Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Forbedret oljeutvinning ved hjelp av en kombinasjon av biosurfaktanter

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

Vi illustrerer metodene som er involvert i screening og identifisering av biosurfactanten som produserer mikrober. Metoder for kromatografisk karakterisering og kjemisk identifisering av biosurfaktantene, som bestemmer biosurfaktens industrielle anvendbarhet i å forbedre utvinning av restolje, presenteres også.

Abstract

Biosurfactants er overflateaktive forbindelser som er i stand til å redusere overflatespenningen mellom to faser av forskjellige polariteter. Biosurfactants har dukket opp som lovende alternativer til kjemiske overflateaktive stoffer på grunn av mindre toksisitet, høy biologisk nedbrytbarhet, miljøkompatibilitet og toleranse for ekstreme miljøforhold. Her illustrerer vi metodene som brukes for screening av mikrober som er i stand til å produsere biosurfaktanter. Biosurfactanten som produserer mikrober ble identifisert ved hjelp av fallkollaps, oljespredning og emulsjonsindeksanalyser. Biosurfactant produksjon ble validert ved å bestemme reduksjonen i overflatespenningen til media på grunn av veksten av de mikrobielle medlemmene. Vi beskriver også metodene som er involvert i karakterisering og identifisering av biosurfaktanter. Tynn lagkromatografi av det ekstraherte biosurfaktanten etterfulgt av differensialfarging av platene ble utført for å bestemme biosurfaktens natur. LCMS, 1H NMR og FT-IR ble brukt til kjemisk å identifisere biosurfactanten. Vi illustrerer videre metodene for å evaluere anvendelsen av kombinasjonen av produserte biosurfaktanter for å forbedre utvinningen av restolje i en simulert sandpakkekolonne.

Introduction

Biosurfaktanter er de amfipatiske overflateaktive molekylene produsert av mikroorganismer som har kapasitet til å redusere overflaten og den interfaciale spenningen mellom to faser1. Et typisk biosurfaktant inneholder en hydrofil del som vanligvis består av en sukkermoiety eller en peptidkjede eller hydrofil aminosyre og en hydrofob del som består av en mettet eller umettet fettsyrekjede2. På grunn av deres amfipatiske natur samles biosurfaktanter i grensesnittet mellom de to fasene og reduserer den interfaciale spenningen ved grensen, noe som letter spredningen av en fase inn i de andre 1,3. Ulike typer biosurfaktanter som er rapportert så langt inkluderer glykolipider der karbohydrater er knyttet til langkjedede alifatsyrer eller hydroksy-alifatsyrer via esterbindinger (f.eks. rhamnolipider, trehalolipider og soforolipider), lipopeptider der lipider er festet til polypeptidkjeder (f.eks. overflateaktivin og lavysin) og polymere biosurfaktanter som vanligvis består av polysakkaridproteinkomplekser (f.eks. emulsjon, liposan, alasan og lipomannan)4. Andre typer biosurfaktanter produsert av mikroorganismer inkluderer fettsyrer, fosfolipider, nøytrale lipider og partikkelbiosurfaktanter5. Den mest studerte klassen av biosurfaktanter er glykolipider, og blant dem er de fleste studiene rapportert på rhamnolipids6. Rhamnolipids inneholder ett eller to molekyler av rhamnose (som danner den hydrofile delen) knyttet til ett eller to molekyler av langkjedet fettsyre (vanligvis hydroksy-decanoinsyre). Rhamnolipids er primære glykolipider rapportert først fra Pseudomonas aeruginosa7.

Biosurfactants har fått økende fokus sammenlignet med deres kjemiske kolleger på grunn av ulike unike og særegne egenskaper som de tilbyr8. Disse inkluderer høyere spesifisitet, lavere toksisitet, større mangfold, enkel forberedelse, høyere biologisk nedbrytbarhet, bedre skumming, miljøkompatibilitet og aktivitet under ekstreme forhold9. Strukturelt mangfold av biosurfaktantene (figur S1) er en annen fordel som gir dem en fordel over de kjemiske motstykkene10. De er generelt mer effektive og effektive ved lavere konsentrasjoner, da deres kritiske micellekonsentrasjon (CMC) vanligvis er flere ganger lavere enn kjemiske overflateaktive stoffer11. De har blitt rapportert å være svært termostabile (opptil 100 °C) og tåler høyere pH (opptil 9) og høye saltkonsentrasjoner (opptil 50 g/l)12 og gir dermed flere fordeler i industrielle prosesser, noe som krever eksponering for ekstreme forhold13. Biologisk nedbrytbarhet og lavere toksisitet gjør dem egnet for miljøapplikasjoner som bioremediering. På grunn av fordelene de tilbyr, har de fått økt oppmerksomhet i ulike bransjer som mat, landbruk, vaskemiddel, kosmetikk og petroleumsindustri11. Biosurfaktanter har også fått mye oppmerksomhet i oljeutbedring for fjerning av petroleumsforurensninger og giftige miljøgifter14.

Her rapporterer vi produksjon, karakterisering og anvendelse av biosurfaktanter produsert av Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108. Trinnene som er involvert i screening, karakterisering og anvendelse av en kombinasjon av biosurfaktanter for økt oljeutvinning er skissert i figur 1.

Figure 1
Figur 1: En metode for økt oljeutvinning ved hjelp av en kombinasjon av biosurfaktanter. Den trinnvise arbeidsflyten vises. Arbeidet ble utført i fire trinn. Først ble de mikrobielle stammene dyrket og screenet for produksjon av biosurfactant av ulike analyser, som inkluderte fallkollapsanalyse, oljespredningsanalyse, emulsjonsindeksanalyse og overflatespenningsmåling. Deretter ble biosurfaktantene hentet fra den cellefrie buljongen og deres natur ble identifisert ved hjelp av tynn lagkromatografi, og de ble ytterligere identifisert ved hjelp av LCMS, NMR og FT-IR. I neste trinn ble de ekstraherte biosurfaktantene blandet sammen, og potensialet til den resulterende blandingen for økt oljeutvinning ble bestemt ved hjelp av sandpakkekolonneteknikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Screening av disse mikrobielle stammene for å produsere biosurfaktanter ble gjort ved fallkollaps, oljespredning, emulsjonsindeksanalyse og bestemmelse av reduksjon i overflatespenningen til det cellefrie mediet på grunn av vekst av mikrober. Biosurfaktantene ble ekstrahert, karakterisert og kjemisk identifisert av LCMS, 1H NMR og FT-IR. Til slutt ble en blanding av biosurfaktanter produsert av disse mikrober tilberedt og ble brukt til å gjenvinne restoljen i en simulert sandpakkekolonne.

Den nåværende studien illustrerer bare metodene som er involvert i screening, identifisering, strukturell karakterisering og anvendelse av biosurfactantkombinasjonen for å forbedre restoljeutvinningen. Det gir ikke en detaljert funksjonell karakterisering av biosurfaktantene produsert av de mikrobielle stammene 15,16. Ulike eksperimenter som kritisk micellebestemmelse, termogravimetrisk analyse, overflate våthet og biologisk nedbrytbarhet utføres for detaljert funksjonell karakterisering av biosurfactant. Men siden dette papiret er et metodepapir, er fokuset på screening, identifikasjon, strukturell karakterisering og anvendelse av biosurfactantkombinasjonen for å forbedre utvinning av restolje; disse eksperimentene er ikke inkludert i denne studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vekst av mikrobielle stammer

  1. Vei 2 g Luria Broth pulver og legg til 50 ml destillert vann i en 250 ml konisk kolbe. Bland innholdet til pulveret oppløses helt og utgjør volumet til 100 ml ved hjelp av destillert vann.
  2. På samme måte, lag to kolber på 100 ml Luria Broth og legg bomullsplugger på halsen på kolber.
  3. Dekk bomullspluggene med aluminiumsfolie og autoklaver kolber i 15 min ved 121 °C og 15 psi for å sterilisere mediet.
  4. Etter autoklavering, la mediet avkjøles til romtemperatur.
  5. For fremstilling av primærkultur av en stamme, velg en enkelt koloni fra en LA-plate ved hjelp av en inokulasjonssløyfe og inokulere i et reagensrør som inneholder 5 ml steril Luria buljong.
  6. Inkuber reagensrøret over natten ved 30 °C ved 180 o/min.
  7. Inokuler kolbeene som inneholder 100 ml autoklavert Luria Broth ved å tilsette 1 ml over natten dyrkede frøkulturer til kolbeene inne i laminærluftstrømskapet.
  8. Inkuber kolber i en roterende inkubator ved 30 °C og 180 o/min i 7 dager.
  9. Etter ferdigstillelse av inkubasjonsperioden, høst kolber og overfør kulturbuljongen til sentrifugerørene. Sentrifuger kulturen på 4500 x g i 20 min i en nedkjølt sentrifuge ved 4 °C.
  10. Hell forsiktig cellen fri supernatant i et friskt beger og bruk det i screeninganalyser for biosurfactantproduksjon.

2. Screeninganalyser for biosurfactant produksjon

MERK: I de følgende avsnittene ble kommersielt overflateaktivt middel (Saponin) brukt som en positiv kontroll mens vann og uinokulerte medier ble brukt som en negativ kontroll.

  1. Drop-skjul-analyse
    1. Ta en ren glasssklie og belegge overflaten på lysbildet med 200 μL olje.
    2. Tilsett 20 μL av cellen fri supernatant i midten av oljen og la den være uforstyrret i 2-3 min.
      MERK: Hvis fallet kollapser, skårer du det supernatante positive for tilstedeværelsen av biosurfactant.
  2. Analyse av oljespredning
    1. Ta 20 ml dobbelt destillert vann i en Petri-plate (75 mm diameter) og tilsett 200 μL råolje til overflaten av vannet.
    2. Tilsett 20 μL cellefri supernatant i midten av oljen og la den være uforstyrret i 1 min.
      MERK: Hvis det dannes en avregningssone på grunn av oljeforskyvning, skårer du det supernatante positive for tilstedeværelsen av biosurfakten.
  3. Emusjonsindeksanalyse (E24-analyse )
    1. Tilsett 4 ml bensin og cellefritt supernatant i et rent glassrør.
    2. Virvel blandingen kraftig i 3 min og la den være uforstyrret i de neste 24 timer.
    3. Etter 24 timer, bestem E24-indeksen som en prosentandel av høyden på det emulgert lag (cm) med hensyn til høyden på hele væskekolonnen (cm).
      Equation 1
      MERK: Hvis en emulsjon (olje i vann eller vann i olje) observeres etter 24 timer, vil supernatanten sannsynligvis inneholde biosurfakten.
  4. Måling av overflatespenning
    MERK: Overflatespenningen ble målt ved hjelp av Du Noüy-ringmetoden17. Instrumentet som brukes i dette eksperimentet (se Materialliste) er svært følsomt, så sørg for riktig rengjøring av glassbeholderen og sonden.
    1. Slå på systemet og dobbeltklikk på den tilknyttede programvaren for å åpne den.
    2. Rengjør glassbeholderen med væsken hvis overflatespenning skal bestemmes.
    3. Tilsett væsken (40 ml) i fartøyet og monter fartøyet på beholderen.
    4. Lås opp probeholderen og monter proben på den. Lås nå probeholderen ved å trykke på låsknappen på den manuelle kontrolleren.
    5. Bruk den manuelle kontrolleren til å justere høyden på plattformen slik at sonden er rundt 2-3 mm fra overflaten av væsken.
    6. Bruk nå programvaren til å måle overflatespenningen. Klikk på Fil plassert øverst til venstre på skjermen. Klikk Åpne arbeidsområde. Et popup-vindu vises.
    7. Rull ned og dobbeltklikk på ikonet K100: Surface og Interfacial Tension .
    8. Klikk nå på Fil-ikonet øverst til venstre på skjermen. Klikk ny database. Skriv inn navnet for å lagre dataene og klikk på OK.
    9. Igjen, klikk på Fil > Ny måling > SFT > Ring. Angi navnet på målingen. Kontroller at konfigurasjonsmalen viser SFT-ring.
    10. Fyll ut detaljene i målekonfigurasjonsvinduet ved å velge sonden og fartøyet som brukes til målingen. Fyll også ut detaljene i væsken og gassfasen.
      MERK: Væskefasen vil være vann, mens gassfasen vil være luft. Tettheten av væskefasen er tettheten av cellen fri supernatant. Dette kan bestemmes ved å ta vekten på 50 ml væske og beregne tetthet som kg/m3.
    11. Klikk nå på Prosedyre-fanen og fyll ut følgende detaljer: Deteksjonshastighet: 6 mm / min, Deteksjonsfølsomhet: 0,005 g, Søkehastighet: 6 mm/min, Søkefølsomhet: 0,005 g, Målehastighet: 3 mm/min, Målefølsomhet: 0,001 g, Nedsenkingsdybde: 3 mm, Returavstand: 10%, korreksjon: Harkins &Jordan, maksverdier: 5. Klikk på OK.
    12. I popup-vinduet velger du databasen for å lagre data og klikker på OK.
      MERK: Man kan opprette en ny database her eller legge til nye målinger i eksisterende data.
    13. Klikk nå på Play-knappen øverst på midten av skjermen. Systemet vil begynne å utføre skriptet. Etter at systemet stabiliserer seg, vil det oppdage overflaten. Senk sonden ned i væsken, beveg sonden frem og tilbake og oppdag spenningen i den dannede lamellen.
    14. For å få resultatene, klikk på Måleikonet på midten til venstre på skjermen. Klikk på Data og noter ned overflatespenningen som er bestemt.
    15. Etter ferdigstillelse av målingen, senk høyden på plattformen og lås opp og demonter sonden og fartøyet fra instrumentet.
      MERK: For å bestemme reduksjonen i overflatespenningen på grunn av biosurfaktantproduksjon, bør uinokulert LB brukes som kontroll.

3. Biosurfactant ekstraksjon

  1. Juster pH i cellen uten supernatant til 2 ved hjelp av 2 N HCl. Oppbevar blandingen ved 4 °C over natten.
  2. Tilsett like mye kloroform-metanolblanding (2:1) til supernatanten og bland kraftig i 20 minutter.
  3. La blandingen være uforstyrret for at faseseparasjon skal skje.
  4. Fjern den øvre fasen som inneholder vann og metanol, og la den nedre fasen som inneholder biosurfactanten fordampe i en avtrekkshette.
  5. Etter fordampning av den organiske fasen, redissolve honningfarget rå biosurfactant i 3 ml kloroform og bruk denne blandingen for videre identifisering og karakterisering av biosurfactanten.

4. Emusjonsstabilitetsstudier

  1. Emulsjonsstabilitet ved forskjellige temperaturer
    1. Ta 5 ml cellefrie supernatanter i forskjellige reagensrør.
    2. Tilsett 5 ml bensin i hvert reagensrør og bland kraftig ved virvel i 3 minutter.
    3. Inkuber reagensrørene over natten i forskjellige vannbad ved forskjellige temperaturer (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C og 70 °C).
    4. Etter 24 timer estimerer du emulsjonsindeksene som nevnt tidligere.
  2. Emulsjonsstabilitet ved forskjellige pH-verdier
    1. Ta 5 ml av cellen fri supernatant i rene reagensrør.
    2. Juster pH for cellefrie supernatanter (2, 4, 6, 8 og 10) ved hjelp av 1 N HCl og 1 N NaOH.
    3. Tilsett like mye bensin i reagensrørene og bland kraftig ved virvel i 3 minutter.
    4. La reagensrørene være uforstyrret ved romtemperatur i 24 timer.
    5. Beregn emulsjonsindeksen som nevnt tidligere.
  3. Emulsjonsstabilitet ved ulike saltkonsentrasjoner
    1. Ta 5 ml av cellen fri supernatant i rene reagensrør.
    2. Tilsett forskjellige mengder salt (NaCl) til supernatantene (0 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 60 g/l og 80 g/l).
    3. Løs opp saltene i cellefrie supernatanter ved å virvelere i 3 min.
    4. Tilsett like mye bensin i reagensrørene og bland kraftig ved virvel i 3 minutter.
    5. La reagensrørene være uforstyrret ved romtemperatur i 24 timer.
    6. Beregn emulsjonsindeksen etter 24 timer.

5. Bestemme biosurfaktens natur

  1. TLC av det ekstraherte biosurfaktanten
    1. Spot 20 μL av biosurfaktantene på TLC-plater. Spot 2 μL på en gang.
    2. Se biosurfaktantene på tre forskjellige TLC-plater.
    3. Forbered en 100 ml blanding av eluenten som inneholder kloroform:metanol (2:1) og tilsett eluenten til TLC-kammeret. Lukk lokket på kammeret og la det mette i 20 minutter.
    4. Etter tørking av platene, plasser TLC-platene inne i kammeret mettet med en kloroform metanolblanding og kjør TLC.
    5. Etter at eluenten har nådd toppen av TLC-platen (1 cm fra toppen), ta platene ut og la den lufttørke.
  2. Farging for lipiddeteksjon
    1. Ta et rent TLC-kammer og legg til noen (5-10) granulater av jod i det friske kammeret og mette kammeret i 5 til 10 minutter.
    2. Plasser TLC-platen inne i kammeret og følg utviklingen av de gule flekkene. Hvis flekkene vises, skår biosurfactanten positivt for tilstedeværelsen av lipidkomponenten.
  3. Farging for peptid- eller aminosyredeteksjon
    1. Forbered en ninhydrinløsning ved å oppløse 0,4 g ninhydrin i 20 ml butanol. Tilsett 0,6 ml 100% glasial eddiksyre til blandingen.
    2. Spray TLC-platen med ninhydrinoppløsning og la den lufttørke i 2 min. Varm platen ved 110 °C og følg utviklingen av fargen.
      MERK: Hvis de blå flekkene vises, skår biosurfactanten positivt for tilstedeværelsen av en peptidkjede eller aminosyre.
  4. Farging for karbohydratdeteksjon
    1. Forbered en løsning av p-anisaldehyd ved å tilsette 2 ml p-anisaldehyd til 48 ml issyre som inneholder 1 ml H2SO4. Tilsett 0,6 ml eddiksyre til blandingen.
    2. Spray blandingen jevnt på en TLC-plate og la den lufttørke i 2 minutter.
    3. Inkuber platen ved 110 °C og overvåk utviklingen av flekker.
      MERK: Hvis de grønne eller brune flekkene vises, skår biosurfactanten positivt for tilstedeværelsen av karbohydrater.

6. Kjemisk identifikasjon av biosurfactanten

  1. LCMS av biosurfactanten
    1. Løs opp 25 mg av det ekstraherte biosurfaktanten i 1 ml kloroform.
    2. Utfør LCMS (i en låsespraykonfigurasjon med en referanseskanningsfrekvens på 10 s) ved hjelp av en C18-kolonne.
    3. Bruk kloroform:metanol (1:1) som en mobil fase og injiser 2 μL av prøven i kolonnen med en strømningshastighet på 0,1 ml/min.
    4. Sett de eksperimentelle parametrene til: polaritet: ES positiv, kapillær spenning: 3 kV, kildetemperatur: 80 °C, desolvasjonstemperatur: 300 °C, desolvasjonsgassstrømningshastighet: 7000 l/t og fellegassstrømningshastighet: 0,40 ml/min.
    5. Skann områdene fra 100 til 1200 Da i løpet av en deteksjonstid på 20 minutter og undersøk ionene i positiv ES-modus.
    6. Analyser m/z-verdiene ved hjelp av en hvilken som helst massespektrometrimengdeprogramvare.
    7. For analyse, logg inn på programvaren.
    8. Klikk på Batch Search og skriv inn listen over massene som er oppnådd. Undervis resultatene i en positiv lademodus og bruk M + H og M + Na som adducts. Oppretthold nøyaktigheten til 10 PPM og merk av for Visningsstruktur.
    9. Klikk på Søk og fra listen over forbindelser, velg den med det laveste PPM-nivået.
  2. 1 H NMR av biosurfactanten
    MERK: 1H NMR av biosurfactanten ble utført ved hjelp av et spektrometer på 400 MHz NMR (se Materialfortegnelse).
    1. Løs opp 5 mg av biosurfakten i 1 ml deutert kloroform (CdCl3).
    2. Overfør blandingen til et NMR-rør. Hette røret ordentlig og sett røret inn i nøkkelen. Juster høyden på røret ved hjelp av justeringsrøret.
    3. Plasser røret sammen med nøkkelen i NMR-maskinen og følg trinnene som er nevnt nedenfor for å få et NMR-spektrum.
    4. Slik velger du prøverørtype: sx N, der N er posisjonen der røret ble plassert (f.eks. sx 13, hvis røret ble plassert i 13. posisjon) i tilhørende programvare.
    5. Skriv inn edc, og trykk ENTER for å opprette en ny mappe der data kan lagres.
    6. Et popup-vindu vises. Velg løsningsmidlet ved å klikke på CdCl 3 i listen og skriv inn navnet på prøven.
    7. Hvis du vil starte protokollen, skriver du inn "getprosol"; for å låse løsningsmidlet, skriv inn "lock cdcl3".
    8. Skriv inn "topshim" for å shim prøven, og til slutt skrive "rga;zgefp" for å hente dataene. Dette vil starte protokollen.
    9. Når spektra er oppnådd, skriver du inn "apk;abs n" og trykker enter for fase- og baselinekorrigering.
    10. Hvis du vil velge primærtoppene, skriver du inn pp og trykker ENTER. Hvis du bare vil velge intense topper, skriver du inn "mi" og skriver inn intensiteten som toppene skal velges over. Standardverdien blir 0,2.
    11. For å integrere toppene, klikk på Integrer og plasser markøren på venstre side av toppen som skal integreres, og hold markøren klikk og dra markøren rundt toppen.
    12. Lagre dataene ved å klikke på Fil øverst til venstre, og klikk deretter på Lagre.
    13. Prøven kan løses ut fra maskinen ved å skrive inn "sx ej".
    14. Analyser toppene og bestem miljøet til H-atomene.
  3. Fourier Transformer infrarød spektroskopi av biosurfactanten
    MERK: FT-IR av ekstrahert biosurfactant ble utført ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig spektrofotometer i ATR-modus (se Materialfortegnelse).
    1. Slå på spektrofotometeret og kontroller rensing, tørkemiddel og detektor.
    2. For å samle et spektrum, samle først bakgrunnsspekteret uten en prøve på plass.
    3. Ta det ekstraherte biosurfaktanten og tørk det helt. Plasser det tørkede biosurfaktanten rett over diamantkrystallen, trykk på trykk og trykk på ATR-berøringspunktet.
    4. I programvaren velger du nummeret på skanningene (skriv inn 30) og skanner spekteret fra 400 cm-1 til 4000 cm-1.
    5. Klikk på OK for å legge til prøvespekteret i spektralvinduet.
    6. Klikk på Filer > Lagre > Lagre som og skriv inn filnavnet etterfulgt av filtypen .spa og klikk på OK.

7. Biosurfactant anvendelse (forbedret oljeutvinning)

MERK: I dette eksperimentet ble dobbelt destillert vann brukt som negativ kontroll og 10% SDS, 10% Tween 80 og 10% kommersiell saponin ble brukt som positive kontroller.

  1. Ta glasset og forsegle bunnutløpet med glassull og glassperler.
  2. Pakk kolonnen med sandjord på en slik måte at litt væske kan tilsetts på toppen av jorda, og strømmen gjennom kan samles på bunnen. Monter kolonnen på holderen og legg til noen glassperler på toppen av jorda.
  3. Oversvømme kolonnen med 50 ml saltlakeoppløsning og samle gjennom strømmen for å bestemme porevolumet.
    porevolum = volum saltlake tilsatt på toppen - volumet av gjennomstrømning samlet.
  4. Fjern saltlake fra kolonnen ved å tvinge råolje til å passere gjennom den etter å ha lagt til fra toppen av kolonnen. Samle volumet av saltlake og olje som kommer ut av kolonnen for å bestemme det første oljemetningsvolumet. Volumet av saltlake som frigjøres fra kolonnen vil være det første oljemetningsvolumet eller originaloljen på plass.
  5. La kolonnen være uforstyrret i 24 timer.
  6. Etter 24 timer oversvømmer du kolonnen med 10 porevolumer saltlake og samler oljen som kommer ut av kolonnen for å estimere sekundær oljeutvinning. Oljen som er igjen i kolonnen etter sekundær oljeutvinning tilsvarer restoljen.
  7. Forbered en blanding av biosurfaktanter ved å legge til like store mengder ekstrahert biosurfaktant (ekstrahert etter trinn 3.5) til glassbegeret. Legg biosurfactants til toppen av kolonnen og inkuber kolonnen i 24 timer.
  8. Etter 24 timer måler du mengden olje og vann for å bestemme ytterligere eller økt oljeutvinning. Volumet av oljen som slippes ut fra kolonnen vil tilsvare restoljen som utvinnes.
  9. Beregn økt oljeutvinning med følgende ligning:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre bakteriestammer (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108) ble screenet for produksjon av biosurfaktanter av ulike analyser, som inkluderte fallkollapsanalyse, oljeforskyvningsanalyse, emulsjonsindeksanalyse og reduksjon av overflatespenning. Cellefrie supernatanter av alle de tre bakteriestammene og en løsning av kjemisk overflateaktivt middel resulterte i en dråpekollaps og ble derfor scoret positivt for tilstedeværelsen av biosurfaktantene (figur 4a). På den annen side kollapset ikke vanndråpen og ble derfor scoret negativt for tilstedeværelsen av biosurfactanten. Kommersielle overflateaktive og cellefrie supernatanter i de tre bakteriekulturene lyktes også med å fortrenge oljelaget i oljespredningsanalysen og ble derfor scoret positivt for tilstedeværelsen av biosurfaktant (figur 4b). Vann kunne derimot ikke fortrenge olje og ble derfor scoret negativt. I emusjonsindeksanalyser ble det observert en stabil emulsjon i reagensrør som inneholder kommersielt overflateaktivt middel og supernatantene til de tre mikrobielle stammene. Det ble imidlertid ikke observert emulsjon i reagensrøret som inneholder uinokulert kulturmedium (figur 4c). Dette foreslo igjen at Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108 produserer biosurfaktanter. Bekreftelse av biosurfactant produksjon ble oppnådd ved å måle overflatespenningen til den cellefrie buljongen og sammenligne den med den uinokulerte kontrollen. Biosurfactants av Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108 ble funnet å redusere overflatespenningen til mediet fra henholdsvis 58,89 mN/m til 45,41 mN/m, 45,82 mN/m og 28,43 mN/m (figur 5).

IFT-målinger ble utført ved hjelp av ringtrekkmetoden. Biosurfaktantene fra alle de tre stammene var i stand til å redusere de interfaciale spenningene mellom ulike vandige og organiske faser betydelig (tabell S1). Overflatespenningen og de interfaciale spenningsmålingene bekrefter at alle de tre stammene produserer biosurfaktanter.

Løsningsmiddelutvinning av biosurfaktanter fra cellefrie kulturer i Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108 resulterte i biosurfaktantkonsentrasjoner på henholdsvis 820 mg/l, 560 mg/l og 480 mg/l.

Som observert i figur 4C var emulsjonen dannet av biosurfactanten vann i oljemikroemulsjon. Emusjonsstabilitetsanalyser viste at biosurfaktantene viste god stabilitet under ulike miljøforhold (figur 6). Emulsjonene som ble produsert var svært stabile på tvers av forskjellige temperaturer (figur 6a), pH-verdier (figur 6b) og saltkonsentrasjoner (figur 6c) testet.

Tynn lagkromatografi ble utført for å bestemme biosurfaktantenes natur. Farging av platene med joddamp resulterte i utvikling av gule flekker i alle biosurfaktantene og kontrollen (Biosurfactant fra Bacillus sp. IITD 106 (figur 7a). Dette indikerte at biosurfaktantene inneholdt en lipid moiety. Ingen blåfargede flekker ble oppnådd i noen av TLC-platene ved farging med ninhydrin (figur 7b). Dette viste at biosurfactants ikke inneholdt noen peptid moiety. Blå og grønne flekker ble observert i alle TLC-platene, når de ble farget med anisaldehydflekk (figur 7c). Dette viste at biosurfactants inneholdt en karbohydrat moiety. Fra resultatene av TLC ble det konkludert med at alle biosurfaktantene var glykolipider.

Kjemisk identifisering av biosurfaktantene ved hjelp av LCMS avslørte at Rhodococcus sp. IITD102, og Lysinibacillus sp. IITD104 produserer samme type biosurfaktant, som ble identifisert som Di-rhamnopyranosic hydroksydekanosyre med en masse på 480,25 Da. Strukturen til biosurfactant ble støttet av 1H NMR- og FT-IR-data (figur 8).

I 1H NMR-spektrum representerte de kjemiske skiftene oppnådd ved 7,2 protoner av karboksylgrupper. Kjemiske skift tilsvarende protoner av metylgruppe ble oppnådd i området 1-2 ppm. Skift tilsvarende protoner festet til alkylgrupper ble oppnådd ved 2,3 ppm. FT-IR spektra av biosurfactants ekstrahert fra Rhodococcus sp. IITD102 og Lysinibacillus sp. IITD104 viste tilstedeværelsen av sterke topper på bølge nummer 3,290 cm-1, som bekrefter tilstedeværelsen av OH funksjonell gruppe. En liten topp på bølge nummer 2,951 cm-1 tilsvarer CH stretching. En sterk topp på 1620 cm-1 representerte tilstedeværelsen av karboksylgruppe i biosurfaktantene. Andre topper som ble oppnådd ved henholdsvis 1 530, 1 410, 1 200 og 1 060, bekreftet tilstedeværelsen av funksjonsgruppene alkyl, CH3, C-O-C og C-CH3 . Både NMR- og FT-IR-data støttet strukturen til biosurfakten som ble bestemt fra LCMS-studier. LCMS av rå biosurfactant fra Paenibacillus sp. IITD108 (Figur 9) viste at den produserer en rhamnolipid som inneholder tre lipidkjeder som danner den store hydrofobe kjernen i biosurfakten. Biosurfactanten ble identifisert som 2decanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hydroksydekanosyre med en masse på 802 Da. Resultatene av LCMS ble støttet av 1H NMR- og FT-IR-data.

Oppsettet for økt oljeutvinning er vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentelt oppsett for økt oljeutvinning ved hjelp av sandpakkekolonneteknikken. Kolonnen fullpakket med jord ble montert på holderen. Bunnutløpet var forseglet med glassull og glassperler. Etter sekundær utvinning ble restoljen inne i kolonnen utsatt for økt oljeutvinning ved tilsetning av biosurfactantblandingen til den. Røret plassert nederst i kolonnen ble brukt til å samle den eluterte fraksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I det simulerte, forbedrede oljeutvinningseksperimentet, av 50 ml saltlake tilsatt til toppen av kolonnen, ble det samlet inn 12 ml i gjennomstrømningen, og derfor ble porevolumet anslått til å være 38 ml. Da oljen ble tvunget gjennom kolonnen, ble 33 ml saltlake frigjort fra kolonnen. Dette representerte det første oljemetningsvolumet. Sekundær utvinning ved hjelp av 10 porevolumer saltlake resulterte i elution av 10 ml olje. Restoljen som var igjen i kolonnen var 23 ml. Vann som inneholder blandingen av biosurfaktanter var i stand til å gjenvinne 13 ml olje fra kolonnen (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Simulert økt oljeutvinning ved hjelp av en sandpakkekolonne. Det første oljemetningsvolumet til både kontroll- og testkolonnen var rundt 33 ml. Under sekundær oljeutvinning ble rundt 10 ml olje utvunnet fra både kontroll og testkolonner. Forskjellene i utvinningsprofilene til testen og kontrollkolonnene ble bare observert under utvinning av restoljen som er igjen i kolonnen. Den biosurfakterende blandingen resulterte i ytterligere utvinning av 13 ml av restoljen som var igjen fra testkolonnen, mens i kontrollkolonnen ble bare 1,03 ml olje gjenvunnet i dette trinnet. Dette viser at biosurfactantblandingen har et stort potensial for å øke utvinningen av restolje fra reservoarene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Dette representerte økt oljeutvinning. Derfor var vann som inneholder blandingen av biosurfaktanter i stand til å utvinne 56,52% av restoljen fra kolonnen (tabell 1). På den annen side var løsninger på 10% SDS, 10% Tween 80 og 10% saponin i stand til å gjenopprette 85%, 68% og 73% restolje fra kolonnen.

Parametere Oversvømmelse av kontroll Kombinert oversvømmelse av biosurfactanter 10 % SDS 10 % Tween 10 % Saponin
NÅVERDI (ml) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (ml) 33 33 33 29 33
Salgssted (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
SOR (ml) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (ml) 23.23 23 21.5 18.8 23
ROS (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ROR (ml) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
AOR (%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

der PV = porevolum bestemt etter første kolonnemetning med saltlake, OOIP = original olje på plass, IOSV = første oljemetningsvolum, POS = Prosentvis oljemetning, Sv = volum saltlake tilsatt for sekundær utvinning, SOR = sekundær olje gjenvunnet etter saltlakeflom, ROC = restolje i kolonne etter sekundær utvinning, ROS = restoljemetning, ROR = Restolje gjenvunnet etter biosurfactant flom, AOR = ekstra olje utvunnet

Tabell 1: Simulert økt oljeutvinning i en sandpakkekolonne.

Figure 4
Figur 4: Screeninganalyser for biosurfaktantproduksjon (a) Drop collapse-analyse: Vanndråpen kollapset ikke etter å ha blitt tilsatt til den oljebelagte overflaten mens de kjemiske overflateaktive og cellefrie supernatantene i de tre bakteriestammene resulterte i fallkollapsen. (b) Oljeforskyvningsanalyse: Vanndråpen førte ikke til forskyvning av oljen, mens de kjemiske overflateaktive og cellefrie supernatantene i de tre bakteriestammene forskjøvet lagene av olje (c) Emulsjonsindeksanalyse: De cellefrie supernatantene og den kommersielle overflateaktive løsningen resulterte alle i dannelsen av en stabil emulsjonsindeks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Reduksjon av overflatespenning på grunn av produksjon av biosurfactanter. Bestemmelse av reduksjon i overflatespenningen til mediet på grunn av mikrobiell vekst bekreftet biosurfactantproduksjonen av mikrobielle medlemmer. På grunn av veksten av Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104, reduserte overflatespenningen til mediet fra 59 mN / m til 45 mN / m. På grunn av veksten av Paenibacillus sp. IITD 108, reduserte overflatespenningen til mediet fra 59 mN / m til 28 mN / m. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Emulsjonsstabilitet ved ulike (a) temperaturer, (b) pH-verdier og (c) saltkonsentrasjoner. Alle emulsjonene som genereres ved hjelp av supernatantene til de tre mikrobielle stammene og blandingen av kommersielt overflateaktivt middel, viser stor stabilitet under forskjellige miljøforhold. Innenfor områdene temperatur, pH og saltkonsentrasjon som ble testet, var emulsjonsindeksene som ble fastslått like, og ingen større reduksjon av EI ble observert ved høyere verdier av de forskjellige faktorene som tilsier at biosurfaktant kan brukes under ekstreme miljøforhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: TLC-karakterisering av biosurfaktanter (a) Plater farget med joddamp: Ulike flekker utviklet på TLC-platen viser at de ekstraherte biosurfaktantene er en blanding av ulike forbindelser som inneholder en lipidgruppe. Flekkene merket med blå pil representerer biosurfaktantene, som har farget positivt for tilstedeværelsen av lipid moiety. De andre flekkene representerer resten av forbindelsene som er tilstede i blandingen av rå biosurfactant. (b) Plater farget med ninhydrin: Ingen lilla flekker dukket opp når platene ble farget med ninhydrin. Dette representerte fravær av aminosyrer i biosurfaktantblandingen og (c) Plater farget med anisaldehyd: Lysegrønne og gule flekker dukket opp på TLC-platen, og disse representerer forbindelsene som inneholder sukker. Flekkene merket med svarte piler representerer biosurfaktantene som har farget positivt for tilstedeværelsen av karbohydratmoiety. Flekkene som farget både med jod og anisaldehyd representerer forbindelser som inneholder både lipid- og karbohydratmoieties og kan muligens være et glykolipid biosurfaktant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Kjemisk karakterisering av biosurfaktanten ekstrahert fra Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104. (a) representerer FT-IR-spektraet til biosurfaktantene som ekstraheres fra Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104, (b) representerer H1 NMR spektra av biosurfactants ekstrahert fra Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104, og (c) viser strukturen av rå biosurfactants ekstrahert fra Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Kjemisk karakterisering av biosurfaktanten ekstrahert fra Paenibacillus sp. IITD 108. (a) representerer FT-IR-spektraet til biosurfaktantene som ekstraheres fra Paenibacillus sp. IITD 108, (b) representerer 1H NMR-spektra av biosurfaktantene som ekstraheres fra Paenibacillus sp. IITD 108, og (c) viser strukturen til de rå biosurfaktantene som ekstraheres fra Paenibacillus sp. IITD 108. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur S1: Struktur av ulike typer biosurfaktanter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell S1: Effekt av biosurfaktanter på interfacial spenning (IFT) mellom vann og hydrokarboner. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biosurfactants er en av de mest allsidige gruppene av biologisk aktive komponenter som blir attraktive alternativer til kjemiske overflateaktive stoffer. De har et bredt spekter av applikasjoner i mange bransjer som vaskemidler, maling, kosmetikk, mat, legemidler, landbruk, petroleum og vannbehandling på grunn av deres bedre fuktbarhet, lavere CMC, diversifisert struktur og miljøvennlighet18. Dette har ført til økt interesse for å oppdage flere mikrobielle stammer som er i stand til biosurfactant produksjon. Her illustrerer vi metodene for screening, identifisering og anvendelse av en blanding av biosurfaktanter produsert av Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 og Paenibacillus sp. IITD 108, for økt oljeutvinning. Biosurfactant produksjon ble screenet av fallkollaps, oljespredning, emulsjonsindeksanalyse og bekreftet ved å måle reduksjonen i overflatespenningen til mediet på grunn av mikrobiell vekst. Ulike rapporter om produksjon av glykolipid biosurfactants (rhamnolipids og trehalolipids) fra Rhodococcus er tilgjengelig ilitteraturen 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. har rapportert produksjon og optimalisering av et lipopeptid biosurfactant fra Paenibacillus sp. alvei ARN6325. Bezza et al. har rapportert biologisk nedbrytning av pyren av et lipopeptid biosurfactant produsert av Paenibacillus dendritiformis CN526. Biosurfactant produksjon (Lipopeptides og glykolipider) har også blitt rapportert av andre stammer av Paenibacillus 27,28,29,30,31. Ulike arter av Lysinibacillus har blitt rapportert å produsere biosurfactants 32,33,34. Lysinibacillus sphaericus har blitt rapportert å produsere rhamnolipid i stand til solubilisering av hydrofobe plantevernmidler35.

En av fordelene som biosurfaktanter tilbyr over sine kjemiske kolleger er deres stabilitet under ekstreme miljøforhold. Biosurfaktantene produsert av Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 og Paenibacillus sp. IITD 108 ble analysert for stabilitet under forskjellige områder av temperatur-, pH- og saltkonsentrasjoner og ble funnet å være stabile under ekstreme verdier av disse parametrene. Tidligere rapporterte Habib et al. en lipopeptid produsert av hydrokarbon som forringet Rhodococcus sp. som viste stabilitet på tvers av forskjellige områder av temperaturer, pH-verdier og saltkonsentrasjoner36. Økning i konsentrasjonen av uorganiske salter er rapportert å øke stabiliteten til emulsjonen37. Tendensen til kolloidene til agglomerat eller separat er en funksjon av de attraktive (Van der Walls-kreftene) og frastøtende krefter (elektrostatiske krefter) som er involvert under partikkelinteraksjon38. Saltkrystallene ved oppløsning i vann etablerer sine egne elektriske ladninger og ionene frigjorde adsorb på emulsjonsdråpene. Ved å øke saltkonsentrasjonen reduseres ekspansjonen og frastøtelsen av det andre laget. Jo høyere ladetettheten til en ion, jo lavere er lengden på det elektriske laget. Dermed resulterer divalente kasjoner som Na2 + i dannelsen av mer stabile emulsjoner i forhold til monovalente kasjoner39.

En annen fordel som biosurfaktanter har over kjemiske overflateaktive stoffer er at de er biologisk nedbrytbare40. Zeng et al. har sammenlignet nedbrytningskapasiteten til syntetisk overflateaktivt Triton X 100, lineære alkylbenzene sulfonater (LAS) og rhamnolipid og funnet ut at rhamnolipid biosurfactant ble fullstendig degradert mens LAS og Triton X 100 bare ble delvis degradert41. Liu et al. rapporterer også at i motsetning til syntetiske overflateaktive stoffer CTAB, Triton X 100 og SDS, har rhamnolipid ingen toksisitet og kan lett forringes av B. subtilis og andre kompostmikroorganismer42.

Biosurfaktantene produsert av alle tre mikrobielle stammer ble funnet å være glykolipider. Rhodococcus har tidligere blitt rapportert å produsere glykolipid av ulike forskningsgrupper 20,21,23. Lignende rapporter om glykolipid biosurfactant produksjon av Lysinibacillus og Paenibacillus er også tilgjengelig i litteraturen 31,32,35,43,44. Kjemisk identifikasjon av biosurfaktantene avslørte at de var rhamnolipider. Rhamnolipids er klassen av glykolipid biosurfactants som inneholder en eller to rhamnose enheter koblet til en lipidkjede45. De er den mest studerte typen biosurfaktanter. Ulike mikrobielle stammer er rapportert å produsere rhamnolipids 7,46,47,48,49. Rhamnolipids har blitt rapportert å ha et stort potensial for å øke utvinningen av restolje 50,51,52,53. I vår studie fant vi at blandingen av biosurfaktanter produsert av Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104, og Paenibacillus sp. IITD 108 klarte å gjenopprette rundt 56,52% av restoljen i en simulert sandpakkekolonnetest. Dette viste at blandingen av biosurfaktanter kan brukes til utvinning av restolje fra jordreservoarene. I en lignende sandpakketest har Sun et al. rapportert at biosurfactant var vellykket med å utvinne 50% avrestoljen 54. Biosurfactants som inneholder cellefri buljong av Bacillus subtilis har også blitt rapportert å være effektive i å utvinne 33% av restolje55. Restoljeutvinning på 27% og 26% -36% har også blitt rapportert av Darvishi et al. og Wahabi et al.56,57.

Økonomisk evaluering av biosurfaktanter for utvinning av restolje fra reservoarer viser at utnyttelse av biosurfaktanter i EOR er økonomisk et levedyktig alternativ. Moutinho et al. rapporterte at den typiske kostnaden for en kommersiell biosurfactant (rhamnolipids) er rundt 59,6 USD per kg58. I en annen studie har det også blitt rapportert at biosurfactantkonsentrasjonen på 28 mg/l biosurfactant forbedret restoljeutvinningen og førte til produksjon av 52,5 m3 ekstra olje59. Studiene viste at biosurfaktantkonsentrasjon på 10 mg/l var tilstrekkelig til å mobilisere oljeutvinningen. Ifølge de rapporterte dataene er mengden biosurfactant som kreves for å produsere 52,5 m3 ekstra olje rundt 0,525 kg. Den totale produksjonskostnaden på 52,5 m3 olje er omtrent US $ 21463 hvorav bare US $ 30 er kostnaden for produksjon av biosurfactanten. Dataene viser at den prosentvise kostnaden for biosurfakten i oljeproduksjon per fat bare er 0,0000139%.

Våre resultater tyder på at kombinasjonen av biosurfaktantene effektivt kan brukes til å utvinne restolje fra reservoarene. Så vidt vi vet er dette den første rapporten om å øke utvinningen av restoljen fra reservoaret ved hjelp av en blanding av biosurfaktanter produsert av forskjellige mikrobielle stammer. Selv om studien vår tydelig beskriver metodene som er involvert i screening, strukturell karakterisering og anvendelse av biosurfaktanter i økt oljeutvinning, gir studien ikke en detaljert funksjonell karakterisering av biosurfaktantene, noe som påvirker effektiviteten i ulike applikasjoner. Kritisk micellekonsentrasjon, som er målet på effektiviteten til ethvert overflateaktivt middel i å danne micellene og spesifiserer den begrensende konsentrasjonen av overflateaktivt middel for meningsfull bruk, er ikke bestemt i den nåværende studien60. På samme måte er termisk stabilitet av biosurfactanten, som bestemmer dens anvendbarhet ved reservoarforhold for EOR heller ikke blitt beskrevet61. Biosurfactants i noen applikasjoner brukes også som antibiofilmmidler. Deres overflate fuktbarhet spiller en viktig rolle i å bestemme deres antibiofilm natur. Overflate våthetsstudier er heller ikke utført i dagens arbeid62. Andre funksjonelle egenskaper som er viktige i ulike anvendelser av biosurfaktanter, som inkluderer deres biologisk nedbrytbarhet og den antimikrobielle naturen, er heller ikke bestemt i denne studien63,64. Dermed har vi fokusert på strukturell karakterisering av biosurfaktanter. Avhengig av målapplikasjonen kan funksjonell karakterisering som stabilitet, biologisk nedbrytbarhet og antimikrobiell aktivitet utføres.

I fallkollapsanalysen og oljespredningsanalysen, for å øke synligheten, er det bedre å bruke en olje som har litt farge. I oljespredningsanalysen bør emulsjonen observeres etter 24 timer. Lette skum, hvis dannet, oppløses i 24 timer. Tensiometere er svært følsomme instrumenter, derfor under overflatespenningsmålinger, bør fartøyet og sonden rengjøres riktig før hver måling for å unngå feil på grunn av overføring av siste målinger. Utvinning av biosurfactant innebærer tilsetning av kloroform metanolblanding til det cellefrie supernatantet. Trinnet skal enten utføres i en avtrekkshette, eller kolben skal dekkes med aluminiumsfolie umiddelbart etter overføring av ekstraksjonsblandingen. Under sekundær utvinning i et EOR-eksperiment bør saltlakeoppløsning tilsettes i overkant til det ikke kommer mer olje ut av kolonnen.

Metoden diskuterer omfanget av blanding av biosurfaktanter ved utvinning av restolje fra kolonnene. Prosessen er avhengig av mange faktorer. Vekststadiet av mikrober der de første kulturene høstes. Noen biosurfaktanter er rapportert produsert i loggfasen, mens andre er rapportert produsert i den stasjonære fasen. Kulturene bør høstes tilsvarende på det aktuelle stadiet når biosurfactantproduksjonen har nådd sitt maksimum. Biosurfactant screeninganalyser er mindre følsomme, derfor bør alle analysene utføres før de kommer til en konklusjon om biosurfactanten som produserer evne til en bestemt stamme. Rensing av biosurfaktanten bør utføres før kjemisk karakterisering av biosurfakten hvis konsentrasjonen av biosurfactant er lav i rå biosurfactanten. Forbedrede forsøk på oljeutvinning er svært avhengig av hvilken type jord som brukes til å pakke kolonnen. Jorden må være helt tørr og bør siktes for å fjerne større granulater og andre faste forurensninger. En blanding av sandjord og tørr hagejord (i like forhold) bør foretrekkes for pakking av kolonnen. Søyleutløpet må forsegles riktig med glassull og glassperler for å unngå lekkasje av jord fra kolonnen i løpet av eksperimentet.

Metoden som er beskrevet er nyttig for å bestemme betydningen av de produserte biosurfaktantene og deres blandinger i utvinning av ekstra olje i et simulert sandpakkekolonneeksperiment. Ulike biosurfaktanter har forskjellige spesifisiteter fordi de inneholder forskjellige funksjonsgrupper65. En kombinasjon av biosurfaktanter vil muliggjøre solubilisering av ulike hydrokarboner og vil derfor øke restoljeutvinningen fra reservoarene. Metoden som beskrives vil bidra til å bestemme potensialet for biosurfactantblandinger i feltapplikasjoner som økt oljeutvinning fra oljebrønner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Institutt for bioteknologi, Indias regjering, for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, J. D., Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61 (1), 47-64 (1997).
  2. Banat, I. M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology. 51 (1), 1-12 (1995).
  3. Singh, A., Van Hamme, J. D., Ward, O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances. 25 (1), 99-121 (2007).
  4. Shah, N., Nikam, R., Gaikwad, S., Sapre, V., Kaur, J. Biosurfactant: types, detection methods, importance and applications. Indian Journal of Microbiology Research. 3 (1), 5-10 (2016).
  5. McClements, D. J., Gumus, C. E. Natural emulsifiers-Biosurfactants, phospholipids, biopolymers, and colloidal particles: Molecular and physicochemical basis of functional performance. Advances in Colloid and Interface Science. 234, 3-26 (2016).
  6. Nguyen, T. T., Youssef, N. H., McInerney, M. J., Sabatini, D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Research. 42 (6-7), 1735-1743 (2008).
  7. Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 54 (5), 625-633 (2000).
  8. Banat, I. M., Makkar, R. S., Cameotra, S. S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53 (5), 495-508 (2000).
  9. Mulugeta, K., Kamaraj, M., Tafesse, M., Aravind, J. A review on production, properties, and applications of microbial surfactants as a promising biomolecule for environmental applications. Strategies and Tools for Pollutant Mitigation: Avenues to a Cleaner Environment. , 3-28 (2021).
  10. Sharma, J., Sundar, D., Srivastava, P. Biosurfactants: Potential agents for controlling cellular communication, motility, and antagonism. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 727070 (2021).
  11. Vijayakumar, S., Saravanan, V. Biosurfactants-types, sources and applications. Research Journal of Microbiology. 10 (5), 181-192 (2015).
  12. Curiel-Maciel, N. F., et al. Characterization of enterobacter cloacae BAGM01 producing a thermostable and alkaline-tolerant rhamnolipid biosurfactant from the Gulf of Mexico. Marine Biotechnology. 23 (1), 106-126 (2021).
  13. Nikolova, C., Gutierrez, T. Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry: current state of knowledge and future perspectives. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  14. Rastogi, S., Tiwari, S., Ratna, S., Kumar, R. Utilization of agro-industrial waste for biosurfactant production under submerged fermentation and its synergistic application in biosorption of Pb2. Bioresource Technology Reports. 15, 100706 (2021).
  15. Zargar, A. N., Lymperatou, A., Skiadas, I., Kumar, M., Srivastava, P. Structural and functional characterization of a novel biosurfactant from Bacillus sp. IITD106. Journal of Hazardous Materials. 423, Pt B 127201 (2022).
  16. Adnan, M., et al. Functional and structural characterization of pediococcus pentosaceus-derived biosurfactant and its biomedical potential against bacterial adhesion, quorum sensing, and biofilm formation. Antibiotics. 10 (11), 1371 (2021).
  17. Du Nouy, P. L. A new apparatus for measuring surface tension. The Journal of General Physiology. 1 (5), 521-524 (1919).
  18. Akbari, S., Abdurahman, N. H., Yunus, R. M., Fayaz, F., Alara, O. R. Biosurfactants-a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnology Research and Innovation. 2 (1), 81-90 (2018).
  19. Bicca, F. C., Fleck, L. C., Ayub, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia. 30 (3), 231-236 (1999).
  20. Kuyukina, M. S., et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. Journal of Microbiological Methods. 46 (2), 149-156 (2001).
  21. Philp, J., et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Applied Microbiology and Biotechnology. 59 (2), 318-324 (2002).
  22. Mutalik, S. R., Vaidya, B. K., Joshi, R. M., Desai, K. M., Nene, S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp. MTCC 2574. Bioresource Technology. 99 (16), 7875-7880 (2008).
  23. Shavandi, M., Mohebali, G., Haddadi, A., Shakarami, H., Nuhi, A. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces. 82 (2), 477-482 (2011).
  24. White, D., Hird, L., Ali, S. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp., strain PML026. Journal of Applied Microbiology. 115 (3), 744-755 (2013).
  25. Najafi, A., et al. Interactive optimization of biosurfactant production by Paenibacillus alvei ARN63 isolated from an Iranian oil well. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 82 (1), 33-39 (2011).
  26. Bezza, F. A., Chirwa, E. M. N. Pyrene biodegradation enhancement potential of lipopeptide biosurfactant produced by Paenibacillus dendritiformis CN5 strain. Journal of Hazardous Materials. 321, 218-227 (2017).
  27. Jimoh, A. A., Lin, J. Biotechnological applications of Paenibacillus sp. D9 lipopeptide biosurfactant produced in low-cost substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (3), 921-941 (2020).
  28. Liang, T. -W., et al. Exopolysaccharides and antimicrobial biosurfactants produced by Paenibacillus macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (2), 933-950 (2014).
  29. Mesbaiah, F. Z., et al. Preliminary characterization of biosurfactant produced by a PAH-degrading Paenibacillus sp. under thermophilic conditions. Environmental Science and Pollution Research. 23 (14), 14221-14230 (2016).
  30. Quinn, G. A., Maloy, A. P., McClean, S., Carney, B., Slater, J. W. Lipopeptide biosurfactants from Paenibacillus polymyxa inhibit single and mixed species biofilms. Biofouling. 28 (10), 1151-1166 (2012).
  31. Gudiña, E. J., et al. Novel bioemulsifier produced by a Paenibacillus strain isolated from crude oil. Microbial Cell Factories. 14 (1), 1-11 (2015).
  32. Pradhan, A. K., Pradhan, N., Sukla, L. B., Panda, P. K., Mishra, B. K. Inhibition of pathogenic bacterial biofilm by biosurfactant produced by Lysinibacillus fusiformis S9. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (2), 139-149 (2014).
  33. Manchola, L., Dussán, J. Lysinibacillus sphaericus and Geobacillus sp biodegradation of petroleum hydrocarbons and biosurfactant production. Remediation Journal. 25 (1), 85-100 (2014).
  34. Bhardwaj, G., Cameotra, S. S., Chopra, H. K. Biosurfactant from Lysinibacillus chungkukjangi from rice bran oil sludge and potential applications. Journal of Surfactants and Detergents. 19 (5), 957-965 (2016).
  35. Gaur, V. K., et al. Rhamnolipid from a Lysinibacillus sphaericus strain IITR51 and its potential application for dissolution of hydrophobic pesticides. Bioresource Technology. 272, 19-25 (2019).
  36. Habib, S., et al. Production of lipopeptide biosurfactant by a hydrocarbon-degrading Antarctic Rhodococcus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6138 (2020).
  37. Shao, P., Ma, H., Zhu, J., Qiu, Q. Impact of ionic strength on physicochemical stability of o/w emulsions stabilized by Ulva fasciata polysaccharide. Food Hydrocolloids. 69, 202-209 (2017).
  38. Trefalt, G., Borkovec, M. Overview of DLVO theory. , Available from: https://archive-ouverte.unige.ch/unige:148595 (2014).
  39. Kazemzadeh, Y., Ismail, I., Rezvani, H., Sharifi, M., Riazi, M. Experimental investigation of stability of water in oil emulsions at reservoir conditions: Effect of ion type, ion concentration, and system pressure. Fuel. 243, 15-27 (2019).
  40. Chong, H., Li, Q. Microbial production of rhamnolipids: opportunities, challenges and strategies. Microbial Cell Factories. 16 (1), 1-12 (2017).
  41. Zeng, G., et al. Co-degradation with glucose of four surfactants, CTAB, Triton X-100, SDS and Rhamnolipid, in liquid culture media and compost matrix. Biodegradation. 18 (3), 303-310 (2007).
  42. Liu, G., et al. Advances in applications of rhamnolipids biosurfactant in environmental remediation: a review. Biotechnology and Bioengineering. 115 (4), 796-814 (2018).
  43. John, W. C., Ogbonna, I. O., Gberikon, G. M., Iheukwumere, C. C. Evaluation of biosurfactant production potential of Lysinibacillus fusiformis MK559526 isolated from automobile-mechanic-workshop soil. Brazilian Journal of Microbiology. 52 (2), 663-674 (2021).
  44. Naing, K. W., et al. Isolation and characterization of an antimicrobial lipopeptide produced by Paenibacillus ehimensis MA2012. Journal of Basic Microbiology. 55 (7), 857-868 (2015).
  45. Wittgens, A., et al. Novel insights into biosynthesis and uptake of rhamnolipids and their precursors. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (7), 2865-2878 (2017).
  46. Rahman, K., Rahman, T. J., McClean, S., Marchant, R., Banat, I. M. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnology Progress. 18 (6), 1277-1281 (2002).
  47. Bahia, F. M., et al. Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  48. Kim, C. H., et al. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environment Research. 91 (8), 739-747 (2019).
  49. Nalini, S., Parthasarathi, R. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production from Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its biocontrol efficacy against Fusarium wilt of eggplant. Annals of Agrarian Science. 16 (2), 108-115 (2018).
  50. Wang, Q., et al. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology and Bioengineering. 98 (4), 842-853 (2007).
  51. Câmara, J., Sousa, M., Neto, E. B., Oliveira, M. Application of rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa in microbial-enhanced oil recovery (MEOR). Journal of Petroleum Exploration and Production Technology. 9 (3), 2333-2341 (2019).
  52. Amani, H., Mehrnia, M. R., Sarrafzadeh, M. H., Haghighi, M., Soudi, M. R. Scale up and application of biosurfactant from Bacillus subtilis in enhanced oil recovery. Applied Biochemistry and Biotechnology. 162 (2), 510-523 (2010).
  53. Gudiña, E. J., et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation. Bioresource Technology. 177, 87-93 (2015).
  54. Sun, G., Hu, J., Wang, Z., Li, X., Wang, W. Dynamic investigation of microbial activity in microbial enhanced oil recovery (MEOR). Petroleum Science and Technology. 36 (16), 1265-1271 (2018).
  55. Jha, S. S., Joshi, S. J., SJ, G. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian Journal of Microbiology. 47 (4), 955-964 (2016).
  56. Darvishi, P., Ayatollahi, S., Mowla, D., Niazi, A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 84 (2), 292-300 (2011).
  57. Al-Wahaibi, Y., et al. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B30 and its application in enhancing oil recovery. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 114, 324-333 (2014).
  58. Moutinho, L. F., Moura, F. R., Silvestre, R. C., Romão-Dumaresq, A. S. Microbial biosurfactants: A broad analysis of properties, applications, biosynthesis, and techno-economical assessment of rhamnolipid production. Biotechnology Progress. 37 (2), 3093 (2021).
  59. Youssef, N., Simpson, D. R., McInerney, M. J., Duncan, K. E. In-situ lipopeptide biosurfactant production by Bacillus strains correlates with improved oil recovery in two oil wells approaching their economic limit of production. International Biodeterioration & Biodegradation. 81, 127-132 (2013).
  60. Ruckenstein, E., Nagarajan, R. Critical micelle concentration and the transition point for micellar size distribution. The Journal of Physical Chemistry. 85 (20), 3010-3014 (1981).
  61. de Araujo, L. L., et al. Microbial enhanced oil recovery using a biosurfactant produced by Bacillus safensis isolated from mangrove microbiota-Part I biosurfactant characterization and oil displacement test. Journal of Petroleum Science and Engineering. 180, 950-957 (2019).
  62. Banat, I. M., De Rienzo, M. A. D., Quinn, G. A. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (24), 9915-9929 (2014).
  63. Klosowska-Chomiczewska, I., Medrzycka, K., Karpenko, E. Biosurfactants-biodegradability, toxicity, efficiency in comparison with synthetic surfactants. Research and Application of New Technologies in Wastewater Treatment and Municipal Solid Waste Disposal in Ukraine, Sweden, and Poland. 17, 141-149 (2013).
  64. Fernandes, P. A. V., et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (4), 704-709 (2007).
  65. Santos, D. K. F., Rufino, R. D., Luna, J. M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 401 (2016).

Tags

Miljøvitenskap utgave 184
Forbedret oljeutvinning ved hjelp av en kombinasjon av biosurfaktanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter