Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøkelse av hjertemetabolisme i isolert perfusert musehjerte med hyperpolarisert [1-13 C]pyruvat og 13C/31P NMR-spektroskopi

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Vi beskriver et eksperimentelt oppsett for administrering av hyperpolariserte 13C-merkede metabolitter i kontinuerlig perfusjonsmodus til et isolert perfusert musehjerte. En dedikert 13C-NMR-oppkjøpsmetode muliggjorde kvantifisering av metabolsk enzymaktivitet i sanntid, og en multiparametrisk 31P-NMR-analyse muliggjorde bestemmelse av vevets ATP-innhold og pH.

Abstract

Metabolisme er grunnlaget for viktige prosesser i cellulært liv. Karakterisering av hvordan metabolske nettverk fungerer i levende vev gir viktig informasjon for å forstå sykdomsmekanismen og utforme behandlinger. I dette arbeidet beskriver vi prosedyrer og metoder for å studere metabolsk aktivitet i celler i et retrograd perfusert musehjerte i sanntid. Hjertet ble isolert in situ i forbindelse med hjertestans for å minimere myokardiskemien og ble perfundert inne i et NMR-spektrometer (kjernemagnetisk resonans). Mens i spektrometeret og under kontinuerlig perfusjon ble hyperpolarisert [1-13 C] pyruvat administrert til hjertet, og de påfølgende hyperpolariserte [1-13 C] laktat- og [13C] bikarbonatproduksjonshastighetene tjente til å bestemme, i sanntid, hastighetene av laktatdehydrogenase og pyruvat dehydrogenaseproduksjon. Denne metabolske aktiviteten til hyperpolarisert [1-13C]pyruvat ble kvantifisert med NMR-spektroskopi på en modellfri måte ved bruk av produktselektiv metting-eksitasjoner oppkjøpsmetode. 31 P-spektroskopi ble brukt mellom de hyperpolariserte oppkjøpene for å overvåke hjerteenergien og pH. Dette systemet er unikt nyttig for å studere metabolsk aktivitet i det sunne og syke musehjertet.

Introduction

Endringer i hjertemetabolismen er forbundet med en rekke kardiomyopatier og danner ofte grunnlaget for de underliggende patofysiologiske mekanismene1. Imidlertid er det mange hindringer for å studere metabolisme i levende vev, da de fleste biokjemiske analyser krever homogenisering av vev og cellelyse og / eller radioaktiv sporing. Derfor er det et presserende behov for nye verktøy for å undersøke myokardmetabolisme i levende vev. Magnetisk resonans (MR) av hyperpolariserte 13C-merkede substrater muliggjør sanntidsmålinger av metabolisme i levende vev2, uten bruk av ioniserende stråling, ved å øke MR-signal-til-støy-forholdet (SNR) til det merkede stedet (e) med flere størrelsesordener3. Her beskriver vi et eksperimentelt oppsett, en oppkjøpsmetode og en analytisk tilnærming for å studere den raske metabolismen i det isolerte musehjertet og parallelt presentere indikatorer for generell vevsenergi og surhet. Hjertets pH er en verdifull indikator, da syrebasebalansen forstyrres i de tidlige stadier av hjertesykdommer og tilstander som myokardiskemi, maladaptiv hypertrofi og hjertesvikt6.

Hyperpolarisert [1-13 C] laktat og [13 C] bikarbonat produksjon fra hyperpolarisert [1-13C] pyruvat bidrar til å bestemme produksjonshastighetene av laktat dehydrogenase (LDH) og pyruvat dehydrogenase (PDH). De fleste av de tidligere studiene utført ved bruk av hyperpolariserte substrater i det isolerte gnagerhjertet brukte enten komplekse kinetiske modeller for å utlede den enzymatiske aktiviteten til LDH og PDH, eller rapporterte signalintensitetsforholdene til det hyperpolariserte produktet til et substrat uten å beregne de faktiske enzymaktivitetshastighetene 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Her brukte vi produktselektiv saturating-excitations tilnærming 15, som muliggjør overvåking av enzymaktiviteten på en modellfri måte15,16. På denne måten ble de absolutte enzymatiske hastighetene (dvs. antall mol produkt produsert per tidsenhet) bestemt. 31 P-spektroskopi ble brukt til å observere signalene fra uorganisk fosfat (Pi), fosfokreatin (PCr) og adenosintrifosfat (ATP). En multiparametrisk analyse ble brukt til å karakterisere pH-fordelingen i hjertet, som demonstrert av det heterogene kjemiske skiftet i vevets Pi-signal.

Det retrograd perfuserte musehjertet (Langendorffhjertet)17,18,19 er en ex vivo-modell for det intakte bankende hjertet. I denne modellen er hjertets levedyktighet og pH bevart i minst 80 min20, og det har vist potensial for utvinning etter en langvarig iskemisk skade21,22. Likevel kan utilsiktet variabilitet under mikrokirurgi føre til variasjon i vevets levedyktighet på tvers av hjerter. Tidligere studier har rapportert om forverring av dette hjertet over tid19; For eksempel er det observert en reduksjon i kontraktil funksjon på 5%-10% per time18. Adenosintrifosfatsignalet (ATP) har tidligere vist seg å rapportere om myokardial energisk status og levedyktighet23. Her bemerket vi at det perfuserte hjertet noen ganger kan vise utilsiktet variasjon i levedyktighetsnivåer, som demonstrert av ATP-innholdet, til tross for at vi hadde en uavbrutt perfusjons- og oksygenforsyning. Vi demonstrerer her at normalisering av LDH- og PDH-ratene til ATP-innholdet i hjertet reduserer interhjertevariabiliteten i disse hastighetene.

I den følgende protokollen beskriver vi den kirurgiske prosedyren som brukes ved hjertekanylering, isolering og påfølgende perfusjon i NMR-spektrometeret. Det er verdt å merke seg at andre kirurgiske tilnærminger rettet mot å isolere og perfisere musehjertet har blitt beskrevet før24,25.

Metodene som brukes for å skaffe data relatert til enzymatiske hastigheter i det bankende hjertet (ved bruk av 13 C-spektroskopi og hyperpolarisert [1-13C] pyruvat) og hjertets levedyktighet og surhet (ved bruk av 31P NMR-spektroskopi) er også beskrevet. Til slutt forklares de analytiske metodene for å bestemme metabolske enzymaktiviteter og vevets levedyktighet og surhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den felles etiske komiteen (IACUC) ved Det hebraiske universitetet og Hadassah Medical Center godkjente studieprotokollen for dyrevelferd (MD-19-15827-1).

1. Krebs-Henseleit buffer forberedelse

  1. En dag før forsøket, lag en modifisert versjon av Krebs-Henseleit-bufferen (KHB) 26. Oppløs i utgangspunktet 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvat, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 og 1,2 mM KH 2 PO4 i dobbeltdestillert H2O.
  2. Boble denne blandingen med 95% / 5% O 2 / CO 2 i 20 minutter, og tilsett deretter 1,2 mM CaCl2.
  3. Juster bufferens pH til 7,4 med HCl eller NaOH.
  4. På forsøksdagen tilsettes 10 mM glukose og 72 U/l insulin til KHB fremstilt i trinn 1.2.
    MERK: Insulin tilsettes perfusjonsbufferen som beskrevet i arbeidet til Kolwicz et al.26 og i samsvar med tidligere studier som rapporterer at insulin øker kontraktilfunksjonen27 og intensiteten av det hyperpolariserte [13C] bikarbonatsignalet 28.

2. Forberedelse av perfusjonssystem

  1. Hold et reservoar på 200 ml KHB i et vannbad ved 40 °C, og boble med 95%/5%O2/CO2 ved en strømningshastighet på 4 l/min i 1 time før hjerteperfusjon. Hold bufferen kontinuerlig boblende med denne gassblandingen gjennom hele eksperimentet.
    1. Sett først vannbadet på 40 °C. Sett inn KHB-reservoaret. Bruk en peristaltisk pumpe (se materialtabell) og forlengelsesrør av medisinsk kvalitet for å resirkulere KHB mellom bufferreservoaret og 10 mm NMR-røret med en konstant strømningshastighet på 7,5 ml / min.
    2. Koble tre platinaherdede silikonrør (3 mm i.d.) til pumpen (ett innløpsrør og to utløpsrør for KH-bufferen). Sett utstrømnings- og innstrømningsledningene inn i den oppvarmede KH-bufferen. Sett deretter oksygenledningen inn i den oppvarmede KH-bufferen.
    3. Bruk tynne polyetereterketon (PEEK, se materialtabell) linjer for buffer og hyperpolarisert middel for å strømme til og fra NMR-røret i spektrometerets boring.
  2. Sørg for at temperaturen holdes på 37-37,5 °C. Følg trinnene nedenfor.
  3. Pakk innstrømningsledningen (fra bufferbeholderen til NMR-røret) med et varmebånd satt til 42 °C.
  4. Varm opp NMR-røret inne i spektrometeret med en varm luftstrøm som reguleres av spektrometeret.
  5. Bruk en NMR-kompatibel temperatursensor (se Materialfortegnelse) for å måle temperaturen inne i NMR-røret. Temperaturen justeres til 37-37,5 °C.

3. Kalibrering og klargjøring av NMR-spektrometeret for innsamling

  1. På dagen for forsøket, sett inn en 13 C standardprøve som inneholder 1,4-dioksan (materialfortegnelse) i spektrometeret, og still inn og match NMR-sonden for 13C. Deretter får du et spektrum som viser det termiske likevektssignalet til 1,4-dioksan med en nutasjonsvinkel på 90 °.
  2. Bytt nå ut 13C-standardprøven med en 31 P-standardprøve (materialfortegnelse), som inneholder 105 mM ATP i D2O. Juster og match NMR-sonden for 31P.
    MERK: Et spektrum som viser de termiske likevektsfosfatsignalene oppnås med en nutasjonsvinkel på 50 °.
  3. Sett innstrømningsledningen, utstrømningsledningen og temperatursonden inn i et 10 mm NMR-rør, og sett deretter røret inn i magnetboringen. Juster varmebåndet til 42 °C.
  4. Skaff deg et 31 P NMR-spektrum av den sirkulerende KH-bufferen som skal brukes i eksperimentet i 30minutter, med en muttervinkel på 50° og en TR på 1,1 s (1,640 oppkjøp).

4. Dyreforberedelse, kirurgisk prosedyre og perfusjon av hjertet i NMR-røret

  1. Bedøv en mannlig HSD: ICR (CD-1) mus med 3,3% isofluran i romluft (materialfortegnelse) ved 340 ml / min i 5 minutter ved hjelp av et gassanestesisystem (materialfortegnelse) i et induksjonskammer.
  2. Bruk nasalbedøvelse til vedlikehold av generell anestesi med 2,9% isofluran.
    MERK: Det tas hensyn til å minimere smerte og ubehag for dyret.
  3. Fest dyrets lemmer med tape, sørg for en negativ pedal smerterefleks, og injiser deretter 300 IE natriumheparin intraperitonealt.
  4. Fukt musens brystvegg og mage grundig med 70% alkohol for å sikre renslighet og unngå hårforurensning eller hindring under den kirurgiske prosedyren.
  5. På 1 min etter heparininjeksjonen, kutt huden og muskelen i bukhulen med liten saks.
  6. Plasser den lille buede kjevehemostatlåsende myggklemmen mellom xiphoidprosessen og brysthuden for å løfte brystet og avsløre membranen. Punkter og kutt høyre lobe av membranen.
  7. Klipp brystet over midtlinjen, trekk tilbake til sidene, og fjern deretter.
  8. Injiser venstre hjertekammer med 200 IE natriumheparin for å forhindre blodkoagulasjon. Injiser deretter 0,1 ml iskald 0,5 mol/L KCl for å oppnå hjertestans, som tidligere beskrevet25. Hjertestans er viktig for å kunne kanylere hjertet.
  9. Identifiser thymus, og fjern den ved hjelp av saks for å avsløre aorta. Fjern gjenværende ribbe burvev.
  10. Identifiser aortabuen, og bruk buede tang for å plassere en løs knute med en 3-0 silkesutur (materialfortegnelse) rundt den stigende aorta. Injiser 3 ml KHB i venstre ventrikkel for å fjerne blodpropper fra aorta.
  11. Bruk buet tang for å trekke hjertet dårligere for bedre visualisering av den stigende aorta.
  12. Utfør kanylering in situ med et 22 G intravenøst kateter (materialfortegnelse). Påfør cyanoakrylat lim i kanylert region, og utfør deretter dobbel suturbinding. Injiser ytterligere KH-buffer i hjertet, og kontroller at den strømmer gjennom kanyleringsrøret.
  13. Fjern de buede tangene. Koble hjertet fra det omkringliggende innvollet, og perfuser det retrograd med iskald KHB (4 °C) gjennom det intravenøse kateteret.
  14. Koble hjertet til innstrømningsslangen i perfusjonssystemet via det intravenøse kateteret. Ved oppstart av perfusjon med varm buffer (37-37,5 °C) ved 7,5 ml/min, begynner hjertet å slå spontant.
  15. Fest NMR-røret med det bankende hjertet, utstrømningslinjene og temperatursonden, og sett inn i boringen av spektrometeret, og sørg for at hjertet er i sentrum av NMR-sonden.

5. Innhenting av data for hjerteenergi og pH

  1. Oppnå 31P-spektra i ca. 1 time med en vippevinkel på 50 ° og en TR på 1,1 s.

6. DNP spinn polarisering og oppløsning

  1. Klargjør en 28,5 mg formulering av [1-13C]pyruvat. Denne formuleringen består av 11,1 mM til 14,0 mM OX063-radikal i den pene syren.
  2. Klargjør 4 ml oppløsningsmedium. Oppløsningsmediet består av TRIS-fosfatbuffer, som inneholder 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS og2mM HCl. Denne mediumblandingen justeres slik at ved tilsetning av 28,5 mg [1-13C]pyruvsyreformulering til 4 ml av denne bufferen (i oppløsningsfasen), vil pH i den resulterende oppløsning være 7,4.
  3. Utfør spinnpolarisering og rask oppløsning i en oppløsning-DNP (dDNP) spinnpolarisasjonsenhet i henhold til produsentens instruksjoner (materialfortegnelse). Påfør mikrobølgebestråling med en frekvens på 94,110 GHz for polarisering av [1-13C] pyruvsyreformuleringen ved 1,45 K til 1,55 K i ca. 1,5 timer.
  4. Bland raskt 4 ml hyperpolarisert medium fra dDNP-enheten med en godt oksygenert løsning som utfyller det hyperpolariserte oppløsningsmediet for å oppnå en sammensetning som passer godt til perfusjonsmediet.
    MERK: Det siste volumet av mediet perfuserer hjertet under hyperpolariserte injeksjoner med 14 mM hyperpolarisert [1-13C] pyruvat er 26 ml. Den endelige sammensetningen av det injiserte medium (etter blanding) inneholder 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glukose, 1,2 mM CaCl 2og 72 U / l insulin.
  5. Administrer det hyperpolariserte [1-13C] pyruvatholdige mediet til det isolerte hjertet ved hjelp av et kontinuerlig strømningsoppsett29.
    MERK: Dette gjøres for å sikre at hjerteperfusjonen ikke forstyrres på noe tidspunkt under forsøket, og at det hyperpolariserte mediet administreres med en kjent hastighet og i en kjent varighet.

7. Hyperpolarisert 13C spektroskopi

  1. Oppnå hyperpolariserte 13 C-data ved hjelp av produktselektive saturerende-eksitasjonspulser 15 ved å bruke 2,5 ms kardinalsinuspulser (Sinc), som tidligere beskrevet15,16. Selektivt eksitere [1-13 C] laktat og [13C] bikarbonat fortløpende med 6 s intervaller for å oppnå et 12 s intervall for hver metabolitt.
  2. For [1-13 C] laktatdeteksjon, sentrer den selektive Sinc-pulsen ved [1-13 C] pyruvathydratfrekvensen (179,4 ppm), noe som resulterer i signalintensitetsforhold (lac) på 0,113 for C 1-signalene til [1-13 C] pyruvat til [1-13C] laktat.
  3. For [13 C] bikarbonatdeteksjon, sentrer den selektive Sinc-pulsen ved 157,7 ppm, som er 214 Hz nedfelt av [13C] bikarbonatsignalet (161,1 ppm); Dette resulterer i et signalintensitetsforhold (bic) på 0,139 for C 1-signalet fra [1-13C] pyruvat til [13C] bikarbonat.

8. Bestemmelse av vevets våtvekt og volum

  1. På slutten av forsøket, løsne hjertet fra perfusjonssystemet, og tørk det forsiktig med silkepapir. Deretter veier hjertet for å oppnå vevets våtvekt.
  2. Bestem hjertevolumet ved hjelp av en tetthetsfaktor på 1,05 g/cm3, som tidligere bestemt for musehjertet30.

9. Kvantifisering av ATP-innhold

  1. Integrer γ-ATP-signalet for en enkelt anskaffelse av ATP-standardprøven og en 30 minutters oppkjøp (TR på 1,1 s og 1,640 oppkjøp) av det isolerte hjertet.
  2. Kvantifiser ATP-innholdet i hjertet ved å sammenligne integralet av hjertets γ-ATP-signal med standarden (materialfortegnelse), hvor sistnevnte har en kjent konsentrasjon (105 mM), og korriger for antall oppkjøp og avslapningseffekter.

10. Løse hjertets Pi-signal

MERK: For å evaluere vevets pH, er det først nødvendig å deconvolve hjertets Pi-signal fra det totale Pi-signalet (Pit). Dette gjøres ved å utelate signalet til KHB Pi (PiKH) fra signalet til Pit.

  1. I et 31P-spektrum av KHB som viser et enkelt Pi-signal (PiKH, figur 1A), passer PiKH-signalet til en Lorentzian-funksjon ved hjelp av Excel (materialfortegnelse).
  2. Volumet som er synlig for NMR-sonden (Vp, 1.375 ml), inneholder mer KHB når prøverøret ikke inneholder hjertet. For å korrigere for denne fyllingseffekten, beregn det dempede buffersignalet (Pib) ved hjelp av Eq. 1A.
    Equation 1Eq. 1A
    hvor Vh er hjertets volum, som bestemt i trinn 8.
  3. Trekk dette signalet fra Pit i henhold til Eq. 1B for å oppnå Pi-signalet som oppstår utelukkende fra det perfuserte hjertet (Pih, figur 1B).
    Equation 2Ekv. 1B

11. Multiparametrisk pH-analyse

  1. Utfør konverteringen av Pih-signalets kjemiske skiftfordeling til pH med henvisning til det kjemiske skiftet av PCr ved bruk av Eq. 231.
    Equation 3Tilsvarende 2
    hvor Δδ er den kjemiske skiftforskjellen, pKa er 6,72, δ fri base er 5,69, og δ fri syre er 3,27, som tidligere beskrevet31.
  2. Korriger den resulterende pH-fordelingskurven for ikke-lineariteten mellom Pih kjemisk skiftskala og pH-skalaen i henhold til Lutz et al.32. En typisk pH-fordeling som følge av denne beregningen er presentert i figur 1C.
  3. Analyser vevets pH-fordeling med en multiparametrisk tilnærming ved hjelp av syv statistiske parametere etter arbeidet til Lutz et al. 32. Fire av disse parametrene presenteres her da de ser ut til å være de mest beskrivende for vevets pH: 1) global maksimal pH; 2) vektet gjennomsnittlig pH; 3) vektet median pH; og 4) skjevheten i pH-plottet (figur 1C).

12. Beregning av LDH- og PDH-aktiviteter

MERK: Produksjonshastigheten til de hyperpolariserte metabolittene [1-13 C]laktat og [13C]bikarbonat brukes til å beregne henholdsvis LDH- og PDH-aktivitetene. I produktselektiv saturerende-eksitasjonstilnærming15 detekteres bare nylig syntetiserte hyperpolariserte metabolitter ved hver selektiv eksitasjon.

  1. Bruk det hyperpolariserte [1-13C]pyruvatsignalet som referanse for å bestemme det tilsvarende metabolittproduksjonsnivået.
    1. Under perfusjonen med det hyperpolariserte mediet øker [1-13 C]pyruvatkonsentrasjonen i NMR-røret (innvasking), deretter platåer (ved en maksimal konsentrasjon på 14mM), og reduseres deretter (utvasking).
    2. For å identifisere tidspunktene hvor pyruvatkonsentrasjonen nådde et konstant nivå (platå), korriger [1-13C] pyruvatsignalet for signalforfall som følge av T 1-relaksasjon og RF-pulsering ved hjelp av den effektive relaksasjonskonstanten, Teff.
    3. For hver injeksjon, definer Teff basert på dens evne til å korrigere [1-13C] pyruvat-henfallskurven for å vise denne strømningsdynamikken (Eq.3).
      Equation 4Tilsvarende 3
      hvor Equation 5 er [1-13 C] pyruvatsignalet som ble anskaffet under [13C] bikarbonatoppkjøpet. Den gjennomsnittlige Teff i forsøkene beskrevet her ble funnet å være 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 hjerter).
    4. Velg datapunktene der konsentrasjonen er innenfor 10% av det maksimalt korrigerte [1-13C] pyruvatsignalet for videre analyse.
  2. Bruk tilsvarende data for [1-13 C]laktat- og [13C]bikarbonatproduksjon for tidspunktene valgt i trinn 12.1for beregning av metabolittproduksjonshastigheter ved bruk av Eq. 4A og Eq. 4B, forutsatt at SNR for metabolittsignalet er større enn 2 (terskel for analyse). Et typisk eksempel på et slikt utvalg av tidspunkter er vist i figur 2B (uthevet tidsvindu).
  3. Beregn produksjonsratene for hvert av de valgte datapunktene ved hjelp av Eq. 4A og Eq. 4B:
    Equation 17Eq. 4A
    Equation 6Ekv. 4B
    hvor Equation 7 og er produksjonshastighetene til henholdsvis [1-13 C]laktat eller [13 C]bikarbonat ved hvert tidspunkt. Equation 9 og er faktorer som representerer den relative eksitasjonen av henholdsvis [1-13 C]pyruvat og Equation 10 Equation 8 produktene [1-13 C]laktat eller [13C]bikarbonat. Disse faktorene ble tidligere bestemt til å være henholdsvis 0,113 og 0,13929. Vp er volumet som detekteres av NMR-sonden (1.375 ml), TR angir tidsintervallet mellom to påfølgende produktselektive mettende eksitasjoner (12 s for hvert produkt), Equation 11 og er signalene til henholdsvis [1-13 C] laktat og [13 C] bikarbonat, og og Equation 14 er signalene til [1-13 C] pyruvat som ble ervervet under [1-13 C] laktat og Equation 12 Equation 13 [13 C]bikarbonateksitasjoner, henholdsvis. [Pyr] er [1-13 C] pyruvatkonsentrasjonen, som var 14mM under platåfasen.
    1. Bestem hastigheten for hvert punkt og deretter gjennomsnittet per hyperpolarisert injeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

31P-spektrene registrert fra et musehjerte perfusert med KHB og fra bufferen alene er vist i figur 1A. Signalene fra α-, β- og γ-ATP, PCr og Pi ble observert i hjertet. Pi-signalet var sammensatt av to hovedkomponenter: i det høyere feltet (venstre side av signalet) skyldtes Pi-signalet hovedsakelig KHB ved en pH på 7,4; i det nedre feltet (høyre side av signalet) var Pi-signalet bredere og mindre homogent på grunn av det surere miljøet. Sistnevnte mønster oppstår fra hjertevevet. Pi-signalet i hjertevevet ekstraheres ved å subtrahere Pi-signalet til KHB (figur 1B) og konverteres deretter fra ppm-skalaen til pH-skalaen (figur 1C). pH undersøkes ved hjelp av en multiparametrisk analyse av vevets Pi-signal ved å beregne vektet gjennomsnitt, vektet median, globalt maksimum og skjevhet (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Typiske 31 P-spektra, skillet mellom Pi-signalet til KHB og hjertet, konvertering fra kjemisk skifte til pH-akser og de statistiske parametrene for pH-fordelingen. (A) Det øvre panelet viser et typisk 31P NMR-spektrum oppnådd fra et musehjerte perfusjonert med KHB i spektrometeret, mens det nedre panelet viser et spektrum hentet fra KHB alene. Det tankestrekmerkede spektralområdet vises forstørret i panel B. Forkortelser: Pi = uorganisk fosfat; PCr = fosfokreatin; ATP = adenosintrifosfat; ADP = adenosindifosfat. (B) Det opprinnelige spekteret vises i svart (Pit); den stiplede kurven viser bare Pi-signalet fra bufferen (Pib). Sistnevnte ble oppnådd ved å montere en Lorentzian-linjeform med senteret ved den tilsvarende KHB-komponenten i Pit-signalet og justere for mengden KHB i sonden etter hjerteinnsettingen (i henhold til Eq. 1A). Pi-signalet som tilskrives hjertet (Pih) vises i oransje, og dette oppnås ved å trekke Pib-signalet fra Pit-signalet (i henhold til Eq. 1B). (C) Konvertering av Pih-signalets kjemiske skiftfordeling vist i (B) til en pH-fordeling og multiparametrisk pH-analyse. Ikke-lineariteten mellom kjemisk forskyvning og pH-skalaen ble korrigert som tidligere beskrevet32. Resultatene av den multiparametriske pH-analysen er markert med de vertikale linjene. For denne spesifikke fordelingen er verdiene til de statistiske parametrene oppgitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Med den hyperpolariserte produktselektive metter-eksitasjonsoppkjøpstilnærmingen15, er det mulig å utføre absolutt kvantifisering av LDH- og PDH-enzymaktivitetene. Figur 2 oppsummerer anskaffelses- og prosesseringstrinnene som kreves for denne bestemmelsen. Tabell 1 viser ATP-innholdet og LDH- og PDH-ratene i fem forskjellige hjerter. Normalisering av LDH- og PDH-aktivitetene til ATP-innholdet i hvert hjerte reduserte variabiliteten i LDH- og PDH-målingene på tvers av gruppen, som det fremgår av enzymaktivitetskolonnene i tabell 1, som uttrykkes i enheter av nmol/s/μmol ATP.

Figure 2
Figur 2: Hyperpolarisert 13 C MRS prosessering og analyse av [1-13C] pyruvat metabolisme. (A) Representant 13 C NMR-spektra ervervet med produktets selektive mettende eksitasjonstilnærming under en injeksjon av 14 mM hyperpolarisert [1-13C]pyruvat i det perfuserte musehjertet. Signaltildeling: 1 = [1-13 C]laktat (183,2ppm); 2 = [1-13C] pyruvat (171 ppm); 3 = [13C] bikarbonat (161,1 ppm); * = urenheter som oppstår fra [1-13C]pyruvatformuleringen33. (B) Tidsforløpet for de hyperpolariserte signalintensitetene vist i A. De integrerte intensitetene til [1-13C]pyruvat (grå) ble justert for T1-henfallog RF-pulsering med en Teff-tidskonstant på 32 s (svart), og dette ga forventet strømningsdynamikk for substratet (innvasking, platå, utvasking). Videre analyse ble utført på datapunktene innenfor tidsvinduet der det justerte [1-13 C]pyruvatsignalet viste en konstant og maksimal [1-13C]pyruvatkonsentrasjon i NMR-røret (uthevet i lyseblått). Produksjonsratene for LDH og PDH (Equation 18 og ) for de valgte tidspunktene ble beregnet i henhold til Eq. 4A og Eq. 4B og Equation 19deretter gjennomsnittet. Gjennomsnittsverdiene for denne injeksjonen (Equation 1 og Equation 1 ) er angitt i enheter på nmol/s. For visningsformål ble det justerte [1-13 C]pyruvatet, [1-13 C]laktatet og [13 C]bikarbonatet multiplisert med henholdsvis 0,143, 10 og 80 i forhold til [1-13C]pyruvatsignalet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hjerte nr. ATP (μmol) LDH-frekvens (nmol/s) PDH-rate (nmol/s) LDH-frekvens (nmol/s/μmol ATP) PDH-rate (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Gjennomsnitt (SD) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % gjennomsnitt 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabell 1: ATP-innhold og LDH- og PDH-rater i fem hjerter. Forkortelser: SD = Standardavvik; SD % Gjennomsnitt = prosentandelen av standardavviket fra gjennomsnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi demonstrerer et eksperimentelt oppsett som er designet for å undersøke hyperpolarisert [1-13C] pyruvat metabolisme, vevsenergi og pH i en isolert musehjertemodell.

De kritiske trinnene i protokollen er som følger: 1) sikre at bufferens pH er 7,4; 2) sikre at alle komponentene i bufferen er inkludert; 3) unngå blodpropp i hjertekarene ved heparininjeksjoner; 4) unngå iskemisk skade på hjertet ved å redusere metabolsk aktivitet (KCl injeksjon og iskald buffer); 5) unngå innføring av luftbobler i hjertet på noe punkt i prosedyren; 6) validere vellykket kanylering av aorta etter fargen på vevet, som endres fra mørk rød til lys rosa; 7) sørge for at perfusjonen er kontinuerlig når hjertet er flyttet til varm buffer; 8) nøye overvåke temperaturen inne i NMR-røret i spektrometeret ved siden av hjertet og holde det ved 37 °C; 9) kontrollerer magnetfelthomogeniteten gjennom hele målingen; og 10) ved hjelp av nøyaktig og oppdatert kalibrering for RF-pulser.

Modifikasjoner og feilsøking av teknikken
Vi noterer oss et par modifikasjoner som ble gjort i denne studien: 1) initiering av perfusjon med iskald KHB videre til kirurgi ble brukt for å beskytte hjertet; og 2) valideringen av bufferens pH ble utført hele tiden for å sikre at denne parameteren var under kontroll og ikke var en kilde til variasjon i resultatene. Dette ble gjort i de ulike trinnene for forberedelse og eksperimentering ved hjelp av en pH-måler, pH-indikatorstrimler og Pi-signalet på 31P-spekteret.

Kilder til variabilitet og hvordan du korrigerer for dem
Musehjertet ble valgt for å passe inn i et 10 mm NMR-rør. Dette lille hjertet gir imidlertid lave signaler, og den delikate kirurgiske prosedyren for å isolere og perfusere hjertet er utfordrende. Samlet sett fører dette til variabel levedyktighet av vev og metabolsk aktivitet. For å ta hensyn til denne variabiliteten normaliserte vi metabolske hastigheter av LDH og PDH til ATP-innholdet (dvs. mol / s / ATP). En lignende bruk av ATP-innholdet som referanse ble tidligere rapportert i xenograft brysttumorskiver29. Denne typen normalisering er gunstig fordi den muliggjør sammenligning med resultatene fra andre forskere og med andre forhold. I tillegg, ved å bruke en konverteringsfaktor fra ATP-mengden til vevsmassen, kan man utlede den enzymatiske aktiviteten per vevsvekt (for vevet der metabolisme oppstår).

I tillegg til variasjonen mellom forskjellige isolerte hjertepreparater (dvs. fra forskjellige dyr), viste vevet Pi (Pih) kjemisk skift en ikke-homogen fordeling i denne studien. Lutz et al.32 viste en lignende ikke-homogen fordeling i xenografttumorer, og denne fordelingen ble analysert ved hjelp av en multiparametrisk tilnærming. I dette arbeidet ble denne metodikken implementert i det perfuserte musehjertet. Vi bemerker at det er sannsynlig at Pih-signalet rapporterer hovedsakelig på den intracellulære pH, som angitt tidligere16.

Usikkerhet
En underliggende antagelse i kvantifiseringen av og er at den hyperpolariserte [1-13C]pyruvatløsningen fyller hele volumet oppdaget av Equation 18 NMR-sonden (Vp, Eq. 4A og Equation 19 Eq. 4B). Den hyperpolariserte [1-13C] pyruvatoppløsningen strømmer gjennom hjertets kranspulsårer for å fylle de ekstracellulære og intracellulære rommene. Derfor antas hjertevolumet å være fylt med den hyperpolariserte løsningen i samme grad som resten av Vp.

Ved å bruke den hyperpolariserte produktselektive meturerende-eksitasjonstilnærmingen15,29, kan den enzymatiske aktiviteten kvantifiseres uavhengig av eventuelle variasjoner iT1 av metabolittene og reversibiliteten av den enzymatiske reaksjonen. Denne bestemmelsen er robust og immun mot variasjoner i T1 og eksitasjonsprofiler og er sannsynligvis mer reproduserbar på tvers av laboratorier sammenlignet med areal under kurveanalysene, som er avhengig av de spesifikke oppkjøpsbetingelsene og oppsettet i hvert laboratorium.

Undersøkelse [1-13C] pyruvat metabolisme, som er i krysset mellom aerob og anaerob metabolisme, er av stor verdi for å studere hypoksi, iskemi, reperfusjonsskade, sult og endring i hjertemetabolismen, slik som i diabetisk kardiomyopati. Hyperpolariserte 13C-merkede pyruvatanaloger har blitt testet klinisk 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, og derfor er resultatene av slike studier sannsynligvis translasjonelle. Viktigst av alt, vår tilnærming muliggjør kvantifisering av enzymaktivitet i cellen i hele organet.

Det isolerte gnagerhjertepreparatet og prosedyrene og metodene som er involvert i denne undersøkelsen, vil bidra til å fremme forståelsen av effekten av en rekke stressorer på hjertefunksjon, energi og metabolisme, da de målte parametrene i denne modellen tilskrives utelukkende hjertet. I motsetning til rottehjertet, er musehjertet egnet for å studere transgene modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det er ingen avsløringer.

Acknowledgments

Dette prosjektet mottok finansiering fra Israel Science Foundation under tilskuddsavtale nr. 1379/18; Jabotinsky-stipendiet fra det israelske departementet for vitenskap og teknologi for anvendt og ingeniørvitenskap for direkte doktorgradsstudenter nr. 3-15892 for DS; og EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under tilskuddsavtale nr. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Biologi Metabolisme metabolsk bildebehandling avbildningsmiddel magnetisk resonansspektroskopi laktatdehydrogenase pyruvat dehydrogenase [1-13C] pyruvat pH uorganisk fosfat
Undersøkelse av hjertemetabolisme i isolert perfusert musehjerte med hyperpolarisert [1-13 C]pyruvat og <sup>13</sup>C/<sup>31</sup>P NMR-spektroskopi <sup></sup>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain,… More

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter