Summary
우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.
Abstract
신진 대사는 세포 생활에서 중요한 과정의 기초입니다. 생체 조직에서 대사 네트워크가 어떻게 기능하는지 특성화하면 질병의 메커니즘을 이해하고 치료법을 설계하는 데 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 역행성 관류된 마우스 심장에서 세포 내 대사 활동을 실시간으로 연구하기 위한 절차와 방법론을 설명합니다. 심장은 심근 허혈을 최소화하기 위해 심정지와 함께 현장에서 분리되었고 핵자기 공명(NMR) 분광계 내부에서 관류되었습니다. 분광계에서 그리고 연속 관류 하에서, 과분극 [1-13 C] 피루브산이 심장에 투여되었고, 후속 과분극 [1-13 C] 젖산 및 [13C] 중탄산염 생성 속도는 실시간으로 젖산 탈수소 효소 및 피루 베이트 탈수소 효소 생산 속도를 결정하는 역할을했습니다. 과분극된 [1-13C]피루브산의 이러한 대사 활성은 생성물 선택적 포화-여기 획득 접근법을 사용하여 모델 자유 방식으로 NMR 분광법으로 정량화되었습니다. 31 P 분광법은 심장 에너지 및 pH를 모니터링하기 위해 과분극 획득 사이에 적용되었습니다. 이 시스템은 건강하고 병든 쥐의 심장에서 대사 활동을 연구하는 데 매우 유용합니다.
Introduction
심장 대사의 변화는 다양한 심근병증과 관련이 있으며 종종 근본적인 병태생리학적 메커니즘의 기초를 형성합니다1. 그러나 대부분의 생화학적 분석에는 조직의 균질화와 세포 용해 및/또는 방사능 추적이 필요하기 때문에 살아있는 조직의 대사를 연구하는 데는 많은 장애물이 있습니다. 따라서 생체 조직에서 심근 대사를 조사하기 위한 새로운 도구가 절실히 필요합니다. 과분극된 13C-표지 기질의 자기 공명(MR)은 표지된 부위의 MR 신호 대 잡음비(SNR) 비율을 몇 배나 증가시킴으로써 이온화 방사선을 사용하지 않고 생체 조직2의 대사를 실시간으로 측정할 수있습니다. 여기에서 우리는 분리된 마우스 심장의 빠른 대사를 연구하기 위한 실험 설정, 획득 접근 방식 및 분석적 접근 방식을 설명하고 동시에 일반적인 조직 에너지 및 산도의 지표를 제시합니다. 심장 pH는 심근 허혈, 부적응 비대, 심부전과 같은 심장 질환 및 상태의 초기 단계에서 산-염기 균형이 깨지기 때문에 중요한 지표이다6.
과분극 [1-13C]젖산염 및 [13C]과분극 [1-13C]피루브산으로부터의 중탄산염 생산은 젖산 탈수소효소(LDH) 및 피루브산 탈수소효소(PDH)의 생성 속도를 결정하는 데 도움이 됩니다. 분리된 설치류 심장에서 과분극된 기질을 사용하여 수행된 대부분의 이전 연구는 LDH 및 PDH의 효소 활성을 도출하기 위해 복잡한 동역학 모델을 사용하거나, 실제 효소 활성률을 계산하지 않고 기질에 대한 과분극 생성물의 신호 강도 비율을 보고했습니다 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. 여기서, 본 발명자들은 생성물 선택적 포화-여기 접근법(15)을 사용하였으며, 이는 모델-없는 방식으로 효소 활성의 모니터링을 가능하게 한다15,16. 이러한 방식으로, 절대 효소 비율 (즉, 단위 시간당 생산 된 생성물의 몰 수)이 결정되었다. 31 P 분광법은 무기 인산염(Pi), 인산(PCr) 및 아데노신 삼인산(ATP)의 신호를 관찰하는 데 사용되었습니다. 조직의 Pi 신호에서 이질적인 화학적 이동에 의해 입증된 바와 같이 심장의 pH 분포를 특성화하기 위해 다중 매개변수 분석이 사용되었습니다.
역행성 관류된 마우스 심장(Langendorff heart)17,18,19은 온전한 박동 심장에 대한 생체 외 모델입니다. 이 모델에서, 심장 생존율 및 pH는 적어도 80분 동안 보존된다20, 그리고 장기간 허혈성 손상 후 회복 가능성을 보여주었다21,22. 그럼에도 불구하고 미세 수술 중 부주의한 가변성은 심장 전체의 조직 생존력에 가변성을 초래할 수 있습니다. 이전 연구에서는 시간이 지남에 따라 이 심장의 악화에 대해 보고했습니다19; 예를 들어, 시간당 5%-10%의 수축 기능 감소가 관찰되었다18. 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP) 신호는 이전에 심근의 에너지 상태와 생존력에 대해 보고하는 것으로 나타났다23. 여기에서 우리는 관류된 심장이 중단 없는 관류 및 산소 공급이 있었음에도 불구하고 ATP 함량에 의해 입증된 바와 같이 때때로 생존 수준에서 의도하지 않은 변동성을 보일 수 있음을 언급했습니다. 우리는 여기에서 LDH 및 PDH 비율을 심장의 ATP 함량으로 정규화하면 이러한 비율의 심장 간 변동성이 감소한다는 것을 보여줍니다.
다음 프로토콜에서는 NMR 분광계에서 심장 캐뉼라 삽입, 분리 및 그에 따른 관류에 사용되는 수술 절차를 설명합니다. 주목할 점은, 마우스 심장을 분리하고 관류하는 것을 목표로 하는 다른 외과적 접근법이 이전에 기술되었다는것이다 24,25.
박동 심장의 효소 속도(13C 분광법 및 과분극[1-13C]피루브산 사용) 및 심장의 생존력 및 산도(31PNMR 분광법 사용)와 관련된 데이터를 수집하는 데 사용되는 방법론도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 대사 효소 활성과 조직 생존력 및 산도를 결정하기 위한 분석 방법론을 설명합니다.
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Protocol
히브리 대학교와 하다사 메디컬 센터의 공동 윤리 위원회(IACUC)는 동물 복지를 위한 연구 프로토콜(MD-19-15827-1)을 승인했습니다.
1. Krebs-Henseleit 완충액 준비
- 실험 하루 전에 Krebs-Henseleit 완충액(KHB)26의 수정된 버전을 준비합니다. 처음에, 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM 피루브산, 1.2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3, 및 1.2 mM KH2PO4를 이중-증류된 H2O에 용해시킨다.
- 이 혼합물을 95%/5% O 2/CO2로 20분 동안 버블링한 다음 1.2mM CaCl2를 추가합니다.
- HCl 또는 NaOH로 완충액의 pH를 7.4로 조정합니다.
- 실험 당일 1.2단계에서 제조한 KHB에 10mM 포도당과 72U/L 인슐린을 첨가한다.
참고: 인슐린은 Kolwicz et al.26의 연구에 설명된 대로 관류 완충액에 첨가되며 인슐린이 수축 기능(27)과 과분극된 [13C]중탄산염 신호(28)의 강도를 증가시킨다고 보고한 이전 연구와 일치합니다.
2. 관류 시스템 준비
- 200°C의 수조에 40mL의 KHB 저장소를 보관하고 심장 관류 전에 95시간 동안 5L/min의 유속으로 2%/4% O2/CO1로 버블링합니다. 실험 내내 이 가스 혼합물로 버퍼가 지속적으로 버블링되도록 합니다.
- 먼저 수조를 40°C로 설정합니다. KHB 저장소를 삽입합니다. 연동 펌프( 재료 표 참조)와 의료용 확장 튜브를 사용하여 7.5mL/min의 일정한 유속으로 버퍼 저장소와 10mm NMR 튜브 사이의 KHB를 재순환시킵니다.
- 3개의 백금 경화 실리콘 튜브(내경 3mm)를 펌프에 연결합니다(KH 버퍼용 유입 튜브 1개와 유출 튜브 2개). 유출 및 유입 라인을 가열된 KH 버퍼에 삽입합니다. 그런 다음 가열된 KH 버퍼에 산소 라인을 삽입합니다.
- 얇은 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK, 재료 표 참조) 라인을 사용하여 완충액과 과분극제가 분광계의 구멍 내에서 NMR 튜브로 흐르도록 합니다.
- 온도가 37-37.5 °C로 유지되는지 확인하십시오. 아래 단계를 따르십시오.
- 42°C로 설정된 가열 테이프로 유입 라인(버퍼 저장소에서 NMR 튜브까지)을 감쌉니다.
- 분광계에 의해 조절되는 따뜻한 공기 흐름으로 분광계 내부의 NMR 튜브를 가열합니다.
- NMR 호환 온도 센서( 재료 표 참조)를 사용하여 NMR 튜브 내부의 온도를 측정합니다. 온도는 37-37.5 °C로 조정됩니다.
3. 획득을 위한 NMR 분광계의 교정 및 준비
- 실험 당일, 1,4-디옥산(재료 표)을 함유한 13C 표준 샘플을 분광계에 삽입하고, 13C에 대한 NMR 프로브를 조정하고 일치시킨다. 그런 다음 너트화 각도가 90°인 1,4-디옥산의 열 평형 신호를 나타내는 스펙트럼을 얻습니다.
- 이제 13C표준 샘플을D2O에 105mM의 ATP를 함유하는 31P표준 샘플(재료 표)로 교환한다.
참고: 열 평형 인산염 신호를 보여주는 스펙트럼은 50°의 너트화 각도로 얻어집니다. - 유입선, 유출선, 온도 프로브를 10mm NMR 튜브에 삽입한 다음 튜브를 마그네틱 보어에 삽입합니다. 가열 테이프를 42 °C로 조정합니다.
- 50°의 너트화 각도와 1.1초(1,640 수집)의 TR로 30분 동안 해당 실험에 사용할 순환 KH 버퍼의 31PNMR 스펙트럼을 획득합니다.
4. NMR 튜브에서 동물의 준비, 수술 절차 및 심장 관류
- 유도 챔버에서 가스 마취 시스템(재료 표)을 사용하여 실내 공기(재료 표)에 3.3% 이소플루란이 있는 수컷 HSD:ICR(CD-1) 마우스를 340mL/min으로 5분 동안 마취합니다.
- 전신 마취 유지를 위해 2.9% 이소플루란으로 비강 마취를 사용하십시오.
알림: 동물의 통증과 불편함을 최소화하기 위해 주의를 기울입니다. - 테이프로 동물의 팔다리를 고정하고 부정적인 페달 통증 반사를 확인한 다음 300IU의 헤파린 나트륨을 복강 내 주사하십시오.
- 마우스의 흉벽과 복부를 70% 알코올로 완전히 적셔 청결을 유지하고 수술 중 모발 오염이나 방해를 방지합니다.
- 헤파린 주사 후 1 분에 작은 가위로 복강의 피부와 근육을 자릅니다.
- 작은 구부러진 턱 지혈제 잠금 모기 클램프를 xiphoid process와 흉부 피부 사이에 놓아 가슴을 들어 올리고 횡격막을 노출시킵니다. 다이어프램의 오른쪽 엽에 구멍을 뚫고 자릅니다.
- 정중선을 가로 질러 가슴을 자르고 측면으로 후퇴 한 다음 제거하십시오.
- 혈액 응고를 방지하기 위해 200IU의 헤파린 나트륨으로 심장의 좌심실을 주사하십시오. 그런 다음 앞서 설명한 대로 0.1mL의 얼음처럼 차가운 0.5mol/L KCl을 주입하여 심정지를 일으킵니다(25). 심장 마비는 심장을 캐뉼러 할 수 있어야합니다.
- 흉선을 확인하고 가위로 제거하여 대동맥을 노출시킵니다. 잔여 흉곽 조직을 제거합니다.
- 대동맥궁을 확인하고 구부러진 집게를 사용하여 상행 대동맥 주위에 3-0 실크 봉합사(재료 표)로 느슨한 매듭을 놓습니다. 3mL의 KHB를 좌심실에 주입하여 대동맥에서 혈전을 제거합니다.
- 상행 대동맥을 더 잘 시각화하기 위해 구부러진 집게를 사용하여 심장을 아래쪽으로 수축시킵니다.
- 22G 정맥 카테터(재료 표)로 현장 캐뉼라 삽입을 수행합니다. 캐뉼러드 영역에 시아노아크릴레이트 접착제를 도포한 다음 이중 봉합사 묶기를 수행합니다. 추가 KH 버퍼를 심장에 주입하고 캐뉼레이션 튜브를 통해 흐르는지 확인합니다.
- 구부러진 집게를 제거합니다. 심장을 주변 내장에서 분리하고 정맥 카테터를 통해 얼음처럼 차가운 KHB(4°C)로 역행합니다.
- 정맥 카테터를 통해 관류 시스템의 유입 라인에 심장을 연결합니다. 7.5mL/min의 따뜻한 완충액(37-37.5°C)으로 관류를 시작하면 심장이 자발적으로 뛰기 시작합니다.
- 박동 심장, 유출선 및 온도 프로브로 NMR 튜브를 고정하고 분광계의 구멍에 삽입하여 심장이 NMR 프로브의 중심에 있는지 확인합니다.
5. 심장 에너지 및 pH에 대한 데이터 수집
- 50°의 플립 각도와 1.1초의 TR로 약 1시간 동안 31P스펙트럼을 획득합니다.
6. DNP 스핀 분극 및 용해
- [1-13C] 피루브산의 28.5 mg 제형을 준비한다. 이러한 제제는 11.1 mM 내지 14.0 mM 산의 OX063 라디칼로 이루어진다.
- 4mL의 용해 배지를 준비합니다. 용해 매질은 11.2 mM NaH2PO4, 38.8 mMNa2HPO4, 33 mM TRIS 및 2 mM HCl을 함유하는 TRIS-포스페이트 완충액으로 구성된다. 이 배지 조성은 이 완충액 4mL에 [1-13C]피루브산 제제 28.5mg을 첨가할 때(용해 단계에서) 결과 용액의 pH가 7.4가 되도록 조정됩니다.
- 제조자의 지시에 따라 dissolution-DNP(dDNP) 스핀 편광 장치에서 스핀 분극 및 빠른 용해를 수행한다(표 of Materials). 약 1.5시간 동안 1.45K에서 1.55K의 [1-13C]피루브산 제형의 편광을 위해 94.110GHz의 주파수에서 마이크로파 조사를 적용합니다.
- dDNP 장치에서 얻은 4mL의 과분극 배지를 과분극 용해 배지를 보완하는 잘 산소화된 용액과 빠르게 혼합하여 관류 배지와 거의 일치하는 조성을 얻습니다.
참고: 14mM 과분극[1-13C]피루브산으로 과분극 주사하는 동안 심장을 관류하는 배지의 최종 부피는 26mL입니다. 주입된 배지의 최종 조성(혼합 후)은 4.7mM KCl, 1.2mM MgSO4, 70mM NaCl, 25mMNaHCO3, 1.2mM KH2PO4, 10mM 포도당, 1.2mM CaCl2 및72U/L 인슐린을 포함합니다. - 연속 흐름 설정29를 사용하여 분리된 심장에 과분극된 [1-13C]피루브산 함유 배지를 투여합니다.
참고: 이것은 실험 중 어느 시점에서든 심장 관류가 방해받지 않고 과분극 배지가 알려진 속도로 알려진 기간 동안 투여되도록 하기 위해 수행됩니다.
7. 과분극 13C분광법
- 이전에 설명된 바와 같이, 2.5 ms 카디널 사인(Sinc) 펄스를 적용하여 생성물-선택성 포화-여기 펄스(15)를 사용하여 과분극된 13C데이터를 획득한다(15,16). [1-13C]젖산물과 [13 C]중탄산염을 6초 간격으로 연속적으로 선택적으로 여기시켜 각 대사 산물에 대해 12초 간격을 얻습니다.
- [1-13C]젖산 검출의 경우, 선택적 Sinc 펄스를 [1-13 C]피루브산 수화물 주파수(179.4ppm)로 중앙에 배치하여 [1-13 C]피루브산의C1 신호에 대한 신호 강도 비율(lac)이 0.113이 됩니다.
- [13C] 중탄산염 검출의 경우 선택적 Sinc 펄스를 157.7ppm으로 중앙에 배치하며, 이는 [13C] 중탄산염 신호(161.1ppm)의 214Hz 다운필드입니다. 그 결과 [1-13C]피루브산과 [13C]중탄산염의C1신호에 대해 신호 강도비(bic)가 0.139가 됩니다.
8. 조직 습윤 중량 및 부피 측정
- 실험이 끝나면 관류 시스템에서 심장을 분리하고 티슈 페이퍼로 부드럽게 건조시킵니다. 이어서, 심장의 무게를 측정하여 조직 습윤 중량을 구한다.
- 마우스 심장(30)에 대해 이전에 결정된 바와 같이, 1.05 g/cm3의 밀도 계수를 사용하여 심장의 부피를 결정한다.
9. ATP 함량 정량화
- ATP 표준 샘플의 단일 획득과 분리된 심장의 30분 획득(TR 1.1초 및 1,640 획득)의 γ-ATP 신호를 통합합니다.
- 심장의 γ-ATP 신호의 적분을 표준(재료 표)의 적분과 비교하여 심장의 ATP 함량을 정량화하고, 후자는 알려진 농도(105mM)를 가지며, 획득 및 이완 효과의 수를 수정합니다.
10. 심장의 Pi 신호 해결
참고: 조직 pH를 평가하려면 먼저 총 Pi 신호(Pit)의 신호에서 심장의 Pi 신호를 디컨볼루션해야 합니다. 이것은 Pit의 신호에서 KHB Pi(PiKH)의 신호를 생략하여 수행됩니다.
- 단일 Pi 신호(PiKH를 보여주는 KHB의 31P스펙트럼, 그림 1A)에서 Excel(재료 표)을 사용하여 PiKH 신호를 로렌치안 함수에 맞춥니다.
- NMR 프로브에 보이는 부피(Vp, 1.375 mL)는 샘플 튜브가 심장을 포함하지 않을 때 더 많은 KHB를 함유한다. 이 충전 효과를 보정하려면 식 1A를 사용하여 감쇠 버퍼 신호(Pib)를 계산하십시오.
식 1A
여기서VH 는 8단계에서 결정된 심장의 부피입니다. - 식 1B에 따라 Pit 에서 이 신호를 빼서 관류된 심장에서만 발생하는 Pi 신호를 얻습니다(Pih, 그림 1B).
식 1B
식 1A
식 1B11. 다중 파라미터 pH 분석
- 식 231을 사용하여 PCr의 화학적 이동을 참조하여 pH로의Pih 신호 화학적 이동 분포의 변환을 수행한다.
식 2
여기서 Δδ는 화학적 이동 차이이고, pKa는 6.72이고, 유리 염기는 5.69 δ, δ유리 산은 3.27이며, 앞서 설명한 바와 같이(31). - Lutz et al.32에 따라 Pih 화학적 이동 척도와 pH 척도 사이의 비선형성에 대한 결과 pH 분포 곡선을 수정합니다. 이 계산으로 인한 일반적인 pH 분포는 그림 1C에 나와 있습니다.
- Lutz et al.의 연구에 따라 7가지 통계 매개변수를 사용하여 다중 매개변수 접근 방식으로 조직 pH 분포를 분석합니다. 32. 이들 파라미터 중 4개는 조직 pH를 가장 잘 설명하는 것으로 보이기 때문에 여기에 제시되어 있다: 1) 전체 최대 pH; 2) 가중 평균 pH; 3) 가중 중간 pH; 및 4) pH 플롯의 왜도(도 1C).
식 212. LDH 및 PDH 활동 계산
참고: 과분극 대사 산물 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염의 생성 속도는 각각 LDH 및 PDH 활성을 계산하는 데 사용됩니다. 생성물 선택적 포화-여기 접근법(15)에서, 새로 합성된 과분극 대사산물만이 각각의 선택적 여기에 의해 검출된다.
- 과분극 [1-13C] 피루브산 신호를 참조로 사용하여 해당 대사 산물 생산 수준을 결정합니다.
- 과분극 매질로 관류하는 동안 NMR 튜브의 [1-13C]피루브산 농도가 증가하고(세척), 고원(최대 농도 14mM에서), 감소(세척)됩니다.
- 피루브산 농도가 일정한 수준(고원)에 도달한 시점을 식별하기 위해, 유효 이완 상수Teff를 사용하여T1 이완 및 RF 맥동으로 인한 신호 감쇠에 대한 [1-13C]피루브산 신호를 수정합니다.
- 각 주입에 대해 이 유동 역학을 보여주기 위해 [1-13C]피루브산 붕괴 곡선을 수정하는 능력에 기초하여 Teff를 정의합니다(Eq.3).
식 3
여기서
는 [1-13C]중탄산염 획득 동안 획득된 [1-13C]피루브산 신호입니다. 본원에 기재된 실험에서 평균Teff 는 35.8 s ± 2.3 s (n=5 hearts)인 것으로 밝혀졌다. - 추가 분석을 위해 농도가 최대 보정된 [1-13C]피루브산 신호의 10% 이내인 데이터 포인트를 선택합니다.
- 대사산물 신호의 SNR이 2(분석 임계값)보다 큰 경우 대사산물 생성 속도를 계산하기 위해 12.1단계에서 선택한 시점에 대한 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염 생산의 해당 데이터를 사용하십시오. 이러한 시점 선택의 전형적인 예가 도 2B (강조된 시간 윈도우)에 도시되어 있다.
- 식 4A 및 식 4B를 사용하여 선택된 각 데이터 포인트의 생산 속도를 계산합니다.
식 4A
식 4B
여기서
와 는 각각 각 시점에서 [1-13 C] 젖산 또는 [13 C] 중탄산염의 생산 속도입니다. [1-13 C] 피루 베이트와 
생성물 [1-13 C] 젖산 또는 [13C] 중탄산염의 상대적 여기를 나타내는 인자입니다.
이들 인자는 이전에 각각 0.113 및 0.139로 결정되었다29. Vp는 NMR 프로브(1.375mL)에 의해 검출되는 부피이고, TR은 2개의 연속적인 생성물 선택적 포화 여기(각 생성물에 대해 12초) 사이의 시간 간격을 나타내며, 는 각각 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염의 신호이고 
, 
는 [1-13C]젖산염 및 [13C]젖산염 및 [13C]피루브산의 신호이다 C] 중탄산염 여기, 각각. [Pyr]은 [1-13C]피루브산 농도로, 고원기 동안 14mM이었습니다.- 각 지점에 대한 속도를 결정한 다음 과분극 주입당 평균을 결정합니다.
식 3
는 [1-13C]중탄산염 획득 동안 획득된 [1-13C]피루브산 신호입니다. 본원에 기재된 실험에서 평균Teff 는 35.8 s ± 2.3 s (n=5 hearts)인 것으로 밝혀졌다.
식 4A
식 4B
와 는 각각 각 시점에서 [1-13 C] 젖산 또는 [13 C] 중탄산염의 생산 속도입니다. [1-13 C] 피루 베이트와 
생성물 [1-13 C] 젖산 또는 [13C] 중탄산염의 상대적 여기를 나타내는 인자입니다.
이들 인자는 이전에 각각 0.113 및 0.139로 결정되었다29. Vp는 NMR 프로브(1.375mL)에 의해 검출되는 부피이고, TR은 2개의 연속적인 생성물 선택적 포화 여기(각 생성물에 대해 12초) 사이의 시간 간격을 나타내며, 는 각각 [1-13C]젖산염 및 [13C]중탄산염의 신호이고 
, 
는 [1-13C]젖산염 및 [13C]젖산염 및 [13C]피루브산의 신호이다 C] 중탄산염 여기, 각각. [Pyr]은 [1-13C]피루브산 농도로, 고원기 동안 14mM이었습니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
KHB로 관류된 마우스 심장으로부터 그리고 완충액 단독으로부터 기록된 31P스펙트럼이 도 1A에 제시되어 있다. α-, β-, γ-ATP, PCr 및 Pi의 신호가 심장에서 관찰되었습니다. Pi 신호는 두 가지 주요 구성 요소로 구성되었습니다 : 더 높은 필드 (신호의 왼쪽)에서 Pi 신호는 대부분 pH 7.4의 KHB로 인한 것입니다. 하단 필드(신호의 오른쪽)에서 Pi 신호는 더 산성 환경으로 인해 더 넓고 덜 균질했습니다. 후자의 패턴은 심장 조직에서 발생합니다. 심장 조직 Pi 신호는 KHB의 Pi 신호를 빼서 추출한 다음(그림 1B) ppm 척도에서 pH 척도로 변환합니다(그림 1C). pH는 가중 평균, 가중 중앙값, 전체 최대값 및 왜도를 계산하여 조직 Pi 신호의 다중 모수 분석을 사용하여 조사됩니다(그림 1C).
그림 1: 일반적인 31P스펙트럼, KHB와 심장의 Pi 신호 간의 차이, 화학적 이동에서 pH 축으로의 변환, pH 분포의 통계적 매개변수. (A) 상부 패널은 분광계에서 KHB로 관류된 마우스 심장으로부터 얻어진 전형적인 31P NMR 스펙트럼을 표시하고, 하단 패널은 KHB 단독으로 얻은 스펙트럼을 보여줍니다. 대시로 표시된 스펙트럼 영역은 패널 B에서 확대되어 표시됩니다. 약어: Pi = 무기 인산염; PCr = 포스포크레아틴; ATP = 아데노신 삼인산; ADP = 아데노신 디포스페이트. (B) 원래 스펙트럼은 검은색(Pit)으로 표시됩니다. 점선 곡선은 버퍼의 Pi 신호만 표시합니다(Pib). 후자는 Pit 신호의 해당 KHB 성분에 중심을 두고 로렌치안 선 모양을 피팅하고 심장 삽입 후 프로브의 KHB 양을 조정하여 얻었습니다(식 1A에 따름). 심장에 기인하는 Pi 신호(Pih)는 주황색으로 표시되며, 이는 Pit신호에서 Pib신호를 뺀 값입니다(식 1B에 따름). (C) (B)에 나타낸Pih 시그널 화학적 이동 분포를 pH 분포로 전환하고 다중 파라메트릭 pH 분석. 화학적 이동과 pH 스케일 사이의 비선형성은 이전에 기술된 바와 같이 보정되었다32. 다중 모수 pH 분석의 결과는 수직선으로 표시됩니다. 이 특정 분포의 경우 통계 매개 변수의 값이 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
과분극된 생성물 선택적 포화-여기 획득 접근법(15)을 이용하면, LDH 및 PDH 효소 활성의 절대 정량화를 수행할 수 있다. 그림 2 는 이 결정에 필요한 수집 및 처리 단계를 요약한 것입니다. 표 1은 5개의 상이한 심장에서의 ATP 함량 및 LDH 및 PDH 비율을 나타낸다. LDH 및 PDH 활성을 각 심장의 ATP 함량으로 정규화하면 표 1의 효소 활성 열에서 볼 수 있듯이 그룹 전체의 LDH 및 PDH 측정의 변동성이 감소했으며, 이는 nmol/s/μmol ATP 단위로 표시됩니다.
그림 2: 과분극 13C MRS 처리 및 [1-13C]피루브산 대사 분석. (A) 관류된 마우스 심장에 14mM의 과분극[1-13C]피루브산을 주입하는 동안 생성물 선택적 포화-여기 접근법으로 획득한 대표적인 13CNMR 스펙트럼. 신호 할당: 1 = [1-13 C]젖산염(183.2ppm); 2 = [1-13 C] 피루 베이트 (171ppm); 3 = [13°C] 중탄산염 (161.1 ppm); * = [1-13C] 피루브산 배합물에서 발생하는 불순물33. (B) A에 표시된 과분극 신호 강도의 시간 경과. [1-13C] 피루브산 (회색)의 적분 강도는 T1붕괴 및 RF 맥동에 대해 32 초 (흑색)의 Teff 시간 상수로 조정되었으며, 이는 기판에 대한 예상 유동 역학 (세척, 고원, 세척)을 산출했습니다. 조정된 [1-13C]피루브산 신호가 NMR 튜브에서 일정하고 최대 [1-13C]피루브산 농도를 나타내는 시간 창 내의 데이터 포인트에 대해 추가 분석이 수행되었습니다(연한 파란색으로 강조 표시됨). 선택된 시점에 대한 LDH 및 PDH(
및 )의 생성 속도를 식 4A 및 
식 4B에 따라 계산한 다음 평균화했습니다. 이 주입의 평균값(
및 
)은 nmol/s 단위로 제공됩니다. 표시 목적을 위해, 조정 된 [1-13 C] 피루 베이트, [1-13 C] 젖산 및 [13 C] 중탄산염에 [1-13 C] 피루 베이트 신호에 대해 각각 0.143, 10및 80을 곱했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 심장 번호 | ATP (마이크로몰) | LDH 비율 (nmol/s) | PDH 비율 (nmol/s) | LDH 비율 (nmol/s/μmol ATP) | PDH 비율 (nmol/s/μmol ATP) |
| 1 | 0.49 | 7.61 | 0.59 | 15.4 | 1.19 |
| 2 | 0.25 | 3.66 | 0.32 | 14.42 | 1.26 |
| 3 | 0.51 | 6.01 | 0.66 | 11.81 | 1.3 |
| 4 | 0.53 | 9.27 | 1.09 | 17.34 | 2.04 |
| 5 | 0.64 | 9.38 | 0.6 | 14.77 | 0.94 |
| 평균(SD) | 0.49 (0.13) | 7.19 (2.15) | 0.65 (0.25) | 14.75 (1.78) | 1.35 (0.37) |
| SD % 평균 | 26.00% | 30.00% | 38.30% | 12.10% | 27.50% |
표 1: 5개 심장의 ATP 함량 및 LDH 및 PDH 비율. 약어: SD = 표준 편차; SD % 평균 = 평균에서 표준 편차의 백분율입니다.
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Discussion
우리는 분리된 마우스 심장 모델에서 과분극된 [1-13C]피루브산 대사, 조직 에너지 및 pH를 조사하도록 설계된 실험 설정을 보여줍니다.
프로토콜 내의 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 완충액의 pH가 7.4인지 확인하고; 2) 버퍼의 모든 성분이 포함되도록 하는 것; 3) 헤파린 주사에 의한 심장 혈관의 혈액 응고를 피하십시오. 4) 대사 활성을 감소시킴으로써 심장에 대한 허혈성 손상을 피하는 것(KCl 주사 및 얼음-냉 완충액); 5) 절차의 어느 시점에서든 심장에 기포가 유입되는 것을 피하십시오. 6) 짙은 빨간색에서 밝은 분홍색으로 변하는 조직의 색에 의한 대동맥의 성공적인 캐뉼라 삽입을 검증합니다. 7) 심장이 따뜻한 완충액으로 이동하면 관류가 연속적인지 확인합니다. 8) 심장 옆 분광계에서 NMR 튜브 내부의 온도를 면밀히 모니터링하고 37°C로 유지합니다. 9) 측정을 통해 자기장 균질성을 확인하는 단계; 10) RF 펄스에 대해 정확하고 업데이트된 보정을 사용합니다.
기술의 수정 및 문제 해결
우리는 이 연구에서 이루어진 몇 가지 수정에 주목합니다: 1) 심장을 보호하기 위해 수술에 추가로 얼음처럼 차가운 KHB로 관류를 개시했습니다. 및 2) 완충액 pH의 검증을 전체적으로 수행하여 이 파라미터가 제어되고 결과의 변동의 원인이 아님을 확인했습니다. 이는 pH 측정기, pH 지시약 스트립 및 31P스펙트럼 상의 Pi 신호를 사용하여 다양한 준비 및 실험 단계에서 수행되었습니다.
변동성의 원인과 이를 수정하는 방법
마우스 심장은 10mm NMR 튜브에 맞도록 선택되었습니다. 그러나 이 작은 심장은 낮은 신호를 제공하며 심장을 분리하고 관류하는 섬세한 수술 절차가 어렵습니다. 전반적으로, 이것은 다양한 조직 생존력과 대사 활동으로 이어집니다. 이러한 변동성을 설명하기 위해 LDH와 PDH의 대사율을 ATP 함량(즉, mole/s/ATP)으로 정규화했습니다. ATP 함량을 기준으로 유사한 사용이 이전에 이종이식 유방 종양 절편29에서 보고되었습니다. 이러한 유형의 정규화는 다른 연구자의 결과 및 다른 조건과 비교할 수 있기 때문에 유용합니다. 또한, ATP 양으로부터 조직 질량으로의 전환 인자를 이용하여, 조직 중량 당 효소 활성을 도출할 수 있다(대사가 일어나는 조직에 대해).
상이한 단리된 심장 제제 사이의 가변성 (즉, 상이한 동물로부터) 외에도, 조직 파이 (Pih) 화학적 이동은 본 연구에서 비균질 분포를 나타내었다. Lutz et al.32는 이종이식 종양에서 유사한 비균질 분포를 입증했으며 이 분포는 다중 매개변수 접근 방식을 사용하여 분석되었습니다. 이 연구에서 이 방법론은 관류된 마우스 심장에서 구현되었습니다. 본 발명자들은 이전에 나타낸 바와 같이, Pih신호가 세포 내 pH에 대해 우세하게 보고될 가능성이 높다는 점에 주목한다16.
불확실
및 의 정량화 에 대한 기본 가정은 과분극된 [1-13C]피루브산 용액이 NMR 프로브에 의해 검출된 전체 부피를 채우고 있다는 것입니다(Vp, 수식 4A 및 수식 4B). 과분극된 [1-13C]피루브산 용액은 심장의 관상 동맥을 통해 흘러 세포외 및 세포내 구획을 채웁니다. 그러므로, 심장 용적은 나머지Vp와 동일한 정도로 과분극된 용액으로 채워진 것으로 가정된다.
과분극화된 생성물 선택적 포화-여기 접근법15,29를 사용하여, 효소 활성은 대사산물의T1 및 효소 반응의 가역성의 임의의 변화와 독립적으로 정량화될 수 있다. 이 측정은 견고하고 T1 및 여기 프로파일의 변화에 영향을 받지 않으며 각 실험실의 특정 획득 조건 및 설정에 따라 달라지는 곡선 아래 면적 분석에 비해 실험실 전체에서 더 재현 가능할 수 있습니다.
호기성 및 혐기성 대사의 교차로에 있는 [1-13C]피루브산 대사를 조사하는 것은 저산소증, 허혈, 재관류 손상, 기아 및 당뇨병성 심근병증과 같은 심장 대사의 변화를 연구하는 데 큰 가치가 있습니다. 과분극된 13C-표지된 피루브산 유사체는 임상적으로 시험되었다 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 따라서, 이러한 연구의 결과는 번역적일 가능성이 높다. 가장 중요한 것은 우리의 접근 방식을 통해 전체 장기에서 세포 내 효소 활성을 정량화할 수 있다는 것입니다.
이 연구에 포함된 격리된 설치류 심장 준비와 절차 및 방법론은 이 모델에서 측정된 매개변수가 전적으로 심장에 기인하기 때문에 심장 기능, 에너지 및 신진대사에 대한 다양한 스트레스 요인의 영향을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 쥐의 심장과는 달리, 쥐의 심장은 형질전환 모델을 연구하는 데 적합하다.
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Disclosures
공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 보조금 계약 번호 1379/18에 따라 이스라엘 과학 재단으로부터 자금을 받았습니다. 직접 박사 과정 학생을위한 응용 및 공학 과학을위한 이스라엘 과학 기술부의 Jabotinsky 장학금 번호 3-15892 DS; 보조금 계약 No. 858149(AlternativesToGd)에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
| NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
| Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
| Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
| Lines, tubings, suture | |||
| Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
| Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
| Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
| Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
| Chemicals and pharmaceuticals | |||
| [1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
| Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
| Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
| Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
| Isoflurane | Terrel | ||
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
| Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
| TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
| Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
| NMR standards | |||
| 13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
| 31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
| Software | |||
| Excel 2016 | Microsoft | ||
| MNova | Mestrelab Research |
References
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![과분극 [<sup>1-13</sup>C] 피루브산 및 <sup>13</sup>C / <sup>31</sup>P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/63188.jpg)
