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Biology

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau zur Verabreichung von hyperpolarisierten 13C-markierten Metaboliten im kontinuierlichen Perfusionsmodus an ein isoliertes perfundiertes Mausherz. Ein spezieller 13-C-NMR-Erfassungsansatz ermöglichte die Quantifizierung der metabolischen Enzymaktivität in Echtzeit, und eine multiparametrische 31-P-NMR-Analyseermöglichte die Bestimmung des ATP-Gehalts und des pH-Werts des Gewebes.

Abstract

Der Stoffwechsel ist die Grundlage wichtiger Prozesse im zellulären Leben. Die Charakterisierung der Funktionsweise von Stoffwechselnetzwerken in lebenden Geweben liefert entscheidende Informationen für das Verständnis der Mechanismen von Krankheiten und die Entwicklung von Behandlungen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren und Methoden zur Untersuchung der zellinternen Stoffwechselaktivität in einem retrograden perfundierten Mausherz in Echtzeit. Das Herz wurde in situ isoliert, in Verbindung mit einem Herzstillstand, um die Myokardischämie zu minimieren, und wurde in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR) perfundiert. Während des Spektrometers und unter kontinuierlicher Perfusion wurde dem Herzen hyperpolarisiertes [1-13 C]pyruvat verabreicht, und die anschließenden hyperpolarisierten [1-13 C]Laktat- und [13C]Bicarbonat-Produktionsraten dienten dazu, in Echtzeit die Raten der Laktatdehydrogenase- und Pyruvatdehydrogenase-Produktion zu bestimmen. Diese metabolische Aktivität von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat wurde mit NMR-Spektroskopie modellfrei unter Verwendung des produktselektiven Ansatzes zur Erfassung von Sättigungsanregungen quantifiziert. 31 Die P-Spektroskopie wurde zwischen den hyperpolarisierten Aufnahmen angewendet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu überwachen. Dieses System ist einzigartig nützlich für die Untersuchung der Stoffwechselaktivität im gesunden und kranken Mausherzen.

Introduction

Veränderungen des Herzstoffwechsels sind mit einer Vielzahl von Kardiomyopathien assoziiert und bilden häufig die Grundlage für die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen1. Es gibt jedoch zahlreiche Hindernisse bei der Untersuchung des Stoffwechsels in lebenden Geweben, da die meisten biochemischen Assays die Homogenisierung des Gewebes und die Zelllyse und/oder die radioaktive Rückverfolgung erfordern. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Werkzeugen zur Untersuchung des Myokardstoffwechsels in lebenden Geweben. Die Magnetresonanz (MR) von hyperpolarisierten 13C-markierten Substraten ermöglicht Echtzeitmessungen des Stoffwechsels in lebenden Geweben2 ohne den Einsatz ionisierender Strahlung, indem das MR-Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der markierten Stelle(n) um mehrere Größenordnungenerhöht wird 3. Hier beschreiben wir einen Versuchsaufbau, einen Erfassungsansatz und einen analytischen Ansatz zur Untersuchung des schnellen Stoffwechsels im isolierten Mausherz und präsentieren parallel dazu Indikatoren für die allgemeine Gewebeenergetik und den Säuregehalt. Der pH-Wert des Herzens ist ein wertvoller Indikator, da das Säure-Basen-Gleichgewicht in den frühen Stadien von Herzerkrankungen und Zuständen wie Myokardischämie, maladaptiver Hypertrophie und Herzinsuffizienz gestört ist6.

Die hyperpolarisierte Produktion von [1-13 C]lactat und [13 C]Bicarbonat aus hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat hilft bei der Bestimmung der Produktionsraten von Laktatdehydrogenase (LDH) und Pyruvatdehydrogenase (PDH). Die meisten der früheren Studien, die unter Verwendung hyperpolarisierter Substrate im isolierten Nagetierherz durchgeführt wurden, verwendeten entweder komplexe kinetische Modelle, um die enzymatische Aktivität von LDH und PDH abzuleiten, oder berichteten über die Signalintensitätsverhältnisse des hyperpolarisierten Produkts zu einem Substrat, ohne die tatsächlichen Enzymaktivitätsraten zu berechnen 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Hier haben wir den produktselektiven Sättigungsanregungsansatz 15 verwendet, der es ermöglicht, die Enzymaktivität modellfrei zu überwachen15,16. Auf diese Weise wurden die absoluten enzymatischen Raten (d.h. die Anzahl der Mol des pro Zeiteinheit produzierten Produkts) bestimmt. 31 Die P-Spektroskopie wurde verwendet, um die Signale von anorganischem Phosphat (Pi), Phosphokreatin (PCr) und Adenosintriphosphat (ATP) zu beobachten. Eine multiparametrische Analyse wurde verwendet, um die pH-Verteilung des Herzens zu charakterisieren, wie die heterogene chemische Verschiebung des Pi-Signals des Gewebes zeigt.

Das retrograd durchblutete Mausherz (Langendorff-Herz)17,18,19 ist ein Ex-vivo-Modell für das intakt schlagende Herz. In diesem Modell bleiben die Lebensfähigkeit des Herzens und der pH-Wert für mindestens 80 Minutenerhalten 20 und es hat sich ein Erholungspotenzial nach einer längeren ischämischen Verletzung gezeigt21,22. Nichtsdestotrotz kann eine unbeabsichtigte Variabilität während der Mikrochirurgie zu einer Variabilität der Gewebelebensfähigkeit zwischen den Herzen führen. Frühere Studien haben über die Verschlechterung dieses Herzens im Laufe der Zeit berichtet19; Zum Beispiel wurde eine Verringerung der kontraktilen Funktion von 5%-10% pro Stunde beobachtet18. Es wurde bereits gezeigt, dass das Adenosintriphosphat (ATP)-Signal über den energetischen Status und die Lebensfähigkeit des Myokards berichtet23. Hier stellten wir fest, dass das perfundierte Herz gelegentlich eine unbeabsichtigte Variabilität der Lebensfähigkeit aufweisen kann, wie der ATP-Gehalt zeigt, obwohl wir eine ununterbrochene Perfusion und Sauerstoffversorgung hatten. Wir zeigen hier, dass die Normalisierung der LDH- und PDH-Raten auf den ATP-Gehalt des Herzens die Inter-Herz-Variabilität in diesen Raten reduziert.

Im folgenden Protokoll beschreiben wir den chirurgischen Eingriff zur Herzkanülierung, Isolierung und anschließenden Perfusion im NMR-Spektrometer. Bemerkenswert ist, dass andere chirurgische Ansätze, die darauf abzielen, das Mausherz zu isolieren und zu perfundieren, vor24,25 beschrieben wurden.

Die Methoden zur Erfassung von Daten in Bezug auf die enzymatischen Raten im schlagenden Herzen (unter Verwendung von 13 C-Spektroskopie und hyperpolarisiertem [1-13C] Pyruvat) sowie die Lebensfähigkeit und den Säuregehalt des Herzens (unter Verwendung der 31P-NMR-Spektroskopie) werden ebenfalls beschrieben. Abschließend werden die analytischen Methoden zur Bestimmung der metabolischen Enzymaktivitäten sowie der Lebensfähigkeit und des Säuregehalts des Gewebes erläutert.

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Protocol

Die gemeinsame Ethikkommission (IACUC) der Hebräischen Universität und des Hadassah Medical Center hat das Studienprotokoll für den Tierschutz (MD-19-15827-1) genehmigt.

1. Krebs-Henseleit-Pufferpräparation

  1. Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment eine modifizierte Version des Krebs-Henseleit-Puffers (KHB) vor26. Zunächst werden 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM Pyruvat, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 und 1,2 mM KH2 PO4 in doppelt destilliertemH2Ogelöst.
  2. Diese Mischung wird 20 Minuten lang mit 95%/5% O2/CO2 aufgeblasen und dann 1,2 mM CaCl2 zugegeben.
  3. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers mit HCl oder NaOH auf 7,4 ein.
  4. Am Tag des Versuchs werden 10 mM Glucose und 72 U/L Insulin zu dem in Schritt 1.2 hergestellten KHB gegeben.
    HINWEIS: Insulin wird dem Perfusionspuffer zugesetzt, wie in der Arbeit von Kolwicz et al.26 beschrieben und in Übereinstimmung mit früheren Studien, die berichten, dass Insulin die kontraktile Funktion27 und die Intensität des hyperpolarisierten [13C]Bicarbonat-Signals 28 erhöht.

2. Vorbereitung des Perfusionssystems

  1. Halten Sie ein Reservoir von 200 ml KHB in einem Wasserbad bei 40 °C und blasen Sie es mit 95%/5% O 2/CO2 bei einer Durchflussrate von 4 l / min für 1 h vor der Herzperfusion. Lassen Sie den Puffer während des gesamten Experiments kontinuierlich mit diesem Gasgemisch sprudeln.
    1. Stellen Sie zunächst das Wasserbad auf 40 °C ein. Setzen Sie den KHB-Vorratsbehälter ein. Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe (siehe Materialtabelle) und Verlängerungsschläuche in medizinischer Qualität, um die KHB zwischen dem Pufferreservoir und dem 10-mm-NMR-Röhrchen mit einer konstanten Durchflussrate von 7,5 ml/min umzuwälzen.
    2. Schließen Sie drei platingehärtete Silikonschläuche (3 mm Innendurchmesser) an die Pumpe an (ein Zulaufschlauch und zwei Auslaufrohre für den KH-Puffer). Führen Sie die Vor- und Zulaufleitungen in den beheizten KH-Puffer ein. Führen Sie dann die Sauerstoffleitung in den erhitzten KH-Puffer ein.
    3. Verwenden Sie dünne Polyetheretherketonleitungen (PEEK, siehe Materialtabelle), damit der Puffer und das hyperpolarisierte Mittel in der Bohrung des Spektrometers zum und vom NMR-Röhrchen fließen können.
  2. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur bei 37-37,5 °C gehalten wird. Führen Sie die folgenden Schritte aus.
  3. Wickeln Sie die Zulaufleitung (vom Pufferbehälter zum NMR-Röhrchen) mit einem auf 42 °C eingestellten Heizband ein.
  4. Erhitzen Sie die NMR-Röhre im Spektrometer mit einem warmen Luftstrom, der vom Spektrometer reguliert wird.
  5. Verwenden Sie einen NMR-kompatiblen Temperatursensor (siehe Materialtabelle), um die Temperatur im NMR-Röhrchen zu messen. Die Temperatur ist auf 37-37,5 °C eingestellt.

3. Kalibrierung und Vorbereitung des NMR-Spektrometers für die Aufnahme

  1. Führen Sie am Tag des Experiments eine 13-C-Standardprobe, die 1,4-Dioxan enthält (Materialtabelle), in das Spektrometer ein und stimmen Sie die NMR-Sonde auf 13C ab. Dann erhält man ein Spektrum, das das thermische Gleichgewichtssignal von 1,4-Dioxan mit einem Nutationswinkel von 90° zeigt.
  2. Tauschen Sie nun die 13 C-Standardprobe gegen eine 31P-Standardprobe (Materialtabelle) aus, die 105mM ATP in D2O enthält.
    ANMERKUNG: Ein Spektrum, das die Signale des thermischen Gleichgewichtsphosphats anzeigt, wird mit einem Nutationswinkel von 50° erhalten.
  3. Führen Sie die Zuflussleitung, die Abflussleitung und den Temperaturfühler in ein 10-mm-NMR-Röhrchen ein und führen Sie das Röhrchen dann in die Magnetbohrung ein. Stellen Sie das Heizband auf 42 °C ein.
  4. Erfassen Sie ein 31P-NMR-Spektrum des zirkulierenden KH-Puffers, der in diesem Experiment für 30 Minuten verwendet werden soll, mit einem Nutationswinkel von 50° und einem TR von 1,1 s (1.640 Aufnahmen).

4. Tiervorbereitung, chirurgischer Eingriff und Perfusion des Herzens in der NMR-Röhre

  1. Anästhesie einer männlichen HSD:ICR (CD-1)-Maus mit 3,3% Isofluran in der Raumluft (Materialtabelle) bei 340 ml/min für 5 min unter Verwendung eines Gasanästhesiesystems (Materialtabelle) in einer Induktionskammer.
  2. Verwenden Sie eine Nasenanästhesie zur Aufrechterhaltung der Vollnarkose mit 2,9% Isofluran.
    HINWEIS: Es wird darauf geachtet, Schmerzen und Beschwerden für das Tier zu minimieren.
  3. Sichern Sie die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband, sorgen Sie für einen negativen Pedalschmerzreflex und injizieren Sie dann 300 IE Natriumheparin intraperitoneal.
  4. Befeuchten Sie die Brustwand und den Bauch der Maus gründlich mit 70% Alkohol, um Sauberkeit zu gewährleisten und Haarkontaminationen oder Verstopfungen während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden.
  5. Schneiden Sie 1 Minute nach der Heparin-Injektion die Haut und den Muskel der Bauchhöhle mit einer kleinen Schere ab.
  6. Platzieren Sie die kleine Mückenklemme mit gekrümmtem Kiefer, die den Hämostat verriegelt, zwischen dem Xiphoid-Prozess und der Brusthaut, um die Brust anzuheben und das Zwerchfell freizulegen. Punktieren und schneiden Sie den rechten Lappen des Zwerchfells.
  7. Schneiden Sie die Brust über die Mittellinie, ziehen Sie sich zu den Seiten zurück und entfernen Sie sie dann.
  8. Injizieren Sie den linken Ventrikel des Herzens mit 200 IE Natriumheparin, um die Blutgerinnung zu verhindern. Injizieren Sie dann 0,1 ml eiskalte 0,5 mol/l KCl, um einen Herzstillstand zu erreichen, wie zuvor beschrieben25. Ein Herzstillstand ist wichtig, um das Herz kanülieren zu können.
  9. Identifizieren Sie die Thymusdrüse und entfernen Sie sie mit einer Schere, um die Aorta freizulegen. Entfernen Sie restliches Brustkorbgewebe.
  10. Identifizieren Sie den Aortenbogen und platzieren Sie mit einer gebogenen Pinzette einen losen Knoten mit einer 3-0-Seidennaht (Materialtabelle) um die aufsteigende Aorta. Injizieren Sie 3 ml KHB in den linken Ventrikel, um Blutgerinnsel aus der Aorta zu entfernen.
  11. Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um das Herz nach unten zurückzuziehen, um die aufsteigende Aorta besser sichtbar zu machen.
  12. Führen Sie die Kanülierung in situ mit einem intravenösen 22-G-Katheter durch (Materialtabelle). Tragen Sie Cyanacrylatkleber in den kanülierten Bereich auf und führen Sie dann eine doppelte Nahtbindung durch. Injizieren Sie zusätzlichen KH-Puffer in das Herz und überprüfen Sie, ob er durch das Kanülenrohr fließt.
  13. Entfernen Sie die gebogene Pinzette. Trennen Sie das Herz von den umgebenden Eingeweiden und perfundieren Sie es retrograd mit eiskaltem KHB (4 °C) durch den intravenösen Katheter.
  14. Verbinden Sie das Herz über den intravenösen Katheter mit der Zuflussleitung des Perfusionssystems. Zu Beginn der Perfusion mit warmem Puffer (37-37,5 °C) bei 7,5 ml/min beginnt das Herz spontan zu schlagen.
  15. Befestigen Sie das NMR-Röhrchen mit dem schlagenden Herzen, den Abflussleitungen und der Temperatursonde und führen Sie es in die Bohrung des Spektrometers ein, wobei Sie sicherstellen, dass sich das Herz in der Mitte der NMR-Sonde befindet.

5. Erfassung von Daten für Herzenergetik und pH-Wert

  1. Erfassen Sie 31P-Spektren für ca. 1 h mit einem Flip-Winkel von 50 ° und einem TR von 1,1 s.

6. DNP-Spinpolarisation und -auflösung

  1. Bereiten Sie eine 28,5-mg-Formulierung von [1-13C]pyruvat vor. Diese Formulierung besteht aus 11,1 mM bis 14,0 mM OX063 Radikal in der reinen Säure.
  2. Bereiten Sie 4 ml Auflösungsmedium vor. Das Auflösungsmedium besteht aus TRIS-Phosphatpuffer, der 11,2 mMNaH2PO4, 38,8 mMNa2HPO4,33 mM TRIS und 2 mM HCl enthält. Diese Mediumzusammensetzung wird so eingestellt, dass bei Zugabe von 28,5 mg [1-13C]Brenztraubensäureformulierung zu 4 ml dieses Puffers (in der Auflösungsphase) der pH-Wert der resultierenden Lösung 7,4 beträgt.
  3. Führen Sie die Spinpolarisation und die schnelle Auflösung in einem Auflösungs-DNP (dDNP)-Spinpolarisationsgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) durch. Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz von 94,110 GHz für die Polarisation der [1-13C]Brenztraubensäureformulierung bei 1,45 K bis 1,55 K für etwa 1,5 h.
  4. Mischen Sie schnell die 4 ml des hyperpolarisierten Mediums aus dem dDNP-Gerät mit einer gut sauerstoffhaltigen Lösung, die das hyperpolarisierte Auflösungsmedium ergänzt, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die dem Perfusionsmedium sehr nahe kommt.
    HINWEIS: Das Endvolumen des Mediums, das das Herz während der hyperpolarisierten Injektionen mit 14 mM hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat durchblutet, beträgt 26 ml. Die endgültige Zusammensetzung des injizierten Mediums (nach dem Mischen) enthält 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM Glucose,1,2mM CaCl2 und 72 U/L Insulin.
  5. Verabreichen Sie das hyperpolarisierte [1-13C]pyruvat-haltige Medium an das isolierte Herz unter Verwendung eines kontinuierlichen Flussaufbaus29.
    HINWEIS: Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Herzperfusion zu keinem Zeitpunkt während des Experiments gestört wird und dass das hyperpolarisierte Medium mit einer bekannten Rate und für eine bekannte Dauer verabreicht wird.

7. Hyperpolarisierte 13-C-Spektroskopie

  1. Erfassen Sie hyperpolarisierte 13C-Daten unter Verwendung produktselektiver Sättigungsanregungsimpulse 15 durch Anlegen von 2,5 ms Kardinalsinus (Sinc)-Impulsen, wie zuvor beschrieben15,16. [1-13C]lactat und [13C]Bicarbonat werden selektiv nacheinander in 6-s-Intervallen angeregt, um ein 12-s-Intervall für jeden Metaboliten zu erhalten.
  2. Für die Detektion von [1-13C]Laktat zentrieren Sie den selektiven Sinc-Impuls auf die [1-13 C]Pyruvathydratfrequenz (179,4 ppm), was zu einem Signalintensitätsverhältnis (lac) von 0,113 für dieC1-Signale von [1-13 C]pyruvat zu [1-13C]lactat führt.
  3. Zentrieren Sie für die Detektion von [13 C]bicarbonat den selektiven Sinc-Impuls bei 157,7 ppm, was 214 Hz Downfield des [13C]Bicarbonat-Signals (161,1 ppm) entspricht. Daraus ergibt sich ein Signalintensitätsverhältnis (BIC) von 0,139 für dasC1-Signalvon [1-13 C]pyruvat zu [13C]bicarbonat.

8. Bestimmung des Gewebefeuchtgewichts und -volumens

  1. Lösen Sie das Herz am Ende des Experiments vom Perfusionssystem und trocknen Sie es vorsichtig mit Seidenpapier ab. Wiegen Sie anschließend das Herz, um das nasse Gewicht des Gewebes zu erhalten.
  2. Bestimmen Sie das Volumen des Herzens mit einem Dichtefaktor von 1,05 g/cm3, wie zuvor für das Mausherz30 bestimmt.

9. Quantifizierung des ATP-Gehalts

  1. Integrieren Sie das γ-ATP-Signal einer einzelnen Erfassung der ATP-Standardprobe und einer 30-minütigen Erfassung (TR von 1,1 s und 1.640 Erfassungen) des isolierten Herzens.
  2. Quantifizieren Sie den ATP-Gehalt des Herzens, indem Sie das Integral des γ-ATP-Signals des Herzens mit dem des Standards (Materialtabelle) vergleichen, bei dem letzterer eine bekannte Konzentration (105 mM) aufweist, und korrigieren Sie die Anzahl der Akquisitionen und Entspannungseffekte.

10. Auflösung des Pi-Signals des Herzens

HINWEIS: Um den pH-Wert des Gewebes zu bewerten, ist es zunächst notwendig, das Pi-Signal des Herzens von dem des gesamten Pi-Signals (Pit) zu trennen. Dies geschieht, indem das Signal des KHB Pi (PiKH) von dem des Pi t weggelassenwird.

  1. In einem 31P-Spektrum von KHB, das ein einzelnes Pi-Signal zeigt (PiKH, Abbildung 1A), passen Sie das PiKH-Signal mit Excel (Materialtabelle) an eine Lorentzsche Funktion an.
  2. Das für die NMR-Sonde sichtbare Volumen(VP, 1,375 ml) enthält mehr KHB, wenn das Probenröhrchen das Herz nicht enthält. Um diesen Fülleffekt zu korrigieren, berechnen Sie das gedämpfte Puffersignal (Pib) mit Gl. 1A.
    Equation 1Gl. 1A
    wobei Vh das Volumen des Herzens ist, wie in Schritt 8 bestimmt.
  3. Subtrahieren Sie dieses Signal vom Pit gemäß Gl. 1B, um das Pi-Signal zu erhalten, das ausschließlich aus dem perfundierten Herzen stammt (Pih, Abbildung 1B).
    Equation 2Gl. 1B

11. Multiparametrische pH-Analyse

  1. Führen Sie die Umwandlung der chemischen Verschiebungsverteilung des Pih-Signals in den pH-Wert in Bezug auf die chemische Verschiebung von PCr unter Verwendung von Gl. 231 durch.
    Equation 3Gl. 2
    wobei Δδ die chemische Verschiebungsdifferenz ist, pKa 6,72, δ freie Base 5,69 und δ freie Säure 3,27 ist, wie zuvor beschrieben31.
  2. Korrigieren Sie die resultierende pH-Verteilungskurve um die Nichtlinearität zwischen der Pih-Metrik und der pH-Skala gemäß Lutz et al.32. Eine typische pH-Verteilung, die sich aus dieser Berechnung ergibt, ist in Abbildung 1C dargestellt.
  3. Analysieren Sie die pH-Verteilung des Gewebes mit einem multiparametrischen Ansatz unter Verwendung von sieben statistischen Parametern in Anlehnung an die Arbeit von Lutz et al. 32. Vier dieser Parameter werden hier vorgestellt, da sie den pH-Wert des Gewebes am besten zu beschreiben scheinen: 1) globaler maximaler pH-Wert; 2) gewichteter mittlerer pH-Wert; 3) gewichteter medianer pH-Wert; und 4) Schiefe des pH-Diagramms (Abbildung 1C).

12. Berechnung der LDH- und PDH-Aktivitäten

ANMERKUNG: Die Produktionsraten der hyperpolarisierten Metaboliten [1-13 C]lactat und [13C]bicarbonat werden zur Berechnung der LDH- bzw. PDH-Aktivitäten verwendet. Bei dem produktselektiven Sättigungsanregungsansatz15 werden bei jeder selektiven Anregung nur neu synthetisierte hyperpolarisierte Metaboliten nachgewiesen.

  1. Verwenden Sie das hyperpolarisierte [1-13C]pyruvatsignal als Referenz, um das entsprechende Metabolitenproduktionsniveau zu bestimmen.
    1. Während der Perfusion mit dem hyperpolarisierten Medium steigt die [1-13 C]pyruvatkonzentration im NMR-Röhrchen an (Wash-in), erreicht dann Plateaus (bei einer maximalen Konzentration von 14mM) und nimmt dann ab (Wash-out).
    2. Um die Zeitpunkte zu identifizieren, an denen die Pyruvatkonzentration ein konstantes Niveau (Plateau) erreicht hat, korrigieren Sie das [1-13C]pyruvatsignal für den Signalabfall infolge derT1-Relaxation und der HF-Pulsation unter Verwendung der effektiven Relaxationskonstante Teff.
    3. Definieren Sie für jede Injektion denT-eff basierend auf seiner Fähigkeit, die [1-13C]Pyruvat-Zerfallskurve zu korrigieren, um diese Strömungsdynamik zu zeigen (Gl.3).
      Equation 4Gl. 3
      wobei Equation 5 das [1-13 C]pyruvatsignal ist, das während des [13C]bicarbonat-Erwerbs erfasst wurde. Der durchschnittlicheT eff in den hier beschriebenen Experimenten betrug 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 Herzen).
    4. Wählen Sie die Datenpunkte aus, an denen die Konzentration innerhalb von 10% des maximal korrigierten [1-13C]Pyruvatsignals liegt, um sie weiter zu analysieren.
  2. Für die Berechnung der Metabolitenproduktionsraten unter Verwendung von Gl. 4A und Gl. 4B sind die entsprechenden Daten der [1-13 C]Laktat- und [13C]Bicarbonatproduktion für die in Schritt 12.1ausgewählten Zeitpunkte zu verwenden, sofern das SNR des Metabolitensignals größer als 2 ist (Schwellenwert für die Analyse). Ein typisches Beispiel für eine solche Auswahl von Zeitpunkten ist in Abbildung 2B (hervorgehobenes Zeitfenster) dargestellt.
  3. Berechnen Sie die Produktionsraten jedes der ausgewählten Datenpunkte mit Gl. 4A und Gl. 4B:
    Equation 17Gl. 4A
    Equation 6Gl. 4B
    wobei Equation 7 und sind die Produktionsraten von [1-13 C]lactat bzw. [13C]bicarbonat zu jedem Zeitpunkt. Equation 9 und sind Faktoren, die die relative Anregung von [1-13 C]pyruvat und Equation 8 Equation 10 den Produkten [1-13 C]lactat bzw. [13C]bicarbonat darstellen. Diese Faktoren wurden zuvor mit 0,113 bzw. 0,13929 bestimmt. Vp ist das Volumen, das von der NMR-Sonde detektiert wird (1,375 ml), TR bezeichnet das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden produktselektiven Sättigungsanregungen (12 s für jedes Produkt) Equation 11 und sind die Signale von [1-13 C]lactat bzw. [13 C]bicarbonat und sind die Signale von [1-13 C]pyruvat, die während des [1-13 C]lactats und Equation 14 Equation 13 Equation 12 [13] erworben wurden C]bicarbonat-Anregungen. [Pyr] ist die [1-13 C]pyruvatkonzentration, die während der Plateauphase 14mM betrug.
    1. Bestimmen Sie die Rate für jeden Punkt und berechnen Sie dann den Durchschnitt pro hyperpolarisierter Injektion.

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Representative Results

Die 31P-Spektren, die von einem mit KHB perfundierten Mausherz und nur vom Puffer aufgenommen wurden, sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Signale von α-, β- und γ-ATP, PCr und Pi wurden im Herzen beobachtet. Das Pi-Signal setzte sich aus zwei Hauptkomponenten zusammen: Im höheren Feld (linke Seite des Signals) war das Pi-Signal hauptsächlich auf die KHB bei einem pH-Wert von 7,4 zurückzuführen; Im unteren Feld (rechte Seite des Signals) war das Pi-Signal aufgrund der saureren Umgebung breiter und weniger homogen. Letzteres Muster entsteht aus dem Herzgewebe. Das Pi-Signal des Herzgewebes wird extrahiert, indem das Pi-Signal des KHB subtrahiert wird (Abbildung 1B) und dann von der ppm-Skala in die pH-Skala umgewandelt wird (Abbildung 1C). Der pH-Wert wird unter Verwendung einer multiparametrischen Analyse des Gewebe-Pi-Signals untersucht, indem der gewichtete Mittelwert, der gewichtete Median, das globale Maximum und die Schiefe berechnet werden (Abbildung 1C).

Figure 1
Abbildung 1: Typische 31 P-Spektren, die Unterscheidung zwischen dem Pi-Signal des KHB und des Herzens, die Umwandlung von der chemischen Verschiebung in pH-Achsen und die statistischen Parameter der pH-Verteilung . (A) Die obere Abbildung zeigt ein typisches 31P-NMR-Spektrum, das von einem Mausherz erhalten wurde, das im Spektrometer mit KHB durchblutet wurde. während das untere Feld ein Spektrum zeigt, das nur von KHB erhalten wurde. Der mit einem Strich markierte Spektralbereich ist in Abbildung B vergrößert dargestellt. Abkürzungen: Pi = anorganisches Phosphat; PCr = Phosphokreatin; ATP = Adenosintriphosphat; ADP = Adenosindiphosphat. (B) Das ursprüngliche Spektrum ist schwarz (Pit) dargestellt; Die gestrichelte Kurve zeigt nur das Pi-Signal aus dem Puffer (Pib). Letzteres wurde erhalten, indem eine Lorentzsche Linienform mit ihrem Mittelpunkt an der entsprechenden KHB-Komponente des Pit-Signals angepasst und die Menge an KHB in der Sonde nach dem Einführen des Herzens angepasst wurde (gemäß Gl. 1A). Das dem Herzen zugeordnete Pi-Signal (Pih) ist orange dargestellt, und dies wird erhalten, indem das Pib-Signal vom Pit-Signal subtrahiert wird (gemäß Gl. 1B). (C) Umwandlung der in (B) gezeigten chemischen Verschiebungsverteilung des Pih-Signals in eine pH-Verteilung und eine multiparametrische pH-Analyse. Die Nichtlinearität zwischen der chemischen Verschiebung und den pH-Skalen wurde wie zuvor beschrieben korrigiert32. Die Ergebnisse der multiparametrischen pH-Analyse werden durch die vertikalen Linien markiert. Für diese spezifische Verteilung werden die Werte der statistischen Parameter angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Mit dem hyperpolarisierten produktselektiven Sättigungs-Anregungserfassungsansatz15 ist es möglich, eine absolute Quantifizierung der LDH- und PDH-Enzymaktivitäten durchzuführen. Abbildung 2 fasst die für diese Bestimmung erforderlichen Erfassungs- und Verarbeitungsschritte zusammen. Tabelle 1 zeigt den ATP-Gehalt und die LDH- und PDH-Raten in fünf verschiedenen Herzen. Die Normalisierung der LDH- und PDH-Aktivitäten auf den ATP-Gehalt jedes Herzens reduzierte die Variabilität der LDH- und PDH-Messungen in der gesamten Gruppe, wie in den Enzymaktivitätsspalten in Tabelle 1 zu sehen ist, die in Einheiten von nmol/s/μmol ATP ausgedrückt werden.

Figure 2
Abbildung 2: Hyperpolarisierte 13-C-MRS-Verarbeitung und Analyse des [1-13C]Pyruvat-Metabolismus. (A) Repräsentative 13-C-NMR-Spektren, die mit dem produktselektiven Sättigungsanregungsansatz während einer Injektion von 14 mM hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat in das perfundierte Mausherz aufgenommen wurden. Signalzuordnung: 1 = [1-13 C]Laktat (183,2ppm); 2 = [1-13C]pyruvat (171 ppm); 3 = [13C]bicarbonat (161,1 ppm); * = Verunreinigungen, die sich aus der [1-13C]pyruvat-Formulierung33 ergeben. (B) Zeitverlauf der in A dargestellten hyperpolarisierten Signalintensitäten. Die integrierten Intensitäten von [1-13C]pyruvat (grau) wurden für denT1-Zerfallund die HF-Pulsation mit einer T-eff-Zeitkonstante von 32 s (schwarz) angepasst, was die erwartete Strömungsdynamik für das Substrat ergab (Einwaschen, Plateau, Auswaschen). Weitere Analysen wurden an den Datenpunkten innerhalb des Zeitfensters durchgeführt, in dem das angepasste [1-13 C]pyruvatsignal eine konstante und maximale [1-13C]pyruvatkonzentration im NMR-Röhrchen zeigte (hellblau hervorgehoben). Die Produktionsraten von LDH und PDH (Equation 18 und ) für die ausgewählten Zeitpunkte wurden nach Gl. 4A und Gl. 4B berechnet und Equation 19anschließend gemittelt. Die Mittelwerte für diese Injektion (Equation 1 und Equation 1 ) werden in Einheiten von nmol/s angegeben. Zu Anzeigezwecken wurden das angepasste [1-13 C]pyruvat, das [1-13 C]lactat und das [13 C]bicarbonat mit 0,143, 10 bzw. 80 relativ zum [1-13C]pyruvatsignal multipliziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Herz-Nr. ATP (μmol) LDH-Rate (nmol/s) PDH-Rate (nmol/s) LDH-Rate (nmol/s/μmol ATP) PDH-Rate (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Mittelwert (SD) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % Mittelwert 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabelle 1: ATP-Gehalt und LDH- und PDH-Raten in fünf Herzen. Abkürzungen: SD = Standardabweichung; SD % Mittelwert = der Prozentsatz der Standardabweichung vom Mittelwert.

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Discussion

Wir demonstrieren einen experimentellen Aufbau, der darauf ausgelegt ist, den hyperpolarisierten [1-13C]Pyruvatstoffwechsel, die Gewebeenergetik und den pH-Wert in einem isolierten Mausherzmodell zu untersuchen.

Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind wie folgt: 1) Sicherstellen, dass der pH-Wert des Puffers 7,4 beträgt; 2) Sicherstellung, dass alle Komponenten des Puffers enthalten sind; 3) Vermeidung der Blutgerinnung in den Herzgefäßen durch Heparin-Injektionen; 4) Vermeidung einer ischämischen Schädigung des Herzens durch Verringerung der Stoffwechselaktivität (KCl-Injektion und eiskalter Puffer); 5) Vermeidung des Einbringens von Luftblasen in das Herz an jedem Punkt des Verfahrens; 6) Validierung der erfolgreichen Kanülierung der Aorta durch die Farbe des Gewebes, die von dunkelrot nach hellrosa wechselt; 7) Stellen Sie sicher, dass die Perfusion kontinuierlich ist, sobald das Herz in einen warmen Puffer bewegt wird. 8) genaue Überwachung der Temperatur in der NMR-Röhre im Spektrometer neben dem Herzen und Halten bei 37 °C; 9) Überprüfung der Magnetfeldhomogenität während der gesamten Messung; und 10) Verwendung einer genauen und aktualisierten Kalibrierung für die HF-Impulse.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Technik
Wir stellen einige Modifikationen fest, die in dieser Studie vorgenommen wurden: 1) Die Einleitung der Perfusion mit eiskaltem KHB nach der Operation wurde zum Schutz des Herzens eingesetzt; und 2) die Validierung des Puffer-pH-Werts wurde durchgehend durchgeführt, um sicherzustellen, dass dieser Parameter unter Kontrolle war und keine Quelle für Schwankungen in den Ergebnissen war. Dies geschah in den verschiedenen Schritten der Vorbereitung und des Experimentierens mit einem pH-Meter, pH-Indikatorstreifen und dem Pi-Signal im 31P-Spektrum.

Quellen der Variabilität und wie man sie korrigiert
Das Mausherz wurde so gewählt, dass es in ein 10-mm-NMR-Röhrchen passt. Dieses kleine Herz liefert jedoch schwache Signale, und der heikle chirurgische Eingriff zur Isolierung und Perfusion des Herzens ist eine Herausforderung. Insgesamt führt dies zu einer variablen Lebensfähigkeit des Gewebes und einer variablen Stoffwechselaktivität. Um dieser Variabilität Rechnung zu tragen, normalisierten wir die Stoffwechselraten von LDH und PDH auf den ATP-Gehalt (d.h. Mol/s/ATP). Eine ähnliche Verwendung des ATP-Gehalts als Referenz wurde zuvor in Xenograft-Brusttumorschnittenberichtet 29. Diese Art der Normalisierung ist von Vorteil, da sie einen Vergleich mit den Ergebnissen anderer Forscher und mit anderen Bedingungen ermöglicht. Darüber hinaus kann man durch die Verwendung eines Umrechnungsfaktors von der ATP-Menge auf die Gewebemasse die enzymatische Aktivität pro Gewebegewicht (für das Gewebe, in dem der Stoffwechsel stattfindet) ableiten.

Neben der Variabilität zwischen verschiedenen isolierten Herzpräparaten (d.h. von verschiedenen Tieren) zeigte die chemische Verschiebung des Gewebes Pi (Pih) in dieser Studie eine inhomogene Verteilung. Lutz et al.32 zeigten eine ähnliche inhomogene Verteilung in Xenotransplantat-Tumoren, und diese Verteilung wurde mit einem multiparametrischen Ansatz analysiert. In dieser Arbeit wurde diese Methodik im perfundierten Mausherz implementiert. Wir stellen fest, dass es wahrscheinlich ist, dass das Pih-Signal überwiegend über den intrazellulären pH-Wert berichtet, wie bereitserwähnt 16.

Ungewissheit
Eine zugrunde liegende Annahme bei der Quantifizierung von Equation 18 und ist, dass die hyperpolarisierte [1-13C]pyruvatlösung das gesamte von der NMR-Sonde detektierte Volumen ausfüllt (Vp, Gl. 4A und Equation 19 Gl. 4B). Die hyperpolarisierte [1-13C]pyruvatlösung fließt durch die Koronararterien des Herzens, um die extrazellulären und intrazellulären Kompartimente zu füllen. Daher wird angenommen, dass das Herzvolumen im gleichen Maße mit der hyperpolarisierten Lösung gefüllt ist wie der Rest des VP.

Unter Verwendung des hyperpolarisierten produktselektiven Sättigungsanregungsansatzes15,29 kann die enzymatische Aktivität unabhängig von etwaigen Variationen imT1 der Metaboliten und der Reversibilität der enzymatischen Reaktion quantifiziert werden. Diese Bestimmung ist robust und immun gegen Variationen derT1- und Anregungsprofile und ist wahrscheinlich laborübergreifend reproduzierbarer als bei Analysen der Fläche unter den Kurven, die von den spezifischen Aufnahmebedingungen und dem Aufbau in jedem Labor abhängen.

Die Untersuchung des [1-13C]Pyruvat-Metabolismus, der sich an der Schnittstelle zwischen aerobem und anaerobem Metabolismus befindet, ist von großem Wert für die Untersuchung von Hypoxie, Ischämie, Reperfusionsschäden, Hunger und Veränderungen des Herzstoffwechsels, wie z. B. bei diabetischer Kardiomyopathie. Hyperpolarisierte 13C-markierte Pyruvatanaloga wurden klinisch getestet 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, und daher sind die Ergebnisse solcher Studien wahrscheinlich translational. Am wichtigsten ist, dass unser Ansatz die Quantifizierung der zellinternen Enzymaktivität im gesamten Organ ermöglicht.

Die isolierte Nagetierherzpräparation und die Verfahren und Methoden, die an dieser Forschung beteiligt sind, werden dazu beitragen, das Verständnis der Wirkung einer Vielzahl von Stressoren auf die Herzfunktion, die Energetik und den Stoffwechsel zu verbessern, da die gemessenen Parameter in diesem Modell ausschließlich dem Herzen zugeschrieben werden. Im Gegensatz zum Rattenherz eignet sich das Mausherz für die Untersuchung transgener Modelle.

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Disclosures

Es gibt keine Offenlegungen.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde von der Israel Science Foundation im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 1379/18 finanziert; das Jabotinsky-Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie für angewandte und ingenieurwissenschaftliche Wissenschaften für direkte Doktoranden Nr. 3-15892 für D.S.; und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

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References

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Biologie Heft 194 Stoffwechsel metabolische Bildgebung Bildgebung Magnetresonanzspektroskopie Laktatdehydrogenase Pyruvatdehydrogenase [1-13C]pyruvat pH-Wert anorganisches Phosphat
Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und <sup>13</sup>C/<sup></sup><sup>31</sup>P-NMR-Spektroskopie
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Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

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