Summary
Drie-fotonenmicroscopie maakt fluorescentiebeeldvorming met hoog contrast mogelijk diep in levende biologische weefsels, zoals muizen- en zebravishersenen, met een hoge spatiotemporale resolutie.
Abstract
Multifotonenmicroscopietechnieken, zoals tweefotonenmicroscopie (2PM) en drie-fotonenmicroscopie (3PM), zijn krachtige hulpmiddelen voor deep-tissue in vivo beeldvorming met subcellulaire resolutie. 3PM heeft twee grote voordelen voor deep-tissue beeldvorming over 2PM die op grote schaal is gebruikt in biologielaboratoria: (i) langere dempingslengte in verstrooiende weefsels door gebruik te maken van ~ 1.300 nm of ~ 1.700 nm excitatielaser; ii) minder achtergrondfluorescentiegeneratie als gevolg van niet-lineaire excitatie van hogere orde. Als gevolg hiervan maakt 3PM structurele en functionele beeldvorming met hoog contrast diep in verstrooiende weefsels mogelijk, zoals intact muizenbrein van de corticale lagen naar de hippocampus en de volledige voorhersenen van volwassen zebravissen.
Tegenwoordig zijn laserbronnen die geschikt zijn voor 3PM commercieel beschikbaar, waardoor een bestaand twee-foton (2P) beeldvormingssysteem kan worden omgezet in een drie-foton (3P) systeem. Bovendien zijn er meerdere commerciële 3P-microscopen beschikbaar, waardoor deze techniek gemakkelijk beschikbaar is voor biologische onderzoekslaboratoria. Dit artikel toont de optimalisatie van een typische 3PM-opstelling, met name gericht op biologiegroepen die al een 2P-opstelling hebben, en demonstreert intravitale 3D-beeldvorming in intacte muizen- en volwassen zebravishersenen. Dit protocol omvat de volledige experimentele procedure van 3P-beeldvorming, inclusief microscoopuitlijning, prechirping van ~ 1.300 en ~ 1.700 nm laserpulsen, diervoorbereiding en intravitale 3P-fluorescentiebeeldvorming diep in volwassen zebravis- en muizenhersenen.
Introduction
In de biowetenschappen zijn multifotonenmicroscopie (MPM) -technieken, zoals 2PM en 3PM, krachtige hulpmiddelen geweest voor diepe in vivo beeldvorming met een hoge spatiotemporale resolutie en een hoog contrast in verstrooiende weefsels. Bovendien veroorzaken deze methoden minder fotobleaching in vergelijking met confocale microscopiemet één foton 1,2,3,4. 3PM is voordelig voor beeldvorming van dieper weefsel in vergelijking met 2PM vanwege twee belangrijke kenmerken: (i) het gebruik van excitatie met een langere golflengte (~ 1.300 nm of ~ 1.700 nm) vermindert weefselverstrooiing, en (ii) het excitatieproces van hogere orde (d.w.z. fluorescentiesignaal hangt af van de kubus van het excitatievermogen in 3PM in plaats van het kwadraat van het excitatievermogen in 2PM) dat de ongewenste achtergrondfluorescentie onderdrukt3 . Bijgevolg maakt 3PM beeldvorming met hoog contrast mogelijk op diepere gebieden in levende weefsels zoals de hippocampus in een intact volwassen muizenbrein 3,5,6,7,8,9,10,11 en de volledige voorhersenen van volwassen zebravissen12, inclusief Ca2+ activiteitsregistratie en veelkleurige waarnemingen. Bovendien zijn contrastrijke beelden verkregen met 3PM door de intacte schedels van muis en volwassen zebravis12,13.
Tegenwoordig zijn excitatielaserbronnen die geschikt zijn voor 3P-excitatie (3PE) bij ~ 1.300 en ~ 1.700 nm in de handel verkrijgbaar. Omdat het laserscansysteem in wezen hetzelfde is voor 2PM en 3PM, is het omzetten van een bestaande 2P-opstelling naar een 3P-opstelling mogelijk in biologielaboratoria met de installatie van een commercieel verkrijgbare laser voor 3PE. Het 3P-fluorescentiesignaal is afhankelijk van het laservermogen, de pulsduur, de laserherhalingsfrequentie en het numerieke diafragma (NA) van de objectieflens. Uitgaande van een diffractie-beperkte focus (d.w.z. het achterste diafragma van de objectieflens wordt overvuld door de excitatiebundel), beschrijft Eq (1) de tijdgemiddelde fluorescentiefotonenflux van het brandpuntsvolume als gevolg van 3PE.
(1)
Waarbij f de laserherhalingssnelheid is, τ de duur van de laserpuls (volledige breedte bij maximaal de helft), φ de efficiëntie van de systeemverzameling is, η de fluorescentie-kwantumefficiëntie is, σ3 de 3P-absorptiedoorsnede is, C de fluorofoorconcentratie, n0 de reflecterende index van het monstermedium (bijv. Water), λ de excitatiegolflengte in vacuüm is, NA is het numerieke diafragma van de objectieflens, een3 is de ruimtelijke integratieconstante van het brandpuntsvolume, 
is de tijdgemiddelde excitatiefotonenflux (fotonen / s) onder de objectieflens, z is de bebeelde diepte en EAL is de effectieve dempingslengte14. Hier hebben we aangenomen dat de EAL (meestal > 100 μm) veel groter is dan de axiale resolutie van de microscoop (meestal < 10 μm). Bij paraxiale benadering is een3 gelijk aan 28,114. gp(3) is de3e-orde temporele coherentie van de excitatiebron, en gp(3) is respectievelijk 0,41 en 0,51 voor hyperbolisch-secant-kwadraatpulsen en gaussische pulsen. De opvangefficiëntie φ kan worden geschat door rekening te houden met de fluorescentieverzameling door de objectieflens, de transmissie van de objectieflens, de reflectiviteit van de dichroïsche spiegel, de transmissie van de filters en de detectie-efficiëntie van de detector (bijv. Fotomultiplicatorbuis of PMT). Omdat de 3P-fluorescentie-intensiteit sterk afhankelijk is van verschillende parameters, is optimalisatie van de 3P-opstelling vereist om de 3P-fluorescentiesignalen te maximaliseren.
Dit protocol illustreert het optimalisatieproces van een typische 3P-opstelling, wat met name nuttig zal zijn voor biologielaboratoria die een 2P-opstelling hebben en van plan zijn om de mogelijkheden uit te breiden naar 3P-beeldvorming of om hun commerciële 3P-opstelling op optimale prestaties te houden. Dit video-artikel demonstreert ook deep-tissue 3P-beeldvorming in levende dierlijke hersenen. Het eerste deel behandelt de optimalisatie van een typische 3P-opstelling met een in de handel verkrijgbare laserbron en multifotonenmicroscoop. Het tweede en derde deel beschrijven respectievelijk zebravissen en muizenvoorbereiding voor 3PM van neuronale structuren en activiteiten. De craniotomiechirurgie bij muizen is eerder gemeld in protocoldocumentenen 15,16,17. Het vierde deel toont intravitale 3P-beeldvorming in zebravis- en muizenhersenen.
Protocol
Alle dierproeven en huisvestingsprocedures voor zebravissen en muizen werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Zebravissen en muizen werden na het experiment geëuthanaseerd door respectievelijk tricaïneoplossing met hoge concentratie en verstikking van koolstofdioxide.
1. Optimalisatie van de drie-foton microscopie setup
OPMERKING: Draag een laserveiligheidsbril voor oogbescherming. Blokkeer de laserstraal met een straalblokker wanneer optiek wordt geplaatst of verplaatst. Om de laser te visualiseren, gebruikt u een infraroodviewer of een infrarooddetectorkaart.
- Schakel de laser in en stel de middelste golflengte van de idler-uitgang van de niet-collineaire optische parametrische versterker (NOPA) in op ~ 1.300 nm of ~ 1.700 nm.
- Plaats een dun afdekglas op de straallijn van de signaalpoort van NOPA (d.w.z. ~ 700-900 nm) om een klein deel van de laserstraal naar een Si-fotodiode te reflecteren om triggersignalen te verkrijgen (figuur 1). Plaats een beam blocker in het transmissiepad van het afdekglas.
- Plaats pulscompressoren op het lichtpad om de femtosecondelaser voor te bereiden om de pulsduur voor 15.00 uur te optimaliseren. Plaats voor een bundel van ~1.300 nm een prisma-paar compressor18,19 (bijv. N-SF11 prismaparen). Plaats voor ~1.700 nm laser een Si plaat van ~3 mm in dikte20. Stel de hoek tussen de Si-plaat en het laserpad in de hoek van de Brewster in (~ 73,9 ° voor 1.700 nm) om de lasertransmissie te maximaliseren. Draai de Si-plaat om de hoek van de Brewster te bereiken door de reflectie te minimaliseren.
- Plaats flipperspiegels om gemakkelijk te kunnen schakelen tussen de ~1.300 nm en ~1.700 nm bundellijnen.
- Plaats een halve golfplaat (bijvoorbeeld een achromatische halve golfplaat die geschikt is voor ~ 1.300 en ~ 1.700 nm) gemonteerd op een rotatietrap en een polariserende bundelsplitser (PBS) om de intensiteit van de laser te regelen. Plaats een beam blocker in het reflectiepad van de PBS.
OPMERKING: De laser moet loodrecht door de PBS gaan om een hoge extinctieverhouding te bereiken. Het laservermogen voor 3PM wordt geregeld door de halve golfplaat te draaien. - Plaats een dun afdekglas in het lichtpad na de voedingsregelaar en vóór de optische sluiter om een klein deel van de laserstraal naar een vermogensmeter te reflecteren. Gebruik de vermogensmeter als 'referentievermogensmeter' om het laservermogen onder het objectief te berekenen tijdens het fotograferen (zie stap 1.12).
- Lijn het laserpad uit door de spiegels aan te passen om de straal in het 3PM-systeem te verspreiden.
- Meet de bundelgrootte op de positie van de achterste opening van het objectief met behulp van een mesrand op een vertaaltrap en een vermogensmeter. Zorg ervoor dat de balkmaat niet te klein of te groot is.
OPMERKING: Meestal vult de bundel de lens met hoge NA-objectieven iets onder om een hoge vermogensdoorvoer te bereiken voor beeldvorming van diep weefsel. Een bundelgrootte van ~10-13 mm (1/e2) bij het achterste diafragma van het Olympus objectief (~15 mm achterste diafragmadiameter) helpt bijvoorbeeld om een effectieve NA van ~0,7-0,9 te bereiken. Wanneer de bundelgrootte te klein is, wordt het 3P-signaal zwak en verslechtert de ruimtelijke resolutie vanwege de lage effectieve NA. Wanneer de bundelgrootte te groot is, wordt het maximaal beschikbare excitatievermogen onder het objectief zwak door het vermogensverlies bij de achterste opening van het objectief. Voor deep-tissue beeldvorming lijden de marginale stralen ook een hoger verlies als gevolg van de langere weg in het weefsel. - Als de bundelgrootte bij de achteropening van het objectief niet geschikt is, plaatst u de juiste optische elementen, zoals bolle lenzen, in het laserstraalpad om de bundelgrootte aan te passen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de laserstraal niet groter is dan de galvo spiegels om onnodig stroomverlies te voorkomen. - Plaats de objectieflens op de 3PM-instelling.
- Meet de pulsduur na het objectief met behulp van een autocorrelator. Pas de pulscompressor aan om kortere pulsen te bereiken als de pulsduur te lang is (bijvoorbeeld >70 fs). Gebruik ~50-70 fs pulsen voor 3PM en een Michelson interferometer geplaatst tussen de laser en het objectief om de vertraging voor autocorrelatiemetingen te bieden.
OPMERKING: Een fotodiode met een juiste spectrale respons (bijvoorbeeld een siliciumfotodiode voor golflengte groter dan 1.200 nm) geplaatst op de focus van het objectief kan gemakkelijk dienen als een niet-lineaire detector, en de twee-foton fotostroom van de fotodiode kan worden gebruikt om de autocorrelatiesporen20 te verkrijgen. De prisma-paar compressor voor ~ 1.300 nm kan op twee manieren worden aangepast: (1) het veranderen van de afstand tussen de twee prisma's; (2) het veranderen van de padlengten van de laserstraal in het prismaglas door het prisma loodrecht op de basislijn van het prisma te bewegen. De Si-plaatcompressor voor ~1.700 nm kan worden aangepast door de Si-plaat te vervangen door een dikkere of dunnere Si-plaat. - Plaats een vermogensmeter aan de uitgang van de objectieflens. Meet het laservermogen onder het objectief en lees de waarde van de referentievermogensmeter af (uit stap 1.6). Bereken de verhouding van het vermogen onder het objectief en bij de referentievermogensmeter.
OPMERKING: Tijdens het fotograferen kan het werkelijke laservermogen onder het objectief worden berekend op basis van de vermogensverhouding en de waarde van de referentievermogensmeter. - Haal de vermogensmeter onder het objectief vandaan.
- [Optioneel] Controleer de beperkte prestaties van het beeldvormingssysteem met fotonenopnameruis
OPMERKING: Om deze taak uit te voeren, zijn de volgende elementen nodig: 1) één fluoresceïne- of Texas Red-kleurstofpool (bijv. ~ 10 μM), 2) een fotonenteller en 3) een oscilloscoop.- Plaats het kleurstofpoolmonster onder de objectieflens van 3PM.
- Laat de objectieflens voorzichtig op de verfpoel zakken totdat de afstand kleiner is dan de werkafstand van de objectieflens.
- Plaats water tussen de lens en het afdekglas van het verfbad.
- Stel het uitgangsvermogen van de microscoop in op een kleine hoeveelheid (bijvoorbeeld <1 mW met ~ 1 MHz pulsherhalingsfrequentie) om het oppervlak van de verfpool te lokaliseren.
- Start de Live sessie van de microscoop en stel de z-locatie in op nul.
- Beweeg het objectief langzaam weg van het monster om de bovenkant van de verfpoel te bereiken (zoals aangegeven door de derde harmonische generatie (THG) geproduceerd door het afdekglas).
- Stel de z-locatie in op nul op de positie van het afdekglas.
- Verlaag het objectief iets totdat een duidelijk fluorescentiesignaal zichtbaar is in het fluorescentiekanaal.
- Sluit de uitgang van de PMT aan op een BNC splitter. Sluit de uitgangen van de verdeler aan op de fotonenteller en het beeldacquisitiesysteem.
- Stel het laservermogen in op een waarde waarbij het aantal fotonen per seconde lager is dan 5% van de laserherhalingssnelheid (bijvoorbeeld 50.000
fotonen /s wanneer een 1 MHz-laser wordt gebruikt). - Beperk het gezichtsveld tot het maximaal mogelijke met de software en zorg ervoor dat de helderheid uniform is over het hele beeld.
- Stel de framesnelheid in op 1,0 frame per seconde.
- Stel de acquisitieperiode van de fotonenteller in op t = aantal pixels per frame × pixelverblijftijd en een geschikt discriminatorniveau.
- Verzamel het aantal fotonen en pixels tegelijkertijd gedurende een gelijkwaardige periode. Om het aantal pixels te verkrijgen, verzamelt u gemiddelde pixelwaarden van de hele afbeelding, evenals de gemiddelde en standaarddeviatiewaarden.
- Herhaal stap 1.14.14 en blokkeer de excitatielaser om het aantal donkere fotonen en pixels te verkrijgen.
- Stop de Live acquisitie van de software.
- Trek de donkere tellingen (verkregen in stap 1.14.15) af van de fotonentellingen (verkregen in stap 1.14.14) en het totale aantal pixels (verkregen in stap 1.14.14).
- Deel het totale aantal in het donker afgetrokken aantal pixels door het aantal met donkere afgetrokken fotonen (verkregen in stap 1.14.17). Gebruik de verkregen waarde als de 'conversiefactor' (d.w.z. pixelwaarden/foton) van een pixelwaarde naar een aantal fotonen.
- Converteer het gemiddelde en de standaardafwijking van de pixeltellingen (verkregen in stap 1.14.14) naar fotonentellingen, d.w.z. delen door de 'conversiefactor' (verkregen in stap 1.14.18). Vergelijk de gemiddelde en standaarddeviatie van de fotonentellingen. Zorg ervoor dat de standaarddeviatie ongeveer gelijk is aan de vierkantswortel van het gemiddelde van het aantal fotonen als de prestaties van het beeldvormingssysteem dicht bij de opnameruislimiet liggen.
- [Optioneel] Controleer de signaaldetectie-efficiëntie van de microscoop.
- Volg stappen 1.14.1-1.1-1.14.17 om de prestaties van de microscoop en de signaaldetectie-efficiëntie te testen om het aantal fotonen te verkrijgen. Maak voor stap 1.14.15 een blancomonster gemaakt van het oplosmiddel voor de kleurstof en verkrijg het aantal fotonen voor het blanco monster met de laser aan en met hetzelfde vermogen als voor de verfpoule. Trek de blancotellingen af van de fotonentellingen uit de kleurstofpool om de fluorescentiefotonentellingen te verkrijgen.
- Gebruik de bekende 3P-doorsneden van fluoresceïne of Texas Red10,22 en Eq. (1) (met een effectieve NA om de vulling van de achteropening correct te verklaren) om de verwachte fotonentellingen te berekenen en vergelijk vervolgens de berekende waarde met de fotonentellingen die experimenteel zijn gemeten. Noteer zowel het aantal fotonen in het laboratoriumnotitieblok als testresultaten voor de microscoop voor toekomstige referenties.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de berekende en gemeten waarden dicht bij elkaar liggen (bijvoorbeeld binnen een factor 2). Dergelijke kwantitatieve tests van het systeem zijn bijzonder nuttig om consistente beeldvormingsprestaties in de loop van de tijd te garanderen.
2. Visbereiding voor 15u
OPMERKING: Draag handschoenen en een laboratoriumjas voor deze procedure. Kies de volwassen zebravis volgens het experiment. Voltooi de volledige voorbereiding (stappen 2.1 tot 2.7) binnen ~ 15 min.
- Bereid een petrischaaltje met ~0,5 cm 2% hoogsmeltpunt agar. Snijd een rechthoekig gat in de agar langer en iets breder dan de vis. Gebruik was om dunne buizen (voor perfusie van water in de bek van de vis) aan de petrischaal te bevestigen met één uiteinde in de rechthoek. Gebruik was om slangen met een grotere diameter (voor het verwijderen van water) aan de rand van de petrischaal te bevestigen.
- Kies vis voor het experiment. Verdoof de vis met 0,2 mg/ml tricaïne-oplossing (pH 7,2) in de oplossing van Hank totdat de vis volledig niet meer reageert en diep verdoofd is.
- Leg de vis op zijn kant op een natte spons. Injecteer met behulp van een microsyringe retro-orbitaal 3 μL pancuroniumbromide (0,4 μg/μL in Hank's oplossing) om de vis te verlammen. Plaats de vis kort in de oplossing van Hank om ervoor te zorgen dat deze volledig verlamd is.
- Leg de vis met de zijkant naar boven in de petrischaal met de kop naar de buis. Gebruik een tang om de slang te manipuleren, open voorzichtig de bek van de vis en schuif de slang in de mond. Schuif de vis voorzichtig naar de slang zodat de slang aan de achterkant van de bek van de vis komt te staan.
- Droog de agar snel maar voorzichtig rond de vis en verwijder het water bovenop de vis. Doop een klein stukje laboratoriumweefsel in laboratoriumlijm en leg het weefsel op de agar aan beide zijden van de vis en over de rug van de vis caudaal naar de kieuwen.
OPMERKING: Duw niet op de vis en oefen geen druk uit. Pas op dat u geen lijm op de kieuwen krijgt. - Breng een kleine druppel bupivacaïne direct op het oppervlak van het hoofd aan om de vis te verdoven tijdens het afbeelden in het gebied waar de laser contact zal maken met de huid.
- Breng de petrischaal met de vis naar de microscoop en vul deze met viswater. Sluit de slang aan op een waterpomp om systeemwater met 2 ml /min in de bek van de vis te pompen en verwijder tegelijkertijd de perfusieoplossing met dezelfde snelheid uit de schotel. Zorg ervoor dat het water wordt voorzien van zuurstof met een bubbler en wordt opgewarmd tot ~ 30 °C met een aquariumverwarmer.
OPMERKING: De vis is nu klaar voor beeldvorming. Controleer de gezondheid van de vis door de bloedstroom in het signaal van de derde harmonische generatie (THG) te controleren tijdens het afbeelden (zie rubriek 4.1). 3P-beeldvorming moet ook compatibel zijn met meer geavanceerde visbereidingen zoals die worden gebruikt in 2P-beeldvorming om het hoofd te fixeren en lichaamsbewegingen mogelijk te maken tijdens beeldvorming tijdens virtual reality23. Deze volledig niet-invasieve beeldvorming vermijdt de noodzaak van schedelverwijdering zoals typisch is in andere studies van gewervelde dieren en is een stap in de richting van het minimaliseren van invasief onderzoek en bijbehorende pijn.
3. Muisvoorbereiding voor 15u
OPMERKING: Draag handschoenen, chirurgisch masker en laboratoriumjas tijdens de volgende procedures. Kies de muislijn op basis van het experiment. De muis moet vóór de operatie onder een licht-donkercyclus van 12:12 uur worden gehuisvest. De hele operatie (stappen 3.2-3.11) is aseptisch en alle chirurgische hulpmiddelen moeten vóór gebruik worden gesteriliseerd. De craniotomie duurt ~1 uur.
- Plaats een donutvormige (4,5-6,5 mm diameter) coverslip en een coverslipschijf (5 mm diameter) op schone parafilm. Gebruik een naald om een kleine hoeveelheid optische lijm aan te brengen om de donutvormige coverslip op de coverslip-schijf te lijmen. Laat de schijf-donut coverslip op de parafilm onder ultraviolet licht gedurende 10-20 minuten uitharden. Verwijder de volledige schijf-donut coverslip van de parafilm en gebruik een pincet om overtollige lijm en 70% ethanol weg te krabben om vuil te verwijderen.
OPMERKING: De coverslips zijn ~0,17 mm dik. De donutvormige coverslip wordt gebruikt om de juiste druk op de hersenen uit te oefenen voor chronische beeldvorming. - Verdoof de muis met 3% isofluraan en 20% O2 gasmengsel in een inductiekamer. Weeg de muis. Plaats de muis in buikligging op een verwarmingskussen. Stel de temperatuur van het verwarmingskussen in op ~37 °C.
- Bevestig de boventanden in het mondgat van een stereotaxisch apparaat met de plaatsing van een verdovingsmasker. Bevestig de oorstaven aan de oren. Behoud anesthesie met 2% isofluraan en 20% O2 gasmengsel tijdens de operatie.
OPMERKING: Pas de concentratie isofluraan aan door de reactie van de muis te controleren. Controleer het anesthesieniveau door de ademhalingsfrequentie te bekijken (~ 1 Hz voor diepe slaap) en de voeten te knijpen om te controleren op een reactie vóór de operatie. - Breng oogzalf aan op de ogen voor smering. Sluit de oogleden. Doe alle operatielampjes aan. Subcutaan injecteren ketoprofen, dexamethason en glycopyrrolaat op basis van het lichaamsgewicht van de muis vóór de operatie.
OPMERKING: De medicijndoses zijn respectievelijk 2 mg / ml, 0,1 mg / ml en 0,1 mg / ml voor ketoprofen, dexamethason en glycopyrrolaat. De injectievolumes voor ketoprofen, dexamethason en glycopyrrolaat zijn afhankelijk van het lichaamsgewicht en zijn respectievelijk 2,5 μL / g, 2 μL / g en 2 μL / g. - Verwijder haar op de kruin van het hoofd en in de buurt van de oren.
- Knip zoveel mogelijk haar met een schaar of een tondeuse en verwijder het geknipte haar van de operatieplaats.
- Breng een geschikte hoeveelheid ontharingscrème aan. Wacht 1 min.
- Verwijder haar en crème met een wattenstaafje gedrenkt in zoutoplossing.
- Herhaal stap 3.5.2 en 3.5.3 totdat het haar volledig is verwijderd.
- Breng 5% povidon-jodiumoplossing en vervolgens 70% ethanol op de huid aan om het gebied te reinigen. Herhaal het proces drie keer.
- Geef een subcutane injectie van atropine (dosis op basis van lichaamsgewicht, 0,02-0,05 mg / kg) op het hoofd. Wacht 1 min.
- Snijd de huid op de kruin van het hoofd om de schedel bloot te leggen. Zorg ervoor dat het bregmapunt en het lambdapunt beide zichtbaar zijn. Lijm het resterende huidweefsel aan de rand van de schedel met behulp van biocompatibele lijm om te voorkomen dat boorstof onder de huid binnendringt (wat een immuunrespons kan opwekken).
- Gebruik een chirurgische marker om een cirkel met een diameter van 5 mm over het betreffende gebied te tekenen. Kies bijvoorbeeld het midden van het gebied ~ 2,5 mm lateraal en 2 mm caudaal naar de bregma, die het grootste deel van de somatosensorische cortex en de visuele cortex bedekt.
- Boor langzaam langs de cirkel en breng zoutoplossing aan om de schedel te hydrateren wanneer je halverwege klaar bent. Vertraag de boorsnelheid voor de laatste helft en bedek de schedel met zoutoplossing voordat u de schedel verwijdert. Open de schedel voorzichtig met een tang en breng een klein stukje steriel gelschuim gedrenkt in zoutoplossing aan om eventuele bloedingen in de hersenen onmiddellijk te stoppen. Houd de hersenen gehydrateerd door zoutoplossing te gebruiken.
- Breng een druppel zoutoplossing aan op de zijkant van de voorbereide schijf-donut coverslip tegenover het hersenweefsel. Plaats het uitstekende schijfgedeelte van de schijf-donutdeksels in het schedelvenster. Gebruik een lange staaf die door het stereotaxische apparaat wordt vastgehouden om het schijfgedeelte van het schedelvenster van de coverslip voorzichtig op het hersenoppervlak te drukken, zodat het donutgedeelte de schedel stevig bedekt. Droog het gebied rond de schijf-donut coverslip met een wattenstaafje.
- Breng een laag biocompatibele lijm aan onder de donutvormige rand. Breng een laag tandcementmengsel aan onder en rond het donutgedeelte van de schijf-donutdekselslip. Breng nog een laag lijm aan boven het tandcement. 5% glucose (dosis op basis van lichaamsgewicht, 10 μL/g) kan tijdens de operatie elk uur subcutaan worden geïnjecteerd om dierlijke energie te leveren.
- Sluit het anesthesiesysteem af. Laat de muis los van het stereotactische apparaat. Breng de muis onmiddellijk over naar een op maat gemaakt compact stereotactisch apparaat, met een verwarmingspad bij ~ 37 ° C en een anesthesieapparaat.
- Plaats de muis in een buikligging op het verwarmingskussen van het aangepaste compacte stereotaxische apparaat. Stel de temperatuur in op ~37 °C. Bevestig de boventanden in het mondgat van het stereotactische apparaat en de oorstaven aan de oren van de muis. Doe de verdovingsbuizen aan en onderhoud de anesthesie met 1,5% isofluraan en 20% O2 gasmengsel.
OPMERKING: De muis is nu klaar voor beeldvorming. Houd de muis verdoofd tijdens de volgende beeldvormingsprocedures. Pas de concentratie isofluraan aan door de reactie van de muis te controleren.
4. Intravitale beeldvorming in de hersenen van vissen en muizen
- Intravitale beeldvorming in het brein van de zebravis
OPMERKING: Om de hersenen van de vissen onder de objectieflens goed te lokaliseren, wordt een ccd-camera (secondary charge-coupled device) gebruikt op hetzelfde pad als het excitatielicht voor widefield-beeldvorming.- Stel de microscoop in en kalibreer het vermogen (zoals beschreven in sectie 1).
- Plaats een lage vergroting (meestal 4x) objectief op de microscoop.
- Leg de petrischaal met de vis en de buisjes onder de microscoop.
- Gebruik een LED-lichtbron (light-emitting diode) om de petrischaal te verlichten.
- Open de cameramodus van de beeldacquisitiesoftware (afbeelding 2).
- Klik op Live.
- Kies kanaal A aan de rechterkant van het scherm.
- Pas de histograminstellingen aan om de afbeelding duidelijk te zien.
OPMERKING: Deze moeten indien nodig worden bijgewerkt. - Stel de motorinstelling op de motorcontroller in op Base.
- Laat het doel zakken totdat de vis zichtbaar is.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de objectieflens geen fysiek contact maakt met het hoofd. - Plaats het midden van de viskop in het midden van het gezichtsveld.
- Beweeg het objectief omhoog en weg van de viskop.
- Vervang de objectieflens met lage vergroting door de lens met hoge NA-objectief voor 15.00 uur.
OPMERKING: De lens met lage vergroting en de lens met hoge NA-objectief hoeven niet parfocaal te zijn, maar moeten dichtbij genoeg zijn om ervoor te zorgen dat de vis zich binnen het gezichtsveld van de lens met hoge NA-objectief bevindt. - Laat de objectieflens langzaam zakken en zorg ervoor dat het objectief geen fysiek contact maakt met het hoofd. Stop in de CCD-camerasoftware met het bewegen van het objectief wanneer de bovenkant van het hoofd zichtbaar is. Stel de z-locatie in op 0 μm.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de objectieflens zitten wanneer u een waterdompelobjectief gebruikt. - Schakel de LED-lichtbron uit en sluit het donkere gordijn rond het systeem.
- Stel de beeldverwerkingssoftware in op de Multiphoton GG-modus voor 3P-beeldvorming en stel het vermogen onder de objectieflens in op minder dan 1 mW (met ~ 1 MHz pulsherhalingsfrequentie).
- Wijzig de motorinstellingsknop van Basis in Objectief op de motorcontroller.
- Doe de lichten in de kamer uit.
- Schakel de PMT's in en open de 3PM excitatiebronsluiter. Zorg ervoor dat er een omtrek van het bot verschijnt in het fluorescentiesignaalkanaal als gevolg van autofluorescentie en in het THG-signaalkanaal als gevolg van THG van het bot (figuur 2C).
- Voer beeldvorming uit op verschillende diepten door de vermogensniveaus te verhogen wanneer u dieper beeldgeeft.
- Intravitale beeldvorming in het muizenbrein
OPMERKING: Injecteer elk uur 5% glucose in de verdoofde muis tijdens het afbeelden; de dosis is gebaseerd op het lichaamsgewicht (10 μL/g).- Stel de beeldverwerkingssoftware in op de Multiphoton GG-modus voor 3P-beeldvorming en stel het vermogen onder de objectieflens in op minder dan 1 mW (met ~ 1 MHz pulsherhalingsfrequentie).
OPMERKING: Zorg ervoor dat het operatievenster loodrecht op de objectieflens wordt geplaatst om aberratie te verminderen. De fijnafstelling wordt uitgevoerd door het stereotaxische apparaat te kantelen. - Beweeg de objectieflens dicht bij het venster en breng water aan tussen het objectief en het schedelvenster; stel de aswaarden van alle motoren in op nul.
OPMERKING: Lichtabsorptie in H2O bij ~ 1.700 nm is groot, wat het laservermogen van ~ 1.700 nm aanzienlijk vermindert na een diepte van ~ 1-2 mm water. Gebruik voor ~ 1.700 nm excitatie D2O, dat een veel kleinere absorptie heeft bij 1.700 nm, voor wateronderdompeling om de absorptie door water te verminderen. - Klik op de knop Live in de beeldacquisitiesoftware en open PMT-kanalen, bijvoorbeeld één fluorescentiesignaalkanaal en één THG-signaalkanaal. Pas de PMT-versterking en het achtergrondniveau indien nodig aan.
- Beweeg langzaam de objectieflens omhoog om het raamoppervlak te lokaliseren door het THG-kanaal te bewaken vanuit de grote bloedvaten en het glasoppervlak van het venster. Pas indien nodig de vensterstand aan (zie de opmerking in stap 4.2.12). Nul de motoren om het oppervlak van de hersenen te definiëren.
- Voer beeldvorming uit en pas het vermogensniveau aan op basis van de beelddiepte.
- Stel de beeldverwerkingssoftware in op de Multiphoton GG-modus voor 3P-beeldvorming en stel het vermogen onder de objectieflens in op minder dan 1 mW (met ~ 1 MHz pulsherhalingsfrequentie).
Representative Results
De succesvolle afronding van dit protocol zal resulteren in een goed uitgelijnde microscoop met optimale lichtparameters (bijv. pulsduur, NA) en dierlijke preparaten die geschikt zijn voor in vivo 3PM. De in de handel verkrijgbare 3P-opstelling bestaat uit geschikte spiegels en lenzen voor zowel ~ 1.300 nm als ~ 1.700 nm; daarom is er geen verandering in de optica nodig wanneer de excitatiegolflengte wordt geschakeld tussen 1.300 nm en 1.700 nm. Als de lenzen in een 3P-opstelling geen geschikte coating hebben voor 1.300 en 1.700 nm, moeten deze worden vervangen door geschikte lenzen om laservermogensverlies te verminderen. Met de geoptimaliseerde 3PM en de juiste diervoorbereiding kunnen in vivo fluorescentie- en THG-beelden met een hoog contrast diep in de hersenen worden verzameld.
Figuur 3 toont representatieve 3P-beelden van intacte volwassen zebravissen. Hoge resolutie, niet-invasieve en diepe beeldvorming van genetisch gelabelde neuronen in het hersenen van volwassen zebravissen wordt bereikt met behulp van 3PM. Hoewel beeldvorming in het telencephalongebied is gemeld in de hersenen van volwassen zebravissen met behulp van 2PM 24,25,26,27, biedt 3PM toegang tot het volledige telencephalon en regio's die uitdagender of onmogelijk te observeren zijn met behulp van andere technieken. De verdeling van cellagen in het optische tectum en cerebellum kan worden waargenomen in figuur 3C. Bij een succesvolle beeldvormingssessie is het bot zichtbaar in het THG-kanaal en neuronen zichtbaar in het fluorescentiekanaal. Voor beeldvorming van volwassen zebravissen werd de camerafunctie van de microscoop gebruikt om de vis te lokaliseren (figuur 3A). Deze stap is niet nodig voor beeldvorming van muizenhersenen, omdat het glazen venster groot genoeg is om de hersenen gemakkelijk toegankelijk te maken. Hoge resolutie structurele beelden van volwassen zebravis hersenen werden verkregen met behulp van het systeem beschreven in de vorige secties. De schedel is te zien in het THG-kanaal (figuur 3B), dat helpt bij het navigeren door de hersenen en het vinden van het bovenste oppervlak. Zoals waargenomen in figuur 3C, zijn neuronen te onderscheiden met een hoge signaal-achtergrondverhouding (SBR) diep in het volwassen brein. Het weefsel boven de hersenen is zichtbaar in het fluorescentiekanaal als gevolg van autofluorescentie.
Figuur 4 toont meerkleurige 3P-afbeeldingen van GCaMP6s-gelabelde neuronen (groen) en Texas Red-gelabelde bloedvaten (rood) samen met THG (blauw) signalen in het volwassen muizenbrein met 1.340 nm excitatie10. De beelden zijn gereproduceerd uit eerder werk10. In figuur 4 werd de pulsenergie bij focus op ~ 1,5 nJ in de gehele diepte gehouden om voldoende fluorescentie- en THG-signalen te verkrijgen, en het maximale gemiddelde laservermogen was ~ 70 mW. De pulsduur werd aangepast tot ~ 60 fs en de effectieve NA was ~ 0,8. Met optimalisatie van de 3PM-opstelling werden met succes contrastrijke beelden verkregen tot op 1,2 mm van het hersenoppervlak, in het CA1 hippocampusgebied (figuur 4A,B). Figuur 4C,D toont Ca2+ activiteitssporen van GCaMP6s-gelabelde neuronen op een diepte van 750 μm voor een opnamesessie van 10 minuten, met een hoge opnamegetrouwheid.
Als de excitatielaser verkeerd is uitgelijnd, kan niet-uniformiteit in signaalhelderheid over het gezichtsveld worden waargenomen. Bovendien, als de laserparameters, zoals de pulsduur, de excitatiepulsenergie bij focus en de effectieve NA, niet zijn geoptimaliseerd, zal het THG-beeld van de visschedel of het craniotomievenster van het muizenbrein niet zichtbaar zijn en / of een hoge excitatiepulsenergie vereisen (bijv. >2 nJ / puls bij focus). Daarom kunnen de THG-signalen aan het hersenoppervlak worden gebruikt als een indicator voor een geoptimaliseerde 3PM-opstelling voordat met deep-tissue imaging wordt begonnen.
Figuur 1: Schematische illustratie van een opstelling om 15.00uur. De golflengte van de excitatielaser is ingesteld op ~1.300 nm of ~1.700 nm, output van de idlerpoort van de NOPA. De prisma-paar compressor en de Si-plaatcompressor worden gebruikt voor respectievelijk de ~ 1.300 nm en ~ 1.700 nm laser om de excitatielaserpuls vooraf te chirpen. De ~1.300 nm en ~1.700 nm laserstralen kunnen worden geschakeld met flipperspiegels. De signaalpoort van de NOPA wordt gebruikt om het triggersignaal te verkrijgen. Een halve golfplaat en een PBS worden gebruikt om het excitatievermogen te regelen. De fluorescentie en THG worden gedetecteerd door GaAsP PMT's. Geschikte combinaties van dichroïsche spiegels en bandpassfilters worden gebruikt om de fluorescentie- en THG-signalen te scheiden. Afkortingen: 3PM = drie-fotonenmicroscopie; NOPA = niet-collineaire optische parametrische versterker; PBS = polariserende bundelsplitser; THG = derde-harmonische generatie; DAQ = data-acquisitie; PMT = fotomultiplicatorbuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve screenshots voor intravitale beeldvorming bij vissen (protocolsectie 4.1). (A) Cameramodusweergave van de beeldacquisitiesoftware met 4x objectieve lens op zijn plaats. De belangrijkste kenmerken van de software zijn als volgt beschreven en genummerd: 1. Beeldmodus van de beeldacquisitiesoftware. De modusopties zijn Camera, Multiphoton en Multiphoton GG. Voor witlichtbeelden met CCD-camera wordt de cameramodus gekozen. 2. Als u op de Live-knop klikt, wordt de camera ingeschakeld (of PMT's als deze in multifoton-opties zijn) en kan een realtime weergave van de microscoop worden waargenomen. 3. Op het tabblad Capture Setup worden de gewenste beeldparameters (vermogen, locatie, diepte) ingesteld. 4. Op het tabblad Vastleggen wordt een maplocatie toegewezen voor de afbeeldingen die moeten worden opgeslagen. De beeldvorming kan in dit tabblad worden gestart. 5. De Z Control-instelling regelt de diepte van de beeldvorming door de z-trapsmotor te verplaatsen. 6. Representatief beeld van een zebraviskop. De rostrale kant van het hoofd bevindt zich aan de linkerkant. (B) Representatieve weergave van de cameramodus met 25x objectieflens. (C) Representatieve weergave van de multifotonen GG-modus met het THG-beeld van het beeld in (B). Afkortingen: CCD = charge-coupled device; PMT = fotomultiplicatorbuis; THG = derde-harmonische generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van het volwassen zebravisbrein verkregen met de beeldacquisitiesoftware. (A) Cameramodusbeeld van volwassen zebraviskop verkregen met een 4x objectieve lens. De bovenkant van het beeld is de rostrale richting. De OT-lobben en CB zijn geschetst. (B) Representatief beeld verkregen in multifoton GG-modus met een 25x objectieflens met het THG-beeld van (A). (C) Fluorescentiebeelden van volwassen zebravishersenen op het snijpunt van het cerebellum en het optische tectum waar GFP tot expressie komt in cytoplasma van neuronen in verschillende diepten. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: OT = optic tectam; CB = cerebellum; THG = derde-harmonische generatie; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Multicolor 3PM van GCaMP6s-gelabelde neuronen (groen), Texas Red-gelabelde bloedvaten (rood) en derde harmonische generatie (blauw) bij 1.340 nm excitatie in het muizenbrein. (A) Z-stack beelden tot 1.200 μm van het hersenoppervlak met een gezichtsveld van 270 x 270 μm (512 x 512 pixels per frame). Het laservermogen werd gevarieerd afhankelijk van de beelddiepte om ~ 1,5 nJ pulsenergie bij de focus te behouden. Het maximale gemiddelde vermogen onder de doelstelling was 70 mW. (B) Geselecteerde 2D-beelden op verschillende beelddiepten. (C) Activiteitsregistratieplaats op 750 μm onder de dura met een gezichtsveld van 270 x 270 μm (256 x 256 pixels). (D) Spontane hersenactiviteit sporen geregistreerd in een wakkere muis van de gelabelde neuronen aangegeven in (C). De framerate was 8,3 Hz, met een pixel verblijftijd van 0,51 μs. De laserherhalingssnelheid was 2 MHz en het gemiddelde vermogen onder de objectieflens was 56 mW. Elk spoor werd genormaliseerd tot de basislijn en low-pass gefilterd met behulp van een hammingvenster van 0,72 s tijdconstante. Schaalbalken = 50 μm. Deze figuur en de figuurlegende zijn gereproduceerd uit 10. Afkorting: 3PM = drie-fotonenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effectieve dempingslengte in de neocortex van het muizenbrein. EAL (magenta-lijn) wordt berekend op basis van de weefselverstrooiing (rode lijn) en de waterabsorptie in het weefsel (blauwe lijn), uitgaande van 75% watersamenstelling. De zwarte sterren wijzen op gerapporteerde experimentele gegevens van EAL in de neocortex van het muizenbrein 3,21,28,29. Merk op dat EAL varieert in verschillende weefsels. Afkorting: EAL = effectieve dempingslengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Excitatie golflengte nm) |
Onderdompelingswater | Maximaal laservermogen (mW) |
Maximale pulsenergie bij focus* (nJ) |
Typische EAL in de muizenschors (μm) |
Beelddiepte in de cortex van de muis** (mm) |
Pulsenergie onder het doel*** (nJ) |
Maximale laserherhalingssnelheid**** (MHz) |
| 1300 | H2O of D2O |
 100 |
2 |
~ 300 | 0.8 | ~ 14 | ~ 7 |
| 1.2 | ~ 55 | ~ 2 | |||||
| 1.6 | ~ 210 | ~ 0,5 | |||||
| 2.1 | ~ 1100 | ~ 0,1 | |||||
| 1700 | D2O |
50 |
3 |
~ 400 | 0.8 | ~ 7 | ~ 7 |
| 1.2 | ~ 20 | ~ 2,5 | |||||
| 1.6 | ~ 55 | ~ 1 | |||||
| 2.1 | ~ 190 | ~ 0,3 |
Tabel 1: Typische 3P excitatie condities voor muis cortex beeldvorming.
* Met een hoge NA (~ 1,0) objectief, pulsbreedte van ~ 50 fs, en typische fluoroforen zoals fluorescerende eiwitten (bijv. GFP en RFP).
** Met de aanname dat de EAL uniform is in de gehele cortex.
Om ~1 nJ/puls bij focus te bereiken, berekend op basis van de EAL en de beelddiepte.
Berekend op basis van de pulsenergie onder het objectief en het maximale permissieve laservermogen.
Afkortingen: 3P = drie-foton; NA = numeriek diafragma; GFP = groen fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; EAL = effectieve dempingslengte.
Discussion
Dit protocol legt stapsgewijze procedures uit voor het instellen van 3P-beeldvorming met een commerciële microscoop en laserbron. In vergelijking met 2PM heeft 3PM een voordeel in toepassingen die optische toegang vereisen in de diepere gebieden, zoals in de hippocampus van de hersenen van de muis. Hoewel 3PM meestal wordt gebruikt in de neurowetenschappen, kan 3PM mogelijk worden toegepast in andere weefsels zoals lymfeklieren, botten en tumoren voor observatie van diep weefsel.
Het is belangrijk om te controleren of het beeldvormingssysteem dicht bij de opnameruislimiet presteert, wat ervoor zorgt dat de detectie- en data-acquisitie-elektronica verwaarloosbare ruis aan het beeld toevoegt na de PMT's. De onzekerheid in het aantal gedetecteerde fotonen wordt fundamenteel beperkt door fotonopnameruis. Shot-noise beperkte prestaties kunnen worden bereikt in een typische multifotonenmicroscoop met behulp van een high-gain fotodetector (bijvoorbeeld een PMT). Fotonopnameruis volgt een Poisson statistische verdeling, waarbij de standaarddeviatie van de verdeling gelijk is aan de vierkantswortel van het gemiddelde van de verdeling. Als u de prestaties van de opnameruis wilt controleren, volgt u stap 1.14 in de protocolsectie.
Om lichte demping door H2O te voorkomen, is het gebruik van D2O voor onderdompeling nuttig, met name voor ~1.700 nm excitatie. Wanneer D2O wordt gebruikt, is het essentieel om D2O elke ~ 10 minuten te vernieuwen of een groot volume D2O te gebruiken om D2O / H2O-uitwisseling tijdens beeldvorming te voorkomen. Men kan ook de D2O afdichten van de kameromgeving3. Als een wd-objectieflens (long working distance) (bijv. WD bij 4 mm of langer) wordt gebruikt voor beeldvorming, kan de dikte van de dompelvloeistof groter zijn dan 2-3 mm. De toegenomen dikte maakt H2O absorptie niet-verwaarloosbaar, zelfs bij ~1.300 nm21. Daarom kan D2O zelfs nodig zijn voor 1.300 nm 3PM bij gebruik van een lange WD-objectieflens.
Aangezien de 3P-fluorescentie-intensiteit afhankelijk is van de kubus van de excitatiepulsenergie op de focus (Eq. (1)), is het instellen van het juiste laservermogen bijzonder belangrijk om adequate 3P-fluorescentiesignalen te verkrijgen en tegelijkertijd thermische en niet-lineaire schade in levende weefsels te voorkomen. Het gemiddelde laservermogen moet onder de thermische schadedrempel worden gehouden. In het muizenbrein, bijvoorbeeld, om thermische weefselschade te voorkomen, moet het gemiddelde vermogen op het hersenoppervlak van de muis op of onder ~ 100 mW worden gehouden voor ~ 1.300 nm excitatie op een diepte van 1 mm en met een gezichtsveld (FOV) van 230 μm x 230 μm21. Evenzo moet het gemiddelde vermogen op ~ 1.700 nm op of onder ~ 50 mW op ~ 1 mm diepte en een FOV van ~ 230 μm x 230 μm (niet-gepubliceerde gegevens) worden gehouden. Verder, om excitatieverzadiging en potentiële niet-lineaire schade te voorkomen, moet de excitatiepulsenergie op 2 nJ en 3 nJ worden gehouden voor ~ 1.300 nm en ~ 1.700 nm excitatie, respectievelijk30.
Door lichtabsorptie en verstrooiing in weefsels wordt de pulsenergie bij focus verzwakt tot 1/e (~37%) na penetratie van weefsels door 1 EAL. De EAL varieert in verschillende weefsels en met de excitatiegolflengten, bijvoorbeeld in de neocortex van het muizenbrein, is de EAL ~ 300 μm en ~ 400 μm bij ~ 1.300 nm en ~ 1.700 nm, respectievelijk 3,29 (figuur 5). Om dezelfde pulsenergie scherp te houden (bijv. 1 nJ/puls) op een diepte van n EHL's, moet de oppervlaktepulsenergie daarom worden vermenigvuldigd met 1 nJ × en. Voor een snelle beeldvorming van structurele en functionele dynamica is een excitatielaser met een hoge herhalingsfrequentie (bij 1 MHz of hoger) wenselijk om een hoge frameratevan 5,6,7,10 te bereiken. De pulsenergiebehoefte en de gemiddelde laservermogenslimiet beperken echter de toepasselijke herhalingssnelheid.
Wanneer we bijvoorbeeld een matig diep gebied bij 4 EPL's (d.w.z. ~ 1,2 mm in de muizencortex met 1.300 nm excitatie) in beeld brengen, is ~ 55 nJ / puls aan het oppervlak nodig om 1 nJ / puls scherp te houden. Wanneer de gemiddelde vermogensbeperking 100 mW is, kunnen we een laserherhalingssnelheid van ~ 2 MHz toepassen. Om echter dieper te fotograferen op een diepte van 7 EPL's, is ~ 1.100 nJ / puls aan het oppervlak vereist om 1 nJ / puls scherp te houden. Ervan uitgaande dat het maximale gemiddelde vermogen 100 mW is om thermische schade te voorkomen, moet de laserherhalingssnelheid worden verlaagd tot 0,1 MHz om een 1.100 nJ / puls aan het oppervlak te bereiken. Tabel 1 geeft een overzicht van typische beeldvormingscondities in de hersenschors van muizen. Merk op dat de beelddiepten in tabel 1 ervan uitgaan dat de EAL uniform is in de gehele cortex van de muis.
Bovendien bestaat er vanwege de beperking van het laservermogen in deep-tissue 3PM een afweging tussen de framesnelheid en de grootte van de beeldpixel, wat vooral belangrijk is voor functionele beeldvorming zoals calciumbeeldvorming. De maximaal beschikbare laserherhalingssnelheid wordt op elke diepte bepaald op basis van de vereiste pulsenergie bij focus en het toepasselijke gemiddelde laservermogen zoals hierboven besproken, bijvoorbeeld 2 MHz op een diepte die overeenkomt met ~ 4 EHL's met 1.300 nm excitatie. Over het algemeen vereist beeldvorming ten minste één puls per pixel. Dienovereenkomstig wordt de minimaal beschikbare pixelverblijftijd bepaald door de laserherhalingssnelheid, bijvoorbeeld 0,5 μs / pixel met 2 MHz excitatie.
Om de hoge ruimtelijke resolutie (~1 μm in lateraal) in 3P-beelden te behouden, is het ideaal om 1 pixel in te stellen op een oppervlakte van ~1 μm2, bijvoorbeeld 256 x 256 pixels voor een FOV van 250 x 250 μm2. Daarom, om snelle beeldvorming uit te voeren met een aanzienlijk grote FOV (bijv. 250 x 250 μm2 met 256 x 256 pixels), 0,5 MHz, 1 MHz en 2 MHz pulsherhalingsfrequenties geven theoretische maximale framesnelheden van respectievelijk ~ 7,6, ~ 15 en ~ 30 frames / s. Evenzo is de optimalisatie van de laserherhalingssnelheid essentieel, afhankelijk van de doeldiepte, scansnelheid en FOV, om voldoende pulsenergie toe te passen onder de thermische schadedrempel. Om de beeldvormingssnelheid te verhogen, kan een adaptieve excitatiebron worden gebruikt om alle excitatiepulsen op de neuronen (d.w.z. interessegebieden) te concentreren door laserpulsen op aanvraag aan de neuronen te leveren31.
3PM is voordelig in vergelijking met 2PM in diepe beeldvorming in levende weefsels en door sterk verstrooiende media zoals een schedel, botten en de witte stoflaag (d.w.z. de externe capsule) van de muizenhersenen. De langere EAL en de hogere orde niet-lineaire excitatie van 3PE komt ten goede aan deep-tissue imaging. Om bijvoorbeeld GCaMP6 in de muizenschors in beeld te brengen, is het 2P-fluorescentiesignaal met 920 nm excitatie hoger dan het 3P-fluorescentiesignaal met 1.300 nm excitatie in ondiepe gebieden bij 690 μm (d.w.z. ~ 2,3 EPL's bij 1.300 nm)21. Vanwege de langere EAL bij 1.300 nm in vergelijking met 920 nm, geeft 3PE echter sterkere fluorescentie dan 2P-excitatie (2PE) op een diepte van ~ 690 μm en dieper21. Deze diepte wordt gedefinieerd als 'signaalovergangsdiepte', waarbij de fluorescentiesignaalsterkten van 2PE en 3PE identiek zijn met dezelfde herhalingsfrequentie en dezelfde maximaal toegestane gemiddelde vermogens21. De signaalovergangsdiepte is afhankelijk van de excitatiegolflengten voor 2PE en 3PE en de fluorofoor.
In de praktijk maakt 920 nm excitatie een hoger gemiddeld laservermogen mogelijk dan 1.300 nm excitatie door minder waterabsorptie. Het hogere gemiddelde vermogen van 2PE zou de signaalovergangsdiepte echter slechts met 0,9 EPL'sduwen 4. Bovendien, wanneer het monster dicht gelabeld is, heeft 3PE het extra voordeel van een veel hogere SBR. Daarom kan 3PM, zelfs voordat de crossover-lengte van het signaal wordt bereikt, beter zijn voor beeldvorming dan 2PM. Bijvoorbeeld, bij het afbeelden van de hersenen van de muis, die een volumefractie (d.w.z. labelingdichtheid) heeft van ~ 2%, 1.300 nm 3PM met 100 mW excitatievermogen presteert beter dan 920 nm 2PM met 200 mW excitatievermogen op een diepte van ~ 700 μm voor fluoresceïne.
3PM heeft ook een voordeel bij beeldvorming door een dunne maar sterk verstrooiende laag die de puntspreidingsfunctie van de excitatiestraal kan vervormen en een onscherpte-achtergrond kan genereren4. Bijvoorbeeld, door de intacte schedel van het muizenbrein lijden 2PM-beelden aan de onscherpte-achtergrond, zelfs op de ondiepe diepte van <100 μm van het hersenoppervlak13. Een vergelijkbare onscherpte-achtergrond werd waargenomen in 2PM met 1.280 nm excitatie door de witte stof in het muizenbrein32. Daarom, wanneer weefsels worden afgebeeld door troebele lagen, heeft 3PM de voorkeur boven 2PM voor beeldvorming met hoog contrast, ongeacht de labelingdichtheid.
We hebben onlangs een fantoom- en theoretische analyse van kralen gemeld waaruit blijkt dat de beelddieptelimiet van 3PM meer dan 8 EPL's33 is; 8 EOL's zijn gelijk aan ~3 mm met ~1.700 nm excitatie in de muizenschors. De momenteel beschikbare laser heeft echter niet genoeg pulsenergie om 8 EPL's in het muizenbrein te bereiken. Verdere ontwikkeling van sterkere lasers zal de huidige beelddieptegrens van 15.00 uur verleggen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub en NIH 1U01NS103516.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| 70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
| Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
| Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
| Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
| Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
| Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
| eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
| GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
| Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
| Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
| Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
| Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
| Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
| Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
| Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
| Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
| Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
| Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
| Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
| Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
| Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
| SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
| Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
| Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
| Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
| Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
| ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
| Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
| Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
| VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
| XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
- Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
- Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
- Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
- Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
- Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
- Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
- Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
- Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
- Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
- Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
- Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
- Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).
