Summary
Tre-fotonmikroskopi muliggør fluorescensbilleddannelse med høj kontrast dybt inde i levende biologisk væv, såsom muse- og zebrafiskhjerner, med høj spatiotemporal opløsning.
Abstract
Multifotonmikroskopiteknikker, såsom to-fotonmikroskopi (2PM) og tre-fotonmikroskopi (3PM), er kraftfulde værktøjer til dybvæv in vivo-billeddannelse med subcellulær opløsning. 3PM har to store fordele ved dybvævsbilleddannelse over kl. 14.00, der har været meget udbredt i biologiske laboratorier: (i) længere dæmpningslængde i spredningsvæv ved at anvende ~ 1.300 nm eller ~ 1.700 nm excitationslaser; ii) mindre baggrundsfluorescensgenerering på grund af højere ordens ikke-lineær excitation. Som et resultat tillader 3PM strukturel og funktionel billeddannelse med høj kontrast dybt inde i spredningsvæv såsom intakt musehjerne fra de kortikale lag til hippocampus og hele forhjernen af voksne zebrafisk.
I dag er laserkilder, der er egnede til kl. 15.00, kommercielt tilgængelige, hvilket muliggør konvertering af et eksisterende to-foton (2P) billeddannelsessystem til et tre-foton (3P) system. Derudover er flere kommercielle 3P-mikroskoper tilgængelige, hvilket gør denne teknik let tilgængelig for biologiske forskningslaboratorier. Dette papir viser optimeringen af en typisk 3PM-opsætning, især rettet mod biologiske grupper, der allerede har en 2P-opsætning, og demonstrerer intravital 3D-billeddannelse i intakte muse- og voksne zebrafiskhjerner. Denne protokol dækker den fulde eksperimentelle procedure for 3P-billeddannelse, herunder mikroskopjustering, prechirping af ~ 1.300 og ~ 1.700 nm laserimpulser, dyrepræparation og intravital 3P fluorescensbilleddannelse dybt i voksne zebrafisk og musehjerner.
Introduction
Inden for life science har multifotonmikroskopi (MPM) teknikker, såsom 2PM og 3PM, været kraftfulde værktøjer til dyb in vivo-billeddannelse med høj spatiotemporal opløsning og høj kontrast i spredningsvæv. Derudover forårsager disse metoder mindre fotoblevask sammenlignet med en-foton konfokal mikroskopi 1,2,3,4. 3PM er fordelagtigt til billeddannelse af dybere væv sammenlignet med 2PM på grund af to hovedfunktioner: (i) anvendelse af længere bølgelængdeexcitation (~ 1.300 nm eller ~ 1.700 nm) reducerer vævsspredning, og (ii) excitationsprocessen af højere orden (dvs. fluorescenssignal afhænger af terningen af excitationseffekten i 3PM i stedet for kvadratet af excitationseffekten i 2PM), der undertrykker den uønskede baggrundsfluorescens3 . Derfor muliggør 3PM billeddannelse med høj kontrast i dybere områder i levende væv som hippocampus i en intakt voksen musehjerne 3,5,6,7,8,9,10,11 og hele forhjernen af voksne zebrafisk12, herunder Ca2+ aktivitetsregistrering og flerfarvede observationer. Desuden er der opnået billeder med høj kontrast med kl. 15.00 gennem de intakte kranier af mus og voksne zebrafisk12,13.
I dag er excitationslaserkilder, der er egnede til 3P-excitation (3PE) ved ~ 1.300 og ~ 1.700 nm, kommercielt tilgængelige. Da laserscanningssystemet i det væsentlige er det samme for 2PM og 3PM, er det muligt at konvertere en eksisterende 2P-opsætning til en 3P-opsætning i biologiske laboratorier med installation af en kommercielt tilgængelig laser til 3PE. 3P-fluorescenssignalet afhænger af objektivlinsens lasereffekt, pulsvarighed, lasergentagelseshastighed og numeriske blænde (NA). Hvis man antager et diffraktionsbegrænset fokus (dvs. at objektivlinsens rygblænde er overfyldt af excitationsstrålen), beskriver Eq (1) den tidsgennemsnitlige fluorescensfotonflux fra brændvidden som følge af 3PE.
(1)
Hvor f er lasergentagelseshastigheden, τ er laserpulsens varighed (fuld bredde ved halvt maksimum), φ er systemopsamlingseffektiviteten, η er fluorescenskvanteeffektiviteten, σ3 er 3P-absorptionstværsnittet, C er fluoroforkoncentrationen, n0 er det reflekterende indeks for prøvemediet (f.eks. Vand), λ er excitationsbølgelængden i vakuum, NA er objektivobjektivets numeriske blænde, en3 er brændviddens rumlige integrationskonstant, 
er den tidsgennemsnitlige excitationsfotonflux (fotoner/s) under objektivlinsen, z er billeddybden, og EAL er den effektive dæmpningslængde14. Her har vi antaget, at EAL (typisk > 100 μm) er meget større end mikroskopets aksiale opløsning (typisk < 10 μm). Under paraxial tilnærmelse er en3 lig med 28, 114. gp(3) er excitationskildens tidsmæssige kohærens i 3. orden, og gp(3) er henholdsvis 0,41 og 0,51 for hyperbolsk-sekant-kvadrerede impulser og gaussiske impulser. Indsamlingseffektiviteten φ kan estimeres ved at overveje objektivlinsens fluorescensopsamling, objektivlinsens transmission, det dikroiske spejls reflektivitet, filtrenes transmission og detektorens detektionseffektivitet (f.eks. Fotomultiplikatorrør eller PMT). Da 3P-fluorescensintensiteten er meget afhængig af forskellige parametre, kræves optimering af 3P-opsætningen for at maksimere 3P-fluorescenssignalerne.
Denne protokol illustrerer optimeringsprocessen for en typisk 3P-opsætning, hvilket vil være nyttigt især for biologiske laboratorier, der har en 2P-opsætning og planlægger at udvide sin kapacitet til 3P-billeddannelse eller for at opretholde deres kommercielle 3P-opsætning med optimal ydeevne. Denne videoartikel demonstrerer også dybvævs 3P-billeddannelse i levende dyrehjerner. Det første afsnit omhandler optimeringen af en typisk 3P-opsætning med en kommercielt tilgængelig laserkilde og multifotonmikroskop. Andet og tredje afsnit beskriver henholdsvis zebrafisk og museforberedelse til kl. 15.00 af neuronale strukturer og aktiviteter. Musens kraniotomi kirurgi er tidligere blevet rapporteret i protokolpapirer samt 15,16,17. Det fjerde afsnit demonstrerer intravital 3P-billeddannelse i zebrafisk og musehjerner.
Protocol
Alle dyreforsøg og opstaldningsprocedurer for zebrafisk og mus blev godkendt og udført i overensstemmelse med Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vejledning. Zebrafisk og mus blev aflivet ved henholdsvis højkoncentrations tricainopløsning og kuldioxidkvælning efter forsøget.
1. Optimering af opsætningen af tre-fotonmikroskopi
BEMÆRK: Brug laser sikkerhedsbriller til øjenbeskyttelse. Bloker laserstrålen med en stråleblokker, når optikken placeres eller flyttes. For at visualisere laseren skal du bruge en infrarød fremviser eller et infrarødt detektorkort.
- Tænd for laseren, og indstil centerbølgelængden af tomgangsudgangen fra den ikke-kollinære optiske parametriske forstærker (NOPA) til ~ 1.300 nm eller ~ 1.700 nm.
- Anbring et tyndt dækglas på strålelinjen fra NOPA's signalport (dvs. ~ 700-900 nm) for at reflektere en lille brøkdel af laserstrålen til en Si-fotodiode for at opnå udløsende signaler (figur 1). Anbring en stråleblokker i dækglasets transmissionsvej.
- Placer pulskompressorer på lysbanen for at prechirp femtosekundlaseren for at optimere pulsvarigheden til kl. 15.00. For ~ 1.300 nm stråle skal du placere en prismeparkompressor 18,19 (f.eks. N-SF11 prismepar). For ~ 1.700 nm laser skal du placere en Si-plade på ~ 3 mm i tykkelse20. Indstil vinklen mellem Si-pladen og laserbanen i Brewsters vinkel (~ 73,9 ° for 1.700 nm) for at maksimere laseroverførsmædenheden. Drej Si-pladen for at opnå Brewsters vinkel ved at minimere refleksionen.
- Placer flipper spejle for at muliggøre praktisk skift mellem ~ 1.300 nm og ~ 1.700 nm strålelinjer.
- Placer en halv bølgeplade (f.eks. En akromatisk halvbølgeplade, der er egnet til ~ 1.300 og ~ 1.700 nm) monteret på et rotationstrin og en polariserende strålesplitter (PBS) for at kontrollere laserens intensitet. Placer en stråleblokker i PBS's refleksionsvej.
BEMÆRK: Laseren skal passere gennem PBS vinkelret for at opnå et højt udryddelsesforhold. Lasereffekten til kl. 15 styres ved at dreje den halve bølgeplade. - Anbring et tyndt dækglas i lysbanen efter strømregulatoren og før den optiske lukker for at reflektere en lille brøkdel af laserstrålen til en effektmåler. Brug effektmåleren som en "referenceeffektmåler" til at beregne lasereffekten under målet under billeddannelse (se trin 1.12).
- Juster laserbanen ved at justere spejlene for at udbrede strålen til 3PM-systemet.
- Mål strålestørrelsen ved placeringen af målets bageste blænde ved hjælp af en knivsæg på et oversættelsestrin og en effektmåler. Sørg for, at bjælkestørrelsen ikke er for lille eller for stor.
BEMÆRK: Strålen underfylder typisk lidt den høje NA-objektivlinse for at opnå høj effektgennemstrømning til dyb vævsbilleddannelse. For eksempel hjælper en strålestørrelse på ~10-13 mm (1/e2) ved den bageste blænde på Olympus-målet (~ 15 mm bageste blændediameter) med at opnå en effektiv NA på ~ 0,7-0,9. Når strålestørrelsen er for lille, bliver 3P-signalet svagt, og den rumlige opløsning forværres på grund af den lave effektive NA. Når strålestørrelsen er for stor, bliver den maksimale tilgængelige excitationseffekt under målet svag på grund af effekttabet ved målets bageste blænde. Til dybvævsbilleddannelse lider de marginale stråler også et højere tab på grund af den længere vej i vævet. - Hvis strålestørrelsen ved målets bageste blænde ikke er passende, skal du placere passende optiske elementer, såsom konvekse linser, i laserstrålebanen for at justere strålestørrelsen.
BEMÆRK: Sørg for, at laserstrålen ikke er større end galvo-spejlene for at forhindre unødvendigt strømtab. - Placer objektivobjektivet på opsætningen kl. 15.00.
- Mål pulsvarigheden efter målet ved hjælp af en autokorrelator. Juster pulskompressoren for at opnå kortere impulser, hvis pulsvarigheden er for lang (f.eks. >70 fs). Brug ~ 50-70 fs impulser til kl. 15 og et Michelson-interferometer placeret mellem laseren og målet om at give forsinkelsen til autokorrelationsmålinger.
BEMÆRK: En fotodiode med en korrekt spektralrespons (f.eks. En siliciumfotodiode til bølgelængde større end 1.200 nm) placeret i objektivets fokus kan bekvemt fungere som en ikke-lineær detektor, og fotostrømmen med to foton fra fotodioden kan bruges til at opnå autokorrelationssporene20. Prismeparkompressoren til ~1.300 nm kan justeres på to måder: (1) ændring af afstanden mellem de to prismer; (2) ændring af laserstrålens stilængder i prismeglasset ved at flytte prismet/prismet(erne) vinkelret på prismets basislinje. Si-pladekompressoren til ~ 1.700 nm kan justeres ved at udskifte Si-pladen med en tykkere eller tyndere Si-plade. - Placer en effektmåler ved udgangen af objektivobjektivet. Mål lasereffekten under målet, og aflæs værdien af referenceeffektmåleren (fra trin 1.6). Beregn forholdet mellem effekten under målet og ved referenceeffektmåleren.
BEMÆRK: Under billeddannelse kan den faktiske lasereffekt under målet beregnes ud fra effektforholdet og værdien af referenceeffektmåleren. - Tag effektmåleren ud under målet.
- [Valgfrit] Kontroller fotonskudsstøj begrænset ydeevne for billedbehandlingssystemet
BEMÆRK: For at udføre denne opgave er følgende elementer nødvendige: 1) en fluorescein eller Texas Red farvestofpulje (f.eks. ~ 10 μM), 2) en fotontæller og 3) et oscilloskop.- Anbring farvestofpuljeprøven under objektivlinsen kl. 15.00.
- Sænk forsigtigt objektivlinsen ned på farvepuljen, indtil afstanden er mindre end objektivlinsens arbejdsafstand.
- Placer vand mellem linsen og dækglasset i farvestofpuljen.
- Indstil mikroskopets udgangseffekt til en lille mængde (f.eks. <1 mW med ~ 1 MHz pulsgentagelseshastighed) for at lokalisere overfladen af farvestofpuljen.
- Start mikroskopets Live-session , og indstil z-placeringen til nul.
- Flyt langsomt målet væk fra prøven for at nå toppen af farvepuljen (som angivet af den tredje harmoniske generation (THG), der produceres af dækglasset).
- Indstil z-placeringen til nul ved dækglassets position.
- Sænk målet lidt, indtil et klart fluorescenssignal er synligt i fluorescenskanalen.
- Tilslut PMT's udgang til en BNC-splitter. Tilslut skillevæggens udgange til fotontælleren og billedoptagelsessystemet.
- Indstil lasereffekten til en værdi, hvor fotontællingerne pr. sekund er lavere end 5 % af lasergentagelseshastigheden (f.eks. 50.000 fotoner/s,
når der anvendes en 1 MHz-laser). - Reducer synsfeltet til det mindst mulige med softwaren, og sørg for, at lysstyrken er ensartet på tværs af billedet.
- Indstil billedhastigheden til 1,0 billede pr. Sekund.
- Indstil fotontællerens anskaffelsesperiode til t = antal pixels pr. billede × pixelopnatningstid og et passende diskriminatorniveau.
- Saml fotontællingen og pixeltællingerne samtidigt i en tilsvarende periode. For at opnå pixelantallet skal du indsamle gennemsnitlige pixelværdier for hele billedet samt middel- og standardafvigelsesværdierne.
- Gentag trin 1.14.14, og bloker excitationslaseren for at opnå det mørke fotonantal og pixelantal.
- Stop Live-anskaffelsen af softwaren.
- Træk de mørke tal (opnået i trin 1.14.15) fra fotontællingerne (opnået i trin 1.14.14) og det samlede pixelantal (opnået i trin 1.14.14).
- Del det samlede antal mørke fratrækkede pixel med det mørktrækkende fotonantal (opnået i trin 1.14.17). Brug den opnåede værdi som 'konverteringsfaktor' (dvs. pixelværdier/foton) fra en pixelværdi til et fotonantal.
- Konverter gennemsnits- og standardafvigelsen for pixeltællingerne (opnået i trin 1.14.14) til fotontællinger, dvs. dividere dem med 'konverteringsfaktoren' (opnået i trin 1.14.18). Sammenlign middel- og standardafvigelsen for fotontællingerne. Sørg for, at standardafvigelsen er omtrent lig med kvadratroden af gennemsnittet af fotontællingerne, hvis billedbehandlingssystemets ydeevne er tæt på skudstøjgrænsen.
- [Valgfrit] Kontroller mikroskopets signaldetekteringseffektivitet.
- For at teste mikroskopets ydeevne og signaldetekteringseffektiviteten skal du følge trin 1.14.1-1.14.17 for at opnå fotontællinger. I trin 1.14.15 oprettes en blind prøve lavet af opløsningsmidlet til farvestoffet, og fotontællingerne for den tomme prøve med laseren tændt og med samme effekt som for farvestofpuljen. Træk de tomme tal fra fotontællingerne fra farvestofpuljen for at opnå fluorescensfotontællingerne.
- Brug de kendte 3P-tværsnit af fluorescein eller Texas Red10,22 og Eq. (1) (med en effektiv NA til at tage højde for rygblændefyldningen korrekt) til at beregne de forventede fotontællinger og derefter sammenligne den beregnede værdi med fotontællingerne målt eksperimentelt. Optag begge fotontællinger i laboratorienotesbogen som testresultater for mikroskopet til fremtidige referencer.
BEMÆRK: Sørg for, at de beregnede og målte værdier er tæt på hinanden (f.eks. inden for en faktor 2). Sådanne kvantitative tests af systemet er særligt nyttige for at sikre ensartet billedbehandlingsydelse over tid.
2. Tilberedning af fisk til kl. 15.00
BEMÆRK: Brug handsker og en laboratoriefrakke til denne procedure. Vælg den voksne zebrafisk i henhold til eksperimentet. Afslut hele forberedelsen (trin 2.1 til 2.7) inden for ~ 15 minutter.
- Forbered en petriskål med ~ 0,5 cm 2% højsmeltepunktsagar. Skær et rektangulært hul i agaren længere og lidt bredere end fisken. Brug voks til at fastgøre tynde slanger (til perfusion af vand i fiskens mund) til petriskålen med den ene ende i rektanglet. Brug voks til at fastgøre slanger med større diameter (til fjernelse af vand) til kanten af petriskålen.
- Vælg fisk til eksperimentet. Bedøm fisken med 0,2 mg/ml tricainopløsning (pH 7,2) i Hanks opløsning, indtil fisken er helt afvisende og dybt bedømt.
- Placer fisken på sin side på en våd svamp. Ved hjælp af en mikrosprøjtning injiceres retro-orbitalt 3 μL pancuroniumbromid (0,4 μg/μL i Hanks opløsning) for at lamme fisken. Læg fisken i Hanks opløsning kort for at sikre, at den er helt lammet.
- Læg fiskens dorsale side op i petriskålen med hovedet mod slangen. Brug tang til at manipulere slangen, åbn forsigtigt fiskens mund og skub slangen ind i munden. Skub forsigtigt fisken mod slangen, så slangen vil være bagerst i fiskens mund.
- Tør hurtigt, men forsigtigt agaren omkring fisken og fjern vandet oven på fisken. Dyp et lille stykke laboratorievæv i laboratorielim og læg vævet på agaren på begge sider af fisken og over fiskens rygkaudal til gællerne.
BEMÆRK: Skub ikke på fisken eller påfør pres. Pas på at undgå at få lim på gællerne. - Påfør en lille dråbe bupivacain direkte på overfladen af hovedet for at bedøbefiske fisken under billeddannelse i det område, hvor laseren kommer i kontakt med huden.
- Bring petriskålen med fisken til mikroskopet og fyld den med fiskeanlægsvand. Tilslut slangen til en vandpumpe for at pumpe systemvand med 2 ml/min ind i fiskens mund og fjern samtidig perfusionsopløsningen fra fadet med samme hastighed. Sørg for, at vandet iltes med en bobler og opvarmes til ~ 30 ° C med en akvarievarmer.
BEMÆRK: Fisken er nu klar til billeddannelse. Overvåg fiskens sundhed ved at overvåge blodgennemstrømningen i tredje harmoniske generations (THG) signal under billeddannelse (se pkt. 4.1). 3P-billeddannelse skal også være kompatibel med mere sofistikerede fiskepræparater som dem, der anvendes i 2P-billeddannelse til at fastgøre hovedet og tillade kropsbevægelser under billeddannelse under virtual reality23. Denne fuldstændig ikke-invasive billeddannelse undgår behovet for fjernelse af kraniet, som det er typisk i andre undersøgelser af hvirveldyr og er et skridt i retning af at minimere invasiv forskning og tilhørende smerte.
3. Forberedelse af musen til kl. 15.00
BEMÆRK: Brug handsker, kirurgisk maske og laboratoriefrakke under følgende procedurer. Vælg muselinjen i henhold til eksperimentet. Musen skal anholdes under en 12:12 timers lys-mørk cyklus før operationen. Hele operationen (trin 3.2-3.11) er aseptisk, og alle kirurgiske værktøjer skal steriliseres før brug. Craniotomien tager ~ 1 time.
- Anbring en donutformet (4,5-6,5 mm diameter) dækslip og en dækskive (5 mm diameter) på ren parafilm. Brug en nål til at påføre en lille mængde optisk klæbemiddel til at lime det doughnutformede dækslip på dækslipsskiven. Hærding disk-donut coverslip på parafilmen under ultraviolet lys i 10-20 min. Fjern hele diskdnutdæksedlen fra parafilmen, og brug pincetten til at ridse overskydende lim og 70% ethanol væk for at fjerne snavs.
BEMÆRK: Dækslipsene er ~0,17 mm tykke. Den donutformede dækseddel bruges til at anvende passende pres på hjernen til kronisk billeddannelse. - Anæstesi musen med 3% isofluran og 20%O2 gasblanding i et induktionskammer. Vej musen. Placer musen i en udsat position på en varmepude. Indstil temperaturen på varmepuden til ~37 °C.
- Fastgør de øverste tænder i mundhullet i et stereotaksisk apparat med placering af en bedøvelsesmaske. Fastgør ørestængerne til ørerne. Oprethold anæstesi med 2% isofluran og 20%O2 gasblanding under operationen.
BEMÆRK: Juster koncentrationen af isofluran ved at overvåge musens respons. Kontroller anæstesiniveauet ved at se vejrtrækningshastigheden (~ 1 Hz for dyb søvn) og klemme fødderne for at kontrollere, om der er reaktion før operationen. - Påfør øjensalve på øjnene til smøring. Luk øjenlågene. Tænd alle operationslysene. Subkutant injicere ketoprofen, dexamethason og glycopyrrolat baseret på musens kropsvægt før operationen.
BEMÆRK: Lægemiddeldoserne er 2 mg / ml, 0,1 mg / ml og 0,1 mg / ml for henholdsvis ketoprofen, dexamethason og glycopyrrolat. Injektionsvolumenerne for ketoprofen, dexamethason og glycopyrrolat afhænger af kropsvægt og er henholdsvis 2,5 μL / g, 2 μL / g og 2 μL / g. - Fjern hår på hovedets krone og nær ørerne.
- Klip så meget hår som muligt med en saks eller en hårklipper og fjern det klippede hår fra operationsstedet.
- Påfør en passende mængde hårfjerningscreme. Vent i 1 minut.
- Fjern hår og creme ved hjælp af en vatpind gennemblødt i saltvand.
- Gentag trin 3.5.2 og 3.5.3, indtil håret er helt fjernet.
- Påfør 5% povidon-jodopløsning og derefter 70% ethanol på huden for at rense området. Gentag processen tre gange.
- Giv en subkutan injektion af atropin (dosis baseret på kropsvægt, 0,02-0,05 mg/kg) på hovedet. Vent i 1 minut.
- Skær huden på hovedets krone for at udsætte kraniet. Sørg for, at bregma-punktet og lambda-punktet begge er udsat. Lim det resterende hudvæv på kanten til kraniet ved hjælp af biokompatibel lim for at undgå, at borestøv kommer ind under huden (hvilket kan fremkalde et immunrespons).
- Brug en kirurgisk markør til at tegne en cirkel med en diameter på 5 mm over interesseområdet. Vælg for eksempel midten af området ~ 2,5 mm lateral og 2 mm kaudal til bregma, som dækker det meste af den somatosensoriske cortex og den visuelle cortex.
- Bor langsomt langs cirklen og påfør saltvand for at hydrere kraniet, når det er halvvejs færdigt. Sænk borehastigheden i den sidste halvdel og dæk kraniet med saltvand, før kraniet fjernes. Åbn kraniet forsigtigt med tang og påfør et lille stykke steril gelfoam gennemblødt i saltvand for straks at stoppe enhver blødning i hjernen. Hold hjernen hydreret ved hjælp af saltvand.
- Påfør en dråbe saltvand på siden af den forberedte disk-doughnut coverslip mod hjernevævet. Placer den fremspringende diskdel af disk-donut-dækslen i kranievinduet. Brug en lang stang, der holdes af det stereotaksiske apparat, til forsigtigt at trykke på diskdelen af dækslip kranievinduet på hjerneoverfladen, og sikre, at doughnutdelen tæt dækker kraniet. Tør området omkring diskdnutdækket med en vatpind.
- Påfør et lag biokompatibel lim under den doughnutformede kant. Påfør et lag tandcementblanding under og omkring doughnutdelen af disk-donut-dækskortet. Påfør et andet lag lim over tandcementen. 5% glukose (dosis baseret på kropsvægt, 10 μL / g) kan injiceres subkutant hver time under operationen for at tilvejebringe animalsk energi.
- Luk anæstesisystemet. Slip musen fra det stereotaktiske apparat. Overfør musen straks til et tilpasset kompakt stereotaktisk apparat med en varmepude ved ~ 37 ° C og et anæstesiapparat.
- Placer musen i en udsat position på varmepuden på det tilpassede kompakte stereotaksiske apparat. Indstil temperaturen til ~37 °C. Fastgør de øverste tænder i mundhullet i det stereotaktiske apparat og ørestængerne til musens ører. Sæt på bedøvelsesrørene, og oprethold anæstesi med 1,5% isofluran og 20%O2 gasblanding.
BEMÆRK: Musen er nu klar til billeddannelse. Hold musen aæstet under følgende billeddannelsesprocedurer. Juster koncentrationen af isofluran ved at overvåge musens respons.
4. Intravital billeddannelse i fisk og musehjerner
- Intravital billeddannelse i zebrafiskens hjerne
BEMÆRK: For korrekt at lokalisere fiskehjernen under objektivlinsen bruges et CCD-kamera (secondary charge-coupled device) på samme vej som excitationslyset til vidvinkelbilleddannelse.- Indstil mikroskopet, og kalibrer effekten (som beskrevet i afsnit 1).
- Placer et mål med lav forstørrelse (typisk 4x) på mikroskopet.
- Placer petriskålen, der indeholder fisken og rørene, under mikroskopet.
- Brug en lysdiode (LED) lyskilde til at belyse petriskålen.
- Åbn kameratilstanden for billedoptagelsessoftwaren (figur 2).
- Klik på Live.
- Vælg kanal A i højre side af skærmen.
- Juster histogramindstillingerne for at se billedet tydeligt.
BEMÆRK: Disse skal opdateres efter behov. - Indstil motorindstillingen på motorstyringen til Base.
- Sænk målet, indtil fisken er synlig.
BEMÆRK: Sørg for, at objektivlinsen ikke får fysisk kontakt med hovedet. - Placer midten af fiskehovedet i midten af synsfeltet.
- Flyt målet op og væk fra fiskehovedet.
- Udskift objektivobjektivet med lav forstørrelse med objektivobjektivet med høj NA i kl. 15.00.
BEMÆRK: Objektivet med lav forstørrelse og objektivet med høj NA behøver ikke at være parfokale, men skal være tæt nok på til at sikre, at fisken er inden for synsfeltet for objektivobjektivet med høj NA. - Sænk langsomt objektivlinsen, og sørg for, at målet ikke får nogen fysisk kontakt med hovedet. I CCD-kamerasoftwaren skal du stoppe med at flytte målet, når toppen af hovedet er synligt. Indstil z-placeringen til 0 μm.
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler under objektivlinsen, når du bruger et vandnedsænkningsmål. - Sluk for LED-lyskilden, og luk det mørke gardin omkring systemet.
- Indstil billedoptagelsessoftwaren til Multiphoton GG-tilstand til 3P-billeddannelse, og indstil effekten under objektivobjektivet til mindre end 1 mW (med ~ 1 MHz pulsgentagelseshastighed).
- Skift motorindstillingsknappen fra Base til Objective på motorstyringen.
- Skru ned for lyset i rummet.
- Tænd FOR PMT'erne, og åbn lukkeren til excitationskilden kl. 15.00. Sørg for, at der vises en oversigt over knoglen i fluorescenssignalkanalen på grund af autofluorescens og i THG-signalkanalen på grund af knoglens THG (figur 2C).
- Udfør billeddannelse i forskellige dybder ved at øge effektniveauerne, når du afbilder dybere.
- Intravital billeddannelse i musehjernen
BEMÆRK: Injicer 5% glukose i den abethetiserede mus hver time under billeddannelse; dosis er baseret på kropsvægt (10 μL/g).- Indstil billedoptagelsessoftwaren til Multiphoton GG-tilstand til 3P-billeddannelse, og indstil effekten under objektivobjektivet til mindre end 1 mW (med ~ 1 MHz pulsgentagelseshastighed).
BEMÆRK: Sørg for, at operationsvinduet er placeret vinkelret på objektivlinsen for at reducere aberration. Finjustering udføres ved at vippe det stereotaxiske apparat. - Flyt objektivlinsen tæt på vinduet, og påfør vand mellem målet og kranievinduet; indstil akseværdier for alle motorer til nul.
BEMÆRK: Lysabsorptionen iH20ved ~ 1.700 nm er stor, hvilket reducerer lasereffekten på ~ 1.700 nm betydeligt efter en dybde på ~ 1-2 mm vand. For ~ 1.700 nm excitation skal du bruge D2O, som har meget mindre absorption ved 1.700 nm, til vandnedsænkning for at reducere absorptionen med vand. - Klik på Live-knappen i billedoptagelsessoftwaren, og åbn PMT-kanaler, f.eks. en fluorescenssignalkanal og en THG-signalkanal. Juster PMT-forstærkningen og baggrundsniveauet efter behov.
- Flyt langsomt op ad objektivlinsen for at lokalisere vinduesoverfladen ved at overvåge THG-kanalen fra de store blodkar og vinduesglasoverfladen. Juster vinduesretningen (se noten i trin 4.2.12), hvis det er nødvendigt. Nulr motorerne for at definere hjernens overflade.
- Udfør billeddannelse, og juster effektniveauet i henhold til billeddybden.
- Indstil billedoptagelsessoftwaren til Multiphoton GG-tilstand til 3P-billeddannelse, og indstil effekten under objektivobjektivet til mindre end 1 mW (med ~ 1 MHz pulsgentagelseshastighed).
Representative Results
En vellykket gennemførelse af denne protokol vil resultere i et korrekt justeret mikroskop med optimale lysparametre (f.eks. pulsvarighed, NA) og dyrepræparater, der er egnede til in vivo kl. 15.00. Den kommercielt tilgængelige 3P-opsætning omfatter passende spejle og linser til både ~ 1.300 nm og ~ 1.700 nm; derfor kræves der ingen ændring i optik, når excitationsbølgelængden skiftes mellem 1.300 nm og 1.700 nm. Hvis linserne i en 3P-opsætning ikke har en passende belægning til 1.300 og 1.700 nm, skal disse udskiftes med passende for at reducere lasereffekttab. Med den optimerede kl. 15.00 og korrekt dyreforberedelse kan in vivo-fluorescens og THG-billeder med høj kontrast opsamles dybt inde i hjernen.
Figur 3 viser repræsentative 3P-billeder af intakte voksne zebrafisk. Høj opløsning, ikke-invasiv og dyb billeddannelse af genetisk mærkede neuroner i den voksne zebrafiskhjerne opnås ved hjælp af kl. 15.00. Selvom billeddannelse i telencephalon-regionen er blevet rapporteret i den voksne zebrafiskhjerne ved hjælp af 2PM 24,25,26,27, giver 3PM adgang til hele telencephalon og regioner, der er mere udfordrende eller umulige at observere ved hjælp af andre teknikker. Fordelingen af cellelag i det optiske tectum og lillehjernen kan observeres i figur 3C. I en vellykket billeddannelsessession er knoglen synlig i THG-kanalen og neuroner synlige i fluorescenskanalen. Til billeddannelse af voksne zebrafisk blev mikroskopets kamerafunktion brugt til at lokalisere fisken (figur 3A). Dette trin er ikke nødvendigt for musehjernebilleddannelse, da glasvinduet er stort nok til at gøre hjernen let tilgængelig. Strukturelle billeder i høj opløsning af voksen zebrafiskhjerne blev opnået ved hjælp af systemet beskrevet i de foregående afsnit. Kraniet ses i THG-kanalen (figur 3B), som hjælper med at navigere i hjernen og finde den øverste overflade. Som observeret i figur 3C kan neuroner skelnes med et højt signal-til-baggrund-forhold (SBR) dybt inde i den voksne hjerne. Vævet over hjernen er synligt i fluorescenskanalen på grund af autofluorescens.
Figur 4 viser flerfarvede 3P-billeder af GCaMP6s-mærkede neuroner (grøn) og Texas Rødmærkede blodkar (rød) sammen med THG (blå) signaler i den voksne musehjerne med 1.340 nm excitation10. Billederne er gengivet fra tidligere arbejde10. I figur 4 blev pulsenergien i fokus opretholdt på ~ 1,5 nJ i hele dybden for at opnå tilstrækkelig fluorescens og THG-signaler, og den maksimale gennemsnitlige lasereffekt var ~ 70 mW. Pulsvarigheden blev justeret til ~ 60 fs, og den effektive NA var ~ 0,8. Med optimering af 3PM-opsætningen blev der med succes opnået billeder med høj kontrast ned til 1,2 mm fra hjerneoverfladen i CA1 hippocampus-regionen (figur 4A, B). Figur 4C,D viser Ca2+ aktivitetsspor af GCaMP6s-mærkede neuroner i en dybde på 750 μm i en 10 minutters optagelsessession, der viser høj optagelsestroskab.
Hvis excitationslaseren er forkert justeret, kan der observeres uensartethed i signallysstyrken på tværs af synsfeltet. Derudover, hvis laserparametrene, såsom pulsvarigheden, excitationspulsenergien i fokus og den effektive NA, ikke optimeres, vil THG-billedet fra fiskekraniet eller kraniotomivinduet i musehjernen ikke være synligt og / eller kræver høj excitationspulsenergi (f.eks. >2 nJ / puls i fokus). Derfor kan THG-signalerne på hjerneoverfladen bruges som indikator for en optimeret 3PM-opsætning, inden man starter dybvævsbilleddannelse.
Figur 1: Skematisk illustration af en opsætning kl. 15.00. Excitationslaserens bølgelængde er indstillet til ~1.300 nm eller ~1.700 nm, output fra TOMGANGSPORTEN PÅ NOPA. Prismeparkompressoren og Si-pladekompressoren bruges til henholdsvis ~ 1.300 nm og ~ 1.700 nm laser til at prechirp excitationslaserpulsen. Laserstrålerne ~1.300 nm og ~1.700 nm kan skiftes med flipperspejle. NOPA's signalport bruges til at opnå det udløsende signal. En halv bølgeplade og en PBS bruges til at styre excitationseffekten. Fluorescensen og THG detekteres af GaAsP PMT'er. Passende kombinationer af dikroiske spejle og båndpasfiltre anvendes til at adskille fluorescens- og THG-signalerne. Forkortelser: 3PM = tre-fotonmikroskopi; NOPA = ikke-kollinær optisk parametrisk forstærker; PBS = polariserende strålesplitter; THG = tredje harmonisk generation; DAQ = dataindsamling; PMT = fotomultiplikatorrør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative skærmbilleder til intravital billeddannelse i fisk (protokolafsnit 4.1). (A) Kameratilstandsvisning af billedoptagelsessoftwaren med 4x objektivobjektiv på plads. Nøglefunktioner i softwaren er skitseret og nummereret som følger: 1. Billedbehandlingstilstand for billedoptagelsessoftwaren. Indstillingerne for tilstand er Kamera, Multiphoton og Multiphoton GG. Til billeddannelse i hvidt lys med CCD-kamera vælges kameratilstanden . 2. Hvis du klikker på knappen Live , tændes kameraet (eller PMT'er, hvis det er i multifotonindstillinger), og der kan observeres en visning i realtid af mikroskopet. 3. Under fanen Capture Setup indstilles de ønskede billedparametre (effekt, placering, dybde). 4. I fanen Capture tildeles en mappeplacering til de billeder, der skal gemmes. Billeddannelsen kan startes i denne fane. Z Control-indstillingen styrer billeddybden ved at flytte z-trinmotoren. 6. Repræsentativt billede af et zebrafiskhoved. Den rostrale side af hovedet er til venstre. (B) Repræsentativ visning af kameratilstand med 25x objektivobjektiv. (C) Repræsentativ visning af Multiphoton GG-tilstand , der indeholder THG-billedet af billedet set i (B). Forkortelser: CCD = ladningskoblet enhed; PMT = fotomultiplikatorrør; THG = tredje harmonisk generation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder af den voksne zebrafiskhjerne erhvervet med billedoptagelsessoftwaren. (A) Kameratilstandsbillede af voksen zebrafiskhoved erhvervet med en 4x objektivlinse. Øverst på billedet er den rostrale retning. OT-loberne og CB er skitseret. (B) Repræsentativt billede erhvervet i Multiphoton GG-tilstand med et 25x objektivobjektiv, der indeholder THG-billedet af (A). C) Fluorescensbilleder af voksne zebrafiskhjerner i krydset mellem lillehjernen og det optiske tektum, hvor GFP udtrykkes i cytoplasma af neuroner i forskellige dybder. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: OT = optisk tectam; CB = cerebellum; THG = tredje harmonisk generation; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Flerfarvet 3PM af GCaMP6s-mærkede neuroner (grøn), Texas Rødmærkede blodkar (rød) og tredje harmonisk generation (blå) på 1.340 nm excitation i musehjernen. (A) Z-stack billeder ned til 1.200 μm fra hjerneoverfladen med et synsfelt på 270 x 270 μm (512 x 512 pixels pr. Ramme). Lasereffekten blev varieret i henhold til billeddybden for at opretholde ~ 1,5 nJ pulsenergi ved fokus. Maksimal gennemsnitlig effekt under målet var 70 mW. (B) Udvalgte 2D-billeder på forskellige billeddybder. (C) Aktivitetsregistreringssted ved 750 μm under duraen med et synsfelt på 270 x 270 μm (256 x 256 pixels). (D) Spontane hjerneaktivitetsspor registreret i en vågen mus fra de mærkede neuroner, der er angivet i (C). Billedhastigheden var 8,3 Hz, med en pixel opholdstid på 0,51 μs. Lasergentagelseshastigheden var 2 MHz, og den gennemsnitlige effekt under objektivlinsen var 56 mW. Hvert spor blev normaliseret til dets baseline og lavpas filtreret ved hjælp af et hammingvindue på 0,72 s tidskonstant. Skalastænger = 50 μm. Denne figur og figurlegenden er gengivet fra 10. Forkortelse: 15:00 = tre-fotonmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Effektiv dæmpelseslængde i musehjernens neocortex. EAL (magenta linje) beregnes ud fra vævsspredningen (rød linje) og vandabsorptionen i vævet (blå linje), idet der antages 75% vandsammensætning. De sorte stjerner indikerer rapporterede eksperimentelle data om EAL i neocortex i musehjernen 3,21,28,29. Bemærk, at EAL varierer i forskellige væv. Forkortelse: EAL = effektiv dæmpningslængde. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Excitation bølgelængde (nm) |
Nedsænkning vand | Maksimal lasereffekt (mW) |
Maksimal pulsenergi i fokus* (nJ) |
Typisk EAL i musebarken (μm) |
Billeddybde i musebarken** (mm) |
Pulsenergi under målet*** (nJ) |
Maksimal lasergentagelseshastighed**** (MHz) |
| 1300 | H2O eller D2O |
 100 |
2 |
~300 | 0.8 | ~ 14 | ~ 7 |
| 1.2 | ~ 55 | ~ 2 | |||||
| 1.6 | ~ 210 | ~0,5 | |||||
| 2.1 | ~ 1100 | ~0,1 | |||||
| 1700 | D2O |
50 |
3 |
~400 | 0.8 | ~ 7 | ~ 7 |
| 1.2 | ~ 20 | ~2,5 | |||||
| 1.6 | ~ 55 | ~1 | |||||
| 2.1 | ~190 | ~0,3 |
Tabel 1: Typiske 3P excitationsbetingelser for musecortexbilleddannelse.
*Med et højt NA (~ 1,0) mål, pulsbredde på ~ 50 fs og typiske fluoroforer såsom fluorescerende proteiner (f.eks. GFP og RFP).
** Med den antagelse, at EAL er ensartet i hele cortex.
For at opnå ~1 nJ/puls i fokus, beregnet ud fra EAL og billeddybden.
Beregnet ud fra pulsenergien under målet og den maksimale tilladende lasereffekt.
Forkortelser: 3P = tre-foton; NA = numerisk blænde; GFP = grønt fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; EAL = effektiv dæmpningslængde.
Discussion
Denne protokol forklarer trinvise procedurer for opsætning af 3P-billeddannelse med et kommercielt mikroskop og laserkilde. Sammenlignet med kl. 14.00 har kl. 15.00 en fordel i applikationer, der kræver optisk adgang i de dybere områder, såsom i musehjernens hippocampus. Selvom 3PM mest bruges i neurovidenskab, kan 3PM potentielt anvendes i andre væv såsom lymfeknuder, knogler og tumorer til dybvævsobservation.
Det er vigtigt at kontrollere, at billedbehandlingssystemet fungerer tæt på skudstøjgrænsen, hvilket sikrer, at detektions- og dataindsamlingselektronik bidrager med ubetydelig støj til billedet efter PMT'erne. Usikkerheden i antallet af detekterede fotoner er grundlæggende begrænset af fotonskudsstøj. Skudstøj begrænset ydeevne kan opnås i et typisk multifotonmikroskop ved hjælp af en high-gain fotodetektor (f.eks. En PMT). Fotonskudsstøj følger en Poisson-statistisk fordeling, hvor standardafvigelsen for fordelingen er lig med kvadratroden af gennemsnittet af fordelingen. Følg trin 1.14 i protokolafsnittet for at kontrollere den begrænsede ydeevne for skudstøj.
For at undgå lysdæmpning medH20er det nyttigt at brugeD20til nedsænkning, især til ~ 1.700 nm excitation. Når D2O bruges, er det vigtigt at opdatere D2O hvert ~ 10 minut eller bruge et stort volumen D2O for at undgå D2O / H2O udveksling under billeddannelse. Man kan også forsegle D2O fra rummiljøet3. Hvis der anvendes et objektivobjektiv med lang arbejdsafstand (WD) (f.eks. WD på 4 mm eller længere) til billeddannelse, kan nedsænkningsvæskens tykkelse overstige 2-3 mm. Den øgede tykkelse gørH20-absorptionenikke ubetydelig, selv ved ~1.300 nm21. Derfor kan D2O være nødvendig selv for 1.300 nm 3PM, når du bruger et langt WD-objektivobjektiv.
Da 3P-fluorescensintensiteten afhænger af terningen af excitationspulsenergien i fokus (Eq. (1)), er det særligt vigtigt at indstille den passende lasereffekt for at opnå tilstrækkelige 3P-fluorescenssignaler, samtidig med at termisk og ikke-lineær skade i levende væv undgås. Den gennemsnitlige lasereffekt skal holdes under tærsklen for termisk skade. I musehjernen, for eksempel for at undgå termisk vævsskade, skal den gennemsnitlige effekt på musens hjerneoverflade holdes på eller under ~ 100 mW for ~ 1.300 nm excitation i en dybde på 1 mm og med et synsfelt (FOV) på 230 μm x 230 μm21. Tilsvarende bør den gennemsnitlige effekt på ~1.700 nm holdes på eller under ~50 mW i ~1 mm dybde og en FOV på ~230 μm x 230 μm (upublicerede data). For at undgå excitationsmætning og potentiel ikke-lineær skade skal excitationspulsenergien desuden holdes ved 2 nJ og 3 nJ for henholdsvis ~ 1.300 nm og ~ 1.700 nm excitation,henholdsvis 30.
På grund af lysabsorption og spredning i væv dæmpes pulsenergien i fokus til 1/e (~ 37%) efter penetration af væv med 1 EAL. EAL varierer i forskellige væv, og med excitationsbølgelængderne, f.eks. i musehjernens neocortex, er EAL henholdsvis ~300 μm og ~400 μm ved ~1.300 nm og ~1.700 nm, henholdsvis 3,29 (figur 5). For at holde den samme pulsenergi i fokus (f.eks. 1 nJ/puls) på en dybde af n EAL'er skal overfladepulsenergien derfor ganges med 1 nJ × en. For hurtig billeddannelse af strukturel og funktionel dynamik er en excitationslaser med en høj gentagelseshastighed (ved 1 MHz eller højere) ønskelig for at opnå en høj billedhastighedpå 5,6,7,10. Pulsenergibehovet og den gennemsnitlige lasereffektgrænse begrænser imidlertid den gældende gentagelseshastighed.
For eksempel, når vi forestiller os et moderat dybt område ved 4 EAL'er (dvs. ~ 1,2 mm i musebarken med 1.300 nm excitation), kræves ~ 55 nJ / puls ved overfladen for at holde 1 nJ / puls i fokus. Når den gennemsnitlige effektbegrænsning er 100 mW, kan vi anvende en ~ 2 MHz lasergentagelseshastighed. For at afbilde dybere i en dybde på 7 EFL'er kræves der imidlertid ~ 1.100 nJ / puls ved overfladen for at opretholde 1 nJ / puls i fokus. Hvis man antager, at den maksimale gennemsnitlige effekt er 100 mW for at undgå termisk skade, bør lasergentagelseshastigheden reduceres til 0,1 MHz for at opnå en 1.100 nJ/puls ved overfladen. Tabel 1 opsummerer typiske billeddannelsesforhold i musehjernebarken. Bemærk, at billeddannelsesdybderne i tabel 1 forudsætter, at EAL er ensartet i hele musecortex.
På grund af lasereffektbegrænsningen i dybvæv 3PM findes der desuden en afvejning mellem billedhastigheden og billedpixelstørrelsen, hvilket er særligt vigtigt for funktionel billeddannelse såsom calciumbilleddannelse. Den maksimale tilgængelige lasergentagelseshastighed afgøres på hver dybde baseret på den krævede pulsenergi i fokus og den gældende gennemsnitlige lasereffekt som beskrevet ovenfor, f.eks. 2 MHz i en dybde svarende til ~4 EAT'er med 1.300 nm excitation. Generelt kræver billeddannelse mindst én puls pr. pixel. Følgelig bestemmes den mindste tilgængelige pixeloplivstid af lasergentagelseshastigheden, f.eks. 0,5 μs/pixel med 2 MHz excitation.
For at bevare den høje rumlige opløsning (~ 1 μm i lateral) i 3P-billeder er det ideelt at indstille 1 pixel til et område på ~ 1 μm2, f.eks. 256 x 256 pixels til en FOV på 250 x 250 μm2. For at udføre hurtig billeddannelse med et betydeligt stort synsfelt (f.eks. 250 x 250 μm2 med 256 x 256 pixels), giver 0,5 MHz, 1 MHz og 2 MHz pulsgentagelseshastigheder derfor teoretiske maksimale billedhastigheder på henholdsvis ~ 7,6, ~ 15 og ~ 30 billeder / s. Ligeledes er optimeringen af lasergentagelseshastigheden afgørende, afhængigt af måldybden, scanningshastigheden og FOV, for at anvende tilstrækkelig pulsenergi under tærsklen for termisk skade. For at øge billeddannelseshastigheden kan en adaptiv excitationskilde bruges til at koncentrere alle excitationsimpulserne på neuronerne (dvs. regioner af interesse) ved at levere laserpulser efter behov til neuronerne31.
3PM er fordelagtig sammenlignet med 2PM i dyb billeddannelse inden for levende væv og gennem stærkt spredte medier som et kranium, knogler og det hvide substanslag (dvs. den eksterne kapsel) i musehjernen. Jo længere EAL og den højere ordens ikke-lineære excitation af 3PE gavner dyb vævsbilleddannelse. For eksempel til billede af GCaMP6 i musecortex er 2P fluorescenssignal med 920 nm excitation højere end 3P fluorescenssignal med 1.300 nm excitation i lavvandede områder ved 690 μm (dvs. ~ 2.3 EAL'er ved 1.300 nm)21. På grund af den længere EAL ved 1.300 nm sammenlignet med 920 nm giver 3PE imidlertid stærkere fluorescens end 2P-excitation (2PE) i en dybde på ~ 690 μm og dybere21. Denne dybde defineres som 'signalovergangsdybde', hvor fluorescenssignalstyrkerne for 2PE og 3PE er identiske med den samme gentagelseshastighed og de samme maksimalt tilladte gennemsnitlige kræfter21. Signalovergangsdybden afhænger af excitationsbølgelængderne for 2PE og 3PE og fluoroforen.
I praksis tillader 920 nm excitation højere gennemsnitlig lasereffekt end 1.300 nm excitation på grund af mindre vandabsorption. Den højere gennemsnitlige effekt på 2PE ville dog kun skubbe signalets crossover-dybde med 0.9 EFL'er4. Derudover, når prøven er tæt mærket, har 3PE den ekstra fordel ved meget højere SBR. Derfor, selv før du når signalovergangslængden, kan 3PM være bedre til billeddannelse end 2PM. For eksempel, når man forestiller musens hjernevaskulatur, som har en volumenfraktion (dvs. mærkningstæthed) på ~ 2%, 1.300 nm 3PM med 100 mW excitationseffekt overgår 920 nm 2PM med 200 mW excitationseffekt i en dybde på ~ 700 μm for fluorescein.
3PM har også en fordel, når man forestiller sig gennem et tyndt, men meget spredt lag, der kan forvrænge excitationsstrålens punktspredningsfunktion og generere en defokuseringsbaggrund4. For eksempel lider 2PM-billeder gennem musehjernens intakte kranium af defokusbaggrunden, selv i den lave dybde på < 100 μm fra hjerneoverfladen13. En lignende defokusbaggrund blev observeret i 2PM med 1.280 nm excitation gennem det hvide stof i musehjernen32. Derfor, når væv afbildes gennem uklare lag, foretrækkes 3PM frem for 2PM for billeddannelse med høj kontrast uanset mærkningstætheden.
Vi rapporterede for nylig en perlefantom- og teoretisk analyse, der viste, at billeddybdegrænsen på 3PM er over 8 EAS33; 8 EAL'er svarer til ~3 mm med ~1.700 nm excitation i musebarken. Den aktuelt tilgængelige laser har imidlertid ikke nok pulsenergi til at opnå 8 EAS'er i musehjernen. Yderligere udvikling af stærkere lasere vil skubbe den nuværende billeddybdegrænse på 3PM.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub og NIH 1U01NS103516.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| 70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
| Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
| Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
| Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
| Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
| Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
| eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
| GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
| Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
| Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
| Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
| Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
| Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
| Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
| Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
| Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
| Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
| Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
| Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
| Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
| Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
| SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
| Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
| Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
| Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
| Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
| ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
| Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
| Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
| VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
| XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
- Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
- Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
- Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
- Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
- Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
- Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
- Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
- Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
- Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
- Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
- Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
- Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).
