Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Forbedret oliegenvinding ved hjælp af en kombination af biooverfladeaktive stoffer

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

Vi illustrerer de metoder, der er involveret i screening og identifikation af det biooverfladeaktive stof, der producerer mikrober. Metoder til kromatografisk karakterisering og kemisk identifikation af de biooverfladeaktive stoffer, bestemmelse af biooverfladeaktivets industrielle anvendelighed til forbedring af restoliegenvinding præsenteres også.

Abstract

Biooverfladeaktive stoffer er overfladeaktive forbindelser, der er i stand til at reducere overfladespændingen mellem to faser af forskellige polariteter. Biooverfladeaktive stoffer har vist sig som lovende alternativer til kemiske overfladeaktive stoffer på grund af mindre toksicitet, høj bionedbrydelighed, miljøkompatibilitet og tolerance over for ekstreme miljøforhold. Her illustrerer vi de metoder, der anvendes til screening af mikrober, der er i stand til at producere biooverfladeaktive stoffer. Det biooverfladeaktive stof, der producerer mikrober, blev identificeret ved hjælp af dråbekollaps, oliespredning og emulsionsindeksassays. Produktionen af biooverfladeaktive biooverflader blev valideret ved at bestemme reduktionen i overfladespændingen af medierne på grund af væksten af de mikrobielle medlemmer. Vi beskriver også de metoder, der er involveret i karakterisering og identifikation af biooverfladeaktive stoffer. Tyndtlagskromatografi af det ekstraherede biooverfladeaktive stof efterfulgt af differentiel farvning af pladerne blev udført for at bestemme arten af det biooverfladeaktive stof. LCMS, 1H NMR og FT-IR blev brugt til kemisk at identificere det biooverfladeaktive stof. Vi illustrerer yderligere metoderne til at evaluere anvendelsen af kombinationen af producerede biooverfladeaktive stoffer til forbedring af restoliegenvinding i en simuleret sandpakningskolonne.

Introduction

Biooverfladeaktive stoffer er de amfipatiske overfladeaktive molekyler produceret af mikroorganismer, der har kapacitet til at reducere overfladen og grænsefladespændingen mellem to faser1. En typisk biooverfladebehandler indeholder en hydrofil del, der normalt består af en sukkerholdighed eller en peptidkæde eller hydrofil aminosyre og en hydrofob del, der består af en mættet eller umættet fedtsyrekæde2. På grund af deres amfipatiske natur samles biooverfladeaktive stoffer ved grænsefladen mellem de to faser og reducerer grænsefladespændingen ved grænsen, hvilket letter spredningen af den ene fase i den anden 1,3. Forskellige typer biooverfladeaktive stoffer, der hidtil er blevet rapporteret, omfatter glycolipider, hvor kulhydrater er forbundet med langkædede alifatiske eller hydroxy-alifatiske syrer via esterbindinger (f.eks. rhamnolipider, trehalolipider og sophorolipider), lipopeptider, hvor lipider er bundet til polypeptidkæder (f.eks. Overfladeaktivin og lichenysin) og polymere biooverfladeaktive stoffer, der normalt består af polysaccharidproteinkomplekser (f.eks. emulsan, liposan, alasan og lipomannan)4. Andre typer biooverfladeaktive stoffer produceret af mikroorganismerne omfatter fedtsyrer, phospholipider, neutrale lipider og partikler biooverfladeaktive stoffer5. Den mest undersøgte klasse af biooverfladeaktive stoffer er glycolipider, og blandt dem er de fleste af undersøgelserne blevet rapporteret om rhamnolipider6. Rhamnolipider indeholder et eller to molekyler rhamnose (som danner den hydrofile del) bundet til et eller to molekyler langkædede fedtsyre (normalt hydroxy-decansyre). Rhamnolipider er primære glycolipider, der først blev rapporteret fra Pseudomonas aeruginosa7.

Biooverfladeaktive stoffer har fået stigende fokus i forhold til deres kemiske modstykker på grund af forskellige unikke og karakteristiske egenskaber, som de tilbyder8. Disse omfatter højere specificitet, lavere toksicitet, større mangfoldighed, let forberedelse, højere bionedbrydelighed, bedre skumdannelse, miljøkompatibilitet og aktivitet under ekstreme forhold9. Strukturel mangfoldighed af biooverfladeaktive stoffer (figur S1) er en anden fordel, der giver dem en fordel i forhold til de kemiske modparter10. De er generelt mere effektive ved lavere koncentrationer, da deres kritiske micellekoncentration (CMC) normalt er flere gange lavere end kemiske overfladeaktive stoffer11. Det er rapporteret, at de er meget termostable (op til 100 °C) og kan tåle højere pH (op til 9) og høje saltkoncentrationer (op til 50 g/l)12 og giver dermed flere fordele i industrielle processer, som kræver udsættelse for ekstreme forhold13. Bionedbrydelighed og lavere toksicitet gør dem velegnede til miljømæssige anvendelser såsom bioremediering. På grund af de fordele, de tilbyder, har de fået øget opmærksomhed i forskellige brancher som fødevare-, landbrugs-, vaskemiddel-, kosmetik- og olieindustrien11. Biooverfladeaktive stoffer har også fået stor opmærksomhed inden for olierensning til fjernelse af olieforurenende stoffer og giftige forurenende stoffer14.

Her rapporterer vi produktion, karakterisering og anvendelse af biooverfladeaktive stoffer produceret af Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108. De trin, der er involveret i screening, karakterisering og anvendelse af en kombination af biooverfladeaktive stoffer til forbedret olieudvinding, er skitseret i figur 1.

Figure 1
Figur 1: En metode til forbedret oliegenvinding ved hjælp af en kombination af biooverfladeaktive stoffer. Det trinvise arbejdsflow vises. Arbejdet blev udført i fire trin. Først blev de mikrobielle stammer dyrket og screenet til produktion af biooverfladeaktive stoffer ved forskellige assays, som omfattede dråbekollapsassay, oliespredningsassay, emulsionsindeksassay og overfladespændingsmåling. Derefter blev de biooverfladeaktive stoffer ekstraheret fra den cellefri bouillon, og deres natur blev identificeret ved hjælp af tyndtlagskromatografi, og de blev yderligere identificeret ved anvendelse af LCMS, NMR og FT-IR. I det næste trin blev de ekstraherede biooverfladeaktive stoffer blandet sammen, og potentialet i den resulterende blanding til forbedret oliegenvinding blev bestemt ved hjælp af sandpakningskolonneteknikken. Klik her for at se en større version af denne figur.

Screening af disse mikrobielle stammer til fremstilling af biooverfladeaktive stoffer blev udført ved dråbekollaps, oliespredning, emulsionsindeksassay og bestemmelse af reduktion i overfladespændingen af det cellefrie medium på grund af mikrobernes vækst. De biooverfladeaktive stoffer blev ekstraheret, karakteriseret og kemisk identificeret af LCMS, 1H NMR og FT-IR. Endelig blev en blanding af biooverfladeaktive stoffer produceret af disse mikrober fremstillet og blev brugt til at genvinde restolien i en simuleret sandpakningskolonne.

Denne undersøgelse illustrerer kun de metoder, der er involveret i screening, identifikation, strukturel karakterisering og anvendelse af den biooverfladeaktive kombination til forbedring af restoliegenvinding. Det giver ikke en detaljeret funktionel karakterisering af de biooverfladeaktive stoffer, der produceres af de mikrobielle stammer15,16. Forskellige eksperimenter såsom kritisk micellebestemmelse, termogravimetrisk analyse, overfladebefugtelighed og bionedbrydelighed udføres for detaljeret funktionel karakterisering af ethvert biooverfladeaktivt stof. Men da dette papir er et metodepapir, er fokus på screening, identifikation, strukturel karakterisering og anvendelse af den biooverfladeaktive kombination til forbedring af restolieindvinding; disse eksperimenter er ikke medtaget i denne undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vækst af mikrobielle stammer

  1. Der vejes 2 g Luria Broth-pulver, og der tilsættes 50 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe. Bland indholdet, indtil pulveret opløses fuldstændigt, og der fyldes op på 100 ml ved hjælp af destilleret vand.
  2. På samme måde fremstilles yderligere to kolber med 100 ml Luria Broth og anbringes bomuldspropper på kolbernes hals.
  3. Dæk bomuldspropperne med aluminiumsfolie, og autoklave kolberne i 15 minutter ved 121 °C og 15 psi for at sterilisere mediet.
  4. Efter autoklavering skal du lade medierne køle af til stuetemperatur.
  5. Til fremstilling af primær kultur af en stamme skal du vælge en enkelt koloni fra en LA-plade ved hjælp af en podningssløjfe og inokulere i et reagensglas indeholdende 5 ml steril Luria bouillon.
  6. Inkubere reagensglasset natten over ved 30 °C ved 180 o/min.
  7. Kolberne, der indeholder 100 ml autoklaveret Luria Broth, inokuleres ved at tilsætte 1 ml frøkulturer fra den ene dag til den anden til kolberne inde i det laminære luftstrømsskab.
  8. Kolberne inkuberes i en roterende inkubator ved 30 °C og 180 o/min i 7 dage.
  9. Efter afslutningen af inkubationsperioden høstes kolberne og overføres kulturbouillonen til centrifugerørene. Centrifugering af kulturen ved 4.500 x g i 20 minutter i en kølecentrifuge ved 4 °C.
  10. Hæld forsigtigt det cellefrie supernatant i et frisk bægerglas og brug det til screening af assays til produktion af biooverfladeaktive stoffer.

2. Screening af assays for produktion af biooverfladeaktive stoffer

BEMÆRK: I de følgende afsnit blev kommercielt overfladeaktivt stof (Saponin) anvendt som en positiv kontrol, mens vand og uinokulerede medier blev anvendt som en negativ kontrol.

  1. Drop kollapsassay
    1. Tag et rent glasglas og belæg overfladen af diaset med 200 μL olie.
    2. Tilsæt 20 μL af den cellefri supernatant til midten af olien og lad den stå uforstyrret i 2-3 minutter.
      BEMÆRK: Hvis faldet kollapser, skal du score supernatanten positiv for tilstedeværelsen af biooverfladeaktivt stof.
  2. Oliespredningsassay
    1. Der tages 20 ml dobbeltdestilleret vand i en Petri-plade (75 mm i diameter) og tilsættes 200 μL råolie til vandets overflade.
    2. Tilsæt 20 μL cellefri supernatant til midten af olien og lad den stå uforstyrret i 1 min.
      BEMÆRK: Hvis der dannes en rydningszone på grund af olieforskydning, skal du score supernatanten positiv for tilstedeværelsen af det biooverfladeaktive stof.
  3. Emulsionsindeksassay (E24-assay )
    1. Tilsæt 4 ml benzin (benzin) og cellefri supernatant hver i et rent glas reagensglas.
    2. Hvirvel blandingen kraftigt i 3 minutter og lad den stå uforstyrret i de næste 24 timer.
    3. Efter 24 timer bestemmes E24-indekset som en procentdel af højden af det emulgerede lag (cm) i forhold til højden af hele væskekolonnen (cm).
      Equation 1
      BEMÆRK: Hvis der observeres en emulsion (olie i vand eller vand i olie) efter 24 timer, vil supernatanten sandsynligvis indeholde det biooverfladeaktive stof.
  4. Måling af overfladespænding
    BEMÆRK: Overfladespændingen blev målt ved hjælp af Du Noüy-ringmetoden17. Instrumentet, der anvendes i dette eksperiment (se Tabel over materialer), er meget følsomt, så sørg for korrekt rengøring af glasbeholderen og sonden.
    1. Tænd for systemet, og dobbeltklik på den tilknyttede software for at åbne den.
    2. Glasbeholderen rengøres med den væske, hvis overfladespænding skal bestemmes.
    3. Tilsæt væsken (40 ml) i beholderen, og monter beholderen på beholderholderen.
    4. Lås sondeholderen op, og monter sonden på den. Lås nu sondeholderen ved at trykke på låseknappen på den manuelle controller.
    5. Brug den manuelle controller til at justere platformens højde, så sonden er omkring 2-3 mm væk fra væskens overflade.
    6. Brug nu softwaren til at måle overfladespændingen. Klik på Filer placeret øverst til venstre på skærmen. Klik på Åbn arbejdsområde. Et pop op-vindue vises.
    7. Rul ned og dobbeltklik på ikonet K100: Surface and Interfacial Tension .
    8. Klik nu på filikonet i øverste venstre hjørne af skærmen. Klik på Ny database. Indtast navnet for at gemme dataene, og klik på OK.
    9. Klik igen på File > New Measurement > SFT > Ring. Angiv navnet på målingen. Sørg for, at konfigurationsskabelonen viser SFT-ringen.
    10. Udfyld detaljerne i vinduet Målekonfiguration ved at vælge sonden og det fartøj, der bruges til målingen. Udfyld også detaljerne i væsken og gasfasen.
      BEMÆRK: Den flydende fase vil være vand, mens gasfasen vil være luft. Tætheden af den flydende fase er densiteten af det cellefrie supernatant. Dette kan bestemmes ved at tage vægten af 50 ml af væsken og beregne densiteten som Kg/m3.
    11. Klik nu på fanen Procedure og udfyld følgende detaljer: Detektionshastighed: 6 mm/min, Detektionsfølsomhed: 0,005 g, Søgehastighed: 6 mm/min, Søgefølsomhed: 0,005 g, Målehastighed: 3 mm/min, Målefølsomhed: 0,001 g, Nedsænkningsdybde: 3 mm, Returafstand: 10%, korrektion: Harkins & Jordan, maks. værdier: 5. Klik på OK.
    12. I pop op-vinduet skal du vælge den database, der skal gemmes data, og klikke på OK.
      BEMÆRK: Man kan oprette en ny database her eller tilføje nye målinger til de eksisterende data.
    13. Klik nu på knappen Afspil øverst på skærmen. Systemet begynder at udføre scriptet. Når systemet er stabiliseret, registrerer det overfladen. Sænk sonden i væsken, flyt sonden frem og tilbage og registrer spændingen i den dannede lamel.
    14. For at opnå resultaterne skal du klikke på ikonet Måling i midten af venstre side af skærmen. Klik på Data og noter den bestemte overfladespænding.
    15. Efter afslutningen af målingen skal du sænke platformens højde og låse sonden og fartøjet op og afmontere det fra instrumentet.
      BEMÆRK: For at bestemme faldet i overfladespændingen på grund af biooverfladeaktiv produktion skal uinokuleret LB anvendes som kontrol.

3. Udvinding af biooverfladeaktive data

  1. Den cellefrie supernatants pH justeres til 2 N HCl.
  2. Der tilsættes lige store mængder chloroform-methanol-blanding (2:1) til supernatanten og blandes kraftigt i 20 minutter.
  3. Lad blandingen være uforstyrret, så der kan ske faseadskillelse.
  4. Fjern den øvre fase, der indeholder vand og methanol, og lad den nedre fase, der indeholder det biooverfladeaktive stof, fordampe i en stinkhætte.
  5. Efter fordampning af den organiske fase skal det honningfarvede rå biooverfladeaktive stof genløses i 3 ml chloroform og anvende denne blanding til yderligere identifikation og karakterisering af biooverfladeaktivanten.

4. Undersøgelser af emulsionsstabilitet

  1. Emulsionsstabilitet ved forskellige temperaturer
    1. Tag 5 ml cellefrie supernatanter i forskellige reagensglas.
    2. Tilsæt 5 ml benzin til hvert reagensglas og bland kraftigt ved hvirvel i 3 minutter.
    3. Inkubere reagensglassene natten over i forskellige vandbade ved forskellige temperaturer (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C og 70 °C).
    4. Efter 24 timer estimeres emulsionsindekserne som tidligere nævnt.
  2. Emulsionsstabilitet ved forskellige pH-værdier
    1. Tag 5 ml af det cellefrie supernatant i rene reagensglas.
    2. Juster pH-værdien af cellefrie supernatanter (2, 4, 6, 8 og 10) ved hjælp af 1 N HCL og 1 N NaOH.
    3. Tilsæt en tilsvarende mængde benzin til reagensglassene og bland kraftigt ved hvirvel i 3 minutter.
    4. Lad reagensglassene stå uforstyrret ved stuetemperatur i 24 timer.
    5. Anslå emulsionsindekset som tidligere nævnt.
  3. Emulsionsstabilitet ved forskellige saltkoncentrationer
    1. Tag 5 ml af det cellefrie supernatant i rene reagensglas.
    2. Der tilsættes forskellige mængder salt (NaCl) til supernatanterne (0 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 60 g/l og 80 g/l).
    3. Opløs saltene i de cellefrie supernatanter ved hvirvel i 3 minutter.
    4. Tilsæt en tilsvarende mængde benzin til reagensglassene og bland kraftigt ved hvirvel i 3 minutter.
    5. Lad reagensglassene stå uforstyrret ved stuetemperatur i 24 timer.
    6. Anslå emulsionsindekset efter 24 timer.

5. Bestemmelse af arten af det biooverfladeaktive stof

  1. TLC af det ekstraherede biooverfladeaktive stof
    1. Spot 20 μL af biooverfladeaktive stoffer på TLC-plader. Spot 2 μL ad gangen.
    2. Spot biooverfladeaktive stoffer på tre forskellige TLC-plader.
    3. Der fremstilles en 100 ml blanding af det eluent, der indeholder chloroform:methanol (2:1), og eluenten tilsættes til TLC-kammeret. Luk låget på kammeret og lad det mætte i 20 minutter.
    4. Efter tørring af pladerne anbringes TLC-pladerne inde i kammeret mættet med en chloroformmethanolblanding og køres TLC.
    5. Når eluenten har nået toppen af TLC-pladen (1 cm væk fra toppen), skal du tage pladerne ud og lade den lufttørre.
  2. Farvning til påvisning af lipid
    1. Tag et rent TLC-kammer og tilsæt nogle (5-10) granuler jod i det friske kammer og mæt kammeret i 5 til 10 minutter.
    2. Placer TLC-pladen inde i kammeret og observer for udviklingen af de gule pletter. Hvis pletterne vises, skal du score det biooverfladeaktive stof positivt for tilstedeværelsen af lipidkomponenten.
  3. Farvning til detektion af peptid eller aminosyre
    1. Forbered en ninhydrinopløsning ved at opløse 0,4 g ninhydrin i 20 ml butanol. Tilsæt 0,6 ml 100% iseddikesyre til blandingen.
    2. Sprøjt TLC-pladen med ninhydrinopløsning og lad den lufttørre i 2 minutter. Opvarm pladen ved 110 °C og observer farvens udvikling.
      BEMÆRK: Hvis de blå pletter vises, skal du score det biooverfladeaktive stof positivt for tilstedeværelsen af enhver peptidkæde eller aminosyre.
  4. Farvning til detektion af kulhydrater
    1. Der fremstilles en opløsning af p-anisaldehyd ved at tilsætte 2 ml p-anisaldehyd til 48 ml iseddike indeholdende 1 mlH2S4. Tilsæt 0,6 ml eddikesyre til blandingen.
    2. Sprøjt blandingen jævnt på en TLC-plade og lad den lufttørre i 2 min.
    3. Inkuber pladen ved 110 °C og overvåg udviklingen af pletter.
      BEMÆRK: Hvis de grønne eller brune pletter vises, skal du score det biooverfladeaktive stof positivt for tilstedeværelsen af kulhydrater.

6. Kemisk identifikation af det biooverfladeaktive stof

  1. LCMS for det biooverfladeaktive stof
    1. 25 mg af det ekstraherede biooverfladeaktive stof opløses i 1 ml chloroform.
    2. Udfør LCMS (i en låsespraykonfiguration med en referencescanningsfrekvens på 10 s) ved hjælp af en C18-kolonne.
    3. Brug chloroform:methanol (1:1) som en mobil fase, og sprøjt 2 μL af prøven ind i kolonnen med en strømningshastighed på 0,1 ml/min.
    4. Indstil forsøgsparametrene til: polaritet: ES-positiv, kapillærspænding: 3 kV, kildetemperatur: 80 °C, desolvationstemperatur: 300 °C, desolvationsgasstrømningshastighed: 7.000 L/t og fældegasstrømningshastighed: 0,40 ml/min.
    5. Scan intervallerne fra 100 til 1.200 Da i løbet af en detektionstid på 20 minutter, og undersøg ionerne i positiv ES-tilstand.
    6. Analysér m/z-værdierne ved hjælp af enhver massespektrometri-kvantitativ software.
    7. Til analyse skal du logge ind på softwaren.
    8. Klik på Batchsøgning , og indtast listen over de opnåede masser. Undersøg resultaterne i en positiv opladningstilstand, og brug M + H og M + Na som addukter. Bevar nøjagtigheden til 10 PPM, og marker på Display Structure.
    9. Klik på Søg , og vælg den med det laveste PPM-niveau fra listen over forbindelser.
  2. 1 H NMR for det biooverfladeaktive stof
    BEMÆRK: 1H NMR af det biooverfladeaktive stof blev udført ved hjælp af et 400 MHz NMR-spektrometer (se materialetabellen).
    1. 5 mg af det biooverfladeaktive stof opløses i 1 ml deuteret chloroform (CdCl3).
    2. Overfør blandingen til et NMR-rør. Dæk røret ordentligt, og indsæt røret i skruenøglen. Juster rørets højde ved hjælp af justeringsrøret.
    3. Placer røret sammen med skruenøglen i NMR-maskinen, og følg nedenstående trin for at få et NMR-spektrum.
    4. For at vælge prøverørstypen: sx N, hvor N er den position, hvor røret blev placeret (f.eks. sx 13, hvis røret blev placeret i den 13. position) i tilknyttet software.
    5. Skriv edc, og tryk på Enter for at oprette en ny mappe, hvor data kan gemmes.
    6. Der vises et pop op-vindue. Vælg opløsningsmidlet ved at klikke på CdCl 3 på listen, og indtast navnet på prøven.
    7. For at starte protokollen skal du skrive "getprosol"; For at låse opløsningsmidlet skal du skrive "lås cdcl3".
    8. Skriv "topshim" for at shim prøven, og skriv til sidst "rga;zgefp" for at erhverve dataene. Dette starter protokollen.
    9. Når spektrene er opnået, skal du skrive "apk;abs n" og trykke på enter for fase- og baselinekorrektion.
    10. For at vælge primære toppe skal du skrive "pp" og trykke på Enter. For kun at vælge intense toppe skal du indtaste "mi" og indtaste den intensitet, over hvilken toppe skal vælges. Standardværdien vil være 0,2.
    11. For at integrere toppe skal du klikke på Integrer og placere markøren på venstre side af toppen, der skal integreres, og mens du holder markøren, skal du klikke og trække markøren rundt om toppen.
    12. Gem dataene ved at klikke på Filer i øverste venstre hjørne, og klik derefter på Gem.
    13. Prøven kan skubbes ud af maskinen ved at skrive "sx ej".
    14. Analyser toppe og bestem miljøet af H-atomerne.
  3. Fourier Transform Infrarød spektroskopi af biooverfladen
    BEMÆRK: FT-IR af ekstraheret biooverfladeaktivt stof blev udført ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt spektrofotometer i ATR-tilstand (se tabel over materialer).
    1. Tænd for spektrofotometeret, og kontroller rensningen, tørremiddel og detektor.
    2. For at indsamle et spektrum skal du først indsamle baggrundsspektret uden en prøve på plads.
    3. Tag det ekstraherede biooverfladeaktive stof og tør det helt. Placer det tørrede biooverfladeaktive middel direkte over diamantkrystallen, påfør tryk og tryk på ATR-berøringspunktet.
    4. I softwaren skal du vælge nummeret på scanningerne (indtast 30) og scanne spektret fra 400 cm-1 til 4.000 cm-1.
    5. Klik på OK for at tilføje prøvespektret til spektralvinduet.
    6. Klik på Filer > Gem > Gem som og indtast filnavnet efterfulgt af udvidelsen .spa og klik på OK.

7. Anvendelse af biooverfladeaktive data (forbedret oliegenvinding)

BEMÆRK: I dette eksperiment blev dobbeltdestilleret vand anvendt som en negativ kontrol, og 10% SDS, 10% Tween 80 og 10% kommerciel saponin blev anvendt som positive kontroller.

  1. Tag glasset og forsegl bundudløbet med glasuld og glasperler.
  2. Pak søjlen med sandjord på en sådan måde, at der kan tilsættes noget væske øverst på jorden, og strømmen igennem kan opsamles i bunden. Monter søjlen på holderen og tilsæt nogle glasperler oven på jorden.
  3. Oversvøm søjlen med 50 ml saltopløsning og opsaml strømmen igennem for at bestemme porevolumenet.
    porevolumen = volumen saltlage tilsat ovenpå - volumen af opsamlet gennemløb.
  4. Fjern saltlage fra søjlen ved at tvinge råolie til at passere gennem den efter tilsætning fra toppen af søjlen. Saml volumenet af saltlage og olie, der kommer ud af søjlen for at bestemme det oprindelige oliemætningsvolumen. Volumenet af saltlage frigivet fra søjlen vil være det oprindelige oliemætningsvolumen eller den originale olie på plads.
  5. Lad søjlen stå uforstyrret i 24 timer.
  6. Efter 24 timer oversvømmes søjlen med 10 porevolumener saltlage og opsamles olien, der kommer ud af søjlen for at estimere sekundær oliegenvinding. Den olie, der er tilbage i søjlen efter sekundær oliegenvinding, svarer til den resterende olie.
  7. Der fremstilles en blanding af biooverfladeaktive stoffer ved at tilsætte lige store mængder af det ekstraherede biooverfladeaktive stof (ekstraheret efter trin 3.5) til glasbægeret. Tilsæt biooverfladeaktive stoffer øverst i kolonnen, og inkuber kolonnen i 24 timer.
  8. Efter 24 timer måles mængden af olie og vand for at bestemme yderligere eller forbedret olieudvinding. Volumenet af den olie, der frigives fra kolonnen, svarer til den resterende olie, der genvindes.
  9. Anslå forbedret olieindvinding med følgende ligning:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tre bakteriestammer (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108) blev screenet til produktion af biooverfladeaktive stoffer ved forskellige assays, som omfattede dråbekollapsassay, olieforskydningsassay, emulsionsindeksassay og reduktion af overfladespænding. Cellefrie supernatanter af alle de tre bakteriestammer og en opløsning af kemisk overfladeaktivt stof resulterede i et dråbekollaps og blev derfor scoret positivt for tilstedeværelsen af de biooverfladeaktive stoffer (figur 4a). På den anden side kollapsede vanddråben ikke og blev derfor scoret negativ for tilstedeværelsen af biooverfladen. Kommercielt overfladeaktivt stof og de cellefrie supernatanter i de tre bakteriekulturer havde også succes med at fortrænge olielaget i det oliespredningsassay og blev derfor scoret positivt for tilstedeværelsen af biooverfladeaktivt stof (figur 4b). Vand kunne derimod ikke fortrænge nogen olie og blev derfor scoret negativt. I emulsionsindeksassays blev der observeret en stabil emulsion i reagensglas indeholdende kommercielt overfladeaktivt stof og supernatanterne af de tre mikrobielle stammer. Imidlertid blev der ikke observeret nogen emulsion i reagensglasset indeholdende uinokuleret dyrkningsmedium (figur 4c). Dette antydede igen, at Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108 producerer biooverfladeaktive stoffer. Bekræftelse af biooverfladeaktiv produktion blev opnået ved at måle overfladespændingen af den cellefri bouillon og sammenligne den med den uinokulerede kontrol. Biooverfladeaktive stoffer af Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108 viste sig at reducere overfladespændingen af mediet fra henholdsvis 58,89 mN/m til 45,41 mN/m, 45,82 mN/m og 28,43 mN/m (figur 5).

IFT-målinger blev udført ved hjælp af ringtrækmetoden. Biooverfladeaktive stoffer fra alle de tre stammer var i stand til signifikant at reducere grænsefladespændingerne mellem forskellige vandige og organiske faser (tabel S1). Overfladespændingen og grænsefladespændingsmålingerne bekræfter, at alle de tre stammer producerer biooverfladeaktive stoffer.

Opløsningsmiddelekstraktion af biooverfladeaktive stoffer fra de cellefrie kulturer af Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 og Paenibacillus sp. IITD108 resulterede i biooverfladeaktive koncentrationer på henholdsvis 820 mg / l, 560 mg / l og 480 mg / l.

Som observeret i figur 4C var emulsionen dannet af det biooverfladeaktive stof vand i oliemikroemulsion. Emulsionsstabilitetsassays viste, at de biooverfladeaktive stoffer udviste en god stabilitet under forskellige miljøforhold (figur 6). De producerede emulsioner var meget stabile på tværs af forskellige temperaturer (figur 6a), pH-værdier (figur 6b) og saltkoncentrationer (figur 6c) testet.

Tyndlagskromatografi blev udført for at bestemme arten af de biooverfladeaktive stoffer. Farvning af pladerne med joddamp resulterede i udvikling af gule pletter i alle biooverfladeaktive stoffer og kontrollen (Biooverfladeaktivt stof fra Bacillus sp. IITD 106 (figur 7a). Dette indikerede, at de biooverfladeaktive stoffer indeholdt en lipidmoiety. Der blev ikke opnået blåfarvede pletter i nogen af TLC-pladerne ved farvning med ninhydrin (figur 7b). Dette viste, at de biooverfladeaktive stoffer ikke indeholdt nogen peptidmoiety. Blå og grønne pletter blev observeret i alle TLC-pladerne, når de blev farvet med anisaldehydplet (figur 7c). Dette viste, at de biooverfladeaktive stoffer indeholdt en kulhydrat moiety. Ud fra resultaterne af TLC blev det konkluderet, at alle de biooverfladeaktive stoffer var glycolipider.

Kemisk identifikation af de biooverfladeaktive stoffer ved hjælp af LCMS afslørede, at Rhodococcus sp. IITD102 og Lysinibacillus sp. IITD104 producerer den samme type biooverfladeaktiv, der blev identificeret som Di-rhamnopyranosisk hydroxydecansyre med en masse på 480,25 Da. Strukturen af biooverfladeaktive oplysninger blev understøttet af 1H NMR- og FT-IR-data (figur 8).

I 1H NMR-spektrum repræsenterede de kemiske skift opnået ved 7, 2 protonerne af carboxyliske grupper. Kemiske skift svarende til protoner af methylgruppe blev opnået i området 1-2 ppm. Forskydninger svarende til protoner bundet til alkylgrupper blev opnået ved 2,3 ppm. FT-IR-spektre af de biooverfladeaktive stoffer ekstraheret fra Rhodococcus sp. IITD102 og Lysinibacillus sp. IITD104 viste tilstedeværelsen af stærke toppe ved bølge nummer 3.290 cm-1, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af OH-funktionsgruppen. En lille top ved bølgenummer 2.951 cm-1 svarer til CH-strækning. En stærk top på 1.620 cm-1 repræsenterede tilstedeværelsen af carboxylisk gruppe i biooverfladeaktive stoffer. Andre toppe, der blev opnået ved 1.530, 1.410, 1.200 og 1.060, bekræftede tilstedeværelsen af henholdsvis alkyl-,CH3-, C-O-C- og C-CH3-funktionelle grupper. Både NMR- og FT-IR-data understøttede strukturen af det biooverfladeaktive stof bestemt ud fra LCMS-undersøgelser. LCMS af rå biooverfladeaktivt stof fra Paenibacillus sp. IITD108 (figur 9) viste, at det producerer et rhamnolipid indeholdende tre lipidkæder, der danner den biooverfladeaktive kernes bulkhydrofobe kerne. Biooverfladen blev identificeret som 2decanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hydroxydecansyre med en masse på 802 Da. Resultaterne af LCMS blev understøttet af 1H NMR- og FT-IR-data.

Opsætningen for forbedret olieudvinding er vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel opsætning til forbedret oliegenvinding ved hjælp af sandpakningskolonneteknikken. Søjlen pakket med jord blev monteret på holderen. Bundudløbet blev forseglet med glasuld og glasperler. Efter sekundær genvinding blev den resterende olie inde i kolonnen udsat for forbedret olieudvinding ved tilsætning af den biooverfladeaktive blanding til den. Røret placeret i bunden af søjlen blev brugt til at opsamle den eluerede fraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

I det simulerede forbedrede oliegenvindingseksperiment blev der ud af 50 ml saltlage tilsat til toppen af søjlen opsamlet 12 ml i gennemstrømningen, og porevolumenet blev derfor anslået til at være 38 ml. Da olie blev tvunget gennem søjlen, blev 33 ml saltlage frigivet fra søjlen. Dette repræsenterede indledende oliemætningsvolumen. Sekundær genvinding ved hjælp af 10 porevolumener saltlage resulterede i eluering af 10 ml olie. Den resterende olie, der var tilbage i søjlen, var 23 ml. Vand indeholdende blandingen af biooverfladeaktive stoffer var i stand til at genvinde 13 ml olie fra kolonnen (figur 3).

Figure 3
Figur 3: Simuleret forbedret oliegenvinding ved hjælp af en sandpakningssøjle. Det oprindelige oliemætningsvolumen for både kontrol- og testkolonne var omkring 33 ml. Under sekundær olieudvinding blev omkring 10 ml af olien genvundet fra både kontrol- og testkolonnerne. Forskellene i testens genvindingsprofiler og kontrolkolonnerne blev kun observeret under genvinding af den resterende olie, der var tilbage i kolonnen. Den biooverfladeaktive blanding resulterede i yderligere genvinding af 13 ml af den resterende olie, der var tilbage fra testkolonnen, mens der i kontrolkolonnen kun blev genvundet 1,03 ml olie i dette trin. Dette viser, at blandingen af biooverfladeaktive stoffer har et stort potentiale til at forbedre genvindingen af restolie fra reservoirerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Dette repræsenterede forbedret olieindvinding. Vand indeholdende blandingen af biooverfladeaktive stoffer var derfor i stand til at genvinde 56,52 % af restolien fra kolonnen (tabel 1). På den anden side var opløsninger af 10% SDS, 10% Tween 80 og 10% saponin i stand til at genvinde 85%, 68% og 73% resterende olie fra kolonnen.

Parametre Kontroller oversvømmelser Kombineret biooverfladeaktiv oversvømmelse 10 % SDS 10 % Tween 10 % Saponin
PV (ml) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (ml) 33 33 33 29 33
POS (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
SOR (ml) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (ml) 23.23 23 21.5 18.8 23
ROS (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ROR (ml) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
AOR (%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

hvor PV = porevolumen bestemt efter indledende kolonnemætning med saltlage, OOIP = original olie på plads, IOSV = indledende oliemætningsvolumen, POS = Procent oliemætning, Sv = volumen saltlage tilsat til sekundær genvinding, SOR = sekundær olie genvundet efter saltvandsoversvømmelse, ROC = restolie i kolonne efter sekundær genvinding, ROS = resterende oliemætning, ROR = Restolie genvundet efter biooverfladeaktiv oversvømmelse AOR = yderligere olie genvundet

Tabel 1: Simuleret forbedret oliegenvinding i en sandpakningssøjle.

Figure 4
Figur 4: Screeningsassays for biooverfladeaktiv produktion (a) Drop collapse assay: Vanddråben kollapsede ikke efter at være blevet tilsat til den oliebelagte overflade, mens det kemiske overfladeaktive stof og cellefrie supernatanter af de tre bakteriestammer resulterede i dråbekollapset. b) Oliefortrængningsassay: Vanddråben resulterede ikke i forskydning af olien, mens det kemiske overfladeaktive stof og cellefrie supernatanter fra de tre bakteriestammer fortrængte lagene af olie (c) Emulsionsindeksassay: De cellefrie supernatanter og den kommercielle overfladeaktive opløsning resulterede alle i dannelsen af et stabilt emulsionsindeks. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Reduktion af overfladespænding som følge af produktion af biooverfladeaktive biooverflader. Bestemmelse af reduktion i mediets overfladespænding som følge af mikrobiel vækst bekræftede de mikrobielle medlemmers biooverfladeaktive produktion. På grund af væksten af Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104 reducerede overfladespændingen af mediet fra 59 mN/m til 45 mN/m. På grund af væksten af Paenibacillus sp. IITD 108 reducerede mediets overfladespænding fra 59 mN/m til 28 mN/m. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Emulsionsstabilitet ved forskellige (a) temperaturer, (b) pH-værdier og (c) saltkoncentrationer. Alle emulsioner genereret ved hjælp af supernatanterne af de tre mikrobielle stammer og blandingen af kommercielt overfladeaktivt stof viser stor stabilitet under forskellige miljøforhold. Inden for de testede temperatur-, pH- og saltkoncentrationsområder var de bestemte emulsionsindekser ens, og der blev ikke observeret nogen større reduktion af EI ved højere værdier af de forskellige faktorer, hvilket indebærer, at biooverfladeaktivt stof kan anvendes under ekstreme miljøforhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: TLC-karakterisering af biooverfladeaktive stoffer (a) Plader farvet med joddamp: Forskellige pletter udviklet på TLC-pladen viser, at de ekstraherede biooverfladeaktive stoffer er en blanding af forskellige forbindelser indeholdende en lipidgruppe. Pletterne markeret med blå pil repræsenterer de biooverfladeaktive stoffer, som har farvet positivt for tilstedeværelsen af lipidmoiety. De andre pletter repræsenterer resten af de forbindelser, der er til stede i blandingen af det rå biooverfladeaktive stof. (b) Plader farvet med ninhydrin: Ingen lilla pletter dukkede op, da pladerne blev farvet med ninhydrin. Dette repræsenterede fravær af aminosyrer i den biooverfladeaktive blanding og (c) Plader farvet med anisaldehyd: Lysegrønne og gule pletter optrådte på TLC-pladen, og disse repræsenterer de forbindelser, der indeholder sukkerarter. Pletterne markeret med sorte pile repræsenterer de biooverfladeaktive stoffer, der har farvet positivt for tilstedeværelsen af kulhydratmoiety. De pletter, der farvede både med jod og anisaldehyd, repræsenterer forbindelser, der indeholder både lipid- og kulhydratmoieties og muligvis kan være et glycolipid biooverfladeaktivt middel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Kemisk karakterisering af det biooverfladeaktive stof ekstraheret fra Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104. a) repræsenterer FT-IR-spektrene for de biooverfladeaktive stoffer, der er udvundet af Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104, b) repræsentererH1 NMR-spektrene for de biooverfladeaktive stoffer, der er udvundet af Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104, og c) viser strukturen af de rå biooverfladeaktive stoffer, der er udvundet af Rhodococcus sp. IITD 102 og Lysinibacillus sp. IITD 104. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Kemisk karakterisering af det biooverfladeaktive stof udvundet af Paenibacillus sp. IITD 108. a) repræsenterer FT-IR-spektrene for de biooverfladeaktive stoffer, der er udvundet af Paenibacillus sp. IITD 108, b) repræsenterer NMR-spektrene på 1H for de biooverfladeaktive stoffer, der er udvundet af Paenibacillus sp. IITD 108, og c) viser strukturen af de rå biooverfladeaktive stoffer, der er udvundet af Paenibacillus sp. IITD 108. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur S1: Struktur af forskellige typer biooverfladeaktive stoffer. Klik her for at downloade denne fil.

Tabel S1: Biooverfladeaktive stoffers indvirkning på grænsefladespændingen (IFT) mellem vand og kulbrinter. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biooverfladeaktive stoffer er en af de mest alsidige grupper af biologisk aktive komponenter, der bliver attraktive alternativer til kemiske overfladeaktive stoffer. De har en bred vifte af anvendelser i mange brancher såsom vaskemidler, maling, kosmetik, fødevarer, lægemidler, landbrug, olie og vandbehandling på grund af deres bedre befugtningsevne, lavere CMC, diversificerede struktur og miljøvenlighed18. Dette har ført til en øget interesse for at opdage flere mikrobielle stammer, der er i stand til biooverfladeaktiv produktion. Her illustrerer vi metoderne til screening, identifikation og anvendelse af en blanding af biooverfladeaktive stoffer produceret af Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 og Paenibacillus sp. IITD 108 til forbedret olieudvinding. Biooverfladeaktiv produktion blev screenet ved dråbekollaps, oliespredning, emulsionsindeksassay og bekræftet ved at måle reduktionen i overfladespændingen af mediet på grund af mikrobiel vækst. Forskellige rapporter om produktion af glycolipid biooverfladeaktive stoffer (rhamnolipider og trehalolipider) fra Rhodococcus er tilgængelige i litteratur 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. har rapporteret produktion og optimering af et lipopeptid biooverfladeaktivt stof fra Paenibacillus sp. alvei ARN6325. Bezza et al. har rapporteret bionedbrydning af pyren af et lipopeptid biooverfladeaktivt stof produceret af Paenibacillus dendritiformis CN526. Biooverfladeaktiv produktion (Lipopeptider og glycolipider) er også blevet rapporteret af andre stammer af Paenibacillus 27,28,29,30,31. Forskellige arter af Lysinibacillus er blevet rapporteret at producere biooverfladeaktive stoffer 32,33,34. Lysinibacillus sphaericus er blevet rapporteret at producere rhamnolipid, der er i stand til opløselighed af hydrofobe pesticider35.

En af de fordele, som biooverfladeaktive stoffer tilbyder i forhold til deres kemiske modstykker, er deres stabilitet under ekstreme miljøforhold. De biooverfladeaktive stoffer produceret af Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 og Paenibacillus sp. IITD 108 blev analyseret for deres stabilitet under forskellige temperaturområder, pH og saltkoncentrationer og viste sig at være stabile under ekstreme værdier af disse parametre. Tidligere rapporterede Habib et al. et lipopeptid produceret af carbonhydridnedbrændende Rhodococcus sp., der viste stabilitet på tværs af forskellige temperaturområder, pH-værdier og saltkoncentrationer36. Forøgelse af koncentrationen af uorganiske salte er rapporteret at øge emulsionens stabilitet37. Kolloidernes tendens til at agglomerere eller adskille er en funktion af de attraktive (Van der Walls-kræfter) og frastødende kræfter (elektrostatiske kræfter), der er involveret under partikelinteraktion38. Saltkrystallerne ved opløsning i vand etablerer deres egne elektriske ladninger, og de frigivne ioner adsorberer på emulsionsdråberne. Ved at øge saltkoncentrationen reduceres udvidelsen og afstødning af det andet lag. Jo højere ladningstætheden af en ion er, desto lavere er længden af det elektriske lag. Således resulterer divalente kationer såsom Na2+ i dannelsen af mere stabile emulsioner sammenlignet med monovalente kationer39.

En anden fordel, som biooverfladeaktive stoffer har i forhold til kemiske overfladeaktive stoffer, er, at de er biologisk nedbrydelige40. Zeng et al. har sammenlignet nedbrydningskapaciteten for syntetisk overfladeaktivt stof Triton X 100, lineære alkylbenzensulfonater (LAS) og rhamnolipid og fundet ud af, at rhamnolipid biooverfladeaktivt stof var fuldstændig nedbrudt, mens LAS og Triton X 100 kun blev delvist nedbrudt41. Liu et al. rapporterer også, at i modsætning til syntetiske overfladeaktive stoffer CTAB, Triton X 100 og SDS udviser rhamnolipid ingen toksicitet og let kan nedbrydes af B. subtilis og andre kompostmikroorganismer42.

De biooverfladeaktive stoffer, der produceres af alle tre mikrobielle stammer, viste sig at være glycolipider. Rhodococcus er tidligere blevet rapporteret at producere glycolipid af forskellige forskergrupper 20,21,23. Lignende rapporter om glycolipid biooverfladeaktiv produktion af Lysinibacillus og Paenibacillus er også tilgængelige i litteraturen 31,32,35,43,44. Kemisk identifikation af de biooverfladeaktive stoffer afslørede, at de var rhamnolipider. Rhamnolipider er klassen af glycolipid biooverfladeaktive stoffer, der indeholder en eller to rhamnose enheder forbundet til en lipidkæde45. De er den mest undersøgte type biooverfladeaktive stoffer. Forskellige mikrobielle stammer er blevet rapporteret at producere rhamnolipider 7,46,47,48,49. Rhamnolipider er blevet rapporteret at udvise stort potentiale for at forbedre genvindingen af resterende olie 50,51,52,53. I vores undersøgelse fandt vi, at blandingen af biooverfladeaktive stoffer produceret af Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 og Paenibacillus sp. IITD 108 med succes genvandt omkring 56,52% af restolien i en simuleret sandpakningskolonnetest. Dette viste, at blandingen af biooverfladeaktive stoffer kan anvendes til genvinding af restolie fra jordreservoirerne. I en lignende sandpakketest har Sun et al. rapporteret, at biooverfladeaktivt middel havde succes med at genvinde 50% af den resterende olie54. Biooverfladeaktive stoffer, der indeholder cellefri bouillon af Bacillus subtilis, er også blevet rapporteret at være effektive til at genvinde 33% af restolie55. Restolieindvinding på 27% og 26% -36% er også blevet rapporteret af Darvishi et al. og Wahabi et al.56,57.

Økonomisk evaluering af biooverfladeaktive stoffer til genvinding af restolie fra reservoirer viser, at udnyttelse af biooverfladeaktive stoffer i EOR er økonomisk en levedygtig mulighed. Moutinho et al. rapporterede, at de typiske omkostninger ved en kommerciel biooverfladeaktivant (rhamnolipider) er omkring 59,6 USD pr. kg58. I en anden undersøgelse er det også blevet rapporteret, at den biooverfladeaktive koncentration på 28 mg/l biooverfladeaktivt stof forbedrede den resterende olieudvinding og førte til produktion af 52,5 m3 yderligere olie59. Undersøgelserne viste, at en koncentration af biooverfladeaktive data på 10 mg/l var tilstrækkelig til at mobilisere olieudvindingen. Ifølge de rapporterede data er mængden af biooverfladeaktivt stof, der kræves for at producere 52,5 m3 ekstra olie, omkring 0,525 kg. De samlede produktionsomkostninger på 52,5 m3 olie er omkring US $ 21463, hvoraf kun US $ 30 er produktionsomkostningerne for biooverfladen. Dataene viser, at de procentvise omkostninger for biooverfladeaktivt middel i olieproduktionen pr. Tønde kun er 0,0000139%.

Vores resultater tyder på, at kombinationen af de biooverfladeaktive stoffer effektivt kan bruges til at genvinde restolie fra reservoirerne. Så vidt vi ved, er dette den første rapport om forbedring af genvindingen af restolien fra reservoiret ved hjælp af en blanding af biooverfladeaktive stoffer produceret af forskellige mikrobielle stammer. Selvom vores undersøgelse klart beskriver de metoder, der er involveret i screening, strukturel karakterisering og anvendelse af biooverfladeaktive stoffer i forbedret oliegenvinding, giver undersøgelsen ikke en detaljeret funktionel karakterisering af de biooverfladeaktive stoffer, som påvirker deres effektivitet i forskellige applikationer. Kritisk micellekoncentration, som er målestokken for effektiviteten af ethvert overfladeaktivt stof til dannelse af micellerne og specificerer den begrænsende koncentration af det overfladeaktive stof med henblik på dets meningsfulde anvendelse, er ikke blevet bestemt i denne undersøgelse60. Tilsvarende er termisk stabilitet af det biooverfladeaktive stof, som bestemmer dets anvendelighed ved reservoirforhold for EOR, heller ikke beskrevet61. Biooverfladeaktive stoffer i nogle applikationer anvendes også som antibiofilmmidler. Deres overfladebefugtelighed spiller en vigtig rolle i bestemmelsen af deres antibiofilm natur. Der er heller ikke foretaget undersøgelser af befugtning af overflader i det nuværende arbejde62. Andre funktionelle egenskaber, der er vigtige i forskellige anvendelser af biooverfladeaktive stoffer, herunder deres bionedbrydelighed og den antimikrobielle karakter, er heller ikke blevet bestemt i denne undersøgelse63,64. Således har vi fokuseret på den strukturelle karakterisering af biooverfladeaktive stoffer. Afhængigt af målapplikationen kan funktionel karakterisering såsom stabilitet, bionedbrydelighed og antimikrobiel aktivitet udføres.

I dråbekollapsassay og oliespredningsassay, for at øge synligheden, er det bedre at bruge en olie, der har en vis farve. I oliespredningsassayet skal emulsionen observeres efter 24 timer. Let skum, hvis det dannes, opløses i 24 timer. Tensiometre er meget følsomme instrumenter, derfor skal beholderen og sonden rengøres korrekt før hver måling under overfladespændingsmålinger for at undgå fejl på grund af overførsel af sidste målinger. Ekstraktion af biooverfladeaktivt stof involverer tilsætning af chloroformmethanolblanding til det cellefrie supernatant. Trinnet skal enten udføres i en stinkhætte, eller kolben skal være dækket af aluminiumsfolie umiddelbart efter overførsel af ekstraktionsblandingen. Under sekundær genvinding i et EOR-forsøg skal saltlageopløsning tilsættes i overskud, indtil der ikke kommer yderligere olie ud af søjlen.

Metoden diskuterer omfanget af blanding af biooverfladeaktive stoffer ved genvinding af restolie fra kolonnerne. Processen er afhængig af mange faktorer. Vækststadiet af mikroberne, hvor de oprindelige kulturer høstes. Nogle biooverfladeaktive stoffer er rapporteret at være produceret i logfasen, mens andre er blevet rapporteret at være produceret i den stationære fase. Kulturerne bør høstes i overensstemmelse hermed på det pågældende stadium, hvor produktionen af biooverfladeaktive stoffer har nået sit maksimum. Biooverfladeaktive screeningsassays er mindre følsomme, og derfor bør alle assays udføres, inden der drages en konklusion om en bestemt stammes biooverfladeaktive produktionsevne. Oprensning af det biooverfladeaktive stof bør foretages inden kemisk karakterisering af det biooverfladeaktive stof, hvis koncentrationen af biooverfladeaktivt stof er lav i det rå biooverfladeaktive stof. Forbedrede oliegenvindingsforsøg er meget afhængige af den jordtype, der anvendes til pakning af søjlen. Jorden skal være helt tør og skal sigtes for at fjerne større granulater og andre faste forurenende stoffer. En blanding af sandjord og tør havejord (i lige forhold) bør foretrækkes til pakning af søjlen. Søjleudløbet skal forsegles korrekt med glasuld og glasperler for at undgå lækage af jord fra søjlen i løbet af forsøget.

Den beskrevne metode er nyttig til bestemmelse af betydningen af de producerede biooverfladeaktive stoffer og deres blandinger ved genvinding af yderligere olie i et simuleret sandpakningskolonneeksperiment. Forskellige biooverfladeaktive stoffer har forskellige specificiteter, fordi de indeholder forskellige funktionelle grupper65. En kombination af biooverfladeaktive stoffer vil muliggøre opløselighed af forskellige kulbrinter og vil derfor øge den resterende olieudvinding fra reservoirerne. Den beskrevne metode vil hjælpe med at bestemme potentialet i biooverfladeaktive blandinger i feltanvendelser såsom forbedret olieudvinding fra oliebrønde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Institut for Bioteknologi, Indiens regering, for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, J. D., Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61 (1), 47-64 (1997).
  2. Banat, I. M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology. 51 (1), 1-12 (1995).
  3. Singh, A., Van Hamme, J. D., Ward, O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances. 25 (1), 99-121 (2007).
  4. Shah, N., Nikam, R., Gaikwad, S., Sapre, V., Kaur, J. Biosurfactant: types, detection methods, importance and applications. Indian Journal of Microbiology Research. 3 (1), 5-10 (2016).
  5. McClements, D. J., Gumus, C. E. Natural emulsifiers-Biosurfactants, phospholipids, biopolymers, and colloidal particles: Molecular and physicochemical basis of functional performance. Advances in Colloid and Interface Science. 234, 3-26 (2016).
  6. Nguyen, T. T., Youssef, N. H., McInerney, M. J., Sabatini, D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Research. 42 (6-7), 1735-1743 (2008).
  7. Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 54 (5), 625-633 (2000).
  8. Banat, I. M., Makkar, R. S., Cameotra, S. S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53 (5), 495-508 (2000).
  9. Mulugeta, K., Kamaraj, M., Tafesse, M., Aravind, J. A review on production, properties, and applications of microbial surfactants as a promising biomolecule for environmental applications. Strategies and Tools for Pollutant Mitigation: Avenues to a Cleaner Environment. , 3-28 (2021).
  10. Sharma, J., Sundar, D., Srivastava, P. Biosurfactants: Potential agents for controlling cellular communication, motility, and antagonism. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 727070 (2021).
  11. Vijayakumar, S., Saravanan, V. Biosurfactants-types, sources and applications. Research Journal of Microbiology. 10 (5), 181-192 (2015).
  12. Curiel-Maciel, N. F., et al. Characterization of enterobacter cloacae BAGM01 producing a thermostable and alkaline-tolerant rhamnolipid biosurfactant from the Gulf of Mexico. Marine Biotechnology. 23 (1), 106-126 (2021).
  13. Nikolova, C., Gutierrez, T. Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry: current state of knowledge and future perspectives. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  14. Rastogi, S., Tiwari, S., Ratna, S., Kumar, R. Utilization of agro-industrial waste for biosurfactant production under submerged fermentation and its synergistic application in biosorption of Pb2. Bioresource Technology Reports. 15, 100706 (2021).
  15. Zargar, A. N., Lymperatou, A., Skiadas, I., Kumar, M., Srivastava, P. Structural and functional characterization of a novel biosurfactant from Bacillus sp. IITD106. Journal of Hazardous Materials. 423, Pt B 127201 (2022).
  16. Adnan, M., et al. Functional and structural characterization of pediococcus pentosaceus-derived biosurfactant and its biomedical potential against bacterial adhesion, quorum sensing, and biofilm formation. Antibiotics. 10 (11), 1371 (2021).
  17. Du Nouy, P. L. A new apparatus for measuring surface tension. The Journal of General Physiology. 1 (5), 521-524 (1919).
  18. Akbari, S., Abdurahman, N. H., Yunus, R. M., Fayaz, F., Alara, O. R. Biosurfactants-a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnology Research and Innovation. 2 (1), 81-90 (2018).
  19. Bicca, F. C., Fleck, L. C., Ayub, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia. 30 (3), 231-236 (1999).
  20. Kuyukina, M. S., et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. Journal of Microbiological Methods. 46 (2), 149-156 (2001).
  21. Philp, J., et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Applied Microbiology and Biotechnology. 59 (2), 318-324 (2002).
  22. Mutalik, S. R., Vaidya, B. K., Joshi, R. M., Desai, K. M., Nene, S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp. MTCC 2574. Bioresource Technology. 99 (16), 7875-7880 (2008).
  23. Shavandi, M., Mohebali, G., Haddadi, A., Shakarami, H., Nuhi, A. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces. 82 (2), 477-482 (2011).
  24. White, D., Hird, L., Ali, S. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp., strain PML026. Journal of Applied Microbiology. 115 (3), 744-755 (2013).
  25. Najafi, A., et al. Interactive optimization of biosurfactant production by Paenibacillus alvei ARN63 isolated from an Iranian oil well. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 82 (1), 33-39 (2011).
  26. Bezza, F. A., Chirwa, E. M. N. Pyrene biodegradation enhancement potential of lipopeptide biosurfactant produced by Paenibacillus dendritiformis CN5 strain. Journal of Hazardous Materials. 321, 218-227 (2017).
  27. Jimoh, A. A., Lin, J. Biotechnological applications of Paenibacillus sp. D9 lipopeptide biosurfactant produced in low-cost substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (3), 921-941 (2020).
  28. Liang, T. -W., et al. Exopolysaccharides and antimicrobial biosurfactants produced by Paenibacillus macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (2), 933-950 (2014).
  29. Mesbaiah, F. Z., et al. Preliminary characterization of biosurfactant produced by a PAH-degrading Paenibacillus sp. under thermophilic conditions. Environmental Science and Pollution Research. 23 (14), 14221-14230 (2016).
  30. Quinn, G. A., Maloy, A. P., McClean, S., Carney, B., Slater, J. W. Lipopeptide biosurfactants from Paenibacillus polymyxa inhibit single and mixed species biofilms. Biofouling. 28 (10), 1151-1166 (2012).
  31. Gudiña, E. J., et al. Novel bioemulsifier produced by a Paenibacillus strain isolated from crude oil. Microbial Cell Factories. 14 (1), 1-11 (2015).
  32. Pradhan, A. K., Pradhan, N., Sukla, L. B., Panda, P. K., Mishra, B. K. Inhibition of pathogenic bacterial biofilm by biosurfactant produced by Lysinibacillus fusiformis S9. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (2), 139-149 (2014).
  33. Manchola, L., Dussán, J. Lysinibacillus sphaericus and Geobacillus sp biodegradation of petroleum hydrocarbons and biosurfactant production. Remediation Journal. 25 (1), 85-100 (2014).
  34. Bhardwaj, G., Cameotra, S. S., Chopra, H. K. Biosurfactant from Lysinibacillus chungkukjangi from rice bran oil sludge and potential applications. Journal of Surfactants and Detergents. 19 (5), 957-965 (2016).
  35. Gaur, V. K., et al. Rhamnolipid from a Lysinibacillus sphaericus strain IITR51 and its potential application for dissolution of hydrophobic pesticides. Bioresource Technology. 272, 19-25 (2019).
  36. Habib, S., et al. Production of lipopeptide biosurfactant by a hydrocarbon-degrading Antarctic Rhodococcus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6138 (2020).
  37. Shao, P., Ma, H., Zhu, J., Qiu, Q. Impact of ionic strength on physicochemical stability of o/w emulsions stabilized by Ulva fasciata polysaccharide. Food Hydrocolloids. 69, 202-209 (2017).
  38. Trefalt, G., Borkovec, M. Overview of DLVO theory. , Available from: https://archive-ouverte.unige.ch/unige:148595 (2014).
  39. Kazemzadeh, Y., Ismail, I., Rezvani, H., Sharifi, M., Riazi, M. Experimental investigation of stability of water in oil emulsions at reservoir conditions: Effect of ion type, ion concentration, and system pressure. Fuel. 243, 15-27 (2019).
  40. Chong, H., Li, Q. Microbial production of rhamnolipids: opportunities, challenges and strategies. Microbial Cell Factories. 16 (1), 1-12 (2017).
  41. Zeng, G., et al. Co-degradation with glucose of four surfactants, CTAB, Triton X-100, SDS and Rhamnolipid, in liquid culture media and compost matrix. Biodegradation. 18 (3), 303-310 (2007).
  42. Liu, G., et al. Advances in applications of rhamnolipids biosurfactant in environmental remediation: a review. Biotechnology and Bioengineering. 115 (4), 796-814 (2018).
  43. John, W. C., Ogbonna, I. O., Gberikon, G. M., Iheukwumere, C. C. Evaluation of biosurfactant production potential of Lysinibacillus fusiformis MK559526 isolated from automobile-mechanic-workshop soil. Brazilian Journal of Microbiology. 52 (2), 663-674 (2021).
  44. Naing, K. W., et al. Isolation and characterization of an antimicrobial lipopeptide produced by Paenibacillus ehimensis MA2012. Journal of Basic Microbiology. 55 (7), 857-868 (2015).
  45. Wittgens, A., et al. Novel insights into biosynthesis and uptake of rhamnolipids and their precursors. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (7), 2865-2878 (2017).
  46. Rahman, K., Rahman, T. J., McClean, S., Marchant, R., Banat, I. M. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnology Progress. 18 (6), 1277-1281 (2002).
  47. Bahia, F. M., et al. Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  48. Kim, C. H., et al. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environment Research. 91 (8), 739-747 (2019).
  49. Nalini, S., Parthasarathi, R. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production from Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its biocontrol efficacy against Fusarium wilt of eggplant. Annals of Agrarian Science. 16 (2), 108-115 (2018).
  50. Wang, Q., et al. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology and Bioengineering. 98 (4), 842-853 (2007).
  51. Câmara, J., Sousa, M., Neto, E. B., Oliveira, M. Application of rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa in microbial-enhanced oil recovery (MEOR). Journal of Petroleum Exploration and Production Technology. 9 (3), 2333-2341 (2019).
  52. Amani, H., Mehrnia, M. R., Sarrafzadeh, M. H., Haghighi, M., Soudi, M. R. Scale up and application of biosurfactant from Bacillus subtilis in enhanced oil recovery. Applied Biochemistry and Biotechnology. 162 (2), 510-523 (2010).
  53. Gudiña, E. J., et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation. Bioresource Technology. 177, 87-93 (2015).
  54. Sun, G., Hu, J., Wang, Z., Li, X., Wang, W. Dynamic investigation of microbial activity in microbial enhanced oil recovery (MEOR). Petroleum Science and Technology. 36 (16), 1265-1271 (2018).
  55. Jha, S. S., Joshi, S. J., SJ, G. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian Journal of Microbiology. 47 (4), 955-964 (2016).
  56. Darvishi, P., Ayatollahi, S., Mowla, D., Niazi, A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 84 (2), 292-300 (2011).
  57. Al-Wahaibi, Y., et al. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B30 and its application in enhancing oil recovery. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 114, 324-333 (2014).
  58. Moutinho, L. F., Moura, F. R., Silvestre, R. C., Romão-Dumaresq, A. S. Microbial biosurfactants: A broad analysis of properties, applications, biosynthesis, and techno-economical assessment of rhamnolipid production. Biotechnology Progress. 37 (2), 3093 (2021).
  59. Youssef, N., Simpson, D. R., McInerney, M. J., Duncan, K. E. In-situ lipopeptide biosurfactant production by Bacillus strains correlates with improved oil recovery in two oil wells approaching their economic limit of production. International Biodeterioration & Biodegradation. 81, 127-132 (2013).
  60. Ruckenstein, E., Nagarajan, R. Critical micelle concentration and the transition point for micellar size distribution. The Journal of Physical Chemistry. 85 (20), 3010-3014 (1981).
  61. de Araujo, L. L., et al. Microbial enhanced oil recovery using a biosurfactant produced by Bacillus safensis isolated from mangrove microbiota-Part I biosurfactant characterization and oil displacement test. Journal of Petroleum Science and Engineering. 180, 950-957 (2019).
  62. Banat, I. M., De Rienzo, M. A. D., Quinn, G. A. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (24), 9915-9929 (2014).
  63. Klosowska-Chomiczewska, I., Medrzycka, K., Karpenko, E. Biosurfactants-biodegradability, toxicity, efficiency in comparison with synthetic surfactants. Research and Application of New Technologies in Wastewater Treatment and Municipal Solid Waste Disposal in Ukraine, Sweden, and Poland. 17, 141-149 (2013).
  64. Fernandes, P. A. V., et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (4), 704-709 (2007).
  65. Santos, D. K. F., Rufino, R. D., Luna, J. M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 401 (2016).

Tags

Miljøvidenskab udgave 184
Forbedret oliegenvinding ved hjælp af en kombination af biooverfladeaktive stoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter