Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

התאוששות שמן משופרת באמצעות שילוב של חומרים ביולוגיים

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

אנו ממחישים את השיטות המעורבות בסינון ובזיהוי של המיקרובים המייצרים את ה-biosurfactant. כמו כן, מוצגות שיטות לאפיון כרומטוגרפי וזיהוי כימי של החומרים הביולוגיים, הקובעים את הישימות התעשייתית של החומר הביולוגי להגברת התאוששות שאריות השמן.

Abstract

חומרים ביולוגיים הם תרכובות פעילות על פני השטח המסוגלות להפחית את מתח הפנים בין שני שלבים של קיטובים שונים. חומרים ביולוגיים התגלו כחלופות מבטיחות לחומרים פעילי שטח כימיים בשל פחות רעילות, התמקרות ביולוגית גבוהה, תאימות סביבתית ועמידות לתנאי סביבה קיצוניים. כאן אנו ממחישים את השיטות המשמשות לסינון של מיקרובים המסוגלים לייצר חומרים ביולוגיים. המיקרובים המייצרים חומרים ביולוגיים זוהו באמצעות קריסת טיפה, התפשטות נפט ובדיקות אינדקס תחליב. ייצור חומרים ביולוגיים אומת על ידי קביעת הירידה במתח הפנים של המדיה עקב צמיחתם של החברים המיקרוביאליים. כמו כן, אנו מתארים את השיטות הכרוכות באפיון וזיהוי של חומרים ביולוגיים. כרומטוגרפיית שכבה דקה של הביו-סראנקט שחולץ ואחריה צביעה דיפרנציאלית של הלוחות בוצעה כדי לקבוע את אופיו של הביו-surfactant. LCMS, 1H NMR ו-FT-IR שימשו לזיהוי כימי של החומר הביולוגי. אנו ממחישים עוד יותר את השיטות להערכת היישום של שילוב של חומרים ביולוגיים המיוצרים לשיפור התאוששות שאריות שמן בעמודת חבילת חול מדומה.

Introduction

חומרים ביולוגיים הם המולקולות האמפיפתיות הפעילות על פני השטח המיוצרות על ידי מיקרואורגניזמים שיש להם את היכולת להפחית את פני השטח ואת המתח הבין-פאזי בין שני שלבים1. חומר ביולוגי טיפוסי מכיל חלק הידרופילי המורכב בדרך כלל ממואטי סוכר או משרשרת פפטידית או חומצת אמינו הידרופילית וחלק הידרופובי המורכב משרשרת חומצות שומן רוויות או בלתי רוויות2. בשל אופיים האמפיפתי, חומרים ביולוגיים מתאספים בממשק שבין שני השלבים ומפחיתים את המתח הבין-פאזי בגבול, מה שמקל על פיזור של שלב אחד לתוך 1,3 השני. סוגים שונים של חומרים ביולוגיים שדווחו עד כה כוללים גליקוליפידים שבהם פחמימות קשורות לחומצות אליפטיות ארוכות שרשרת או הידרוקסי-אליפטיות באמצעות קשרי אסטר (למשל, רמנוליפידים, טרהלולפידים וסופורולפידים), ליפוזיטים שבהם שומנים מחוברים לשרשראות פוליפפטידים (למשל, סרפקטין וליז'ניזין), וחומרים ביולוגיים פולימריים המורכבים בדרך כלל מקומפלקסים של חלבונים פוליסכרידים (למשל, תחליב, ליפוזן, אלאסן וליפומנאן)4. סוגים אחרים של חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי המיקרואורגניזמים כוללים חומצות שומן, פוספוליפידים, שומנים ניטרליים, וחומרים ביולוגיים חלקיקיים5. הקבוצה הנחקרת ביותר של חומרים ביולוגיים היא גליקוליפידים וביניהם רוב המחקרים דווחו על ראמנוליפידים6. ראמנוליפידים מכילים מולקולות אחת או שתיים של ראמנוז (היוצרות את החלק ההידרופילי) הקשורות למולקולה אחת או שתיים של חומצת שומן ארוכת שרשרת (בדרך כלל חומצה הידרוקסי-דקנואית). רמנוליפידים הם גליקוליפידים ראשוניים שדווחו לראשונה מ-Pseudomonas aeruginosa7.

חומרים ביולוגיים צוברים מיקוד הולך וגובר בהשוואה למקבילותיהם הכימיות בשל תכונות ייחודיות וייחודיות שונות שהם מציעים8. אלה כוללים ספציפיות גבוהה יותר, רעילות נמוכה יותר, מגוון גדול יותר, קלות הכנה, התמקרות ביולוגית גבוהה יותר, קצף טוב יותר, תאימות סביבתית ופעילות בתנאים קיצוניים9. המגוון המבני של החומרים הביולוגיים (איור S1) הוא יתרון נוסף שנותן להם יתרון על פני המקבילים הכימיים10. הם בדרך כלל יעילים ויעילים יותר בריכוזים נמוכים יותר מכיוון שריכוז המיסל הקריטי שלהם (CMC) בדרך כלל נמוך פי כמה מאשר חומרים פעילי שטח כימיים11. הם דווחו כעמידים מאוד לתרמוסקולר (עד 100 מעלות צלזיוס) ויכולים לסבול pH גבוה יותר (עד 9) וריכוזי מלח גבוהים (עד 50 גרם לליטר)12 ובכך מציעים מספר יתרונות בתהליכים תעשייתיים, הדורשים חשיפה לתנאים קיצוניים13. התמקרות ביולוגית ורעילות נמוכה יותר הופכות אותם למתאימים ליישומים סביבתיים כגון bioremediation. בגלל היתרונות שהם מציעים, הם מקבלים תשומת לב מוגברת בענפים שונים כמו מזון, חקלאות, חומרי ניקוי, קוסמטיקה ותעשיית הנפט11. גם חומרים ביולוגיים זכו לתשומת לב רבה בתיקון נפט להסרת מזהמי נפט ומזהמים רעילים14.

כאן אנו מדווחים על הייצור, האפיון והיישום של חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104, ו - Paenibacillus sp. IITD108. השלבים המעורבים בסינון, אפיון ויישום של שילוב של חומרים ביולוגיים להתאוששות משופרת של שמן מתוארים באיור 1.

Figure 1
איור 1: שיטה להתאוששות שמן משופרת באמצעות שילוב של חומרים ביולוגיים. זרימת העבודה המדורגת מוצגת. העבודה בוצעה בארבעה שלבים. ראשית, הזנים המיקרוביאליים עברו תרבית וסוננו לייצור חומרים ביולוגיים על ידי בדיקות שונות, שכללו בדיקת קריסת טיפה, בדיקת התפשטות שמן, בדיקת מדד תחליב ומדידת מתח פני השטח. לאחר מכן, החומרים הביולוגיים הוצאו מהמרק נטול התאים ואופיים זוהה באמצעות כרומטוגרפיית שכבה דקה והם זוהו עוד יותר באמצעות LCMS, NMR ו-FT-IR. בשלב הבא, החומרים הביולוגיים המופקים היו מעורבבים יחד והפוטנציאל של התערובת שנוצרה להתאוששות שמן משופרת נקבע באמצעות טכניקת עמודי חבילת החול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הקרנה של זנים מיקרוביאליים אלה לייצור חומרים ביולוגיים נעשתה על ידי קריסת טיפה, התפשטות שמן, בדיקת מדד תחליב וקביעת הפחתה במתח הפנים של המדיום נטול התאים עקב צמיחת המיקרובים. החומרים הביולוגיים הופקו, אופיינו וזוהו כימית על ידי LCMS, 1H NMR ו-FT-IR. לבסוף, הוכנה תערובת של חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי מיקרובים אלה, והיא שימשה לשחזור שאריות השמן בעמודה מדומה של חבילת חול.

המחקר הנוכחי רק ממחיש את השיטות המעורבות בסינון, זיהוי, אפיון מבני ויישום של שילוב הביו-surfactant לשיפור התאוששות השמן השיורי. הוא אינו מספק אפיון פונקציונלי מפורט של החומרים הביולוגיים המיוצרים על ידי הזנים המיקרוביאליים15,16. ניסויים שונים כגון קביעת מיקל קריטי, אנליזה תרמוגרווימטרית, רטיבות פני השטח והתכלות ביולוגית מבוצעים לאפיון פונקציונלי מפורט של כל חומר ביולוגי. אך מכיוון שמאמר זה הוא נייר שיטות, ההתמקדות היא בסינון, זיהוי, אפיון מבני ויישום של שילוב הביו-surfactant בשיפור התאוששות הנפט השיורי; ניסויים אלה לא נכללו במחקר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחת זנים מיקרוביאליים

  1. שוקלים 2 גרם של אבקת לוריא מרק ומוסיפים ל-50 מ"ל של מים מזוקקים בבקבוקון חרוטי של 250 מ"ל. מערבבים את התכולה עד שהאבקה מתמוססת לחלוטין ומרכיבים את הנפח ל-100 מ"ל באמצעות מים מזוקקים.
  2. באופן דומה, הכינו עוד שני צלוחיות של 100 מ"ל של מרק לוריא והניחו תקעי כותנה על צוואר הצלוחיות.
  3. מכסים את תקעי הכותנה בנייר אלומיניום ואוטוקלים את הצלוחיות למשך 15 דקות ב-121 מעלות צלזיוס ו-15 psi כדי לעקר את המדיה.
  4. לאחר האוטוקלבינג, תנו למדיה להתקרר לטמפרטורת החדר.
  5. להכנת תרבית ראשונית של זן, יש לבחור מושבה בודדת מצלחת LA באמצעות לולאת חיסון ולחסן במבחנה המכילה 5 מ"ל של מרק לוריא סטרילי.
  6. הדגירה של המבחנה למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס ב-180 סל"ד.
  7. חסן את הצלוחיות המכילות 100 מ"ל של מרק לוריה אוטוקלבי על ידי הוספת 1 מ"ל של תרביות זרעים שגודלו במהלך הלילה לצלוחיות בתוך ארון זרימת האוויר הלמינרי.
  8. דגירה של הצלוחיות באינקובטור סיבובי ב-30 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך 7 ימים.
  9. לאחר השלמת תקופת הדגירה, לקצור את הצלוחיות ולהעביר את מרק התרבות לצינורות הצנטריפוגה. צנטריפוגה את התרבות ב 4,500 x g במשך 20 דקות בצנטריפוגה בקירור ב 4 °C (74 °F).
  10. בעדינות, יוצקים את הסופרנטנט נטול התאים לתוך טרייה ומשתמשים בו בבדיקות סינון לייצור חומרים ביולוגיים.

2. בדיקות סינון לייצור חומרים ביולוגיים

הערה: בסעיפים הבאים, חומרים פעילי שטח מסחריים (Saponin) שימשו כבקרה חיובית בעוד שמים ומדיה לא גרעינית שימשו כבקרה שלילית.

  1. בדיקת כיווץ נפילה
    1. קחו מגלשת זכוכית נקייה וציפו את פני השטח של המגלשה ב-200 μL של שמן.
    2. מוסיפים 20 μL של ה-supernatant החופשי של התא למרכז השמן ומשאירים אותו ללא הפרעה למשך 2-3 דקות.
      הערה: אם הטיפה קורסת, דרג את ה-supernatant positive עבור נוכחות של חומר ביולוגי.
  2. בדיקת התפשטות נפט
    1. קחו 20 מ"ל של מים מזוקקים כפולים בצלחת פטרי (קוטר 75 מ"מ) והוסיפו 200 μL של נפט גולמי לפני המים.
    2. מוסיפים 20 μL של סופרנאטנט ללא תאים למרכז השמן ומשאירים אותו ללא הפרעה למשך דקה אחת.
      הערה: אם אזור סליקה נוצר עקב תזוזת שמן, דרג את ה-supernatant positive עבור נוכחותו של ה-biosurfactant.
  3. בדיקת אינדקס תחליב (E24 assay)
    1. הוסיפו 4 מ"ל של בנזין (בנזין) וסופרנט ללא תאים כל אחד לתוך מבחנת זכוכית נקייה.
    2. מערבולת את התערובת במרץ במשך 3 דקות ולהשאיר אותה ללא הפרעה במשך 24 השעות הבאות.
    3. לאחר 24 שעות, קבע את מדד E24 כאחוז מגובה השכבה המתחלבת (cm) ביחס לגובה עמוד הנוזל כולו (cm).
      Equation 1
      הערה: אם נצפתה תחליב (שמן במים או במים בשמן) לאחר 24 שעות, סביר להניח שהסופרנט יכיל את החומר הביולוגי.
  4. מדידת מתח פני השטח
    הערה: מתח הפנים נמדד בשיטת טבעת Du Noüy17. המכשיר ששימש בניסוי זה (ראו טבלת חומרים) רגיש מאוד, ולכן הקפידו על ניקוי נכון של כלי הזכוכית ושל הגשושית.
    1. הפעל את המערכת ולחץ פעמיים על התוכנה המשויכת כדי לפתוח אותה.
    2. נקו את כלי הזכוכית עם הנוזל שיש לקבוע את מתח הפנים שלו.
    3. הוסף את הנוזל (40 מ"ל) לתוך הכלי ולהרכיב את הכלי על מחזיק הכלי.
    4. פתח את מחזיק הבדיקה והעלה עליו את הגשושית. כעת נעל את מחזיק הבדיקה על ידי לחיצה על כפתור הנעילה בבקר הידני.
    5. באמצעות הבקר הידני, התאם את גובה הפלטפורמה כך שהגשושית תהיה במרחק של כ-2-3 מ"מ מפני השטח של הנוזל.
    6. כעת השתמש בתוכנה כדי למדוד את מתח הפנים. לחץ על קובץ הממוקם בחלונית הימנית העליונה של המסך. לחץ על פתח סביבת עבודה. יופיע חלון קופץ.
    7. גלול מטה ולחץ פעמיים על סמל K100: Surface ו- Interfacial Tension .
    8. כעת, לחץ על סמל הקובץ הממוקם בפינה הימנית העליונה של המסך. לחץ על מסד נתונים חדש. הזן את השם לשמירת הנתונים ולחץ על אישור.
    9. שוב, לחץ על קובץ > חדש מדידה > SFT > טבעת. הזן את השם של המדידה. ודא שתבנית התצורה מציגה טבעת SFT.
    10. מלא את הפרטים בחלון תצורת המדידה על-ידי בחירת הגשושית וכלי השיט המשמש למדידה. כמו כן, מלא את הפרטים של הנוזל ואת שלב הגז.
      הערה: השלב הנוזלי יהיה מים, בעוד שלב הגז יהיה אוויר. הצפיפות של הפאזה הנוזלית היא הצפיפות של הסופרנטנט החופשי של התא. ניתן לקבוע זאת על ידי לקיחת משקל של 50 מ"ל של הנוזל וחישוב הצפיפות כ- Kg/m3.
    11. כעת לחץ על הכרטיסייה נוהל ומלא את הפרטים הבאים: מהירות זיהוי: 6 מ"מ לדקה, רגישות זיהוי: 0.005 גרם, מהירות חיפוש: 6 מ"מ לדקה, רגישות חיפוש: 0.005 גרם, מהירות מדידה: 3 מ"מ לדקה, רגישות מדידה: 0.001 גרם, עומק טבילה: 3 מ"מ, מרחק החזרה: 10%, תיקון: הארקינס וג'ורדן, ערכים מרביים: 5. לחץ על אישור.
    12. בחלון המוקפץ, בחר את מסד הנתונים כדי לאחסן נתונים ולחץ על אישור.
      הערה: ניתן ליצור מסד נתונים חדש כאן או להוסיף מדידות חדשות לנתונים הקיימים.
    13. כעת לחץ על לחצן הפעל הממוקם במרכז העליון של המסך. המערכת תתחיל להפעיל את הסקריפט. לאחר שהמערכת תתייצב, היא תזהה את פני השטח. לטבול את הגשושית לתוך הנוזל, להזיז את הגשושית קדימה ואחורה ולזהות את המתח בלמלה שנוצרה.
    14. לקבלת התוצאות, לחץ על סמל המדידה בצד השמאלי האמצעי של המסך. לחץ על נתונים וציין את מתח הפנים שנקבע.
    15. לאחר השלמת המדידה, הנמיכו את גובה הפלטפורמה ופתחו את הנעילה ושחררו את הגשושית ואת כלי השיט מהמכשיר.
      הערה: כדי לקבוע את הירידה במתח הפנים עקב ייצור חומרים ביולוגיים, יש להשתמש ב-LB לא מאוכלס כבקרה.

3. מיצוי חומרים ביולוגיים

  1. התאם את ה- pH של הסופרנטנט החופשי של התא ל- 2 באמצעות 2 N HCl. אחסן את התערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. מוסיפים נפח שווה של תערובת כלורופורם-מתנול (2:1) לסופרנט ומערבבים במרץ במשך 20 דקות.
  3. השאירו את התערובת ללא הפרעה כדי שתתרחש הפרדת פאזה.
  4. הסר את השלב העליון המכיל מים ומתנול והשאר את השלב התחתון המכיל את החומר הביולוגי כדי להתאדות במכסה אדים.
  5. לאחר אידוי הפאזה האורגנית, יש לפתור מחדש את החומר הביולוגי הגולמי בצבע דבש ב-3 מ"ל של כלורופורם ולהשתמש בתערובת זו להמשך זיהוי ואפיון של החומר הביולוגי.

4. מחקרי יציבות תחליב

  1. יציבות תחליב בטמפרטורות שונות
    1. קח 5 מ"ל של סופרנאטורים ללא תאים במבחנות שונות.
    2. מוסיפים 5 מ"ל בנזין לכל מבחנה ומערבבים במרץ על ידי מערבולת במשך 3 דקות.
    3. דגירה של המבחנות למשך הלילה באמבטיות מים שונות בטמפרטורות שונות (30 מעלות צלזיוס, 40 מעלות צלזיוס, 50 מעלות צלזיוס, 60 מעלות צלזיוס ו-70 מעלות צלזיוס).
    4. לאחר 24 שעות, העריכו את מדדי האמולסיה כאמור.
  2. יציבות תחליב בערכי pH שונים
    1. קח 5 מ"ל של supernatant ללא תאים במבחנות נקיות.
    2. התאם את ה-pH של סופרנאטורים חופשיים לתאים (2, 4, 6, 8 ו-10) באמצעות 1 N HCl ו-1 N NaOH.
    3. מוסיפים כמות שווה של בנזין למבחנות ומערבבים במרץ על ידי מערבולת במשך 3 דקות.
    4. השאירו את המבחנות ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
    5. הערך את מדד האמולסיה כאמור.
  3. יציבות תחליב בריכוזי מלח שונים
    1. קח 5 מ"ל של supernatant ללא תאים במבחנות נקיות.
    2. מוסיפים כמויות שונות של מלח (NaCl) לסופרנאטים (0 גרם/ל' ל', 5 גרם/ל' , 10 גרם/ל' ל', 20 גרם/ל' ל', 60 גרם/ל' ו-80 גרם/ל').
    3. ממיסים את המלחים בסופרנאטים נטולי התאים על ידי מערבולת במשך 3 דקות.
    4. מוסיפים כמות שווה של בנזין למבחנות ומערבבים במרץ על ידי מערבולת במשך 3 דקות.
    5. השאירו את המבחנות ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
    6. הערך את מדד האמולסיה לאחר 24 שעות.

5. קביעת אופיו של החומר הביולוגי

  1. TLC של החומר הביולוגי המופק
    1. נקודה 20 μL של biosurfactants על צלחות TLC. ספוט 2 μL בבת אחת.
    2. זהה את החומרים הביולוגיים על שלוש צלחות TLC שונות.
    3. מכינים תערובת של 100 מ"ל של האלואנט המכילה כלורופורם:מתנול (2:1) ומוסיפים את האלוהות לתא ה-TLC. סגור את המכסה של החדר ואפשר לו להרוויה במשך 20 דקות.
    4. לאחר ייבוש הצלחות, מניחים את צלחות ה-TLC בתוך החדר הרווי בתערובת מתנול כלורופורמית ומפעילים את ה-TLC.
    5. לאחר שהפלטה הגיעה לחלק העליון של צלחת ה-TLC (במרחק של 1 ס"מ מהחלק העליון), הוציאו את הצלחות ותנו לה להתייבש באוויר.
  2. צביעה לזיהוי שומנים
    1. קח תא TLC נקי והוסף כמה (5-10) גרגירים של יוד לתוך החדר הטרי ולהרוות את החדר במשך 5 עד 10 דקות.
    2. מניחים את לוחית ה- TLC בתוך החדר ומתבוננים בפיתוח הכתמים הצהובים. אם הכתמים מופיעים, דרג את ה-biosurfactant חיובי לנוכחות המרכיב השומני.
  3. צביעה לזיהוי פפטידים או חומצות אמינו
    1. להכין תמיסת ninhydrin על ידי המסת 0.4 גרם של ninhydrin ב 20 מ"ל של בוטנול. מוסיפים לתערובת 0.6 מ"ל של 100% חומצה אצטית קרחונית.
    2. מרססים את צלחת ה-TLC בתמיסת נינהידרין ונותנים לה להתייבש באוויר למשך 2 דקות. מחממים את הצלחת ב-110 מעלות צלזיוס ומתבוננים בהתפתחות הצבע.
      הערה: אם הכתמים הכחולים מופיעים, דרג את החומר הביולוגי כחיובי לנוכחות של שרשרת פפטידית או חומצת אמינו כלשהי.
  4. צביעה לזיהוי פחמימות
    1. הכן תמיסה של p-anisaldehyde על ידי הוספת 2 מ"ל של p-anisaldehyde ל-48 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית המכילה 1 מ"ל של H2SO4. מוסיפים 0.6 מ"ל של חומצה אצטית לתערובת.
    2. מרססים את התערובת באופן שווה על צלחת TLC ומניחים לה להתייבש באוויר במשך 2 דקות.
    3. דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס ועקבה אחר התפתחות הכתמים.
      הערה: אם הכתמים הירוקים או החומים מופיעים, דרג את ה-biosurfactant חיובי לנוכחות של פחמימות כלשהן.

6. זיהוי כימי של החומר הביולוגי

  1. LCMS של החומר הביולוגי
    1. ממיסים 25 מ"ג של החומר הביולוגי המופק ב-1 מ"ל של כלורופורם.
    2. בצע LCMS (בתצורת תרסיס נעילה עם תדר סריקת ייחוס של 10 שניות) באמצעות עמודת C18.
    3. השתמש בכלורופורם:מתנול (1:1) כפאזה ניידת והזריק 2 μL של הדגימה לעמודה בקצב זרימה של 0.1 מ"ל לדקה.
    4. הגדר את הפרמטרים הניסיוניים ל: קוטביות: ES חיובי, מתח נימי: 3 kV, טמפרטורת מקור: 80 °C, טמפרטורת השממה: 300 °C, קצב זרימת גז השממה: 7,000 L /h, וקצב זרימת גז מלכודת: 0.40 מ"ל לדקה.
    5. סרוק את הטווחים שבין 100 ל-1,200 Da במהלך זמן זיהוי של 20 דקות וסקור את היונים במצב ES חיובי.
    6. נתח את ערכי m/z באמצעות כל תוכנה ספקטרומטריית מסה בכמותית.
    7. לניתוח, היכנס לתוכנה.
    8. לחץ על חיפוש אצווה והזן את רשימת ההמונים שהתקבלו. סקור את התוצאות במצב טעינה חיובי והשתמש ב- M + H ו- M + Na כתוספות. שמור על הדיוק ל- 10 PPM וסמן את מבנה התצוגה.
    9. לחץ על חיפוש ומתוך רשימת התרכובות, בחר את זו עם רמת PPM הנמוכה ביותר.
  2. 1 H NMR של החומר הביולוגי
    הערה: 1H NMR של החומר הביולוגי בוצע באמצעות ספקטרומטר NMR של 400 מגה-הרץ (ראה טבלת חומרים).
    1. ממיסים 5 מ"ג של חומר ביולוגי ב-1 מ"ל של כלורופורם מעוות(CdCl3).
    2. מעבירים את התערובת לצינור NMR. סגר את הצינור כראוי והכניס את הצינור למפרש. התאם את גובה הצינור באמצעות צינור המתאם.
    3. מקם את הצינור יחד עם המפרש במכונת ה- NMR ובצע את השלבים המוזכרים להלן כדי לקבל ספקטרום NMR.
    4. כדי לבחור את סוג הצינור לדוגמה: sx N, כאשר N הוא המיקום שבו הצינור הוצב (למשל, sx 13, אם הצינור הוצב במיקום 13) בתוכנההמשויכת .
    5. הקלד edc והקש Enter כדי ליצור תיקיה חדשה שבה ניתן לאחסן נתונים.
    6. יופיע חלון קופץ. בחר את הממס על ידי לחיצה על CdCl 3 ברשימה והזן את שם המדגם.
    7. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הקלד "getprosol"; כדי לנעול את הממס, הקלד "נעל cdcl3".
    8. הקלד "topshim" כדי shim את המדגם, ולבסוף הקלד "rga;zgefp" לרכישת הנתונים. פעולה זו תתחיל את הפרוטוקול.
    9. לאחר קבלת הספקטרום, הקלד "apk;abs n" ולחץ על Enter לתיקון פאזה וקו בסיס.
    10. כדי לבחור פסגות ראשיות, הקלד "pp" והקש Enter. כדי לבחור רק פסגות אינטנסיביות, הזן "mi" והקלד את העוצמה שמעליה יש לבחור את הפסגות. ערך ברירת המחדל יהיה 0.2.
    11. כדי לשלב את הפסגות, לחץ על שילוב והנח את הסמן בצד שמאל של הפסגה כדי להשתלב ותוך כדי החזקת הסמן לחץ וגרור את הסמן סביב הפסגה.
    12. שמור את הנתונים על-ידי לחיצה על קובץ בפינה הימנית העליונה ולאחר מכן לחץ על שמור.
    13. ניתן להוציא את הדגימה מהמכונה על ידי הקלדת "sx ej".
    14. לנתח את הפסגות ולקבוע את הסביבה של אטומי H.
  3. ספקטרוסקופיית אינפרה-אדום של התמרת פורייה של החומר הביולוגי
    הערה: FT-IR של חומר ביולוגי שחולץ בוצע באמצעות ספקטרופוטומטר זמין מסחרית במצב ATR (ראה טבלת חומרים).
    1. הפעילו את הספקטרופוטומטר ובדקו את הטיהור, הייבוש והגלאי.
    2. כדי לאסוף ספקטרום, תחילה אסוף את ספקטרום הרקע ללא דגימה במקום.
    3. קח את החומר הביולוגי המופק וייבש אותו לחלוטין. הניחו את החומר הביולוגי המיובש ישירות מעל גביש היהלום, הפעילו לחץ ולחצו על נקודת המגע של ה-ATR.
    4. בתוכנה, בחר את מספר הסריקות (הזן 30) וסרוק את הספקטרום מ 400 ס"מ-1 ל-4,000 ס"מ-1.
    5. לחץ על אישור כדי להוסיף את ספקטרום הדגימה לחלון הספקטרלי.
    6. לחץ על קבצים > שמור > שמור בשם והזן את שם הקובץ ואחריו הרחבה .spa ולחץ על אישור.

7. יישום ביו-surfactant (שחזור שמן משופר)

הערה: בניסוי זה, מים מזוקקים כפולים שימשו כבקרה שלילית ו-10% SDS, 10% Tween 80 ו-10% saponin מסחרי שימשו כבקרות חיוביות.

  1. קח את הזכוכית ואטם את השקע התחתון עם צמר זכוכית וחרוזי זכוכית.
  2. ארזו את העמודה עם אדמה חולית באופן כזה שניתן יהיה להוסיף נוזל כלשהו בחלק העליון של הקרקע ואת הזרימה דרך ניתן לאסוף בתחתית. הר את העמוד על המחזיק והוסף כמה חרוזי זכוכית על גבי האדמה.
  3. הצפת את העמודה ב-50 מ"ל של תמיסת מלח ואספה את הזרימה כדי לקבוע את נפח הנקבוביות.
    נפח נקבוביות = נפח התמלחת שנוסף למעלה - נפח הזרימה שנאסף.
  4. הסר את התמלחת מהעמודה על ידי אילוץ נפט גולמי לעבור דרכה לאחר הוספה מראש העמודה. אספו את נפח התמלחת והשמן היוצאים מהעמודה כדי לקבוע את נפח רוויית השמן הראשונית. נפח התמלחת המשתחררת מהעמודה יהיה נפח רוויית השמן הראשוני או השמן המקורי במקום.
  5. השאירו את העמודה ללא הפרעה למשך 24 שעות.
  6. לאחר 24 שעות, הציפו את העמודה ב-10 נפחי נקבוביות של תמלחת ואספו את השמן שיוצא מהעמודה כדי להעריך את התאוששות השמן המשנית. השמן שנותר בעמודה לאחר התאוששות השמן המשני מתאים לשמן השיורי.
  7. הכינו תערובת של חומרים ביולוגיים על ידי הוספת נפחים שווים של חומר הביו-סראפלקס המופק (שחולץ לאחר שלב 3.5) לכוס הזכוכית. מוסיפים את החומרים הביולוגיים לראש העמודה ומדגרים את העמודה למשך 24 שעות.
  8. לאחר 24 שעות, מדוד את כמות השמן והמים כדי לקבוע התאוששות שמן נוספת או משופרת. נפח השמן המשתחרר מהעמודה יתאים לשאריות השמן שהתאוששו.
  9. אומדן התאוששות שמן משופרת עם המשוואה הבאה:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלושה זני חיידקים (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ו-Paenibacillus sp. IITD108) נבדקו לייצור חומרים ביולוגיים על ידי מבחנים שונים, שכללו בדיקת קריסת טיפה, בדיקת תזוזת שמן, בדיקת מדד תחליב והפחתת מתח פני השטח. סופרנאטים נטולי תאים של כל שלושת זני החיידקים ותמיסה של חומרים פעילי שטח כימיים גרמו לקריסת טיפה, ולכן קיבלו ציונים חיוביים לנוכחותם של החומרים הביולוגיים (איור 4a). מאידך גיסא, טיפת המים לא התמוטטה ולכן קיבלה ציון שלילי לנוכחותו של הגורם הביולוגי. חומרים פעילי שטח מסחריים וסופרנאטים נטולי תאים של שלוש תרביות החיידקים הצליחו גם הם לעקור את שכבת השמן במבחן התפשטות השמן, ולכן קיבלו ציונים חיוביים לנוכחות של חומר ביולוגי (איור 4b). מים, לעומת זאת, לא יכלו לעקור כל שמן, ולכן, הובקעו שלילי. במבחני מדד האמולסיה נצפתה תחליב יציב במבחנות המכילות חומרים פעילי שטח מסחריים ואת הסופרנאטים של שלושת הזנים המיקרוביאליים. עם זאת, לא נצפתה תחליב במבחנה המכילה מדיום תרבית לא מנוצלת (איור 4c). זה שוב הציע כי Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104, ו Paenibacillus sp. IITD108 לייצר biosurfactants. אישור לייצור חומרים ביולוגיים הושג על ידי מדידת מתח הפנים של המרק נטול התאים והשוואתו עם הבקרה הבלתי מנוצלת. נמצא כי החומרים הביולוגיים של רודוקוקוס sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ו-Paenibacillus sp. IITD108 מפחיתים את מתח הפנים של המדיום מ-58.89 mN/m ל-45.41 mN/m, 45.82 mN/m ו-28.43 mN/m, בהתאמה (איור 5).

מדידות IFT בוצעו בשיטת משיכת הטבעת. החומרים הביולוגיים מכל שלושת הזנים היו מסוגלים להפחית באופן משמעותי את המתחים הבין-פאזיים בין שלבים מימיים ואורגניים שונים (טבלה S1). מתח הפנים ומדידות המתח הבין-פרצופיות מאשרים כי כל שלושת הזנים מייצרים חומרים ביולוגיים.

מיצוי ממסים של חומרים ביולוגיים מתרביות התאים החופשיות של Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 ו-Paenibacillus sp. IITD108 הביא לריכוזים ביו-אקטיביים של 820 מ"ג/ל', 560 מ"ג/ל' ו-480 מ"ג/ל', בהתאמה.

כפי שנצפה באיור 4C, האמולסיה שנוצרה על-ידי החומר הביולוגי הייתה מים במיקרו-אמולסיה של נפט. מבחני יציבות תחליב הראו כי החומרים הביולוגיים הפגינו יציבות טובה בתנאי סביבה מגוונים (איור 6). האמולסיות שיוצרו היו יציבות מאוד בטמפרטורות מגוונות (איור 6a), ערכי pH (איור 6b) וריכוזי מלחים (איור 6c) שנבדקו.

כרומטוגרפיית שכבה דקה בוצעה כדי לקבוע את אופיים של החומרים הביולוגיים. צביעת הלוחות באדי יוד הביאה להתפתחות של כתמים צהובים בכל הגורמים הביולוגיים ולבקרה (Biosurfactant מ-Bacillus sp. IITD 106 (איור 7a). עובדה זו הצביעה על כך שהביו-חומרים מכילים מואטי שומנים. באף אחת מלוחות ה-TLC לא התקבלו כתמים בצבע כחול עם הכתמתם בנינהידרין (איור 7b). זה הראה כי החומרים הביולוגיים לא הכילו שום מואטי פפטידי. כתמים כחולים וירוקים נצפו בכל לוחות ה-TLC, כאשר הם מוכתמים בכתם אניסלדהיד (איור 7c). זה הראה שהביו-surfactants הכילו moiety של פחמימות. מתוצאות TLC, הוסק כי כל החומרים הביולוגיים הם גליקוליפידים.

זיהוי כימי של החומרים הביולוגיים באמצעות LCMS גילה כי ה-Rhodococcus sp. IITD102, ו-Lysinibacillus sp. IITD104 מייצרים את אותו סוג של ביו-surfactant, שזוהה כחומצה הידרוקסידקנואית די-רמנופירנוזיקית עם מסה של 480.25 Da. המבנה של חומר ביולוגי נתמך על-ידי נתוני H NMR ו-FT-IR אחד (איור 8).

בספקטרום 1H NMR, השינויים הכימיים שהתקבלו ב-7.2 ייצגו את הפרוטונים של קבוצות קרבוקסיליות. תזוזות כימיות המתאימות לפרוטונים של קבוצת מתיל התקבלו בטווח 1-2 ppm. משמרות המתאימות לפרוטונים המחוברים לקבוצות אלקיל התקבלו ב-2.3 ppm. ספקטרום FT-IR של הביו-surfactants שחולצו מ-Rhodococcus sp. IITD102 ו-Lysinibacillus sp. IITD104 הראה נוכחות של פסגות חזקות בגל מספר 3,290 cm-1, המאשר את נוכחותה של הקבוצה הפונקציונלית OH. שיא קטן בגל מספר 2,951 ס"מ-1 מתאים למתוח CH. שיא חזק של 1,620 ס"מ-1 ייצג את נוכחותה של קבוצה קרבוקסילית בביו-חומרים. פסגות אחרות שהתקבלו ב-1,530, 1,410, 1,200 ו-1,060 אישרו את נוכחותן של קבוצות פונקציונליות של אלקיל, CH3, C-O-C ו-C-CH3 , בהתאמה. הן נתוני NMR והן נתוני FT-IR תמכו במבנה של החומר הביולוגי שנקבע ממחקרי LCMS. LCMS של חומר ביולוגי גולמי מ-Paenibacillus sp. IITD108 (איור 9) הראה שהוא מייצר רהמנוליפיד המכיל שלוש שרשראות שומנים היוצרות את הליבה ההידרופובית בתפזורת של הביו-surfactant. החומר הביולוגי זוהה כ-2decanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-חומצה הידרוקסידקנואית עם מסה של 802 Da. התוצאות של LCMS נתמכו על ידינתוני H NMR ו- FT-IR אחד.

ההגדרה להתאוששות משופרת של שמן מוצגת באיור 2.

Figure 2
איור 2: הערך הניסויי להתאוששות משופרת של שמן באמצעות טכניקת עמודת אריזת החול. העמוד העמוס באדמה הורכב על המחזיק. השקע התחתון היה אטום בצמר זכוכית וחרוזי זכוכית. לאחר התאוששות משנית, שאריות השמן בתוך העמודה היו נתונות להתאוששות שמן משופרת על ידי הוספת התערובת הביו-אקטיבית אליו. הצינור שהוצב בתחתית העמודה שימש לאיסוף השבר המרומם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

בניסוי התאוששות שמן משופר מדומה, מתוך 50 מ"ל של תמלחת שנוספו לחלק העליון של העמודה, נאספו 12 מ"ל בזרימה, ולכן נפח הנקבוביות הוערך ב-38 מ"ל. כאשר השמן נדחף דרך הטור, 33 מ"ל של תמלחת שוחררו מהטור. זה ייצג את נפח רוויית השמן הראשונית. התאוששות משנית באמצעות נפחים של 10 נקבוביות של תמלחת הביאה להתרוממות של 10 מ"ל שמן. שאריות השמן שנותרו בעמודה היו 23 מ"ל. מים שהכילו תערובת של חומרים ביולוגיים הצליחו לשחזר 13 מ"ל של שמן מהעמודה (איור 3).

Figure 3
איור 3: הדמיה של שחזור שמן משופר באמצעות עמודת ארגז חול. נפח רוויית השמן הראשונית הן של השליטה והן של עמוד הבדיקה הייתה סביב 33 מ"ל. במהלך התאוששות השמן המשנית, כ -10 מ"ל של השמן התאוששו הן מהבקרה והן מעמודות הבדיקה. ההבדלים בפרופילי ההתאוששות של הבדיקה ועמודי הבקרה נצפו רק במהלך ההתאוששות של שאריות השמן שנותרו בעמודה. התערובת הביו-אקטיבית הביאה להתאוששות נוספת של 13 מ"ל של שאריות השמן שנותרו מעמודת הבדיקה, בעוד שבעמודת הבקרה נמצאו רק 1.03 מ"ל של שמן בשלב זה. זה מראה שלתערובת הביו-אקטיבית יש פוטנציאל גדול לשפר את ההתאוששות של שאריות הנפט מהמאגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זה ייצג התאוששות שמן משופרת. לכן, מים המכילים את תערובת החומרים הביולוגיים היו מסוגלים לשחזר 56.52% מהשמן השיורי מהעמודה (טבלה 1). מצד שני, פתרונות של 10% SDS, 10% Tween 80 ו-10% saponin הצליחו לשחזר 85%, 68% ו-73% שמן שיורי מהעמודה.

פרמטרים שליטה בהצפות הצפה משולבת של חומרים ביולוגיים 10 % SDS 10 % טווין 10% ספונין
PV (מ"ל) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (mL) 33 33 33 29 33
קופה (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
SOR (mL) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (mL) 23.23 23 21.5 18.8 23
ROS (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ROR (mL) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
AOR (%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

כאשר PV = נפח נקבוביות שנקבע לאחר רוויית עמודה ראשונית עם תמלחת, OOIP = שמן מקורי במקום, IOSV = נפח רוויית שמן ראשונית, POS = אחוז רוויית שמן, Sv = נפח התמלחת שנוסף להתאוששות משנית, SOR = שמן משני שהתאושש לאחר הצפה של מלח, ROC = שמן שיורי בעמודה לאחר התאוששות משנית, ROS = רוויית שמן שיורית, ROR = שמן שיורי שהתאושש לאחר הצפה ביו-קרקעית, AOR = שמן נוסף שהתאושש

טבלה 1: הדמיית שחזור שמן משופר בעמודת חבילת חול.

Figure 4
איור 4: בדיקת בדיקות סקר לייצור חומרים ביולוגיים (א) בדיקת התמוטטות טיפה: טיפת המים לא קרסה לאחר שנוספו למשטח המצופה בשמן, בעוד שהחיידקים הכימיים פעילי השטח והסופרנאטים נטולי התאים של שלושת זני החיידקים גרמו לקריסת הטיפה. (ב) בדיקת תזוזת שמן: טיפת המים לא גרמה לתזוזה של השמן, בעוד שפעילי השטח הכימיים והסופרנאטורים נטולי התאים של שלושת זני החיידקים עקרו את שכבות השמן (c) בדיקת אינדקס האמולסיה: הסופרנאטנטים נטולי התאים ותמיסת פעילי השטח המסחרית הביאו כולם להיווצרות אינדקס תחליב יציב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הפחתת מתח פני השטח עקב ייצור חומרים ביולוגיים. קביעת הפחתת מתח הפנים של המדיום עקב צמיחה מיקרוביאלית אישרה את ייצור החומרים הביולוגיים על ידי החברים המיקרוביאליים. עקב צמיחתם של רודוקוקוס sp. IITD 102 ו - Lysinibacillus sp. IITD 104, מתח הפנים של המדיום פחת מ-59 mN/m ל-45 mN/m. עקב צמיחתו של Paenibacillus sp. IITD 108, מתח הפנים של המדיום פחת מ-59 mN/m ל-28 mN/m. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: יציבות תחליב בטמפרטורות שונות (א), (ב) ערכי pH ו-(ג) ריכוזי מלח. כל האמולסיות הנוצרות באמצעות הסופרנאטים של שלושת הזנים המיקרוביאליים והתערובת של חומרים פעילי שטח מסחריים מראים יציבות רבה בתנאים סביבתיים שונים. בטווחי הטמפרטורה, ה-pH וריכוז המלח שנבדקו, מדדי האמולסיה שנקבעו היו דומים ולא נצפתה הפחתה משמעותית של EI בערכים גבוהים יותר של הגורמים המשתנים, מה שמרמז על כך שניתן להשתמש בביו-surfactant בתנאים סביבתיים קיצוניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: אפיון TLC של חומרים ביולוגיים (a) צלחות מוכתמות באדי יוד: כתמים שונים שפותחו על צלחת TLC מראים שהביו-surfactants המופקים הם תערובת של תרכובות שונות המכילות קבוצת שומנים. הכתמים המסומנים בחץ כחול מייצגים את ה-biosurfactants, אשר הוכתמו כחיוביים לנוכחותם של שומנים. הכתמים האחרים מייצגים את שאר התרכובות הקיימות בתערובת של הביו-ריאקטנט הגולמי. (ב) צלחות מוכתמות בנינהידרין: לא הופיעו כתמים סגולים כאשר הלוחות הוכתמו בנינהידרין. זה ייצג היעדר של חומצות אמינו בתערובת הביו-אקטיבית ו-(ג) צלחות מוכתמות באניסלדהיד: כתמים ירוקים וצהובים בהירים הופיעו על צלחת TLC ואלה מייצגים את התרכובות המכילות סוכרים. הכתמים המסומנים בחצים שחורים מייצגים את החומרים הביולוגיים שהוכתמו כחיוביים לנוכחותו של מואטי הפחמימות. הכתמים המוכתמים הן ביוד והן באניסלדהיד מייצגים תרכובות המכילות גם שומנים וגם פחמימות, וייתכן שהם מהווים חומר ביולוגי גליקוליפידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: אפיון כימי של החומר הביולוגי המופק מ-Rhodococcus sp. IITD 102 ומ-Lysinibacillus sp. IITD 104. (א) מייצג את ספקטרום FT-IR של הביו-surfactants המופקים מ-Rhodococcus sp. IITD 102 ו-Lysinibacillus sp. IITD 104, (b) מייצג את ספקטרום H1 NMR של הביו-surfactants המופקים מ-Rhodococcus sp. IITD 102 ו-Lysinibacillus sp. IITD 104, ו-(c) מראה את המבנה של החומרים הביולוגיים הגולמיים שהופקו מ-Rhodococcus sp. IITD 102 ו-Lysinibacillus sp. IITD 104. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: אפיון כימי של החומר הביו-אקטיבי המופק מ-Paenibacillus sp. IITD 108. (a) מייצג את ספקטרום FT-IR של הביו-surfactants המופקים מ - Paenibacillus sp. IITD 108, (b) מייצג את ספקטרום 1H NMR של הביו-surfactants המופקים מ - Paenibacillus sp. IITD 108, ו- (c) מראה את המבנה של הביו-surfactants הגולמיים המופקים מ - Paenibacillus sp. IITD 108. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור S1: מבנה של סוגים שונים של חומרים ביולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה S1: השפעת חומרים ביולוגיים על המתח הבין-קרקעי (IFT) בין מים לפחמימנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חומרים ביולוגיים הם אחת הקבוצות המגוונות ביותר של רכיבים פעילים ביולוגית שהופכים לחלופות אטרקטיביות לחומרים פעילי שטח כימיים. יש להם מגוון רחב של יישומים בתעשיות רבות כגון חומרי ניקוי, צבעים, קוסמטיקה, מזון, תרופות, חקלאות, נפט וטיפול במים בשל יציבותם הטובה יותר, CMC נמוך יותר, מבנה מגוון וידידותיות לסביבה18. זה הוביל לעניין גובר בגילוי זנים מיקרוביאליים נוספים המסוגלים לייצר חומרים ביולוגיים. כאן אנו ממחישים את שיטות הסינון, הזיהוי והיישום של תערובת של חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104, ו- Paenibacillus sp. IITD 108, להתאוששות משופרת של שמן. ייצור חומרים ביולוגיים נבדק על ידי קריסת ירידה, התפשטות נפט, בדיקת מדד תחליב ואושר על ידי מדידת הירידה במתח הפנים של המדיום עקב צמיחה מיקרוביאלית. דיווחים שונים על ייצור של חומרים ביולוגיים גליקוליפידים (rhamnolipids ו trehalolipids) מ Rhodococcus זמינים בספרות 19,20,21,22,23,24. נג'אפי ואחרים דיווחו על ייצור ואופטימיזציה של תרופה ביולוגית ליפופפטידית מ-Paenibacillus sp. alvei ARN6325. Bezza et al. דיווחו על פירוק ביולוגי של פירן על ידי תרופה ביולוגית ליפופפטידית המיוצרת על ידי Paenibacillus dendritiformis CN526. ייצור ביו-surfactant (ליפופפטידים וגליקוליפידים) דווח גם על ידי זנים אחרים של Paenibacillus 27,28,29,30,31. דווח כי מינים שונים של Lysinibacillus מייצרים חומרים ביולוגיים 32,33,34. דווח כי Lysinibacillus sphaericus מייצר ראמנוליפידים המסוגלים לסולוביליזציה של חומרי הדברה הידרופוביים35.

אחד היתרונות שרכיבים ביולוגיים מציעים על פני עמיתיהם הכימיים הוא יציבותם בתנאים סביבתיים קיצוניים. החומרים הביולוגיים שיוצרו על ידי Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104, ו - Paenibacillus sp. IITD 108 נבדקו ליציבותם תחת טווחים שונים של ריכוזי טמפרטורה, pH ומלח ונמצאו יציבים תחת ערכים קיצוניים של פרמטרים אלה. בעבר, Habib et al. דיווחו על ליפופפטיד המיוצר על ידי פחמימנים מתפרקים של Rhodococcus sp. שהראה יציבות בטווחים שונים של טמפרטורות, ערכי pH וריכוזי מלח36. עלייה בריכוז המלחים האנאורגניים דווחה כמגבירה את יציבות האמולסיה37. הנטייה של הקולואידים להתאגד או להיפרד היא פונקציה של הכוחות האטרקטיביים (Van der Walls) והדוחים (כוחות אלקטרוסטטיים) המעורבים במהלך אינטראקציה בין חלקיקים38. גבישי המלח על המסתם למים יוצרים מטענים חשמליים משלהם והיונים שחררו ספיחה על טיפות האמולסיה. עם הגדלת ריכוז המלח, ההתרחבות והדחייה של השכבה השנייה פוחתת. כמו כן, ככל שצפיפות המטען של יון גבוהה יותר, כך אורך השכבה החשמלית נמוך יותר. לפיכך, קטיונים דיוואלנטיים כגון Na2+ גורמים להיווצרות של תחליבים יציבים יותר בהשוואה לקטיונים חד-ערכיים39.

יתרון נוסף שיש לחומרים ביולוגיים על פני חומרים פעילי שטח כימיים הוא שהם מתכלים40. Zeng et al. השוו את יכולות ההשפלה של פעילי השטח הסינתטיים Triton X 100, אלקילבנזן סולפונטים ליניאריים (LAS) ו-rhamnolipid ומצאו כי ה-rhamnolipid biosurfactant הושפל לחלוטין ואילו LAS ו-Triton X 100 הושפלו רק באופן חלקי41. Liu et al. מדווחים גם כי בניגוד לחומרים פעילי שטח סינתטיים CTAB, Triton X 100 ו- SDS, rhamnolipid אינם מפגינים רעילות ועלולים להתפרק בקלות על ידי B. subtilis ומיקרואורגניזמים קומפוסט אחרים42.

החומרים הביולוגיים המיוצרים על ידי כל שלושת הזנים המיקרוביאליים נמצאו כגליקוליפידים. בעבר דווח כי רודוקוקוס מייצר גליקוליפידים על ידי קבוצות מחקר שונות 20,21,23. דיווחים דומים על ייצור חומרים ביולוגיים של גליקוליפידים על ידי ליסיניבאצילוס ופאניבצילוס זמינים גם בספרות 31,32,35,43,44. זיהוי כימי של החומרים הביולוגיים גילה שהם רהמנוליפידים. רמנוליפידים הם סוג של חומרים ביולוגיים גליקוליפידים המכילים יחידת ראמנוז אחת או שתיים המחוברות לשרשרת שומנים45. הם הסוג הנחקר ביותר של חומרים ביולוגיים. דווח כי זנים מיקרוביאליים שונים מייצרים ראמנוליפידים 7,46,47,48,49. דווח כי רמנוליפידים מפגינים פוטנציאל גבוה לשיפור ההתאוששות של שאריות הנפט 50,51,52,53. במחקר שלנו, מצאנו שהתערובת של חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104, ו- Paenibacillus sp. IITD 108 התאוששה בהצלחה סביב 56.52% מהשמן השיורי בבדיקת עמודי חול מדומה. זה הראה כי תערובת של biosurfactants יכול לשמש להתאוששות של שאריות נפט ממאגרי הקרקע. בבדיקת חבילת חול דומה, Sun et al. דיווחו כי חומר ביולוגי הצליח לשחזר 50% מהשמן השיורי54. כמו כן דווח כי חומרים ביולוגיים המכילים מרק ללא תאים של Bacillus subtilis יעילים בהתאוששות של 33% משאריות השמן55. התאוששות שארית של 27% ו-26%-36% דווחה גם על ידי Darvishi et al. ו-Wahabi et al.56,57.

הערכה כלכלית של חומרים ביולוגיים להתאוששות של שאריות נפט ממאגרים מראה כי ניצול של חומרים ביולוגיים ב-EOR הוא אפשרות מעשית מבחינה כלכלית. Moutinho et al. דיווחו כי העלות האופיינית של חומר ביולוגי מסחרי (rhamnolipids) היא סביב 59.6 דולר לק"ג58. במחקר אחר, דווח גם כי הריכוז הביו-surfactant של 28 מ"ג/ל' של ביו-surfactant שיפר את התאוששות שאריות השמן והוביל לייצור של 52.5 מ"ק3 של שמן נוסף59. המחקרים הראו כי ריכוז ביו-surfactant של 10 מ"ג/ל' הספיק כדי לגייס את התאוששות השמן. על פי הנתונים המדווחים, כמות החומרים הביולוגיים הנדרשת להפקת 52.5 מ"ק3 של נפט נוסף היא סביב 0.525 ק"ג. העלות הכוללת של ייצור נפט ב-52.5 מ'3 היא כ-21,463 דולר, מתוכם רק 30 דולר הם עלות הייצור של החומר הביולוגי. הנתונים מראים כי אחוז העלות של חומר הביו-אקטיבי בהפקת נפט לחבית הוא רק 0.0000139%.

התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להשתמש ביעילות בשילוב של החומרים הביולוגיים כדי לשחזר שאריות של נפט מהמאגרים. למיטב ידיעתנו, זהו הדו"ח הראשון על שיפור ההתאוששות של שאריות הנפט מהמאגר באמצעות תערובת של חומרים ביולוגיים המיוצרים על ידי זנים מיקרוביאליים שונים. למרות שהמחקר שלנו מתאר בבירור את השיטות הכרוכות בסינון, אפיון מבני ויישום של חומרים ביולוגיים בהתאוששות משופרת של שמן, המחקר אינו מספק אפיון פונקציונלי מפורט של החומרים הביולוגיים, המשפיעים על יעילותם ביישומים שונים. ריכוז מיקל קריטי, שהוא מדד היעילות של כל חומר פעילי שטח ביצירת המיצלות ומציין את הריכוז המגביל של החומר פעילי השטח לשימוש משמעותי בו, לא נקבע במחקר הנוכחי60. באופן דומה, גם היציבות התרמית של החומר הביולוגי, הקובעת את תחולתו בתנאי המאגר עבור EOR, לא תוארה61. חומרים ביולוגיים ביישומים מסוימים משמשים גם כסוכני אנטי-ביופילם. לרטיבות פני השטח שלהם יש תפקיד חשוב בקביעת אופי האנטי-ביופילם שלהם. גם מחקרי רטיבות פני השטח לא בוצעו בעבודה הנוכחית62. מאפיינים פונקציונליים אחרים החשובים ביישומים שונים של חומרים ביולוגיים, הכוללים את ההתכלות הביולוגית שלהם ואת האופי האנטי-מיקרוביאלי, גם הם לא נקבעו במחקר זה63,64. לפיכך, התמקדנו באפיון המבני של חומרים ביולוגיים. בהתאם ליישום היעד, ניתן לבצע אפיון פונקציונלי כגון יציבות, פירוק ביולוגי ופעילות אנטי-מיקרוביאלית.

במבחן קריסת הטיפה ובבדיקת התפשטות השמן, כדי להגדיל את הנראות, עדיף להשתמש בשמן שיש לו צבע כלשהו. במבחן התפשטות השמן, יש לראות את האמולסיה לאחר 24 שעות. קצף קל, אם נוצר, מתפורר תוך 24 שעות. טנסיומטרים הם מכשירים רגישים מאוד ולכן במהלך מדידות מתח פני השטח, יש לנקות את כלי השיט ואת הגשושית כראוי לפני כל מדידה כדי למנוע שגיאות עקב ביצוע של מדידות אחרונות. מיצוי של חומר ביולוגי כולל תוספת של תערובת מתנול כלורופורמית לסופרנט נטול התאים. הצעד צריך להתבצע במכסה אדים, או שהבקבוקון צריך להיות מכוסה ברדיד אלומיניום מיד לאחר העברת תערובת המיצוי. במהלך התאוששות משנית בניסוי EOR, יש להוסיף תמיסת מלח בעודף עד שלא ייצא שמן נוסף מהעמודה.

השיטה דנה בהיקף התערובת של חומרים ביולוגיים בהתאוששות של שאריות שמן מהעמודים. התהליך תלוי בגורמים רבים. שלב הגדילה של המיקרובים שבו נקטפות התרביות הראשוניות. דווח כי חלק מהביו-surfactants מיוצרים בשלב הלוג, בעוד שאחרים דווחו כמופקים בשלב הנייח. יש לקטוף את התרביות בהתאם בשלב המסוים שבו הייצור הביולוגי הגיע למקסימום שלו. מבחני ההקרנה של Biosurfactant הם פחות רגישים, ולכן יש לבצע את כל הבדיקות לפני שמגיעים למסקנה לגבי יכולת הייצור של זן ביולוגי של זן מסוים. יש לבצע טיהור של חומר הביו-surfactant לפני אפיון כימי של ה-biosurfactant אם ריכוז הביו-surfactant נמוך בביו-surfactant הגולמי. ניסויים משופרים בשיקום נפט תלויים מאוד בסוג האדמה המשמשת לאריזת העמודה. הקרקע חייבת להיות יבשה לחלוטין ויש לנפות אותה כדי להסיר גרגירים גדולים יותר ומזהמים מוצקים אחרים. יש להעדיף תערובת של אדמה חולית ואדמה יבשה (ביחס שווה) לאריזת העמודה. שקע העמוד חייב להיות אטום כראוי עם צמר זכוכית וחרוזי זכוכית כדי למנוע דליפת אדמה מהעמוד במהלך הניסוי.

השיטה המתוארת שימושית לקביעת המשמעות של החומרים הביולוגיים המיוצרים ותערובותיהם בהתאוששות של שמן נוסף בניסוי מדומה בעמודת ארגז חול. לחומרים ביולוגיים שונים יש ספציפיות שונה מכיוון שהם מכילים קבוצות תפקודיות שונות65. שילוב של חומרים ביולוגיים יאפשר סולוביליזציה של פחמימנים מגוונים ולכן יגדיל את שאריות התאוששות הנפט מהמאגרים. השיטה המתוארת תסייע בקביעת הפוטנציאל של תערובות ביו-surfactant ביישומי שדה כגון התאוששות נפט משופרת מבארות נפט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות למחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו, על התמיכה הכספית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, J. D., Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61 (1), 47-64 (1997).
  2. Banat, I. M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology. 51 (1), 1-12 (1995).
  3. Singh, A., Van Hamme, J. D., Ward, O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances. 25 (1), 99-121 (2007).
  4. Shah, N., Nikam, R., Gaikwad, S., Sapre, V., Kaur, J. Biosurfactant: types, detection methods, importance and applications. Indian Journal of Microbiology Research. 3 (1), 5-10 (2016).
  5. McClements, D. J., Gumus, C. E. Natural emulsifiers-Biosurfactants, phospholipids, biopolymers, and colloidal particles: Molecular and physicochemical basis of functional performance. Advances in Colloid and Interface Science. 234, 3-26 (2016).
  6. Nguyen, T. T., Youssef, N. H., McInerney, M. J., Sabatini, D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Research. 42 (6-7), 1735-1743 (2008).
  7. Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 54 (5), 625-633 (2000).
  8. Banat, I. M., Makkar, R. S., Cameotra, S. S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53 (5), 495-508 (2000).
  9. Mulugeta, K., Kamaraj, M., Tafesse, M., Aravind, J. A review on production, properties, and applications of microbial surfactants as a promising biomolecule for environmental applications. Strategies and Tools for Pollutant Mitigation: Avenues to a Cleaner Environment. , 3-28 (2021).
  10. Sharma, J., Sundar, D., Srivastava, P. Biosurfactants: Potential agents for controlling cellular communication, motility, and antagonism. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 727070 (2021).
  11. Vijayakumar, S., Saravanan, V. Biosurfactants-types, sources and applications. Research Journal of Microbiology. 10 (5), 181-192 (2015).
  12. Curiel-Maciel, N. F., et al. Characterization of enterobacter cloacae BAGM01 producing a thermostable and alkaline-tolerant rhamnolipid biosurfactant from the Gulf of Mexico. Marine Biotechnology. 23 (1), 106-126 (2021).
  13. Nikolova, C., Gutierrez, T. Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry: current state of knowledge and future perspectives. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  14. Rastogi, S., Tiwari, S., Ratna, S., Kumar, R. Utilization of agro-industrial waste for biosurfactant production under submerged fermentation and its synergistic application in biosorption of Pb2. Bioresource Technology Reports. 15, 100706 (2021).
  15. Zargar, A. N., Lymperatou, A., Skiadas, I., Kumar, M., Srivastava, P. Structural and functional characterization of a novel biosurfactant from Bacillus sp. IITD106. Journal of Hazardous Materials. 423, Pt B 127201 (2022).
  16. Adnan, M., et al. Functional and structural characterization of pediococcus pentosaceus-derived biosurfactant and its biomedical potential against bacterial adhesion, quorum sensing, and biofilm formation. Antibiotics. 10 (11), 1371 (2021).
  17. Du Nouy, P. L. A new apparatus for measuring surface tension. The Journal of General Physiology. 1 (5), 521-524 (1919).
  18. Akbari, S., Abdurahman, N. H., Yunus, R. M., Fayaz, F., Alara, O. R. Biosurfactants-a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnology Research and Innovation. 2 (1), 81-90 (2018).
  19. Bicca, F. C., Fleck, L. C., Ayub, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia. 30 (3), 231-236 (1999).
  20. Kuyukina, M. S., et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. Journal of Microbiological Methods. 46 (2), 149-156 (2001).
  21. Philp, J., et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Applied Microbiology and Biotechnology. 59 (2), 318-324 (2002).
  22. Mutalik, S. R., Vaidya, B. K., Joshi, R. M., Desai, K. M., Nene, S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp. MTCC 2574. Bioresource Technology. 99 (16), 7875-7880 (2008).
  23. Shavandi, M., Mohebali, G., Haddadi, A., Shakarami, H., Nuhi, A. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces. 82 (2), 477-482 (2011).
  24. White, D., Hird, L., Ali, S. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp., strain PML026. Journal of Applied Microbiology. 115 (3), 744-755 (2013).
  25. Najafi, A., et al. Interactive optimization of biosurfactant production by Paenibacillus alvei ARN63 isolated from an Iranian oil well. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 82 (1), 33-39 (2011).
  26. Bezza, F. A., Chirwa, E. M. N. Pyrene biodegradation enhancement potential of lipopeptide biosurfactant produced by Paenibacillus dendritiformis CN5 strain. Journal of Hazardous Materials. 321, 218-227 (2017).
  27. Jimoh, A. A., Lin, J. Biotechnological applications of Paenibacillus sp. D9 lipopeptide biosurfactant produced in low-cost substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (3), 921-941 (2020).
  28. Liang, T. -W., et al. Exopolysaccharides and antimicrobial biosurfactants produced by Paenibacillus macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (2), 933-950 (2014).
  29. Mesbaiah, F. Z., et al. Preliminary characterization of biosurfactant produced by a PAH-degrading Paenibacillus sp. under thermophilic conditions. Environmental Science and Pollution Research. 23 (14), 14221-14230 (2016).
  30. Quinn, G. A., Maloy, A. P., McClean, S., Carney, B., Slater, J. W. Lipopeptide biosurfactants from Paenibacillus polymyxa inhibit single and mixed species biofilms. Biofouling. 28 (10), 1151-1166 (2012).
  31. Gudiña, E. J., et al. Novel bioemulsifier produced by a Paenibacillus strain isolated from crude oil. Microbial Cell Factories. 14 (1), 1-11 (2015).
  32. Pradhan, A. K., Pradhan, N., Sukla, L. B., Panda, P. K., Mishra, B. K. Inhibition of pathogenic bacterial biofilm by biosurfactant produced by Lysinibacillus fusiformis S9. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (2), 139-149 (2014).
  33. Manchola, L., Dussán, J. Lysinibacillus sphaericus and Geobacillus sp biodegradation of petroleum hydrocarbons and biosurfactant production. Remediation Journal. 25 (1), 85-100 (2014).
  34. Bhardwaj, G., Cameotra, S. S., Chopra, H. K. Biosurfactant from Lysinibacillus chungkukjangi from rice bran oil sludge and potential applications. Journal of Surfactants and Detergents. 19 (5), 957-965 (2016).
  35. Gaur, V. K., et al. Rhamnolipid from a Lysinibacillus sphaericus strain IITR51 and its potential application for dissolution of hydrophobic pesticides. Bioresource Technology. 272, 19-25 (2019).
  36. Habib, S., et al. Production of lipopeptide biosurfactant by a hydrocarbon-degrading Antarctic Rhodococcus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6138 (2020).
  37. Shao, P., Ma, H., Zhu, J., Qiu, Q. Impact of ionic strength on physicochemical stability of o/w emulsions stabilized by Ulva fasciata polysaccharide. Food Hydrocolloids. 69, 202-209 (2017).
  38. Trefalt, G., Borkovec, M. Overview of DLVO theory. , Available from: https://archive-ouverte.unige.ch/unige:148595 (2014).
  39. Kazemzadeh, Y., Ismail, I., Rezvani, H., Sharifi, M., Riazi, M. Experimental investigation of stability of water in oil emulsions at reservoir conditions: Effect of ion type, ion concentration, and system pressure. Fuel. 243, 15-27 (2019).
  40. Chong, H., Li, Q. Microbial production of rhamnolipids: opportunities, challenges and strategies. Microbial Cell Factories. 16 (1), 1-12 (2017).
  41. Zeng, G., et al. Co-degradation with glucose of four surfactants, CTAB, Triton X-100, SDS and Rhamnolipid, in liquid culture media and compost matrix. Biodegradation. 18 (3), 303-310 (2007).
  42. Liu, G., et al. Advances in applications of rhamnolipids biosurfactant in environmental remediation: a review. Biotechnology and Bioengineering. 115 (4), 796-814 (2018).
  43. John, W. C., Ogbonna, I. O., Gberikon, G. M., Iheukwumere, C. C. Evaluation of biosurfactant production potential of Lysinibacillus fusiformis MK559526 isolated from automobile-mechanic-workshop soil. Brazilian Journal of Microbiology. 52 (2), 663-674 (2021).
  44. Naing, K. W., et al. Isolation and characterization of an antimicrobial lipopeptide produced by Paenibacillus ehimensis MA2012. Journal of Basic Microbiology. 55 (7), 857-868 (2015).
  45. Wittgens, A., et al. Novel insights into biosynthesis and uptake of rhamnolipids and their precursors. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (7), 2865-2878 (2017).
  46. Rahman, K., Rahman, T. J., McClean, S., Marchant, R., Banat, I. M. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnology Progress. 18 (6), 1277-1281 (2002).
  47. Bahia, F. M., et al. Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  48. Kim, C. H., et al. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environment Research. 91 (8), 739-747 (2019).
  49. Nalini, S., Parthasarathi, R. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production from Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its biocontrol efficacy against Fusarium wilt of eggplant. Annals of Agrarian Science. 16 (2), 108-115 (2018).
  50. Wang, Q., et al. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology and Bioengineering. 98 (4), 842-853 (2007).
  51. Câmara, J., Sousa, M., Neto, E. B., Oliveira, M. Application of rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa in microbial-enhanced oil recovery (MEOR). Journal of Petroleum Exploration and Production Technology. 9 (3), 2333-2341 (2019).
  52. Amani, H., Mehrnia, M. R., Sarrafzadeh, M. H., Haghighi, M., Soudi, M. R. Scale up and application of biosurfactant from Bacillus subtilis in enhanced oil recovery. Applied Biochemistry and Biotechnology. 162 (2), 510-523 (2010).
  53. Gudiña, E. J., et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation. Bioresource Technology. 177, 87-93 (2015).
  54. Sun, G., Hu, J., Wang, Z., Li, X., Wang, W. Dynamic investigation of microbial activity in microbial enhanced oil recovery (MEOR). Petroleum Science and Technology. 36 (16), 1265-1271 (2018).
  55. Jha, S. S., Joshi, S. J., SJ, G. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian Journal of Microbiology. 47 (4), 955-964 (2016).
  56. Darvishi, P., Ayatollahi, S., Mowla, D., Niazi, A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 84 (2), 292-300 (2011).
  57. Al-Wahaibi, Y., et al. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B30 and its application in enhancing oil recovery. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 114, 324-333 (2014).
  58. Moutinho, L. F., Moura, F. R., Silvestre, R. C., Romão-Dumaresq, A. S. Microbial biosurfactants: A broad analysis of properties, applications, biosynthesis, and techno-economical assessment of rhamnolipid production. Biotechnology Progress. 37 (2), 3093 (2021).
  59. Youssef, N., Simpson, D. R., McInerney, M. J., Duncan, K. E. In-situ lipopeptide biosurfactant production by Bacillus strains correlates with improved oil recovery in two oil wells approaching their economic limit of production. International Biodeterioration & Biodegradation. 81, 127-132 (2013).
  60. Ruckenstein, E., Nagarajan, R. Critical micelle concentration and the transition point for micellar size distribution. The Journal of Physical Chemistry. 85 (20), 3010-3014 (1981).
  61. de Araujo, L. L., et al. Microbial enhanced oil recovery using a biosurfactant produced by Bacillus safensis isolated from mangrove microbiota-Part I biosurfactant characterization and oil displacement test. Journal of Petroleum Science and Engineering. 180, 950-957 (2019).
  62. Banat, I. M., De Rienzo, M. A. D., Quinn, G. A. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (24), 9915-9929 (2014).
  63. Klosowska-Chomiczewska, I., Medrzycka, K., Karpenko, E. Biosurfactants-biodegradability, toxicity, efficiency in comparison with synthetic surfactants. Research and Application of New Technologies in Wastewater Treatment and Municipal Solid Waste Disposal in Ukraine, Sweden, and Poland. 17, 141-149 (2013).
  64. Fernandes, P. A. V., et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (4), 704-709 (2007).
  65. Santos, D. K. F., Rufino, R. D., Luna, J. M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 401 (2016).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 184
התאוששות שמן משופרת באמצעות שילוב של חומרים ביולוגיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter