Summary
Trefotonmikroskopi möjliggör fluorescensavbildning med hög kontrast djupt i levande biologiska vävnader, såsom mus- och zebrafiskhjärnor, med hög spatiotemporal upplösning.
Abstract
Multifotonmikroskopitekniker, såsom tvåfotonmikroskopi (2PM) och trefotonmikroskopi (3PM), är kraftfulla verktyg för djupvävnadsin vivo-avbildning med subcellulär upplösning. 3PM har två stora fördelar för djupvävnadsavbildning över 2PM som har använts i stor utsträckning i biologiska laboratorier: (i) längre dämpningslängd i spridningsvävnader genom att använda ~ 1,300 nm eller ~ 1,700 nm excitationslaser; ii) mindre generering av bakgrundsfluorescens på grund av olinjär excitation av högre ordning. Som ett resultat tillåter 3PM strukturell och funktionell avbildning med hög kontrast djupt inne i spridningsvävnader som intakt mushjärna från de kortikala skikten till hippocampus och hela framhjärnan hos vuxna zebrafiskar.
Idag är laserkällor lämpliga för 3PM kommersiellt tillgängliga, vilket möjliggör omvandling av ett befintligt tvåfoton (2P) bildsystem till ett trefotonsystem (3P). Dessutom finns flera kommersiella 3P-mikroskop tillgängliga, vilket gör denna teknik lätt tillgänglig för biologiska forskningslaboratorier. Detta dokument visar optimeringen av en typisk 3PM-inställning, särskilt inriktad på biologigrupper som redan har en 2P-inställning, och visar intravital 3D-avbildning i intakta mus- och vuxna zebrafiskhjärnor. Detta protokoll täcker det fullständiga experimentella förfarandet för 3P-avbildning, inklusive mikroskopinriktning, prechirping av ~ 1,300 och ~ 1,700 nm laserpulser, djurberedning och intravital 3P fluorescensavbildning djupt i vuxna zebrafisk- och mushjärnor.
Introduction
Inom life science har multifotonmikroskopi (MPM) tekniker, såsom 2PM och 3PM, varit kraftfulla verktyg för djup in vivo-avbildning med hög spatiotemporal upplösning och hög kontrast i spridningsvävnader. Dessutom orsakar dessa metoder mindre fotoblekning jämfört med en-foton konfokalmikroskopi 1,2,3,4. 3PM är fördelaktigt för djupare vävnadsavbildning jämfört med 2PM på grund av två huvudfunktioner: (i) användning av längre våglängdsexcitation (~ 1,300 nm eller ~ 1,700 nm) minskar vävnadsspridning, och (ii) den högre ordningens excitationsprocess (dvs fluorescenssignal beror på kuben för excitationseffekten i 3PM istället för kvadraten på excitationseffekten i 2PM) som undertrycker den oönskade bakgrundsfluorescensen3 . Följaktligen möjliggör 3PM avbildning med hög kontrast vid djupare regioner i levande vävnader som hippocampus i en intakt vuxen mushjärna 3,5,6,7,8,9,10,11 och hela framhjärnan hos vuxna zebrafiskar 12, inklusive Ca2+ aktivitetsinspelning och flerfärgade observationer. Dessutom har bilder med hög kontrast erhållits med 3PM genom de intakta skallarna på mus och vuxen zebrafisk 12,13.
Idag är excitationslaserkällor lämpliga för 3P-excitation (3PE) vid ~ 1,300 och ~ 1,700 nm kommersiellt tillgängliga. Eftersom laserskanningssystemet i huvudsak är detsamma för 2PM och 3PM, är det möjligt att konvertera en befintlig 2P-installation till en 3P-installation i biologilaboratorier med installation av en kommersiellt tillgänglig laser för 3PE. 3P-fluorescenssignalen är beroende av objektivlinsens lasereffekt, pulsvaraktighet, laserrepetitionshastighet och numerisk bländare (NA). Om man antar ett diffraktionsbegränsat fokus (dvs. objektivlinsens bakre bländare överfylls av excitationsstrålen), beskriver Eq (1) det tidsmedelvärdet fluorescensfotonflöde från brännvidden som härrör från 3PE.
(1)
Där f är laserrepetitionshastigheten, τ är laserpulsens varaktighet (full bredd vid hälften maximalt), φ är systemets insamlingseffektivitet, η är fluorescenskvanteffektiviteten, σ3 är 3P-absorptionstvärsnittet, C är fluoroforkoncentrationen, n0 är det reflekterande indexet för provmediet (t.ex. vatten), λ är excitationsvåglängden i vakuum, NA är objektivlinsens numeriska bländare, en3 är den rumsliga integrationskonstanten för brännvolymen, 
är det tidsmedelvärdet för excitation fotonflödet (fotoner / s) under objektivlinsen, z är det avbildade djupet och EAL är den effektiva dämpningslängden14. Här har vi antagit att EAL (vanligtvis > 100 μm) är mycket större än mikroskopets axiella upplösning (vanligtvis < 10 μm). Under paraxial approximation är en3 lika med 28, 114. gp(3) är excitationskällans temporala koherens i 3rd-ordningen och gp(3) är 0,41 och 0,51 för hyperbolisk-sekant-kvadrerade pulser respektive gaussiska pulser. Uppsamlingseffektiviteten φ kan uppskattas genom att ta hänsyn till fluorescensuppsamlingen av objektivlinsen, objektivlinsens transmittans, den dikroiska spegelns reflektivitet, filtrens transmittans och detektorns detektionseffektivitet (t.ex. fotomultiplikatorrör eller PMT). Eftersom 3P-fluorescensintensiteten är mycket beroende av olika parametrar krävs optimering av 3P-installationen för att maximera 3P-fluorescenssignalerna.
Detta protokoll illustrerar optimeringsprocessen för en typisk 3P-installation, vilket kommer att vara användbart särskilt för biologilaboratorier som har en 2P-installation och planerar att utöka sin kapacitet till 3P-avbildning eller för att behålla sin kommersiella 3P-installation med optimal prestanda. Denna videoartikel visar också djupvävnad 3P-avbildning i levande djurhjärnor. Det första avsnittet behandlar optimering av en typisk 3P-installation med en kommersiellt tillgänglig laserkälla och multifotonmikroskop. Det andra och tredje avsnittet beskriver zebrafisk- respektive musberedning för 3PM av neuronala strukturer och aktiviteter. Muskraniotomioperationen har tidigare rapporterats i protokollpapper samt 15,16,17. Det fjärde avsnittet visar intravital 3P-avbildning i zebrafisk- och mushjärnor.
Protocol
Alla djurförsök och inhysningsförfaranden för zebrafiskar och möss godkändes och genomfördes i enlighet med Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vägledning. Zebrafiskar och möss avlivades genom trikainlösning med hög koncentration respektive koldioxidkvävning efter experimentet.
1. Optimering av trefotonmikroskopiinställningen
OBS: Använd lasersäkerhetsglasögon för ögonskydd. Blockera laserstrålen med en strålblockerare när optik placeras eller flyttas. För att visualisera lasern, använd en infraröd tittare eller ett infrarött detektorkort.
- Slå på lasern och ställ in mittvåglängden för tomgångsutgången för den icke-kollinjära optiska parametriska förstärkaren (NOPA) på ~ 1 300 nm eller ~ 1 700 nm.
- Placera ett tunt täckglas på strålröret från signalporten på NOPA (dvs ~ 700-900 nm) för att reflektera en liten bråkdel av laserstrålen till en Si-fotodiod för att få utlösande signaler (figur 1). Placera en strålblockerare i täckglasets överföringsväg.
- Placera pulskompressorer på ljusbanan för att prechirp femtosekundlasern för att optimera pulsens varaktighet vid 15 PM. För ~ 1,300 nm stråle, placera en prisma-par kompressor18,19 (t.ex. N-SF11 prisma par). För ~ 1,700 nm laser, placera en Si-platta med ~ 3 mm i tjocklek20. Ställ in vinkeln mellan Si-plattan och laserbanan i Brewsters vinkel (~ 73,9 ° för 1 700 nm) för att maximera lasertransmittansen. Vrid Si-plattan för att uppnå Brewsters vinkel genom att minimera reflektionen.
- Placera flipperspeglar för att möjliggöra bekväm växling mellan strålledningarna ~ 1,300 nm och ~ 1,700 nm.
- Placera en halvvågplatta (t.ex. en akromatisk halvvågplatta som är lämplig för ~ 1 300 och ~ 1 700 nm) monterad på ett rotationssteg och en polariserande stråldelare (PBS) för att styra laserns intensitet. Placera en strålblockerare i PBS: s reflektionsväg.
OBS: Lasern måste passera genom PBS vinkelrätt för att uppnå ett högt utdöendeförhållande. Lasereffekten för 3PM styrs genom att rotera den halva vågplattan. - Placera ett tunt täckglas i ljusbanan efter strömregulatorn och före den optiska slutaren för att reflektera en liten del av laserstrålen till en effektmätare. Använd effektmätaren som en "referenseffektmätare" för att beräkna lasereffekten under målet under avbildning (se steg 1.12).
- Rikta in laserbanan genom att justera speglarna för att sprida strålen in i 3PM-systemet.
- Mät strålstorleken vid positionen för målets bakre öppning med hjälp av en knivsegg på ett översättningssteg och en effektmätare. Se till att strålstorleken inte är för liten eller för stor.
OBS: Vanligtvis underfyller strålen något den höga NA-objektivlinsen för att uppnå hög effektgenomströmning för djup vävnadsavbildning. Till exempel hjälper en strålstorlek på ~ 10-13 mm (1 / e2) vid olympusmålets bakre bländare (~ 15 mm bakre bländardiameter) att uppnå en effektiv NA på ~ 0,7-0,9. När strålstorleken är för liten blir 3P-signalen svag och den rumsliga upplösningen förvärras på grund av den låga effektiva NA. När strålstorleken är för stor blir den maximala tillgängliga excitationseffekten under målet svag på grund av effektförlusten vid målets bakre öppning. För djupvävnadsavbildning lider marginalstrålarna också en högre förlust på grund av den längre vägen i vävnaden. - Om strålstorleken vid målets bakre bländare inte är lämplig, placera lämpliga optiska element, t.ex. konvexa linser, i laserstrålens bana för att justera strålstorleken.
OBS: Se till att laserstrålen inte är större än galvo-speglarna för att förhindra onödig strömförlust. - Placera objektivlinsen på 3PM-inställningen.
- Mät pulsens varaktighet efter målet med hjälp av en autokorrelator. Justera pulskompressorn för att uppnå kortare pulser om pulsens varaktighet är för lång (t.ex. >70 fs). Använd ~ 50-70 fs pulser för 3PM och en Michelson-interferometer placerad mellan lasern och målet för att ge fördröjningen för autokorrelationsmätningar.
OBS: En fotodiod med ett korrekt spektralt svar (t.ex. en kiselfotodiod för våglängd större än 1 200 nm) placerad i fokus för målet kan bekvämt fungera som en olinjär detektor, och tvåfotonfotoströmmen från fotodioden kan användas för att erhålla autokorrelationsspåren20. Prisma-pair-kompressorn för ~ 1,300 nm kan justeras på två sätt: (1) ändra avståndet mellan de två prismorna; (2) ändra laserstrålens banlängder i prismaglaset genom att flytta prismat (erna) vinkelrätt mot prismans baslinje. Si-plattkompressorn för ~ 1 700 nm kan justeras genom att ersätta Si-plattan med en tjockare eller tunnare Si-platta. - Placera en effektmätare vid objektivlinsens utgång. Mät lasereffekten under målet och läs av referenseffektmätarens värde (från steg 1.6). Beräkna effektförhållandet under målet och vid referenseffektmätaren.
OBS: Under avbildning kan den faktiska lasereffekten under målet beräknas utifrån effektförhållandet och värdet på referenseffektmätaren. - Ta ut effektmätaren under målet.
- [Valfritt] Verifiera fotonbildsbrus begränsad prestanda för bildsystemet
OBS: För att utföra denna uppgift behövs följande element: 1) en fluorescein eller Texas Red färgämnespool (t.ex. ~ 10 μM), 2) en fotonräknare och 3) ett oscilloskop.- Placera färgämnesbassängprovet under objektivlinsen 3PM.
- Sänk försiktigt ner objektivlinsen på färgbassängen tills avståndet är mindre än objektivlinsens arbetsavstånd.
- Placera vatten mellan linsen och täckglaset i färgämnespoolen.
- Ställ in mikroskopets uteffekt på en liten mängd (t.ex. <1 mW med ~ 1 MHz pulsrepetitionshastighet) för att lokalisera ytan på färgämnespoolen.
- Starta mikroskopets live-session och ställ in z-platsen till noll.
- Flytta långsamt målet bort från provet för att nå toppen av färgämnespoolen (vilket indikeras av den tredje harmoniska generationen (THG) som produceras av täckglaset).
- Ställ in z-platsen på noll vid täckglasets läge.
- Sänk målet något tills en tydlig fluorescenssignal är synlig i fluorescenskanalen.
- Anslut utgången från PMT till en BNC-splitter. Anslut avdelarens utgångar till fotonräknaren och bildförvärvssystemet.
- Ställ in lasereffekten på ett värde där fotonantalet per sekund är lägre än 5 % av laserrepetitionshastigheten (t.ex.
50 000 fotoner/s när en 1 MHz laser används). - Minska synfältet till ett minimum med programvaran och se till att ljusstyrkan är enhetlig över hela bilden.
- Ställ in bildhastigheten på 1,0 bildrutor per sekund.
- Ställ in upptagningsperioden för fotonräknaren till t = antal pixlar per bildruta × pixel uppehållstid och en lämplig diskriminatornivå.
- Samla in fotonantalet och pixelantalet samtidigt under en motsvarande period. För att få pixelantalet samlar du in genomsnittliga pixelvärden för hela bilden samt medelvärden och standardavvikelsevärden.
- Upprepa steg 1.14.14 och blockera excitationslasern för att få det mörka fotonantalet och pixelantalet.
- Stoppa Live-förvärvet av programvaran.
- Subtrahera mörkertalet (erhållet i steg 1.14.15) från fotonantalet (erhållet i steg 1.14.14) och det totala pixelantalet (erhållet i steg 1.14.14).
- Dividera det mörker-subtraherade totala pixelantalet med det mörk-subtraherade fotonantalet (erhållet i steg 1.14.17). Använd det erhållna värdet som "omvandlingsfaktor" (dvs. pixelvärden/foton) från ett pixelvärde till ett fotonantal.
- Konvertera medelvärdet och standardavvikelsen för pixelantalet (erhållet i steg 1.14.14) till fotonantal, dvs. dividera dem med "omvandlingsfaktorn" (erhållen i steg 1.14.18). Jämför medelvärdet och standardavvikelsen för fotonantalet. Se till att standardavvikelsen är ungefär lika med kvadratroten av medelvärdet av fotonantalet om bildsystemets prestanda ligger nära skottbrusgränsen.
- [Valfritt] Verifiera mikroskopets signaldetekteringseffektivitet.
- För att testa mikroskopets prestanda och signaldetekteringseffektiviteten, följ stegen 1.14.1-1.14.17 för att få fotonantal. För steg 1.14.15, skapa ett blindprov av lösningsmedlet för färgämnet och få fotonantalet för blindprovet med lasern på och med samma effekt som för färgämnespoolen. Subtrahera de tomma räkningarna från fotonräkningarna från färgämnespoolen för att erhålla fluorescensfotonantalet.
- Använd de kända 3P-tvärsnitten av fluorescein eller Texas Red10,22 och Eq. (1) (med en effektiv NA för att ta hänsyn till den bakre bländarfyllningen korrekt) för att beräkna det förväntade fotonantalet och sedan jämföra det beräknade värdet med fotonantalet uppmätt experimentellt. Registrera båda fotonräkningarna i labbanteckningsboken som testresultat för mikroskopet för framtida referenser.
OBS: Se till att de beräknade och uppmätta värdena ligger nära varandra (t.ex. inom en faktor 2). Sådana kvantitativa tester av systemet är särskilt användbara för att säkerställa konsekvent bildprestanda över tid.
2. Fiskberedning för 3PM
OBS: Använd handskar och en labbrock för denna procedur. Välj den vuxna zebrafisken enligt experimentet. Avsluta hela beredningen (steg 2.1 till 2.7) inom ~ 15 min.
- Förbered en petriskål med ~ 0,5 cm 2% agar med hög smältpunkt. Skär ett rektangulärt hål i agar längre och något bredare än fisken. Använd vax för att fästa tunna slangar (för perfusion av vatten i fiskens mun) på petriskålen med ena änden i rektangeln. Använd vax för att fästa slangar med större diameter (för avlägsnande av vatten) på petriskålens kant.
- Välj fisk för experimentet. Bedöva fisken med 0,2 mg/ml trikainlösning (pH 7,2) i Hanks lösning tills fisken är helt svarslös och djupt sövd.
- Placera fisken på sin sida på en våt svamp. Använd en mikrosyring och injicera retroorbitalt 3 μL pankuroniumbromid (0,4 μg/μl i Hanks lösning) för att förlama fisken. Placera fisken i Hanks lösning kort för att säkerställa att den är helt förlamad.
- Placera fiskens ryggsida uppåt i petriskålen med huvudet mot slangen. Använd pincett för att manipulera slangen, öppna försiktigt fiskens mun och skjut slangen in i munnen. Skjut försiktigt fisken mot slangen så att slangen kommer att vara på baksidan av fiskens mun.
- Torka snabbt men försiktigt agar runt fisken och ta bort vattnet ovanpå fisken. Doppa en liten bit laboratorievävnad i laboratorielim och lägg vävnaden på agar på båda sidor av fisken och över fiskens rygg kaudala till gälarna.
OBS: Tryck inte på fisken och tryck inte. Var försiktig så att du undviker att få lim på gälarna. - Applicera en liten droppe bupivakain direkt på huvudets yta för att bedöva fisken under avbildning i det område där lasern kommer att komma i kontakt med huden.
- Ta med petriskålen med fisken till mikroskopet och fyll den med fiskanläggningsvatten. Anslut slangen till en vattenpump för att pumpa in systemvatten med 2 ml/min i fiskens mynning och ta samtidigt bort perfusionslösningen från skålen i samma takt. Se till att vattnet syresätts med en bubblare och värms till ~30 °C med en akvarievärmare.
OBS: Fisken är nu klar för avbildning. Övervaka fiskens hälsa genom att övervaka blodflödet i tredje harmoniska generationens (THG) signal under avbildning (se avsnitt 4.1). 3P-avbildning bör också vara kompatibel med mer sofistikerade fiskpreparat som de som används vid 2P-avbildning för att fixera huvudet och tillåta kroppsrörelser under avbildning under virtual reality23. Denna helt icke-invasiva avbildning undviker behovet av borttagning av skallen som är typiskt i andra studier av ryggradsdjur och är ett steg mot att minimera invasiv forskning och tillhörande smärta.
3. Musförberedelse för 3PM
OBS: Använd handskar, kirurgisk mask och labbrock under följande procedurer. Välj muslinjen enligt experimentet. Musen ska vara inrymd under en 12:12 h ljus-mörk cykel före operationen. Hela operationen (steg 3.2-3.11) är aseptisk och alla kirurgiska verktyg ska steriliseras före användning. Kraniotomin tar ~1 h.
- Placera en munkformad (4,5-6,5 mm diameter) täckglas och en täckskiva (5 mm diameter) på ren parafilm. Använd en nål för att applicera en liten mängd optiskt lim för att limma den munkformade täckglaset på täckglasskivan. Härda disk-munkkåpan på parafilmen under ultraviolett ljus i 10-20 min. Ta bort hela skivmunkskyddsglaset från parafilmen och använd pincett för att skrapa bort överflödigt lim och 70% etanol för att ta bort skräp.
OBS: Täckglasen är ~0,17 mm tjocka. Det munkformade täckglaset används för att applicera lämpligt tryck på hjärnan för kronisk avbildning. - Bedöva musen med 3% isofluran och 20%O2 gasblandning i en induktionskammare. Väg musen. Placera musen i ett benäget läge på en värmedyna. Ställ in temperaturen på värmedynan på ~37 °C.
- Fäst de övre tänderna i munhålet på en stereotaxisk apparat med placering av en anestesimask. Fäst öronstängerna i öronen. Behåll anestesi med 2% isofluran och 20%O2 gasblandning under operationen.
OBS: Justera koncentrationen av isofluran genom att övervaka musens svar. Kontrollera anestesinivån genom att titta på andningsfrekvensen (~ 1 Hz för djup sömn) och klämma i fötterna för att kontrollera om det finns någon reaktion före operationen. - Applicera ögonsalva på ögonen för smörjning. Stäng ögonlocken. Slå på alla operationslampor. Injicera subkutant ketoprofen, dexametason och glykopyrrolat baserat på musens kroppsvikt före operationen.
OBS: Läkemedelsdoserna är 2 mg / ml, 0,1 mg / ml och 0,1 mg / ml för ketoprofen, dexametason respektive glykopyrrolat. Injektionsvolymerna för ketoprofen, dexametason och glykopyrrolat beror på kroppsvikt och är 2,5 μl/g, 2 μl/g respektive 2 μl/g. - Ta bort hår på huvudets krona och nära öronen.
- Klipp så mycket hår som möjligt med sax eller en hårklippare och ta bort det klippta håret från operationsområdet.
- Applicera en lämplig mängd hårborttagningskräm. Vänta i 1 min.
- Ta bort hår och grädde genom att använda en bomullspinne indränkt i saltlösning.
- Upprepa steg 3.5.2 och 3.5.3 tills håret har tagits bort helt.
- Applicera 5% povidon-jodlösning och sedan 70% etanol på huden för att rengöra området. Upprepa processen tre gånger.
- Ge en subkutan injektion av atropin (dos baserad på kroppsvikt, 0,02-0,05 mg/kg) på huvudet. Vänta i 1 min.
- Skär huden på huvudets krona för att exponera skallen. Se till att bregmapunkten och lambdapunkten båda är exponerade. Limma den återstående hudvävnaden på kanten på skallen med hjälp av biokompatibelt lim för att undvika att borrdamm tränger in under huden (vilket kan framkalla ett immunsvar).
- Använd en kirurgisk markör för att rita en cirkel med en diameter på 5 mm över det intressanta området. Välj till exempel mitten av området ~ 2,5 mm lateralt och 2 mm kaudalt till bregma, som täcker det mesta av den somatosensoriska cortexen och den visuella cortexen.
- Borra långsamt längs cirkeln och applicera saltlösning för att återfukta skallen när du är halvvägs klar. Sänk borrhastigheten under den sista halvan och täck skallen med saltlösning innan du tar bort skallen. Öppna skallen försiktigt med pincett och applicera en liten bit steril gelfoam blöt i saltlösning för att omedelbart stoppa blödning i hjärnan. Håll hjärnan hydratiserad med saltlösning.
- Applicera en droppe saltlösning på sidan av den förberedda disk-munkkåpan mot hjärnvävnaden. Placera den utskjutande skivdelen av skivmunkkåpan i kranialfönstret. Använd en lång stång som hålls av stereotaxiska apparaten för att försiktigt trycka skivdelen av täckglaset kranialfönstret på hjärnytan, så att munkdelen tätt täcker skallen. Torka området runt skivmunken med en bomullspinne.
- Applicera ett lager biokompatibelt lim under den munkformade kanten. Applicera ett lager tandcementblandning under och runt munkdelen av disk-munkkåpan. Applicera ytterligare ett lager lim ovanför tandcementet. 5% glukos (dos baserad på kroppsvikt, 10 μL/g) kan injiceras subkutant varje timme under operationen för att ge djurenergi.
- Stäng av anestesisystemet. Släpp musen från den stereotaktiska apparaten. Överför musen omedelbart till en anpassad kompakt stereotaktisk apparat, med en värmedyna vid ~ 37 °C och en anestesiapparat.
- Placera musen i ett benäget läge på värmedynan på den anpassade kompakta stereotaxiska apparaten. Ställ in temperaturen på ~37 °C. Fäst de övre tänderna i munhålet på den stereotaktiska apparaten och öronstängerna i musens öron. Sätt på anestesirören och behåll anestesi med 1,5% isofluran och 20%O2-gasblandning.
OBS: Musen är nu redo för avbildning. Håll musen sövd under följande bildbehandlingsprocedurer. Justera koncentrationen av isofluran genom att övervaka musens svar.
4. Intravital avbildning i fisk- och mushjärnor
- Intravital avbildning i zebrafiskhjärnan
OBS: För att korrekt lokalisera fiskhjärnan under objektivlinsen används en sekundär laddningskopplad enhet (CCD) -kamera på samma väg som excitationsljuset för vidfältsavbildning.- Ställ in mikroskopet och kalibrera effekten (enligt beskrivningen i avsnitt 1).
- Placera ett mål med låg förstoring (vanligtvis 4x) på mikroskopet.
- Placera petriskålen som innehåller fisken och rören under mikroskopet.
- Använd en lysdiod (LED) ljuskälla för att belysa petriskålen.
- Öppna kameraläget för bildförvärvsprogrammet (bild 2).
- Klicka på Live.
- Välj kanal A till höger på skärmen.
- Justera histograminställningarna för att se bilden tydligt.
OBS: Dessa måste uppdateras efter behov. - Ställ in motorinställningen på motorstyrenheten på Bas.
- Sänk målet tills fisken är synlig.
OBS: Se till att objektivlinsen inte ger någon fysisk kontakt med huvudet. - Placera mitten av fiskhuvudet i mitten av synfältet.
- Flytta målet uppåt och bort från fiskhuvudet.
- Byt ut objektivlinsen med låg förstoring mot objektivlinsen med hög NA för 3PM.
OBS: Linsen med låg förstoring och den höga NA-objektivlinsen behöver inte vara parfokala utan måste vara tillräckligt nära för att säkerställa att fisken ligger inom synfältet för den höga NA-objektivlinsen. - Sänk långsamt objektivlinsen och se till att målet inte ger någon fysisk kontakt med huvudet. I CCD-kameraprogramvaran slutar du flytta målet när toppen av huvudet är synligt. Ställ in z-platsen på 0 μm.
OBS: Se till att det inte finns några luftbubblor under objektivlinsen när du använder ett vattenfördjupningsmål. - Stäng av LED-ljuskällan och stäng den mörka gardinen runt systemet.
- Ställ in programvaran för bildinsamling på Multiphoton GG-läge för 3P-avbildning och ställ in effekten under objektivlinsen till mindre än 1 mW (med ~ 1 MHz pulsrepetitionshastighet).
- Ändra motorinställningsknappen från Bas till Mål på motorstyrenheten.
- Släck lamporna i rummet.
- Slå på PMT: erna och öppna 3PM excitationskällans slutare. Se till att en kontur av benet visas i fluorescenssignalkanalen på grund av autofluorescens och i THG-signalkanalen på grund av BENETS THG (figur 2C).
- Utför avbildning på olika djup genom att öka effektnivåerna vid djupare avbildning.
- Intravital avbildning i mushjärnan
OBS: Injicera 5% glukos i den sövda musen varje timme under avbildning; dosen baseras på kroppsvikt (10 μl/g).- Ställ in programvaran för bildinsamling på Multiphoton GG-läge för 3P-avbildning och ställ in effekten under objektivlinsen till mindre än 1 mW (med ~ 1 MHz pulsrepetitionshastighet).
OBS: Se till att operationsfönstret är placerat vinkelrätt mot objektivlinsen för att minska avvikelser. Finjustering utförs genom att luta stereotaxiska apparaten. - Flytta objektivlinsen nära fönstret och applicera vatten mellan målet och kranialfönstret; ställ in axelvärden för alla motorer till noll.
OBS: Ljusabsorptionen iH2Ovid ~ 1 700 nm är stor, vilket avsevärt minskar lasereffekten på ~ 1 700 nm efter ett djup på ~ 1-2 mm vatten. För ~ 1 700 nm excitation, användD2O, som har mycket mindre absorption vid 1 700 nm, för nedsänkning av vatten för att minska absorptionen av vatten. - Klicka på Live-knappen i bildförvärvsprogrammet och öppna PMT-kanaler, t.ex. en fluorescenssignalkanal och en THG-signalkanal. Justera PMT-förstärkningen och bakgrundsnivån efter behov.
- Flytta långsamt upp objektivlinsen för att lokalisera fönsterytan genom att övervaka THG-kanalen från de stora blodkärlen och fönsterglasytan. Justera fönsterorienteringen (se anmärkningen i steg 4.2.12) om det behövs. Nollställ motorerna för att definiera hjärnans yta.
- Utför avbildning och justera effektnivån efter bilddjupet.
- Ställ in programvaran för bildinsamling på Multiphoton GG-läge för 3P-avbildning och ställ in effekten under objektivlinsen till mindre än 1 mW (med ~ 1 MHz pulsrepetitionshastighet).
Representative Results
Det framgångsrika slutförandet av detta protokoll kommer att resultera i ett korrekt anpassat mikroskop med optimala ljusparametrar (t.ex. pulsvaraktighet, NA) och djurpreparat som är lämpliga för in vivo 3PM. Den kommersiellt tillgängliga 3P-installationen består av lämpliga speglar och linser för både ~ 1,300 nm och ~ 1,700 nm; Därför krävs ingen förändring i optiken när excitationsvåglängden växlas mellan 1 300 nm och 1 700 nm. Om linserna i en 3P-installation inte har en lämplig beläggning för 1 300 och 1 700 nm måste dessa bytas ut mot lämpliga för att minska lasereffektförlusten. Med den optimerade 3PM och korrekt djurberedning kan in vivo fluorescens och THG-bilder med hög kontrast samlas djupt inne i hjärnan.
Figur 3 visar representativa 3P-bilder av intakt vuxen zebrafisk. Högupplöst, icke-invasiv och djup avbildning av genetiskt märkta nervceller i den vuxna zebrafiskhjärnan uppnås med hjälp av 3PM. Även om avbildning i telencephalonregionen har rapporterats i den vuxna zebrafiskhjärnan med 2PM 24,25,26,27, möjliggör 3PM tillgång till hela telencephalon och regioner som är mer utmanande eller omöjliga att observera med andra tekniker. Fördelningen av cellskikt i optisk tectum och cerebellum kan observeras i figur 3C. I en lyckad avbildningssession är benet synligt i THG-kanalen och neuroner synliga i fluorescenskanalen. För avbildning av vuxna zebrafiskar användes mikroskopets kamerafunktion för att lokalisera fisken (figur 3A). Detta steg är inte nödvändigt för mus hjärnavbildning eftersom glasfönstret är tillräckligt stort för att göra hjärnan lättillgänglig. Högupplösta strukturella bilder av vuxen zebrafiskhjärna erhölls med hjälp av det system som beskrivs i föregående avsnitt. Skallen ses i THG-kanalen (figur 3B), vilket hjälper till att navigera i hjärnan och hitta den övre ytan. Som observerats i figur 3C kan neuroner särskiljas med ett högt signal-till-bakgrundsförhållande (SBR) djupt i den vuxna hjärnan. Vävnaden ovanför hjärnan är synlig i fluorescenskanalen på grund av autofluorescens.
Figur 4 visar flerfärgade 3P-bilder av GCaMP6s-märkta nervceller (gröna) och Texas Red-märkta blodkärl (röda) tillsammans med THG (blå) signaler i den vuxna mushjärnan med 1 340 nm excitation10. Bilderna är återgivna från tidigare verk10. I figur 4 bibehölls pulsenergin vid fokus vid ~ 1,5 nJ i hela djupet för att erhålla tillräcklig fluorescens och THG-signaler, och den maximala genomsnittliga lasereffekten var ~ 70 mW. Pulsvaraktigheten justerades till ~60 fs och den effektiva NA var ~0,8. Med optimering av 3PM-inställningen erhölls bilder med hög kontrast framgångsrikt ner till 1,2 mm från hjärnytan, i CA1 hippocampus-regionen (figur 4A, B). Figur 4C, D visar Ca2+ aktivitetsspår av GCaMP6s-märkta neuroner på ett djup av 750 μm under en 10 minuters inspelningssession, vilket visar hög inspelningstrohet.
Om excitationslasern är feljusterad kan ojämnhet i signalljusstyrka över synfältet observeras. Dessutom, om laserparametrarna, såsom pulsvaraktighet, excitationspulsenergin vid fokus och den effektiva NA, inte är optimerade, kommer THG-bilden från fiskskallen eller kraniotomifönstret i mushjärnan inte att vara synlig och / eller kräver hög excitationspulsenergi (t.ex. >2 nJ / puls vid fokus). Därför kan THG-signalerna vid hjärnytan användas som en indikator för en optimerad 3PM-inställning innan djupvävnadsavbildning påbörjas.
Bild 1: Schematisk illustration av en installation kl. 15. Excitationslaserns våglängd är inställd på ~1 300 nm eller ~1 700 nm, utgång från NOPA:s tomgångsport. Prisma-pair-kompressorn och Si-plattkompressorn används för lasern ~1 300 nm respektive ~1 700 nm för att prechirp excitationslaserpulsen. Laserstrålarna ~1 300 nm och ~1 700 nm kan växlas med flipperspeglar. Signalporten för NOPA används för att erhålla utlösningssignalen. En halv vågplatta och en PBS används för att styra excitationseffekten. Fluorescensen och THG detekteras av GaAsP PMTs. Lämpliga kombinationer av dikroiska speglar och bandpassfilter används för att separera fluorescens- och THG-signalerna. Förkortningar: 3PM = trefotonmikroskopi; NOPA = icke-kollinjär optisk parametrisk förstärkare; PBS = polariserande stråldelare; THG = tredje harmoniska generationen; DAQ = datainsamling; PMT = fotomultiplikatorrör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Representativa skärmbilder för intravital avbildning i fisk (protokollavsnitt 4.1). (A) Kameralägesvy av bildförvärvsprogrammet med 4x objektivlins på plats. Viktiga funktioner i programvaran beskrivs och numreras enligt följande: 1. Bildläge för bildförvärvsprogramvaran. Lägesalternativen är Kamera, Multifoton och Multifoton GG. För avbildning av vitt ljus med CCD-kamera väljs kameraläge . 2. Klicka på Live-knappen slår på kameran (eller PMTs om det finns multifoton-alternativ), och en realtidsvy av mikroskopet kan observeras. 3. På fliken Capture Setup ställs önskade bildparametrar (effekt, plats, djup) in. 4. På fliken Capture tilldelas en mappplats för bilderna som ska sparas. Bildbehandlingen kan startas på den här fliken. Inställningen Z-kontroll styr bilddjupet genom att flytta z-stegsmotorn. 6. Representativ bild av ett zebrafiskhuvud. Den rostrala sidan av huvudet är till vänster. (B) Representativ bild av kameraläget med 25x objektiv. (C) Representativ vy av Multiphoton GG-läge som innehåller THG-bilden av bilden som ses i (B). Förkortningar: CCD = laddningskopplad enhet; PMT = fotomultiplikatorrör; THG = tredje harmoniska generationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av den vuxna zebrafiskhjärnan som förvärvats med programvaran för bildförvärv. Överst på bilden är rostralriktningen. OT-loberna och CB beskrivs. (B) Representativ bild som förvärvats i Multiphoton GG-läge med en 25x objektivlins som innehåller THG-bilden av (A). (C) Fluorescensbilder av vuxen zebrafiskhjärna i skärningspunkten mellan lillhjärnan och den optiska tectum där GFP uttrycks i cytoplasma av neuroner i olika djup. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: OT = optisk tectam; CB = lillhjärnan; THG = tredje harmoniska generationen; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flerfärgad 3PM av GCaMP6s-märkta neuroner (grön), Texas Red-märkta blodkärl (röd) och tredje harmoniska generationen (blå) vid 1 340 nm excitation i mushjärnan. Lasereffekten varierades beroende på bilddjupet för att bibehålla ~1,5 nJ pulsenergi i fokus. Maximal genomsnittlig effekt enligt målet var 70 mW. (B) Utvalda 2D-bilder på olika bilddjup. (C) Aktivitetsinspelningsplats vid 750 μm under dura med ett synfält på 270 x 270 μm (256 x 256 pixlar). (D) Spontana hjärnaktivitetsspår registrerade i en vaken mus från de märkta neuronerna som anges i (C). Bildhastigheten var 8,3 Hz, med en pixel uppehållstid på 0,51 μs. Laserrepetitionshastigheten var 2 MHz och den genomsnittliga effekten under objektivlinsen var 56 mW. Varje spår normaliserades till sin baslinje och lågpassfiltrerades med hjälp av ett hammingfönster på 0,72 s tidskonstant. Skalstänger = 50 μm. Denna figur och figurförklaringen återges från 10. Förkortning: 3PM = trefotonmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Effektiv dämpningslängd i mushjärnans neocortex. EAL (magentalinjen) beräknas utifrån vävnadsspridningen (röd linje) och vattenabsorptionen i vävnaden (blå linje), förutsatt 75% vattenkomposition. De svarta stjärnorna indikerar rapporterade experimentella data om EAL i neocortexen i mushjärnan 3,21,28,29. Observera att EAL varierar i olika vävnader. Förkortning: EAL = effektiv dämpningslängd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Excitation våglängd (nm) |
Nedsänkningsvatten | Maximal lasereffekt (mW) |
Maximal pulsenergi vid fokus* (nJ) |
Typisk EAL i musbarken (μm) |
Bilddjup i musbarken** (mm) |
Pulsenergi under målet*** (nJ) |
Maximal laserrepetitionshastighet**** (MHz) |
| 1300 | H2OellerD2O |
 100 |
2 |
~300 | 0.8 | ~14 | ~7 |
| 1.2 | ~55 | ~2 | |||||
| 1.6 | ~210 | ~0,5 | |||||
| 2.1 | ~1100 | ~0,1 | |||||
| 1700 | D2O |
50 |
3 |
~400 | 0.8 | ~7 | ~7 |
| 1.2 | ~20 | ~2,5 | |||||
| 1.6 | ~55 | ~1 | |||||
| 2.1 | ~190 | ~0,3 |
Tabell 1: Typiska 3P excitationsförhållanden för musbarkavbildning.
* Med ett högt NA (~ 1.0) mål, pulsbredd på ~ 50 fs och typiska fluoroforer som fluorescerande proteiner (t.ex. GFP och RFP).
** Med antagandet att EAL är enhetlig i hela cortex.
För att uppnå ~ 1 nJ / puls vid fokus, beräknat från EAL och bilddjupet.
Beräknat från pulsenergin under målet och den maximala tillåtna lasereffekten.
Förkortningar: 3P = tre foton; NA = numerisk bländare; GFP = grönt fluorescerande protein; RFP = rött fluorescerande protein; EAL = effektiv dämpningslängd.
Discussion
Detta protokoll förklarar steg-för-steg-procedurer för att ställa in 3P-avbildning med ett kommersiellt mikroskop och laserkälla. Jämfört med 2PM har 3PM en fördel i applikationer som kräver optisk åtkomst i de djupare regionerna, till exempel i mushjärnan hippocampus. Även om 3PM mest används inom neurovetenskap, kan 3PM potentiellt appliceras i andra vävnader såsom lymfkörtlar, ben och tumörer för djupvävnadsobservation.
Det är viktigt att verifiera att bildsystemet presterar nära skottbrusgränsen, vilket säkerställer att detekterings- och datainsamlingselektroniken bidrar med försumbart brus till bilden efter PMT: erna. Osäkerheten i antalet upptäckta fotoner begränsas i grunden av fotonbrus. Skottbrusbegränsad prestanda kan uppnås i ett typiskt multifotonmikroskop med hjälp av en fotodetektor med hög förstärkning (t.ex. en PMT). Fotonskottsbrus följer en Poisson-statistisk fördelning, där standardavvikelsen för fördelningen är lika med kvadratroten av medelvärdet av fördelningen. För att verifiera den begränsade prestandan för skottbrus, följ steg 1.14 i protokollavsnittet.
För att undvika ljusdämpning medH2Oär det bra att användaD2Oför nedsänkning, särskilt för ~ 1,700 nm excitation. När D2O används är det viktigt att uppdatera D2O var ~ 10: e minut eller använda en stor volym D2O för att undvika D2O / H2O-utbyte under avbildning. Man kan också täta D2O från rumsmiljön3. Om en objektivlins med långt arbetsavstånd (WD) (t.ex. WD vid 4 mm eller längre) används för avbildning kan nedsänkningsvätskans tjocklek överstiga 2-3 mm. Den ökade tjockleken gör attH2O-absorptioneninte är försumbar även vid ~1 300 nm21. Därför kan D2O vara nödvändigt även för 1 300 nm 3PM när du använder en lång WD-objektivlins.
Eftersom 3P-fluorescensintensiteten beror på kuben för excitationspulsenergin vid fokus (Eq. (1)), är det särskilt viktigt att ställa in lämplig lasereffekt för att erhålla adekvata 3P-fluorescenssignaler samtidigt som man undviker termisk och olinjär skada i levande vävnader. Den genomsnittliga lasereffekten bör hållas under tröskeln för termisk skada. I mushjärnan, till exempel, för att undvika termisk vävnadsskada, bör den genomsnittliga effekten på musens hjärnyta hållas på eller under ~ 100 mW för ~ 1 300 nm excitation på ett djup av 1 mm och med ett synfält (FOV) på 230 μm x 230 μm21. På samma sätt bör den genomsnittliga effekten vid ~ 1 700 nm hållas på eller under ~ 50 mW vid ~ 1 mm djup och ett synfält på ~ 230 μm x 230 μm (opublicerade data). Vidare, för att undvika excitationsmättnad och potentiell olinjär skada, bör excitationspulsenergin hållas vid 2 nJ och 3 nJ för ~ 1 300 nm respektive ~ 1 700 nm excitation30.
På grund av ljusabsorption och spridning i vävnader dämpas pulsenergin vid fokus till 1/e (~ 37%) efter penetrering av vävnader med 1 EAL. EAL varierar i olika vävnader och med excitationsvåglängderna, t.ex. i neocortexen i mushjärnan, är EAL ~ 300 μm och ~ 400 μm vid ~ 1 300 nm respektive ~ 1 700 nm 3,29 (figur 5). För att hålla samma pulsenergi i fokus (t.ex. 1 nJ/puls) på ett djup av n EEL måste ytpulsenergin multipliceras med 1 nJ × en. För snabb avbildning av strukturell och funktionell dynamik är en excitationslaser med hög repetitionshastighet (vid 1 MHz eller högre) önskvärd för att uppnå en hög bildhastighet 5,6,7,10. Pulsenergibehovet och den genomsnittliga lasereffektgränsen begränsar dock den tillämpliga repetitionshastigheten.
När vi till exempel avbildar ett måttligt djupt område vid 4 EALL (dvs ~ 1,2 mm i musbarken med 1 300 nm excitation) krävs ~ 55 nJ / puls vid ytan för att hålla 1 nJ / puls i fokus. När den genomsnittliga effektbegränsningen är 100 mW kan vi tillämpa en ~ 2 MHz laserrepetitionshastighet. Men för att avbilda djupare på ett djup av 7 AEL krävs ~1 100 nJ/puls vid ytan för att bibehålla 1 nJ/puls vid fokus. Förutsatt att den maximala medeleffekten är 100 mW för att undvika termisk skada, bör laserrepetitionshastigheten minskas till 0,1 MHz för att uppnå en 1 100 nJ / puls vid ytan. Tabell 1 sammanfattar typiska avbildningsförhållanden i musens hjärnbark. Observera att avbildningsdjupen i tabell 1 förutsätter att EAL är enhetligt i hela musbarken.
Dessutom, på grund av lasereffektbegränsningen i djupvävnad 3PM, finns det en avvägning mellan bildhastigheten och bildpixelstorleken, vilket är särskilt viktigt för funktionell avbildning som kalciumavbildning. Den maximala tillgängliga laserrepetitionshastigheten bestäms vid varje djup baserat på den erforderliga pulsenergin vid fokus och den tillämpliga genomsnittliga lasereffekten som diskuterats ovan, t.ex. 2 MHz vid ett djup motsvarande ~ 4 EALs med 1 300 nm excitation. I allmänhet kräver avbildning minst en puls per pixel. Följaktligen bestäms den minsta tillgängliga pixelvistelsetiden av laserrepetitionshastigheten, t.ex. 0,5 μs / pixel med 2 MHz excitation.
För att behålla den höga rumsliga upplösningen (~ 1 μm i sidled) i 3P-bilder är det idealiskt att ställa in 1 pixel till ett område på ~ 1 μm2, t.ex. 256 x 256 pixlar för ett synfält på 250 x 250 μm2. För att utföra snabb avbildning med ett betydligt stort synfält (t.ex. 250 x 250 μm2 med 256 x 256 pixlar) ger därför 0,5 MHz, 1 MHz och 2 MHz pulsrepetitionshastigheter teoretiska maximala bildhastigheter på ~ 7,6, ~ 15 respektive ~ 30 bilder / s. På samma sätt är optimeringen av laserrepetitionshastigheten avgörande, beroende på måldjup, skanningshastighet och synfält, för att applicera tillräcklig pulsenergi under tröskeln för termisk skada. För att öka bildhastigheten kan en adaptiv excitationskälla användas för att koncentrera alla excitationspulser på neuronerna (dvs. regioner av intresse) genom att leverera laserpulser på begäran till neuronerna31.
3PM är fördelaktigt jämfört med 2PM i djupavbildning i levande vävnader och genom mycket spridda medier som en skalle, ben och det vita substansskiktet (dvs. den yttre kapseln) i mushjärnan. Ju längre EAL och den högre ordningens olinjära excitation av 3PE gynnar djupvävnadsavbildning. Till exempel, för att avbilda GCaMP6 i musbarken, är 2P fluorescenssignal med 920 nm excitation högre än 3P fluorescenssignal med 1 300 nm excitation i grunda områden vid 690 μm (dvs ~ 2,3 EEL vid 1 300 nm)21. Men på grund av den längre EAL vid 1,300 nm jämfört med 920 nm, ger 3PE starkare fluorescens än 2P excitation (2PE) på ett djup av ~ 690 μm och djupare21. Detta djup definieras som "signalövergångsdjup", vid vilket fluorescenssignalstyrkorna för 2PE och 3PE är identiska med samma repetitionshastighet och samma maximala tillåtna medelkrafter21. Signalkorsningsdjupet beror på excitationsvåglängderna för 2PE och 3PE och fluoroforen.
I praktiken tillåter 920 nm excitation högre genomsnittlig lasereffekt än 1 300 nm excitation på grund av mindre vattenabsorption. Den högre genomsnittliga effekten för 2PE skulle dock bara driva signalövergångsdjupet med 0,9 EALs4. Dessutom, när provet är tätt märkt, har 3PE den ytterligare fördelen med mycket högre SBR. Därför, även innan du når signalkorsningslängden, kan 3PM vara bättre för avbildning än 2PM. Till exempel, när man avbildar musens hjärnkärl, som har en volymfraktion (dvs. märkningstäthet) på ~ 2%, 1,300 nm 3PM med 100 mW excitationseffekt överträffar 920 nm 2PM med 200 mW excitationseffekt på ett djup av ~ 700 μm för fluorescein.
3PM har också en fördel vid avbildning genom ett tunt men mycket spridande skikt som kan förvränga excitationsstrålens punktspridningsfunktion och generera en oskärpa bakgrund4. Till exempel, genom den intakta skallen i mushjärnan, lider 2PM-bilder av oskärpa bakgrunden även på det grunda djupet av <100 μm från hjärnytan13. En liknande defokuseringsbakgrund observerades vid 14-tiden med 1 280 nm excitation genom den vita substansen i mushjärnan32. Därför, när vävnader avbildas genom grumliga lager, är 3PM att föredra framför 2PM för högkontrastavbildning oavsett märkningstäthet.
Vi rapporterade nyligen en pärlfantom och teoretisk analys som visar att bilddjupsgränsen på 3PM är över 8 EALs33; 8 EEL motsvarar ~3 mm med ~1 700 nm excitation i musbarken. Den för närvarande tillgängliga lasern har dock inte tillräckligt med pulsenergi för att uppnå 8 ECL i mushjärnan. Vidareutveckling av starkare lasrar kommer att driva den nuvarande bilddjupsgränsen på 3PM.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub och NIH 1U01NS103516.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5% Povidone-iodine | Amazon | NDC 67818-155-32 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| 70% Ethanol | Thermo Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Aceptical cleaning of surgical areas |
| Agarose | Sigma | A4718-256 | Preparing zebrafish chamber |
| Atropine | Cornell Veterinary Care | ||
| Bergamo II | Thorlabs | Multiphoton Imaging Microscope | |
| Bupivacaine | Cornell Veterinary Care | ||
| Dexamethasone | Cornell Veterinary Care | ||
| Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) | Potomac Photonics | Cover glass used for craniotomy | |
| eye ointment (or topical ophthalmic ointment) | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia |
| GaAsP Amplified PMT | Thorlabs | PMT2100 | PMT detector |
| Glucose | Cornell Veterinary Care | ||
| Glycopyrrolate | Cornell Veterinary Care | ||
| Heater (800 W) | Finnex | Aquarium heater for zebrafish water) | |
| Isoflurane USP 250 mL | Piramal | NDC 66794-0013-25 | For anesthesia of mice |
| Ketoprofen | Cornell Veterinary Care | ||
| Kimwipes | Kimtech | Laboratory tissue for preparing zebrafish | |
| Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle | WPI | NANOFIL + NF36BV | Syringe and needle for injection of pancuronium bromide |
| Optical Adhesive | Norland | NOA 68 | To stick round coverslip and donut shape glass together. |
| Pancuronium Bromide | Cornell Veterinary Care | ||
| Peristaltic Pump | Elemental Science | ESI MP2 | Water pump for zebrafish setup |
| Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) | Elemental Science | MP2 pump tubing | Tubing that goes in the mouth of the zebrafish |
| Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm | Electron Microscopy Sciences | 7229605 | Cover glass used for craniotomy |
| Spirit-NOPA | Spectra Physics | Tunable Optical Parametric Amplifier | |
| SR400 | Stanford Research Systems | SR400 | Photon counter |
| Standard Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S122C | Power detector |
| Sterilized phosphate buffered saline (PBS) | Millipore Sigma | SKU 806552-500ml | Used during mouse brain surgery |
| Surgical drape | Dynarex disposable towel drape | 4410 | For aceptical mouse surgery |
| Thin strip boxing wax | Corning Rubber Co., Inc. | Holding tubing in place in zebrafish chamber | |
| ThorImage | Thorlabs | Image acquisition software | |
| Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) | MP | 103106 | Zebrafish anesthesia and euthanasia |
| Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) | Tygon | Tubing for water flow for zebrafish preparation | |
| VaporGuard | VetEquip | 931401 | For recycling isoflurane |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish. |
| XLPLN25XWMP2 | Olympus | Multiphoton Excitation Dedicated Objective |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
- Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
- Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
- Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
- Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
- Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
- Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
- Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
- Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
- Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
- Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
- Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
- Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
- Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
- Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
- Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
- Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
- Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
- Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
- Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
- Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).
