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생체 계면활성제의 조합을 사용한 향상된 오일 회수

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

우리는 미생물을 생산하는 생체 계면 활성제의 스크리닝 및 확인에 관련된 방법을 설명합니다. 크로마토그래피 특성화 및 생체계면활성제의 화학적 동정을 위한 방법, 잔류 오일 회수를 증진시키는 생체계면활성제의 산업적 응용성을 결정하기 위한 방법들 또한 제시된다.

Abstract

생체 계면활성제는 서로 다른 극성의 두 단계 사이의 표면 장력을 감소시킬 수 있는 표면 활성 화합물이다. 생체 계면활성제는 독성이 적고, 생분해성이 높으며, 환경 적합성 및 극한의 환경 조건에 대한 내성으로 인해 화학 계면활성제에 대한 유망한 대안으로 부상하고 있습니다. 여기에서, 우리는 생체 계면활성제를 생산할 수 있는 미생물의 스크리닝에 사용되는 방법을 예시한다. 미생물을 생산하는 생체계면활성제는 방울 붕괴, 오일 확산 및 유화 지수 분석을 사용하여 확인되었다. 생체계면활성제 생산은 미생물 부재의 성장에 의한 배지의 표면 장력의 감소를 결정함으로써 검증되었다. 우리는 또한 생체 계면 활성제의 특성화 및 확인과 관련된 방법을 설명합니다. 추출된 생체계면활성제의 박층 크로마토그래피에 이어 플레이트의 시등 염색을 수행하여 생체계면활성제의 성질을 확인하였다. LCMS, 1HNMR, 및 FT-IR을 사용하여 생체계면활성제를 화학적으로 동정하였다. 우리는 시뮬레이션된 샌드 팩 컬럼에서 잔류 오일 회수를 향상시키기 위해 생산된 바이오계면활성제의 조합의 적용을 평가하는 방법을 추가로 예시한다.

Introduction

생체 계면 활성제는 두 단계1 사이의 표면 및 계면 장력을 감소시킬 수있는 능력을 가진 미생물에 의해 생성 된 양친매성 표면 활성 분자입니다. 전형적인 생체계면활성제는 일반적으로 당 모이어티 또는 펩티드 사슬 또는 친수성 아미노산 및 포화 또는 불포화 지방산 사슬로 구성되는 소수성 부분2로 구성되는 친수성 부분을 함유한다. 양친매성 특성으로 인해, 생체 계면활성제는 두 상 사이의 계면에서 조립되고 경계에서 계면 장력을 감소시켜 한 상을 다른 1,3으로 분산시키는 것을 용이하게합니다. 지금까지 보고된 다양한 유형의 생체계면활성제에는 탄수화물이 에스테르 결합을 통해 장쇄 지방족 또는 히드록시지방족 산에 연결되는 당지질(예를 들어, 람놀리지질, 트레할로지질 및 소포리지질), 지질이 폴리펩티드 사슬에 부착되는 리포펩티드(예를 들어, 수록실 및 리케니신), 및 일반적으로 다당류-단백질 복합체로 구성되는 고분자 생체계면활성제(예를 들어, 에뮬산, 리포산, 알라산 및 리포만난)4. 미생물에 의해 생산된 다른 유형의 생체계면활성제는 지방산, 인지질, 중성 지질, 및 미립자 생물계면활성제(5)를 포함한다. 생체 계면 활성제의 가장 많이 연구 된 부류는 당지질이며, 그 중 대부분의 연구는 람 놀리 지질6에 대해보고되었습니다. 람놀리피드는 장쇄 지방산(보통 하이드록시데칸산)의 하나 또는 두 개의 분자에 연결된 람노스(친수성 부분을 형성하는)의 하나 또는 두 개의 분자를 함유한다. 람놀리피드는 슈도모나스 aeruginosa7로부터 처음 보고된 일차 당지질이다.

생체 계면 활성제는 그들이 제공하는 다양한 독특하고 독특한 특성으로 인해 화학 물질에 비해 점점 더 많은 관심을 얻고 있습니다8. 여기에는 더 높은 특이성, 낮은 독성, 더 큰 다양성, 준비 용이성, 더 높은 생분해성, 더 나은 발포성, 환경 적합성 및 극한 조건 하에서의 활성이포함됩니다 9. 생체계면활성제의 구조적 다양성(도 S1)은 화학적 대응물(10)에 비해 우위를 제공하는 또 다른 이점이다. 그들은 일반적으로 그들의 임계 미셀 농도 (CMC)가 일반적으로 화학 계면활성제11보다 몇 배 낮기 때문에 더 낮은 농도에서 더 효과적이고 효율적입니다. 이 제품은 매우 열안정성(최대 100°C)이며 더 높은 pH(최대 9개) 및 높은 염 농도(최대 50g/L)를 견딜 수 있는 것으로 보고되었으며12 따라서 극한 조건에 노출되어야 하는 산업 공정에서 몇 가지 이점을 제공합니다13. 생분해성과 낮은 독성으로 인해 생물 개선과 같은 환경 응용 분야에 적합합니다. 그들이 제공하는 장점 때문에, 그들은 식품, 농업, 세제, 화장품 및 석유 산업과 같은 다양한 산업에서 주목을 받고 있습니다11. 생체 계면 활성제는 또한 석유 오염 물질 및 독성 오염 물질(14)의 제거를위한 오일 개선에 많은 주목을 받았다.

여기서 우리는 Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 및 Paenibacillus sp. IITD108에 의해 생산 된 생체 계면 활성제의 생산, 특성화 및 적용을보고합니다. 향상된 오일 회수를 위한 생체계면활성제의 조합의 스크리닝, 특성화 및 적용에 관련된 단계는 도 1에 요약되어 있다.

Figure 1
도 1: 생체계면활성제의 조합을 이용한 향상된 오일 회수를 위한 방법. 단계적 작업 흐름이 표시됩니다. 작업은 네 단계로 수행되었습니다. 먼저 미생물 균주를 배양하고 낙하 붕괴 분석, 오일 확산 분석, 유화 지수 분석 및 표면 장력 측정을 포함하는 다양한 분석법에 의해 생체 계면활성제의 생산을 스크리닝하였다. 그런 다음 무세포 배양액에서 생체 계면 활성제를 추출하고 박층 크로마토그래피를 사용하여 그 성질을 확인하고 LCMS, NMR 및 FT-IR을 사용하여 추가로 확인했습니다. 다음 단계에서, 추출된 생체계면활성제를 함께 혼합하고, 생성된 혼합물의 향상된 오일 회수를 위한 잠재성을 샌드 팩 컬럼 기술을 사용하여 결정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

생체계면활성제를 생산하기 위한 이들 미생물 균주의 스크리닝은 방울 붕괴, 오일 확산, 에멀젼 지수 분석 및 미생물의 성장에 의한 무세포 배지의 표면 장력의 감소의 결정에 의해 수행되었다. 생체계면활성제를 추출하고, 특성화하고, LCMS, 1H NMR, 및 FT-IR에 의해 화학적으로 동정하였다. 마지막으로, 이들 미생물에 의해 생성된 생체계면활성제의 혼합물이 제조되었고, 모의 샌드 팩 컬럼에서 잔류 오일을 회수하는데 사용되었다.

본 연구는 단지 잔류 오일 회수를 증진시키기 위한 생체계면활성제 조합의 스크리닝, 동정, 구조적 특성화 및 적용에 관여하는 방법들을 예시한다. 미생물 균주(15,16)에 의해 생산된 생체계면활성제의 상세한 기능적 특성화를 제공하지 않는다. 모든 생체 계면활성제의 상세한 기능적 특성화를 위해 임계 미셀 결정, 열 중량 분석, 표면 습윤성 및 생분해성과 같은 다양한 실험이 수행됩니다. 그러나이 논문은 방법 논문이기 때문에 잔류 오일 회수 강화에 대한 생체 계면 활성제 조합의 스크리닝, 식별, 구조적 특성화 및 적용에 중점을 둡니다. 이러한 실험은 본 연구에 포함되지 않았다.

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Protocol

1. 미생물 균주의 성장

  1. Luria Broth 분말 2g을 재고 250mL 원뿔형 플라스크에 증류수 50mL를 첨가합니다. 분말이 완전히 용해 될 때까지 내용물을 혼합하고 증류수를 사용하여 부피를 100 mL로 구성하십시오.
  2. 마찬가지로, Luria Broth 100mL의 플라스크를 두 개 더 준비하고 플라스크의 목에 면봉을 놓습니다.
  3. 면 플러그를 알루미늄 호일로 덮고 플라스크를 121°C 및 15 psi에서 15분 동안 오토클레이브하여 매체를 멸균한다.
  4. 오토클레이빙 후 미디어를 실온으로 식히십시오.
  5. 균주의 일차 배양을 준비하기 위해, 접종 루프를 사용하여 LA 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고 멸균 루리아 국물 5 mL를 함유하는 시험관에 접종한다.
  6. 시험관을 180 rpm에서 30°C에서 밤새 인큐베이션한다.
  7. 오토클레이브된 루리아 브로스 100 mL를 함유하는 플라스크에 밤새 성장한 종자 배양물 1 mL를 층류 캐비닛 내부의 플라스크에 첨가하여 접종한다.
  8. 플라스크를 7일 동안 30°C 및 180 rpm의 회전 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
  9. 인큐베이션 기간이 완료된 후, 플라스크를 수확하고 배양액을 원심분리 튜브로 옮긴다. 배양물을 4°C에서 냉장 원심분리기에서 20분 동안 4,500 x g 에서 원심분리한다.
  10. 부드럽게 세포가없는 상청액을 신선한 비이커에 붓고 생체 계면 활성제 생산을위한 스크리닝 분석에 사용하십시오.

2. 생체계면활성제 생산을 위한 스크리닝 분석

참고: 다음 섹션에서는 상업용 계면활성제(Saponin)를 양성 대조군으로 사용하였고, 물과 접종되지 않은 배지를 음성 대조군으로 사용하였다.

  1. 낙하 붕괴 분석
    1. 깨끗한 유리 슬라이드를 가져 와서 슬라이드 표면을 200 μL의 오일로 코팅하십시오.
    2. 20 μL의 무세포 상청액을 오일의 중앙에 첨가하고 2-3 분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
      참고 : 방울이 붕괴되면 생체 계면 활성제의 존재에 대해 상청액을 양성으로 평가하십시오.
  2. 오일 확산 분석
    1. 페트리 플레이트 (직경 75mm)에 이중 증류수 20mL를 취하여 물 표면에 원유 200μL를 첨가하십시오.
    2. 20 μL의 무세포 상청액을 오일의 중앙에 첨가하고 1 분 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
      참고: 오일 변위로 인해 클리어링 구역이 형성되는 경우, 생체 계면활성제의 존재에 대해 상등액을 양성으로 평가하십시오.
  3. 에멀젼 지수 분석 (E24 분석)
    1. 4 mL의 휘발유 (가솔린)와 무세포 상청액을 깨끗한 유리 시험관에 각각 넣으십시오.
    2. 혼합물을 3 분 동안 격렬하게 소용돌이 치게하고 다음 24 시간 동안 방해받지 않도록하십시오.
    3. 24시간 후, 전체 액체 컬럼(cm)의 높이에 대하여 유화층의 높이(cm)의 백분율로서E24 지수를 결정한다.
      Equation 1
      참고 : 24 시간 후에 에멀젼 (물 속의 오일 또는 오일의 물)이 관찰되면 상청액에 생체 계면 활성제가 포함될 가능성이 큽니다.
  4. 표면 장력 측정
    주: 표면 장력은 Du Noüy 고리 방법17을 사용하여 측정하였다. 이 실험에 사용 된 장비 ( 재료 표 참조)는 매우 민감하므로 유리 용기와 프로브를 올바르게 청소하십시오.
    1. 시스템을 켜고 관련 소프트웨어를 두 번 클릭하여 엽니 다.
    2. 표면 장력을 결정해야하는 액체로 유리 용기를 청소하십시오.
    3. 액체 (40 mL)를 용기에 넣고 용기 홀더에 용기를 장착하십시오.
    4. 프로브 홀더의 잠금을 해제하고 프로브를 장착합니다. 이제 수동 컨트롤러의 잠금 버튼을 눌러 프로브 홀더를 잠급니다.
    5. 수동 컨트롤러를 사용하여 프로브가 액체 표면에서 약 2-3mm 떨어져 있도록 플랫폼의 높이를 조정하십시오.
    6. 이제 소프트웨어를 사용하여 표면 장력을 측정하십시오. 화면의 왼쪽 상단 패널에있는 파일을 클릭하십시오. 작업 영역 열기를 클릭합니다. 팝업 창이 나타납니다.
    7. 아래로 스크롤하여 K100: 표면 및 계면 장력 아이콘을 두 번 클릭합니다.
    8. 이제 화면의 왼쪽 상단에있는 파일 아이콘을 클릭하십시오. 새 데이터베이스를 클릭하십시오. 데이터 저장 이름을 입력하고 확인을 클릭하십시오.
    9. 다시 SFT > 링> 새 측정 파일을 클릭>십시오. 측정 이름을 입력합니다. 구성 템플릿에 SFT 링이 표시되는지 확인합니다.
    10. 측정에 사용 중인 프로브와 용기를 선택하여 측정 구성 창에서 세부 정보를 입력합니다. 또한 액체 및 기체상의 세부 사항을 채 웁니다.
      참고 : 액상은 물이되고 기상은 공기입니다. 액상의 밀도는 세포 없는 상청액의 밀도이다. 이것은 액체의 50 mL의 무게를 취하고 밀도를 Kg /m3로 계산하여 결정할 수 있습니다.
    11. 이제 절차 탭을 클릭하고 다음 세부 정보를 입력하십시오 : 감지 속도 : 6mm / 분, 감지 감도 : 0.005g, 검색 속도 : 6mm / 분, 검색 감도 : 0.005g, 측정 속도 : 3mm / 분, 측정 감도 : 0.001g, 침수 깊이 : 3mm, 반사 거리 : 10 %, 수정 : Harkins & Jordan, 최대 값 : 5. 확인을 클릭하십시오.
    12. 팝업 창에서 데이터를 저장할 데이터베이스를 선택하고 확인을 클릭하십시오.
      참고: 여기에서 새 데이터베이스를 만들거나 기존 데이터에 새 측정값을 추가할 수 있습니다.
    13. 이제 화면 상단 중앙에있는 재생 버튼을 클릭하십시오. 시스템이 스크립트 실행을 시작합니다. 시스템이 안정화되면 표면을 감지합니다. 프로브를 액체에 담그고 프로브를 앞뒤로 움직여 형성된 라멜라의 장력을 감지하십시오.
    14. 결과를 얻으려면 화면 왼쪽 가운데에 있는 측정 아이콘을 클릭합니다. 데이터를 클릭하고 결정 된 표면 장력을 기록해 둡니다.
    15. 측정이 완료되면 플랫폼의 높이를 낮추고 장비에서 프로브와 선박을 잠금 해제하고 마운트 해제하십시오.
      참고 : 생체 계면 활성제 생산으로 인한 표면 장력의 감소를 확인하려면 접종되지 않은 LB를 대조군으로 사용해야합니다.

3. 생체 계면활성제 추출

  1. 세포 유리 상청액의 pH를 2 N HCl을 사용하여 2로 조정한다. 혼합물을 밤새 4°C에서 보관한다.
  2. 상등액에 동일한 부피의 클로로포름-메탄올 혼합물 (2:1)을 첨가하고 20 분 동안 격렬하게 혼합하십시오.
  3. 상 분리가 일어나도록 혼합물을 방해받지 않고 그대로 두십시오.
  4. 물과 메탄올을 함유하는 상부상을 제거하고, 생체계면활성제를 함유하는 하부 상을 남겨두고 흄 후드에서 증발시킨다.
  5. 유기 상을 증발시킨 후, 꿀 색깔의 조 생체 계면활성제를 3 mL의 클로로포름에 재용해시키고, 이 혼합물을 생체 계면활성제의 추가 동정 및 특성화를 위해 사용한다.

4. 유화 안정성 연구

  1. 다른 온도에서의 에멀젼 안정성
    1. 5 mL의 무세포 상청액을 다른 시험관에 취하십시오.
    2. 각 시험관에 휘발유 5mL를 넣고 3분 동안 볼텍싱하여 격렬하게 섞는다.
    3. 시험관을 상이한 온도 (30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 및 70°C)에서 상이한 수조에서 밤새 인큐베이션한다.
    4. 24 h 후에, 앞서 언급한 바와 같이 에멀젼 지수를 추정한다.
  2. 상이한 pH 값에서의 에멀젼 안정성
    1. 세포가 없는 상등액 5 mL를 깨끗한 시험관에 취하십시오.
    2. 무세포 상청액(2, 4, 6, 8, 및 10)의 pH를 1 N HCl 및 1 N NaOH를 사용하여 조정한다.
    3. 시험관에 같은 양의 휘발유를 넣고 3 분 동안 볼텍싱하여 격렬하게 섞으십시오.
    4. 시험관을 실온에서 24 시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
    5. 앞에서 언급 한 바와 같이 유제 지수를 추정하십시오.
  3. 상이한 염 농도에서의 에멀젼 안정성
    1. 세포가 없는 상등액 5 mL를 깨끗한 시험관에 취하십시오.
    2. 상청액에 다른 양의 소금 (NaCl)을 추가하십시오 (0 g / L, 5 g / L, 10 g / L, 20 g / L, 60 g / L 및 80 g / L).
    3. 염을 3분 동안 볼텍싱하여 세포 유리 상청액에 용해시킨다.
    4. 시험관에 같은 양의 휘발유를 넣고 3 분 동안 볼텍싱하여 격렬하게 섞으십시오.
    5. 시험관을 실온에서 24 시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
    6. 24 h 후에 에멀젼 지수를 추정하십시오.

5. 생체계면활성제의 성질 결정

  1. 추출된 생체계면활성제의 TLC
    1. 20 μL의 생체계면활성제를 TLC 플레이트 상에 스팟한다. 한 번에 2 μL를 스팟합니다.
    2. 세 개의 다른 TLC 플레이트에 생체 계면활성제를 스팟하십시오.
    3. 클로로포름:메탄올(2:1)을 함유하는 용리액의 100 mL 혼합물을 제조하고, 용리액을 TLC 챔버에 첨가한다. 챔버의 뚜껑을 닫고 20 분 동안 포화되도록하십시오.
    4. 플레이트를 건조시킨 후, TLC 플레이트를 클로로포름 메탄올 혼합물로 포화된 챔버 내부에 놓고 TLC를 실행한다.
    5. 용리액이 TLC 플레이트의 상단 (상단에서 1cm 떨어져 있음)에 도달 한 후 플레이트를 꺼내 공기 건조시킵니다.
  2. 지질 검출을 위한 염색
    1. 깨끗한 TLC 챔버를 가져 와서 신선한 챔버에 요오드 과립 (5-10)을 넣고 챔버를 5 ~ 10 분 동안 포화시킵니다.
    2. TLC 플레이트를 챔버 내부에 놓고 노란색 반점의 발달을 관찰하십시오. 반점이 나타나면, 지질 성분의 존재에 대해 생체계면활성제를 양성으로 점수화한다.
  3. 펩티드 또는 아미노산 검출을 위한 염색
    1. 0.4 g의 닌히드린을 부탄올 20 mL에 용해시켜 닌히드린 용액을 제조하였다. 0.6 mL의 100% 빙초산을 상기 혼합물에 첨가한다.
    2. TLC 플레이트를 닌히드린 용액으로 분무하고 2 분 동안 공기 건조시킵니다. 플레이트를 110°C에서 가열하고 색상의 발달을 관찰한다.
      참고: 파란색 반점이 나타나면 펩티드 사슬 또는 아미노산의 존재에 대해 생체 계면활성제를 양성으로 평가하십시오.
  4. 탄수화물 검출을 위한 염색
    1. H2SO4 1 mL를 함유하는 빙초산 48 mL에 p-anisaldehyde2mL를 첨가하여 p-anisaldehyde의 용액을제조하였다. 0.6 mL의 아세트산을 혼합물에 첨가한다.
    2. 혼합물을 TLC 플레이트에 골고루 뿌리고 2 분 동안 공기 건조시킵니다.
    3. 플레이트를 110°C에서 인큐베이션하고 반점의 발생을 모니터링한다.
      참고 : 녹색 또는 갈색 반점이 나타나면 탄수화물의 존재에 대해 생체 계면 활성제를 양성으로 평가하십시오.

6. 생체계면활성제의 화학적 식별

  1. 생체계면활성제의 LCMS
    1. 추출된 생체계면활성제 25 mg을 클로로포름 1 mL에 녹인다.
    2. C18 컬럼을 사용하여 LCMS(기준 스캔 주파수가 10초인 잠금 스프레이 구성에서)를 수행합니다.
    3. 클로로포름:메탄올(1:1)을 이동상으로 사용하고 시료 2μL를 0.1mL/min의 유속으로 컬럼에 주입합니다.
    4. 실험 파라미터를 극성: ES 포지티브, 모세관 전압: 3kV, 소스 온도: 80°C, 용해 온도: 300°C, 탈용매화 가스 유량: 7,000L/h, 트랩 가스 유량: 0.40mL/분으로 설정합니다.
    5. 20분의 검출 시간 동안 100 내지 1,200 Da 범위를 스캔하고 양성 ES 모드에서 이온을 조사한다.
    6. 질량 분광법을 정량적으로 소프트웨어를 사용하여 m/z 값을 분석합니다.
    7. 분석을 위해 소프트웨어에 로그인하십시오.
    8. 일괄 검색을 클릭하고 얻은 질량 목록을 입력하십시오. 양전하 모드에서 결과를 조사하고 M + H 및 M + Na를 부가물로 사용하십시오. 정확도를 10PPM으로 유지하고 디스플레이 구조를 체크합니다.
    9. 검색을 클릭하고 화합물 목록에서 PPM 수준이 가장 낮은 화합물을 선택하십시오.
  2. 1개 생체계면활성제의 H NMR
    참고: 생체계면활성제의 1HNMR은 400 MHz NMR 분광계를 사용하여 수행되었다( 표 참조).
    1. 5mg의 생체계면활성제를 1mL의 중수소화된 클로로포름(CdCl3)에 녹인다.
    2. 혼합물을 NMR 튜브로 옮깁니다. 튜브를 올바르게 캡하고 튜브를 스패너에 삽입하십시오. 조절기 튜브를 사용하여 튜브의 높이를 조정하십시오.
    3. 스패너와 함께 튜브를 NMR 기계에 놓고 아래 언급 된 단계에 따라 NMR 스펙트럼을 얻으십시오.
    4. 샘플 튜브 유형을 선택하려면: sx N, 여기서 N은 관련 소프트웨어에서 튜브가 배치된 위치(예: sx 13, 튜브가 13번째 위치에 배치된 경우)입니다.
    5. edc를 입력하고 Enter 키를 눌러 데이터를 저장할 수 있는 새 폴더를 만듭니다.
    6. 팝업이 나타납니다. 목록에서 CdCl 3 을 클릭하여 용매를 선택하고 샘플 이름을 입력합니다.
    7. 프로토콜을 시작하려면 "getprosol"을 입력하십시오. 용매를 잠그려면 "잠금 cdcl3"을 입력하십시오.
    8. "topshim"을 입력하여 샘플을 shim하고 마지막으로 "rga;zgefp"를 입력하여 데이터를 수집합니다. 그러면 프로토콜이 시작됩니다.
    9. 스펙트럼을 얻은 후 "apk;abs n"을 입력하고 Enter 키를 눌러 위상 및 기준선 보정을 수행합니다.
    10. 기본 피크를 선택하려면 "pp"를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 강렬한 피크만 선택하려면 "mi"를 입력하고 피크를 선택해야 하는 위의 강도를 입력합니다. 기본값은 0.2입니다.
    11. 피크를 통합하려면 통합을 클릭하고 통합 할 피크의 왼쪽에 커서를 놓고 커서를 누른 상태에서 커서를 클릭하고 커서를 피크 주위로 드래그하십시오.
    12. 왼쪽 상단의 파일을 클릭하여 데이터를 저장 한 다음 저장을 클릭하십시오.
    13. 샘플은 "sx ej"를 입력하여 기계에서 배출 할 수 있습니다.
    14. 피크를 분석하고 H 원자의 환경을 결정하십시오.
  3. 푸리에 변환 적외선 분광법 생체 계면활성제
    주: 추출된 생체계면활성제의 FT-IR은 ATR 모드에서 시판되는 분광광도계를 사용하여 수행하였다( 표 참조).
    1. 분광 광도계를 켜고 퍼지, 건조제 및 검출기를 확인하십시오.
    2. 스펙트럼을 수집하려면 먼저 샘플이 없는 배경 스펙트럼을 수집합니다.
    3. 추출 된 생체 계면 활성제를 가져 와서 완전히 건조시킵니다. 건조된 생체계면활성제를 다이아몬드 결정 위에 직접 놓고 압력을 가하고 ATR 터치포인트를 누릅니다.
    4. 소프트웨어에서 스캔 횟수 (30 입력)를 선택하고 400cm-1에서 4,000cm-1까지 스펙트럼을 스캔하십시오.
    5. 확인을 클릭하여 샘플 스펙트럼을 스펙트럼 창에 추가합니다.
    6. 파일 > 다른 이름으로 저장> 저장하고 파일 이름 뒤에 확장자 .spa를 입력하고 확인을 클릭하십시오.

7. 생체 계면 활성제 적용 (향상된 오일 회수)

참고: 이 실험에서는 이중 증류수를 음성 대조군으로 사용하였고 양성 대조군으로 10% SDS, 10% 트윈 80 및 10% 상업용 사포닌을 사용하였다.

  1. 유리를 가져 와서 유리 양모와 유리 구슬로 바닥 콘센트를 밀봉하십시오.
  2. 토양의 꼭대기에 약간의 액체가 첨가 될 수 있고 흐르는 흐름이 바닥에 수집 될 수 있도록 모래 토양으로 기둥을 포장하십시오. 홀더에 기둥을 장착하고 토양 위에 유리 구슬을 추가하십시오.
  3. 컬럼을 50 mL의 염수 용액으로 플러딩하고 유동을 수집하여 공극 부피를 결정한다.
    기공 부피 = 상부에 첨가된 염수의 부피 - 수집된 유동관의 부피.
  4. 컬럼 상단에서 첨가 한 후 원유가 통과하도록 강제하여 컬럼에서 염수를 제거하십시오. 열에서 나오는 염수와 오일의 부피를 수집하여 초기 오일 포화 부피를 결정하십시오. 컬럼에서 방출되는 염수의 부피는 초기 오일 포화 부피 또는 제자리에 있는 원래 오일이 될 것이다.
  5. 컬럼을 24 시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
  6. 24 시간 후, 10 공극 부피의 염수로 컬럼을 플러드하고 컬럼에서 나오는 오일을 수집하여 이차 오일 회수를 추정하십시오. 이차 오일 회수 후 컬럼에 남아있는 오일은 잔류 오일에 해당한다.
  7. 추출된 생체계면활성제(단계 3.5 이후 추출)를 유리 비이커에 동량의 첨가하여 생체계면활성제의 혼합물을 제조하였다. 생체 계면 활성제를 컬럼 상단에 첨가하고 컬럼을 24 시간 동안 인큐베이션하십시오.
  8. 24시간 후, 오일과 물의 양을 측정하여 추가 또는 향상된 오일 회수율을 결정하십시오. 컬럼으로부터 방출된 오일의 부피는 회수된 잔류 오일에 상응할 것이다.
  9. 다음 방정식을 사용하여 향상된 오일 회수율을 추정합니다.
    Equation 2

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Representative Results

세 개의 박테리아 균주(로도코커스 sp. IITD102, 리시니바실러스 sp. IITD104, 및 파이니바실러스 sp. IITD108)를 낙하 붕괴 분석, 오일 변위 분석, 에멀젼 지수 분석, 및 표면 장력 감소를 포함하는 다양한 검정에 의해 생체계면활성제의 생산을 스크리닝하였다. 세 가지 박테리아 균주 모두의 무세포 상청액 및 화학적 계면활성제의 용액은 방울 붕괴를 초래하였고, 따라서, 생체계면활성제의 존재에 대해 양성으로 점수화되었다(도 4a). 반면에, 물방울은 붕괴되지 않았고, 따라서 생체계면활성제의 존재에 대해 음성으로 점수가 매겨졌다. 세 박테리아 배양물의 상업적 계면활성제 및 무세포 상청액은 또한 오일 확산 분석에서 오일층을 변위시키는데 성공적이었고, 따라서, 생체계면활성제의 존재에 대해 양성으로 점수화되었다(도 4b). 반면에 물은 기름을 대체 할 수 없었기 때문에 부정적인 점수를 받았습니다. 에멀젼 지수 분석에서, 안정한 에멀젼이 상업적인 계면활성제 및 세 미생물 균주의 상청액을 함유하는 시험관에서 관찰되었다. 그러나, 접종되지 않은 배지를 함유하는 시험관에서는 어떠한 에멀젼도 관찰되지 않았다(도 4c). 이것은 Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 및 Paenibacillus sp. IITD108이 생체 계면활성제를 생산한다는 것을 다시 시사했다. 생체계면활성제 생산의 확인은 무세포 배양액의 표면 장력을 측정하고 이를 접종되지 않은 대조군과 비교함으로써 얻어졌다. Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 및 Paenibacillus sp. IITD108의 생체계면활성제는 배지의 표면 장력을 각각 58.89 mN/m에서 45.41 mN/m, 45.82 mN/m 및 28.43 mN/m으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 5).

IFT 측정은 링 풀 방법을 사용하여 수행하였다. 세 균주 모두로부터의 생체계면활성제는 다양한 수성 및 유기 상 사이의 계면 장력을 상당히 감소시킬 수 있었다(표 S1). 표면 장력 및 계면 장력 측정은 세 균주 모두가 생체 계면활성제를 생성한다는 것을 확인시켜준다.

Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 및 Paenibacillus sp. IITD108의 무세포 배양물로부터 생체 계면활성제의 용매 추출은 각각 820 mg/L, 560 mg/L 및 480 mg/L의 생체계면활성제 농도를 가져왔다.

도 4C에서 관찰된 바와 같이, 생체계면활성제에 의해 형성된 에멀젼은 오일 마이크로에멀젼 중의 물이었다. 에멀젼 안정성 분석은 생체계면활성제가 다양한 환경 조건 하에서 양호한 안정성을 나타냈다(도 6). 생성된 에멀젼은 시험된 다양한 온도(도 6a), pH 값(도 6b) 및 염 농도(도 6c)에 걸쳐 매우 안정하였다.

생체계면활성제의 성질을 확인하기 위해 박층 크로마토그래피를 수행하였다. 플레이트를 요오드 증기로 염색하는 것은 모든 생체계면활성제 및 대조군에서 황색 반점의 발달을 가져왔다( 바실러스 sp. IITD 106으로부터의 생체계면활성제(도 7a). 이는 생체계면활성제가 지질 모이어티를 함유함을 나타내었다. 닌히드린으로 염색시 임의의 TLC 플레이트에서 청색 착색된 스폿이 얻어지지 않았다(도 7b). 이는 생체계면활성제가 어떠한 펩티드 모이어티도 함유하지 않았다는 것을 보여주었다. 청색 및 녹색 스폿은 모든 TLC 플레이트에서 관찰되었고, 아니스알데히드 염색으로 염색되었을 때 (도 7c). 이는 생체계면활성제가 탄수화물 모이어티를 함유함을 보여주었다. TLC의 결과로부터, 모든 생체계면활성제가 당지질인 것으로 결론지었다.

LCMS를 이용한 생체계면활성제의 화학적 동정은 로도코커스 sp. IITD102 및 리시니바실러스 sp. IITD104가 동일한 유형의 생체계면활성제를 생성한다는 것을 밝혀냈으며, 즉 480.25 Da의 질량을 갖는 디람노피라노시스 히드록시데칸산으로 확인되었다. 생체계면활성제의 구조는 1HNMR 및 FT-IR 데이터에 의해 지지되었다(도 8).

1HNMR 스펙트럼에서, 7.2에서 수득된 화학적 이동은 카르본기의 양성자를 나타내었다. 메틸기의 양성자에 상응하는 화학적 이동은 1-2 ppm 범위에서 얻어졌다. 알킬기에 부착된 양성자에 상응하는 시프트는 2.3 ppm에서 수득되었다. 로도코커스 sp. IITD102 및 리시니바실러스 sp. IITD104로부터 추출된 생체계면활성제의 FT-IR 스펙트럼은 파수 3,290 cm-1에서 강한 피크의 존재를 나타냈으며, 이는 OH 작용기의 존재를 확인시켜준다. 파동 수 2,951 cm-1에서의 작은 피크는 CH 스트레칭에 대응한다. 1,620 cm-1에서의 강한 피크는 생체계면활성제 내의 카르복실기의 존재를 나타낸다. 1,530, 1,410, 1,200 및 1,060에서 수득된 다른 피크들은 각각 알킬, CH3, C-O-C 및 C-CH3 작용기의 존재를 확인하였다. NMR 및 FT-IR 데이터 둘 다 LCMS 연구로부터 결정된 생체계면활성제의 구조를 지지하였다. Paenibacillus sp. IITD108 (도 9)로부터의 조질 생체계면활성제의 LCMS는 생체계면활성제의 벌크 소수성 코어를 형성하는 세 개의 지질 사슬을 함유하는 람노리피드를 생성한다는 것을 보여주었다. 생체계면활성제는 802 Da의 질량을 갖는 2데카노일)-αL 람노피라노실-3-히드록시데칸산으로 확인되었다. LCMS의 결과는 1HNMR 및 FT-IR 데이터에 의해 뒷받침되었다.

향상된 오일 회수를 위한 설정은 그림 2에 나와 있습니다.

Figure 2
그림 2: 샌드 팩 컬럼 기술을 사용한 향상된 오일 회수를 위한 실험 설정. 토양으로 포장 된 기둥을 홀더에 장착했습니다. 바닥 출구를 유리 양모 및 유리 비드로 밀봉하였다. 이차 회수 후, 컬럼 내부의 잔류 오일은 그것에 생체계면활성제 혼합물을 첨가함으로써 향상된 오일 회수를 행하였다. 컬럼의 바닥에 놓인 튜브를 용출된 분획을 수집하는데 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시뮬레이션된 강화된 오일 회수 실험에서, 컬럼의 상부에 첨가된 염수 50 mL 중에서, 12 mL를 유동관에서 수집하였고, 따라서, 공극 부피는 38 mL로 추정되었다. 오일이 컬럼을 통과하도록 강제되었을 때, 33 mL의 염수가 컬럼으로부터 방출되었다. 이것은 초기 오일 포화 부피를 나타냅니다. 10 공극 부피의 염수를 사용한 이차 회수는 10 mL의 오일을 용출시키는 결과를 가져왔다. 컬럼에 남아있는 잔류 오일은 23 mL였다. 생체계면활성제의 혼합물을 함유하는 물은 컬럼으로부터 13 mL의 오일을 회수할 수 있었다(도 3).

Figure 3
그림 3: 샌드 팩 컬럼을 사용하여 향상된 오일 회수를 시뮬레이션했습니다. 대조군 및 시험 컬럼 둘 다의 초기 오일 포화 부피는 약 33 mL였다. 이차 오일 회수 동안, 약 10 mL의 오일이 대조군 및 시험 컬럼 둘 다로부터 회수되었다. 시험 및 대조군 컬럼의 회수 프로파일의 차이는 컬럼에 남아있는 잔류 오일의 회수 동안에만 관찰되었다. 바이오계면활성제 혼합물은 이 단계에서 대조군 컬럼에서 단지 1.03 mL의 오일만을 회수하는 동안 시험 컬럼으로부터 남겨진 잔류 오일 13 mL의 추가 회수를 초래하였다. 이는 생체계면활성제 혼합물이 저장소로부터 잔류 오일의 회수를 증진시키는데 큰 잠재력을 갖는다는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이것은 향상된 오일 회수를 나타냈다. 따라서, 생체계면활성제의 혼합물을 함유하는 물은 컬럼으로부터 잔류 오일의 56.52%를 회수할 수 있었다(표 1). 한편, 10% SDS, 10% 트윈 80, 및 10% 사포닌의 용액은 컬럼으로부터 85%, 68% 및 73%의 잔류 오일을 회수할 수 있었다.

매개 변수 제어 범람 복합 생체 계면활성제 범람 10 % SDS 10 % 트윈 10 % 사포닌
태양광 발전 (mL) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (mL) 33 33 33 29 33
포스 (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
소르 (mL) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (mL) 23.23 23 21.5 18.8 23
로스 (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
로르(mL) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
아오르(%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

여기서 PV = 염수로 초기 컬럼 포화 후 결정된 공극 부피, OOIP = 원래 오일, IOSV = 초기 오일 포화 부피, POS = 오일 포화 백분율, Sv = 이차 회수를 위해 첨가된 염수의 부피, SOR = 염수 범람 후 회수된 이차 오일, ROC = 이차 회수 후 컬럼 내의 잔여 오일, ROS = 잔류 오일 포화, ROR = 생체계면활성제 플러딩 후 회수된 잔여 오일, AOR = 추가 오일 회수

표 1: 모래 팩 컬럼에서 향상된 오일 회수율을 시뮬레이션했습니다.

Figure 4
그림 4: 생체계면활성제 생산을 위한 스크리닝 분석 (a) 방울 붕괴 분석: 오일 코팅 표면에 첨가된 후 물 방울이 붕괴되지 않았고, 세 박테리아 균주의 화학적 계면활성제 및 무세포 상청액은 방울 붕괴를 초래하였다. (b) 오일 변위 분석: 세 박테리아 균주의 화학적 계면활성제 및 무세포 상청액이 오일층을 변위시키는 동안 물의 방울은 오일의 변위를 초래하지 않았다 (c) 에멀젼 지수 분석: 무세포 상청액 및 상업용 계면활성제 용액은 모두 안정한 에멀젼 지수의 형성을 가져왔다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 생체계면활성제 생산으로 인한 표면 장력 감소. 미생물 성장에 의한 배지의 표면 장력의 감소의 결정은 미생물 부재에 의한 생체계면활성제 생산을 확인하였다. Rhodococcus sp. IITD 102 및 Lysinibacillus sp. IITD 104의 성장으로 인해 배지의 표면 장력이 59mN/m에서 45mN/m으로 감소했습니다. Paenibacillus sp. IITD 108의 성장으로 인해 배지의 표면 장력이 59mN/m에서 28mN/m 으로 감소했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 다양한 (a) 온도, (b) pH 값 및 (c) 염 농도에서의 에멀젼 안정성. 세 가지 미생물 균주의 상청액과 상업적 계면활성제의 혼합물을 사용하여 생성된 모든 에멀젼은 상이한 환경 조건 하에서 큰 안정성을 나타낸다. 시험된 온도, pH 및 염 농도의 범위 내에서, 결정된 에멀젼 지수는 유사하였고, 생물학적 계면활성제가 극한의 환경 조건 하에서 사용될 수 있음을 암시하는 다양한 인자들 중 더 높은 값에서 EI의 주요 감소가 관찰되지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 생체계면활성제의 TLC 특성화 (a) 요오드 증기로 염색된 플레이트: TLC 플레이트 상에 개발된 다양한 스팟은 추출된 생체계면활성제가 지질 그룹을 함유하는 다양한 화합물의 혼합물임을 보여준다. 파란색 화살표로 표시된 반점은 지질 모이어티의 존재에 대해 양성으로 염색된 생체계면활성제를 나타낸다. 다른 스팟은 조 생체계면활성제의 혼합물에 존재하는 나머지 화합물을 나타낸다. (b) 닌히드린으로 염색된 플레이트: 플레이트를 닌히드린으로 염색할 때 보라색 반점이 나타나지 않았다. 이것은 생체 계면 활성제 혼합물 및 (c) 아니스알데히드로 염색 된 플레이트 내에 아미노산의 부재를 나타냈다 : TLC 플레이트 상에 연한 녹색 및 황색 반점이 나타났고 이들은 당을 함유하는 화합물을 나타낸다. 검은 화살표로 표시된 반점은 탄수화물 모이어티의 존재에 대해 양성으로 염색된 생체계면활성제를 나타낸다. 요오드 및 아니살알데히드로 염색된 반점은 지질 및 탄수화물 모이어티를 모두 함유하는 화합물을 나타내며 아마도 당지질 생체계면활성제일 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
도 8: 로도코커스 sp. IITD 102 및 리시니바실러스 sp. IITD 104로부터 추출된 생체계면활성제의 화학적 특성화. (a)는 로도코커스 sp. IITD 102 및 리시니바실러스 sp. IITD 104로부터 추출된 생체계면활성제의 FT-IR 스펙트럼을 나타내고, (b)는 로도코커스 sp. IITD 102 및 리시니바실러스 sp. IITD 104로부터 추출된 생체계면활성제의 H1 NMR 스펙트럼을 나타내고, (c)는 로도코커스 sp. IITD 102 및 리시니바실러스 sp. IITD 104로부터 추출된 조질 바이오계면활성제의 구조를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
도 9: Paenibacillus sp. IITD 108로부터 추출된 생체계면활성제의 화학적 특성화. (a)는 Paenibacillus sp. IITD 108로부터 추출된 생체계면활성제의 FT-IR 스펙트럼을 나타내고, (b)는 Paenibacillus sp. IITD 108로부터 추출된 생체계면활성제의 1H NMR 스펙트럼을 나타내고, (c)는 Paenibacillus sp. IITD 108로부터 추출된 조질 생체계면활성제의 구조를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 S1 : 다양한 유형의 생체 계면 활성제의 구조. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 S1: 물과 탄화수소 사이의 계면 장력(IFT)에 대한 생체계면활성제의 효과. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

생체 계면활성제는 화학적 계면활성제에 대한 매력적인 대안이되고있는 생물학적 활성 성분의 가장 다재다능한 그룹 중 하나입니다. 그들은 세제, 페인트, 화장품, 식품, 제약, 농업, 석유 및 수처리와 같은 수많은 산업에서 더 나은 젖음성, 낮은 CMC, 다양한 구조 및 환경 친화성으로 인해 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다18. 이로 인해 생체 계면 활성제 생산이 가능한 더 많은 미생물 균주를 발견하는 데 대한 관심이 높아졌습니다. 여기에서, 우리는 향상된 오일 회수를 위해 로도코커스 sp. IITD 102, 리시니바실러스 sp. IITD 104, 및 Paenibacillus sp. IITD 108에 의해 생산된 생체계면활성제의 혼합물을 스크리닝, 동정 및 적용하는 방법을 예시한다. 생체계면활성제 생산은 방울 붕괴, 오일 확산, 유화 지수 분석법으로 선별하고 미생물 성장에 의한 배지의 표면 장력 감소를 측정하여 확인하였다. 로도코커스로부터의 당지질 생체계면활성제(rhamnolipids 및 trehalolipids)의 생산에 관한 다양한 보고는 문헌 19,20,21,22,23,24에서 입수가능하다. Najafi et al.은 Paenibacillus sp. alvei ARN6325로부터 리포펩티드 생체계면활성제의 생산 및 최적화를 보고하였다. Bezza et al.은 Paenibacillus dendritiformis CN526에 의해 생산된 리포펩타이드 생체계면활성제에 의한 피렌의 생분해를 보고하였다. 생체계면활성제 생산(리포펩티드 및 당지질)은 또한 Paenibacillus27,28,29,30,31의 다른 균주들에 의해 보고되었다. 리시니바실러스의 다양한 종들이 생체계면활성제32,33,34를 생산하는 것으로 보고되었다. 리시니바실러스 스파에리쿠스는 소수성 살충제35의 가용화할 수 있는 람노리질을 생산하는 것으로 보고되었다.

생체 계면 활성제가 화학 물질에 비해 제공하는 장점 중 하나는 극한의 환경 조건에서의 안정성입니다. Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104, 및 Paenibacillus sp. IITD 108에 의해 생성된 생체계면활성제는 온도, pH 및 염 농도의 상이한 범위 하에서 그들의 안정성에 대해 검정되었고, 이들 파라미터의 극단적인 값 하에서 안정한 것으로 밝혀졌다. 이전에, Habib et al.은 로도코커스 sp.의 탄화수소 분해에 의해 생성된 리포펩티드가 온도, pH 값 및 염 농도36의 상이한 범위에 걸쳐 안정성을 나타냈다고 보고하였다. 무기 염의 농도 증가는 에멀젼37의 안정성을 증가시키는 것으로 보고되었다. 콜로이드가 응집되거나 분리되는 경향은 입자 상호작용(38) 동안 관여되는 매력(Van der Walls 힘) 및 반발력(정전기력)의 함수이다. 물에 용해 된 소금 결정은 자체 전기 전하를 설정하고 방출 된 이온은 에멀젼 방울에 흡착됩니다. 염 농도를 증가시키면, 두 번째 층의 팽창과 반발이 감소한다. 또한, 이온의 전하 밀도가 높을수록, 전기층의 길이는 더 짧아진다. 따라서,Na2+와 같은 2가 양이온은 1가 양이온39와 비교하여 보다 안정한 에멀젼의 형성을 초래한다.

생체 계면 활성제가 화학적 계면 활성제에 비해 갖는 또 다른 이점은 생분해성40이라는 것입니다. Zeng et al. 합성 계면활성제 Triton X 100, 선형 알킬벤젠 설포네이트 (LAS) 및 람노리피드의 분해 능력을 비교한 결과, 람놀리피드 생체계면활성제는 완전히 분해된 반면, LAS 및 Triton X 100은 부분적으로만 분해되었다41. Liu et al.은 또한 합성 계면활성제 CTAB, Triton X 100 및 SDS와는 달리, 람노리피드는 독성을 나타내지 않으며 B. subtilis 및 다른 퇴비 미생물(42)에 의해 쉽게 분해 될 수 있다고보고했다.

세 가지 미생물 균주 모두에 의해 생산된 생체계면활성제는 당지질인 것으로 밝혀졌다. 로도코커스는 이전에 다양한 연구 그룹 20,21,23에 의해 당지질을 생산하는 것으로 보고되었다. 리시니바실러스 및 파이니바실러스에 의한 당지질 생체계면활성제 생산에 대한 유사한 보고가 또한 문헌31,32,35,43,44에서 입수가능하다. 생체 계면 활성제의 화학적 확인은 이들이 rhamnolipids로 밝혀졌습니다. 람놀리피드는 지질 사슬(45)에 연결된 하나 또는 두 개의 람노스 단위를 포함하는 당지질 생체계면활성제의 부류이다. 그들은 가장 많이 연구 된 유형의 생체 계면 활성제입니다. 다양한 미생물 균주가 람놀리피드 7,46,47,48,49를 생산하는 것으로 보고되었다. 람놀리피드는 잔류 오일 50,51,52,53의 회수를 증진시킬 가능성이 높은 것으로 보고되었다. 우리의 연구에서, 우리는 Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 및 Paenibacillus sp. IITD 108에 의해 생성 된 생체 계면 활성제의 혼합물이 시뮬레이션 된 모래 팩 컬럼 테스트에서 잔류 오일의 약 56.52 %를 성공적으로 회수한다는 것을 발견했습니다. 이것은 생체 계면활성제의 혼합물이 지상 저장소로부터 잔류 오일의 회수를 위해 사용될 수 있음을 보여주었다. 유사한 샌드 팩 시험에서, Sun 등은 생체 계면활성제가 잔류 오일54의 50 %를 회수하는 데 성공했다고보고했다. 바실러스 서브틸리스의 무세포 국물을 함유하는 생체계면활성제는 또한 잔류 오일55의 33%를 회수하는데 효과적인 것으로 보고되었다. 27% 및 26%-36%의 잔류 오일 회수율은 Darvishi et al. 및 Wahabi et al.56,57에 의해서도 보고되었다.

저수지에서 잔류 오일을 회수하기위한 생체 계면 활성제의 경제적 평가는 EOR에서 생체 계면 활성제의 활용이 경제적으로 실행 가능한 옵션임을 보여줍니다. Moutinho et al.은 상업용 생체 계면 활성제 (rhamnolipids)의 전형적인 비용이 kg 당 약 59.6 USD라고 보고했다58. 또 다른 연구에서, 28 mg/L의 생체 계면활성제 농도가 잔류 오일 회수를 강화하고 52.5m3 의 추가 오일59의 생산을 유도하였다는 것이 또한 보고되었다. 이 연구는 10 mg / L의 생체 계면 활성제 농도가 오일 회수를 동원하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 보고된 데이터에 따르면, 52.5m3의 추가 오일을 생산하는 데 필요한 생체계면활성제 의 양은 약 0.525kg이다. 52.5m3 오일의 전체 생산 비용은 약 US $ 21463이며, 그 중 US $ 30 만이 바이오 계면 활성제의 생산 비용입니다. 데이터는 배럴 당 오일 생산에서 바이오 계면 활성제의 백분율 비용이 0.0000139 %에 불과하다는 것을 보여줍니다.

우리의 결과는 생체 계면 활성제의 조합이 저장소에서 잔류 오일을 회수하는 데 효율적으로 사용될 수 있음을 시사합니다. 우리의 지식에 따르면, 이것은 다른 미생물 균주에 의해 생성 된 생체 계면 활성제의 혼합물을 사용하여 저장소에서 잔류 오일의 회수를 향상시키는 첫 번째 보고서입니다. 우리의 연구가 향상된 오일 회수에서 생체 계면 활성제의 스크리닝, 구조적 특성화 및 적용과 관련된 방법을 명확하게 설명하지만이 연구는 다양한 응용 분야에서 효율성에 영향을 미치는 생체 계면 활성제의 상세한 기능적 특성화를 제공하지 않습니다. 미셀을 형성하는데 있어서 임의의 계면활성제의 효율의 척도이고 그것의 의미있는 사용을 위한 계면활성제의 제한 농도를 특정하는 임계 미셀 농도는 본 연구(60)에서 결정되지 않았다. 유사하게, EOR에 대한 저장소 조건에서의 그의 적용성을 결정하는 생체계면활성제의 열적 안정성은 또한도 61에 기술되지 않았다. 일부 적용에서 생체계면활성제는 또한 항생제로서 사용된다. 그들의 표면 습윤성은 항생제 성질을 결정하는 데 중요한 역할을합니다. 표면 습윤성 연구는 또한 본 작업(62)에서 수행되지 않았다. 이들의 생분해성 및 항균성 성질을 포함하는 생체계면활성제의 다양한 적용에 중요한 다른 기능적 특성들 또한 본 연구(63,64)에서 결정되지 않았다. 따라서, 우리는 생체 계면활성제의 구조적 특성화에 초점을 맞추었다. 표적 적용에 따라, 안정성, 생분해성 및 항균 활성과 같은 기능적 특성화가 수행될 수 있다.

낙하 붕괴 분석 및 오일 확산 분석에서, 시인성을 증가시키기 위해, 약간의 색깔을 갖는 오일을 사용하는 것이 좋다. 오일 확산 분석에서 에멀젼은 24 시간 후에 관찰되어야합니다. 가벼운 거품이 형성되면 24 시간 안에 분해됩니다. 텐시오미터는 매우 민감한 계측기이므로 표면 장력 측정 중에 마지막 측정의 이월로 인한 오류를 피하기 위해 모든 측정 전에 용기와 프로브를 올바르게 청소해야 합니다. 생체계면활성제의 추출은 클로로포름 메탄올 혼합물을 무세포 상청액에 첨가하는 것을 포함한다. 단계는 흄 후드에서 수행되거나 플라스크는 추출 혼합물을 옮긴 직후에 알루미늄 호일로 덮어야합니다. EOR 실험에서 이차 회수하는 동안, 염수 용액은 컬럼에서 더 이상 오일이 나오지 않을 때까지 과량으로 첨가되어야 합니다.

이 방법은 컬럼에서 잔류 오일을 회수하는 데 생체 계면 활성제의 혼합물의 범위를 논의합니다. 이 과정은 많은 요인에 따라 달라집니다. 초기 배양이 수확되는 미생물의 성장 단계. 일부 생체계면활성제는 로그페이즈에서 생산되는 것으로 보고된 반면, 다른 바이오계면활성제는 고정상에서 생산되는 것으로 보고되었다. 배양물은 생체계면활성제 생산이 최대치에 도달한 특정 단계에서 그에 따라 수확되어야 한다. 생체계면활성제 스크리닝 분석은 덜 민감하므로, 모든 분석은 특정 균주의 생체계면활성제 생산능에 대한 결론에 도달하기 전에 수행되어야 한다. 생체 계면활성제의 정제는 바이오 계면활성제의 농도가 조질 바이오 계면활성제에서 낮은 경우 생체 계면 활성제의 화학적 특성화 전에 수행되어야합니다. 강화 된 오일 회수 실험은 컬럼을 포장하는 데 사용되는 토양의 유형에 크게 의존합니다. 토양은 완전히 건조해야하며 더 큰 과립 및 기타 고체 오염 물질을 제거하기 위해 체질해야합니다. 모래 토양과 건조한 정원 토양 (동등한 비율로)의 혼합물은 기둥을 포장하는 데 선호되어야합니다. 컬럼 배출구는 실험 과정에서 컬럼에서 토양이 누출되지 않도록 유리 양모와 유리 비드로 적절하게 밀봉되어야합니다.

기술된 방법은 모의 샌드 팩 컬럼 실험에서 추가적인 오일의 회수에서 생성된 생체계면활성제 및 이들의 혼합물의 중요성을 결정하는데 유용하다. 상이한 생체계면활성제는 상이한 작용기(65)를 함유하기 때문에 상이한 특이성을 갖는다. 생체 계면 활성제의 조합은 다양한 탄화수소의 가용화를 가능하게하고 따라서 저장소로부터의 잔류 오일 회수를 증가시킬 것입니다. 설명된 방법은 유정으로부터의 향상된 오일 회수와 같은 현장 적용에서 생체계면활성제 혼합물의 잠재력을 결정하는 데 도움이 될 것이다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자들은 재정 지원에 대한 인도 정부의 생명 공학부에 감사하고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

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환경과학 제184호
생체 계면활성제의 조합을 사용한 향상된 오일 회수
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Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

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