2mM CaCl2를 추가합니다.
- HCl 또는 NaOH로 완충액의 pH를 7.4로 조정합니다.
- 실험 당일 1.2단계에서 제조한 KHB에 10mM 포도당과 72U/L 인슐린을 첨가한다.
참고: 인슐린은 Kolwicz et al.26의 연구에 설명된 대로 관류 완충액에 첨가되며 인슐린이 수축 기능
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결과
KHB로 관류된 마우스 심장으로부터 그리고 완충액 단독으로부터 기록된 31P스펙트럼이 도 1A에 제시되어 있다. α-, β-, γ-ATP, PCr 및 Pi의 신호가 심장에서 관찰되었습니다. Pi 신호는 두 가지 주요 구성 요소로 구성되었습니다 : 더 높은 필드 (신호의 왼쪽)에서 Pi 신호는 대부분 pH 7.4의 KHB로 인한 것입니다. 하단 필드(신호의 오른쪽)에서 Pi 신호는 더 산성 환경으로 인해 더 넓고 덜 균질했습니다. 후자의 패턴은 심장 조직에서 발생합니다. 심장 조직 Pi 신호는 KHB의 Pi 신호를 빼서 추출한 다음(그림 1B) ppm 척도에서 pH 척도로 변환합니다(그림 1C). pH는 가중 평균, 가중 중앙값, 전체 최대값 및 왜도를 계산하여 조직 Pi 신호의 다중 모수 분석을 사용하여 조사됩니다(
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토론
우리는 분리된 마우스 심장 모델에서 과분극된 [1-13C]피루브산 대사, 조직 에너지 및 pH를 조사하도록 설계된 실험 설정을 보여줍니다.
프로토콜 내의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 완충액의 pH가 7.4인지 확인하고; 2) 버퍼의 모든 성분이 포함되도록 하는 것; 3) 헤파린 주사에 의한 심장 혈관의 혈액 응고를 피하십시오. 4) 대사 활성을 감소시킴으로써 심장에 대한 허혈성 손상을 피하는 것(KCl 주사 및 얼음-냉 완충액); 5) 절차의 어느 시점에서든 심장에 기포가 유입되는 것을 피하십시오. 6) 짙은 빨간색에서 밝은 분홍색으로 변하는 조직의 색에 의한 대동맥의 성공적인 캐뉼라 삽입을 검증합니다. 7) 심장이 따뜻한 완충액으로 이동하면 관류가 연속적인지 확인합니다. 8) 심장 옆 분광계에서 NMR 튜브 내부의 온도를 면밀히 모니터링하고 37°C로 유지합니다. 9) 측정을 통해 자기장 균질성을 확인하는 단계; 10) RF 펄스에 대해 정확하고 업.......
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감사의 글
이 프로젝트는 보조금 계약 번호 1379/18에 따라 이스라엘 과학 재단으로부터 자금을 받았습니다. 직접 박사 과정 학생을위한 응용 및 공학 과학을위한 이스라엘 과학 기술부의 Jabotinsky 장학금 번호 3-15892 DS; 보조금 계약 No. 858149(AlternativesToGd)에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램.
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재료
31
장착되어 있습니다.당 륨 벤젠-D6P 표준 샘플 D 페닐포스폰산으로
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| HyperSense DNP 편광 | 옥스포드 기기 | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, 전임상 용해-DNP 극분광 |
| NMR 분광계 | RS2D | NMR 큐브, 5.8 T, 10 mm 광대역 프로브 | |
| 연동 펌프가 | Cole-Parmer | 07554-95 | |
| 온도 프로브 | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR 호환 온도 프로브 |
| Somnosuite 저유량 마취 시스템 | Kent Scientific | ||
| Lines, 튜빙, 봉합사 | |||
| Platinum 경화 실리콘 튜브 | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm& 주의; |
| 얇은 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK) 라인 | Upchurch Scientific | id. 0.040" | |
| 정맥 카테터 | BD 의료 | 381323 | 22 G |
| 실크 봉합사 | Ethicon | W577H | 와이어 직경 3-0 |
| < > 화학 물질 및 제약 < / 강력 > | |||
| [1-13 < / sup >C] 피루브 산 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
| 염화칼슘 | 시그마 - 알드리치 | 21074 | CAS : 10043-52-4 |
| D-(+)-포도 | 시그마-알드리치 | G7528 | CAS: 50-99-77 |
| 헤파린 나트륨 | 로텍스메디카 | HEP5A0130C0160 | |
| 염산 37% | 시그마-알드리치 | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
| 인슐린 아스파르트(NovoLog) | Novo Nordisk | ||
| 이소플루란 | 테렐 | ||
| 황산마그네슘 | 시그마-알드리치 | 793612 | CAS : 7487-88-9 |
| 염화칼 | 시그마-알드리치 | P4504 | CAS : 7447-40-7 |
| 인산칼륨 일염기 | 성 시그마-알드리치 | P9791 | CAS : 7778-77-0 |
| 중탄산나트륨 | Gadot 그룹 | CAS : 144-55-8 | |
| 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S9625 | CAS : 7647-14-5 |
| 나트륨 수산화물 | 시그마-알드리치 | 655104 | CAS : 1310-73-2 |
| 인산나트륨 이염기 | 성 시그마-알드리치 | S7907 | CAS : 7558-79-4 |
| 인산나트륨 일염기성 이수화물 | Merck | 6345 | CAS : 13472-35-0 |
| TRIS (생명 공학 등급) | Amresco | 0826 | CAS : 77-86-1 |
| 트리틸 라디칼 OX063 | GE 헬스케어 AS | NC100136 | OX063 |
| NMR 표준 | |||
| 13C 표준 샘플 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 의 40% p-dioxane |
| 2Software | 제작되었습니다 | ||
| > | |||
| Excel 2016 | Microsoft | ||
| MNova | Mestrelab Research |
참고문헌
- Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
- Schroeder, M. A., et al.
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재인쇄 및 허가
![과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg&w=3840&q=75)