Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dypvev tre-foton fluorescens mikroskopi i intakt mus og sebrafisk hjerne

Published: January 13, 2022 doi: 10.3791/63213
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3, 1,4, 1, 1, 1, 2, 1
1School of Applied and Engineering Physics, Cornell University, 2Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 3College of Veterinary Medicine, Cornell University, 4Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

Tre-foton mikroskopi muliggjør fluorescensavbildning med høy kontrast dypt i levende biologisk vev, som mus- og sebrafiskhjerner, med høy romlig oppløsning.

Abstract

Multifotonmikroskopiteknikker, for eksempel tofotonmikroskopi (14:00) og trefotonmikroskopi (15:00), er kraftige verktøy for dypvevs in vivo-avbildning med subcellulær oppløsning. 15:00 har to store fordeler for dypvevsavbildning over 14:00 som har blitt mye brukt i biologilaboratorier: (i) lengre dempingslengde i spredningsvev ved å bruke ~ 1300 nm eller ~ 1700 nm eksitasjonslaser; (ii) mindre bakgrunnsfluorescensgenerering på grunn av høyere ordens ikke-lineær eksitasjon. Som et resultat tillater 15:00 strukturell og funksjonell avbildning med høy kontrast dypt inne i spredningsvev som intakt musehjerne fra kortikale lag til hippocampus og hele forebrain av voksen sebrafisk.

I dag er laserkilder som er egnet for 15:00 kommersielt tilgjengelige, noe som muliggjør konvertering av et eksisterende to-foton (2P) bildebehandlingssystem til et tre-foton (3P) system. I tillegg er flere kommersielle 3P-mikroskoper tilgjengelige, noe som gjør denne teknikken lett tilgjengelig for biologiforskningslaboratorier. Dette dokumentet viser optimaliseringen av et typisk 3PM-oppsett, spesielt rettet mot biologigrupper som allerede har et 2P-oppsett, og demonstrerer intravital 3D-avbildning i intakt mus og voksne sebrafiskhjerner. Denne protokollen dekker den fullstendige eksperimentelle prosedyren for 3P-avbildning, inkludert mikroskopjustering, prechirping av ~ 1300 og ~ 1700 nm laserpulser, dyreforberedelse og intravital 3P fluorescensavbildning dypt i voksne sebrafisk og musehjerner.

Introduction

I life science har multifotonmikroskopiteknikker (MPM), som 14:00 og 15:00, vært kraftige verktøy for dyp in vivo-avbildning med høy romlig oppløsning og høy kontrast i spredningsvev. I tillegg forårsaker disse metodene mindre fotobleaching sammenlignet med en-foton konfikal mikroskopi 1,2,3,4. 15:00 er fordelaktig for dypere vevsavbildning sammenlignet med 14:00 på grunn av to hovedtrekk: (i) ansettelse av lengre bølgelengdeeksitasjon (~ 1300 nm eller ~ 1700 nm) reduserer vevsspredning, og (ii) eksitasjonsprosessen med høyere rekkefølge (dvs. fluorescenssignalet avhenger av kuben til eksitasjonskraften i 15:00 i stedet for kvadratet av eksitasjonskraften i 14:00) som undertrykker uønsket bakgrunnsfluorescens3 . Følgelig muliggjør 3PM høykontrastavbildning i dypere områder i levende vev som hippocampus i en intakt voksen musehjerne 3,5,6,7,8,9,10,11 og hele forebrain av voksen sebrafisk12, inkludert Ca 2+ aktivitetsregistrering og flerfargede observasjoner. Videre har høykontrastbilder blitt oppnådd med 15:00 gjennom de intakte hodeskallene av mus og voksen sebrafisk12,13.

I dag er eksitasjonslaserkilder egnet for 3P-eksitasjon (3PE) ved ~ 1300 og ~ 1700 nm kommersielt tilgjengelige. Siden laserskanningssystemet i hovedsak er det samme for 14:00 og 15:00, er det mulig å konvertere et eksisterende 2P-oppsett til et 3P-oppsett i biologilaboratorier med installasjon av en kommersielt tilgjengelig laser for 3PE. 3P-fluorescenssignalet er avhengig av lasereffekten, pulsvarigheten, laserrepetisjonshastigheten og den numeriske blenderåpningen (NA) til objektivlinsen. Forutsatt at et diffraksjonsbegrenset fokus (dvs. den bakre blenderåpningen til objektivlinsen er overfylt av eksitasjonsstrålen), beskriver Eq (1) den tidsgjennomsnittte fluorescensfotonfluksen fra brennvidden som følge av 3PE.

Equation 1 (1)

Der f er laserrepetisjonshastigheten, er τ laserpulsvarigheten (full bredde ved halv maksimum), φ er systemets oppsamlingseffektivitet, η er fluorescens kvanteeffektiviteten, σ3 er absorpsjonskrysssnittet, C er fluoroforonsentrasjonen, n0 er den reflekterende indeksen til prøvemediet (f.eks. vann), λ er eksitasjonsbølgelengden i vakuum, vakuum , NA er den numeriske blenderåpningen til objektivet, en3 er den romlige integrasjonskonstanten til brennviddet, Equation 1 er den tidsgjennomsnittte eksitasjonsfotonfluksen (fotoner/ s) under objektivet, z er bildedybden, og EAL er den effektive dempingslengden14. Her har vi antatt at EAL (vanligvis > 100 μm) er mye større enn mikroskopets aksiale oppløsning (vanligvis < 10 μm). Under paraksial tilnærming er en3 lik 28,114. gp(3) er 3rd-order temporal sammenheng av eksitasjonskilden, og gp(3) er henholdsvis 0,41 og 0,51 for hyperbolsk-sekant-kvadred pulser og gaussiske pulser. Innsamlingseffektiviteten φ kan estimeres ved å vurdere fluorescenssamlingen ved objektivet, overføringen av objektivlinsen, reflektiviteten til det dikroiske speilet, overføringen av filtrene og detektorens deteksjonseffektivitet (f.eks. fotomultiplikatorrør eller PMT). Siden 3P-fluorescensintensiteten er svært avhengig av ulike parametere, kreves optimalisering av 3P-oppsettet for å maksimere 3P-fluorescenssignalene.

Denne protokollen illustrerer optimaliseringsprosessen til et typisk 3P-oppsett, som vil være nyttig spesielt for biologilaboratorier som har et 2P-oppsett og planlegger å utvide sin evne til 3P-avbildning eller opprettholde sitt kommersielle 3P-oppsett med optimal ytelse. Denne videoartikkelen demonstrerer også dypvevs 3P-avbildning i levende dyrehjerner. Den første delen tar for seg optimalisering av et typisk 3P-oppsett med en kommersielt tilgjengelig laserkilde og multifotonmikroskop. Den andre og tredje delen beskriver sebrafisk og muspreparat, henholdsvis for 3PM av nevronale strukturer og aktiviteter. Musekraniotomioperasjonen har tidligere blitt rapportert i protokollpapirer samt 15,16,17. Den fjerde delen demonstrerer intravital 3P-avbildning i sebrafisk og musehjerner.

Protocol

Alle dyreforsøk og boligprosedyrer for sebrafisk og mus ble godkjent og utført i samsvar med Veiledningen fra Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Sebrafisk og mus ble euthanized av høykonsentrasjon trikain løsning og karbondioksid kvælning, henholdsvis, etter eksperimentet.

1. Optimalisering av tre-foton mikroskopi oppsett

MERK: Bruk laserbriller for øyebeskyttelse. Blokker laserstrålen med en stråleblokker når optikken plasseres eller flyttes. Hvis du vil visualisere laseren, bruker du en infrarød fremviser eller et infrarødt detektorkort.

  1. Slå på laseren og still inn den midtre bølgelengden på tomgangsutgangen til den ikke-kollineære optiske parametriske forsterkeren (NOPA) på ~ 1300 nm eller ~ 1700 nm.
  2. Plasser et tynt dekselglass på strålelinjen fra signalporten til NOPA (dvs. ~700-900 nm) for å reflektere en liten brøkdel av laserstrålen til en Si-fotodiode for å oppnå utløsende signaler (figur 1). Plasser en bjelkeblokker i overføringsbanen til dekkglasset.
  3. Plasser pulskompressorer på lysbanen for å prechirp femtosecond laser for å optimalisere pulsvarigheten for 15:00. For ~1300 nm bjelke, plasser en prisme-pair kompressor18,19 (f.eks. N-SF11 prismepar). For ~1700 nm laser, plasser en Si plate på ~ 3 mm i tykkelse20. Still inn vinkelen mellom Si-platen og laserbanen i Brewsters vinkel (~73,9° i 1700 nm) for å maksimere laseroverføringen. Roter Si-platen for å oppnå Brewsters vinkel ved å minimere refleksjonen.
  4. Plasser vippespeil for å muliggjøre praktisk veksling mellom bjelkelinjene ~1300 nm og ~1700 nm.
  5. Plasser en halv bølgeplate (f.eks. en akromatisk halvbølgeplate egnet for ~ 1300 og ~ 1700 nm) montert på et rotasjonsstadium og en polariserende strålesplitter (PBS) for å kontrollere laserens intensitet. Plasser en bjelkeblokkering i refleksjonsbanen til PBS.
    MERK: Laseren må passere gjennom PBS vinkelrett for å oppnå et høyt utryddelsesforhold. Lasereffekten for 15:00 styres ved å rotere halvbølgeplaten.
  6. Plasser et tynt dekselglass i lysbanen etter strømkontrolleren og før den optiske lukkeren for å reflektere en liten brøkdel av laserstrålen til en kraftmåler. Bruk kraftmåleren som en "referansestrømmåler" for å beregne lasereffekten under målet under bildebehandling (se trinn 1.12).
  7. Juster laserbanen ved å justere speilene for å forplante strålen inn i 3PM-systemet.
  8. Mål bjelkestørrelsen i posisjonen til bakåpningen til målet ved hjelp av en knivkant på et oversettelsesstadium og en kraftmåler. Påse at bjelkestørrelsen ikke er for liten eller for stor.
    MERK: Vanligvis underfyller strålen den høye NA objektive linsen for å oppnå høy effekt gjennomstrømning for dypvevsavbildning. For eksempel bidrar en bjelkestørrelse på ~ 10-13 mm (1/e2) på baksiden av Olympus-målet (~ 15 mm rygg blenderåpningsdiameter) til å oppnå en effektiv NA på ~ 0,7-0,9. Når bjelkestørrelsen er for liten, blir 3P-signalet svakt, og den romlige oppløsningen forverres på grunn av den lave effektive NA. Når bjelkestørrelsen er for stor, blir den maksimale tilgjengelige eksitasjonskraften under målet svak på grunn av strømtapet på baksiden av målet. For dypvevsavbildning lider de marginale strålene også et høyere tap på grunn av den lengre banen i vevet.
  9. Hvis strålestørrelsen på baksiden av målet ikke er hensiktsmessig, plasser passende optiske elementer, for eksempel konvekse linser, i laserstrålebanen for å justere strålestørrelsen.
    MERK: Sørg for at laserstrålen ikke er større enn galvospeilene for å forhindre unødvendig strømbrudd.
  10. Plasser objektivet på 3PM-oppsettet.
  11. Mål pulsvarigheten etter målsettingen ved hjelp av en autokorrelator. Juster pulskompressoren for å oppnå kortere pulser hvis pulsvarigheten er for lang (f.eks. >70 fs). Bruk ~50-70 fs pulser for 15:00 og et Michelson interferometer plassert mellom laseren og målet å gi forsinkelsen for autokorrelasjonsmålinger.
    MERK: En fotodiode med riktig spektral respons (f.eks. en silisiumfotodiode for bølgelengde som er større enn 1200 nm) plassert i fokus for målet, kan enkelt fungere som en ikke-lineær detektor, og den to-foton photocurrent fra fotodioden kan brukes til å oppnå autokorrelasjonssporene20. Prismeparkompressoren for ~ 1300 nm kan justeres på to måter: (1) endre avstanden mellom de to prismene; (2) endre banelengdene til laserstrålen i prismeglasset ved å flytte prismet(e) vinkelrett til grunnlinjen til prismet. Si-platekompressoren for ~ 1700 nm kan justeres ved å erstatte Si-platen med en tykkere eller tynnere Si-plate.
  12. Plasser en kraftmåler ved utgangen av objektivet. Mål laserkraften under målet og les verdien av referansestrømmåleren (fra trinn 1.6). Beregn forholdet mellom kraften under målet og ved referanseeffektmåleren.
    MERK: Under bildebehandling kan den faktiske lasereffekten under målet beregnes ut fra effektforholdet og verdien til referanseeffektmåleren.
  13. Ta ut kraftmåleren fra under målet.
  14. [Valgfritt] Kontrollere begrenset ytelse for fotonbildestøy i bildesystemet
    MERK: For å utføre denne oppgaven er følgende elementer nødvendig: 1) en fluorescein eller Texas Red fargebasseng (f.eks. ~ 10 μM), 2) en fotonteller og 3) et oscilloskop.
    1. Plasser fargebassengprøven under objektivlinsen 15:00.
    2. Senk objektivlinsen forsiktig ned på fargebassenget til avstanden er mindre enn arbeidsavstanden til objektivet.
    3. Plasser vann mellom linsen og dekselglasset i fargebassenget.
    4. Sett mikroskopets utgangseffekt til en liten mengde (f.eks. <1 mW med ~1 MHz pulsrepetisjonshastighet) for å finne overflaten av fargebassenget.
    5. Start live-økten til mikroskopet og sett z-plasseringen til null.
    6. Beveg målet langsomt bort fra prøven for å nå toppen av fargebassenget (som angitt av den tredje harmoniske generasjonen (THG) produsert av dekkglasset).
    7. Sett z-plasseringen til null i posisjonen til dekkglasset.
    8. Senk målet litt til et klart fluorescenssignal er synlig i fluorescenskanalen.
    9. Koble utgangen til AVDRAG til en BNC-splitter. Koble utgangene til skillelinjen til fotontelleren og bildeanskaffelsessystemet.
    10. Sett lasereffekten til en verdi der fotonantallet per sekund er lavere enn 5 % av laserrepetisjonshastigheten (f.eks. Equation 350 000 fotoner/s når en 1 MHz-laser brukes).
    11. Reduser synsfeltet til et minimum som er mulig med programvaren, og sørg for at lysstyrken er jevn over bildet.
    12. Sett bildefrekvensen til 1,0 bilde per sekund.
    13. Sett anskaffelsesperioden for fotontelleren til t = antall piksler per ramme × pikselbotid og et passende diskriminatornivå.
    14. Samle antall fotoner og pikselantall samtidig i en tilsvarende periode. Hvis du vil oppnå pikselantallet, samler du inn gjennomsnittlige bildepunktverdier for hele bildet, i tillegg til gjennomsnitts- og standardavviksverdiene.
    15. Gjenta trinn 1.14.14, og blokkerer eksitasjonslaseren for å oppnå det mørke fotonantallet og pikselantallet.
    16. Stopp live-oppkjøpet av programvaren.
    17. Trekk fra de mørke tellingene (oppnådd i trinn 1.14.15) fra antall fotoner (oppnådd i trinn 1.14.14) og det totale pikselantallet (oppnådd i trinn 1.14.14).
    18. Del det mørke, trukket totale pikselantallet på det mørkt trukket fotonantallet (oppnådd i trinn 1.14.17). Bruk den oppnådde verdien som konverteringsfaktor (dvs. bildepunktverdier/foton) fra en pikselverdi til et antall foton.
    19. Konverter gjennomsnittet og standardavviket for pikselantallet (oppnådd i trinn 1.14.14) til fotonantall, det vil si å dele dem med 'konverteringsfaktoren' (oppnådd i trinn 1.14.18). Sammenlign gjennomsnittet og standardavviket for fotontallene. Kontroller at standardavviket er omtrent lik kvadratroten av gjennomsnittet av fotontallene hvis bildesystemets ytelse er nær skuddstøygrensen.
  15. [Valgfritt] Kontroller signaldeteksjonseffektiviteten til mikroskopet.
    1. Hvis du vil teste mikroskopytelsen og signaldeteksjonseffektiviteten, følger du trinn 1.14.1-1.14.17 for å få fotonantall. For trinn 1.14.15, lag en tom prøve laget av løsningsmidlet for fargestoffet og få fotontallene for den tomme prøven med laseren på og med samme kraft som for fargebassenget. Trekk de tomme tellingene fra fotontallene fra fargebassenget for å oppnå fluorescensfotontallene.
    2. Bruk de kjente 3P-tverrsnittene av fluorescein eller Texas Red10,22 og Eq. (1) (med en effektiv NA for å ta hensyn til ryggåpningen som fylles riktig) for å beregne forventede fotontall og deretter sammenligne den beregnede verdien med fotontallene målt eksperimentelt. Registrer begge fotontallene i labnotatblokken som testresultater for mikroskopet for fremtidige referanser.
      MERK: Sørg for at de beregnede og målte verdiene er nær hverandre (f.eks. innenfor en faktor på 2). Slike kvantitative tester av systemet er spesielt nyttige for å sikre konsistent bildeytelse over tid.

2. Fiskeforberedelse for 15:00

MERK: Bruk hansker og en labfrakk for denne prosedyren. Velg voksen sebrafisk i henhold til eksperimentet. Fullfør hele preparatet (trinn 2.1 til 2.7) innen ~15 min.

  1. Forbered en Petri-tallerken med ~ 0,5 cm 2% høysmeltende agar. Klipp et rektangulært hull i agaren lengre og litt bredere enn fisken. Bruk voks til å feste tynne slanger (for perfusjon av vann i fiskens munn) til Petri-parabolen med den ene enden i rektangelet. Bruk voks til å feste slanger med større diameter (for fjerning av vann) til kanten av Petri-parabolen.
  2. Velg fisk for eksperimentet. Bedøv fisken med 0,2 mg/ml trikainoppløsning (pH 7,2) i Hanks løsning til fisken er helt uresponsiv og dypt bedøvet.
  3. Plasser fisken på siden på en våt svamp. Ved hjelp av en mikrosyringe injiserer retro-orbitalt 3 μL pancuroniumbromid (0,4 μg/μL i Hanks løsning) for å lamme fisken. Plasser fisken i Hanks løsning kort for å sikre at den er helt lammet.
  4. Plasser fiskens dorsale side opp i Petri-parabolen med hodet mot slangen. Bruk tang til å manipulere slangen, åpne fiskens munn forsiktig og skyv slangen inn i munnen. Skyv fisken forsiktig mot slangen slik at slangen vil være på baksiden av fiskens munn.
  5. Tørk agaren raskt, men forsiktig rundt fisken og fjern vannet på toppen av fisken. Dypp et lite stykke laboratorievev i laboratorielim og legg vevet på agaren på begge sider av fisken og over fiskens rygg caudal til gjellene.
    MERK: Ikke trykk på fisken eller legg på trykk. Pass på å unngå å bli lim på gjellene.
  6. Påfør en liten dråpe bupivacaine direkte på overflaten av hodet for å bedøve fisken under avbildning i regionen der laseren vil kontakte huden.
  7. Ta petriskålen med fisken til mikroskopet og fyll den med fiskevann. Koble slangen til en vannpumpe for å pumpe systemvann ved 2 ml/min inn i fiskens munn og fjern samtidig perfusjonsløsningen fra fatet i samme hastighet. Forsikre deg om at vannet er oksygenert med en bobler og oppvarmet til ~ 30 ° C med en akvariumvarmer.
    MERK: Fisken er nå klar for bildebehandling. Overvåk fiskens helse ved å overvåke blodstrømmen i det tredje harmoniske generasjonssignalet (THG) under avbildning (se pkt. 4.1). 3P-avbildning bør også være kompatibel med mer sofistikerte fiskepreparater som de som brukes i 2P-avbildning for å fikse hodet og tillate kroppsbevegelser mens du forestiller deg under virtuell virkelighet23. Denne helt ikke-invasive avbildningen unngår behovet for hodeskallefjerning som det er typisk i andre studier av vertebrater og er et skritt mot å minimere invasiv forskning og tilhørende smerte.

3. Mus forberedelse for 15:00

MERK: Bruk hansker, kirurgisk maske og labfrakk under følgende prosedyrer. Velg muselinjen i henhold til eksperimentet. Musen skal være plassert under en 12:12 h lys-mørk syklus før operasjonen. Hele operasjonen (trinn 3.2-3.11) er aseptisk, og alle operasjonsverktøy bør steriliseres før bruk. Kraniotomien tar ~ 1 time.

  1. Plasser en smultringformet (4,5-6,5 mm diameter) dekslerlip og en coverlip disk (5 mm diameter) på ren parafilm. Bruk en nål til å påføre en liten mengde optisk lim for å lime den smultringformede dekslen på dekslene. Herd disk-donut coverlip på parafilmen under ultrafiolett lys i 10-20 min. Fjern hele disk-donut coverlip fra parafilmen, og bruk pinsett til å skrape bort overflødig lim og 70% etanol for å fjerne rusk.
    MERK: Dekslene er ~0,17 mm tykke. Den smultringformede dekslen brukes til å påføre riktig trykk på hjernen for kronisk avbildning.
  2. Bedøv musen med 3% isofluran og 20% O2 gassblanding i et induksjonskammer. Vei musen. Plasser musen i en utsatt posisjon på en varmepute. Sett temperaturen på varmeputen til ~37 °C.
  3. Fest de øvre tennene i munnhullet til et stereotaxisk apparat med plassering av en bedøvelsesmaske. Fest ørestengene til ørene. Opprettholde anestesi med 2% isofluran og 20% O2 gassblanding under operasjonen.
    MERK: Juster konsentrasjonen av isofluran ved å overvåke musens respons. Kontroller anestesinivået ved å se på pustefrekvensen (~1 Hz for dyp søvn) og klem føttene for å se etter reaksjoner før operasjonen.
  4. Påfør øyesalve på øynene for smøring. Lukk øyelokkene. Slå på alle operasjonslysene. Subkutant injisere ketoprofen, deksametason og glykopyrrolat basert på musen kroppsvekt før operasjonen.
    MERK: Legemiddeldosene er henholdsvis 2 mg/ml, 0,1 mg/ml og 0,1 mg/ml for ketoprofen, deksametason og glykopyrrolat. Injeksjonsvolumene for ketoprofen, deksametason og glykopyrrolat avhenger av kroppsvekten og er henholdsvis 2,5 μL/g, 2 μL/g og 2 μL/g.
  5. Fjern hår på kronen av hodet og i nærheten av ørene.
    1. Klipp så mye hår som mulig med saks eller hårklipper og fjern klippet hår fra operasjonsstedet.
    2. Påfør en passende mengde depilatorisk krem. Vent i 1 min.
    3. Fjern hår og krem ved å bruke en bomullspinne gjennomvåt i saltvann.
    4. Gjenta trinn 3.5.2 og 3.5.3 til håret er helt fjernet.
    5. Påfør 5% povidon-jodoppløsning og deretter 70% etanol på huden for å rense området. Gjenta prosessen tre ganger.
  6. Gi en subkutan injeksjon av atropin (dose basert på kroppsvekt, 0,02-0,05 mg/kg) på hodet. Vent i 1 min.
  7. Klipp huden på kronen av hodet for å eksponere skallen. Pass på at både bregmapunktet og lambdapunktet er eksponert. Lim det gjenværende hudvevet på kanten til skallen ved å bruke biokompatibel lim for å unngå at borestøv kommer inn under huden (noe som kan fremkalle en immunrespons).
  8. Bruk en kirurgisk markør for å tegne en sirkel med en diameter på 5 mm over interesseområdet. Velg for eksempel midten av området ~ 2,5 mm lateral og 2 mm kaudal til bregmaen, som dekker det meste av den somatosensoriske cortex og den visuelle cortexen.
  9. Bor langs sirkelen sakte og påfør saltvann for å hydrere skallen når halvveis ferdig. Senk borehastigheten for den siste halvdelen og dekk skallen med saltvann før du fjerner skallen. Åpne skallen forsiktig med tang og påfør et lite stykke steril gelfoam gjennomvåt i saltvann for umiddelbart å stoppe blødninger i hjernen. Hold hjernen hydrert ved hjelp av saltvann.
  10. Påfør en dråpe saltvann på siden av den tilberedte disk-donut coverlip vendt mot hjernevevet. Plasser den utstående diskdelen av disk-donut-dekslene i kranialvinduet. Bruk en lang stang holdt av stereotaxic apparatet for å forsiktig trykke diskdelen av dekslene kranialvinduet på hjerneoverflaten, og sørg for at smultringdelen tett dekker skallen. Tørk området rundt disk-donut dekslenelip med en bomullspinne.
  11. Påfør et lag med biokompatibel lim under den smultringformede kanten. Påfør et lag med tannsementblanding under og rundt smultringdelen av disk-donut coverlip. Påfør et annet lag lim over tannsementen. 5% glukose (dose basert på kroppsvekt, 10 μL/ g) kan injiseres subkutant hver time under operasjonen for å gi dyreenergi.
  12. Slå av anestesisystemet. Slipp musen fra det stereotaktiske apparatet. Overfør musen til et tilpasset kompakt stereotaktisk apparat umiddelbart, med en varmepute ved ~ 37 ° C og et anestesiapparat.
  13. Plasser musen i en utsatt posisjon på varmeputen til det tilpassede kompakte stereotaxiske apparatet. Still temperaturen på ~37 °C. Fest de øvre tennene i munnhullet til stereotaktisk apparat og ørestengene til musens ører. Sett på bedøvelsesrørene, og oppretthold anestesi med 1,5% isofluran og 20% O2 gassblanding.
    MERK: Musen er nå klar for avbildning. Hold musen bedøvet under følgende bildebehandlingsprosedyrer. Juster konsentrasjonen av isofluran ved å overvåke musens respons.

4. Intravital avbildning i fisk og musehjerner

  1. Intravital avbildning i sebrafiskhjernen
    MERK: For å finne fiskehjernen riktig under objektivet, brukes et sekundært ladekoblet enhetskamera (CCD) på samme bane som eksitasjonslyset for widefield-bildebehandling.
    1. Sett opp mikroskopet og kalibrer kraften (som beskrevet i avsnitt 1).
    2. Plasser et mål med lav forstørrelse (vanligvis 4x) på mikroskopet.
    3. Plasser Petri-retten som inneholder fisken og rørene under mikroskopet.
    4. Bruk en lysdiode (LED) lyskilde for å belyse Petri-parabolen.
    5. Åpne kameramodus for bildeanskaffelsesprogramvaren (figur 2).
    6. Klikk Live.
    7. Velg kanal A på høyre side av skjermen.
    8. Juster histograminnstillingene for å se bildet tydelig.
      MERK: Disse må oppdateres etter behov.
    9. Sett motorinnstillingen på motorstyringen til Base.
    10. Senk målet til fisken er synlig.
      MERK: Pass på at objektivlinsen ikke kommer i fysisk kontakt med hodet.
    11. Plasser midten av fiskehodet i midten av synsfeltet.
    12. Flytt målet opp og bort fra fiskehodet.
    13. Bytt ut objektivet med lav forstørrelse med det høye NA-objektivet for 15:00.
      MERK: Den lave forstørrelseslinsen og den høye NA-objektivlinsen trenger ikke å være parfokal, men må være nær nok til å sikre at fisken er innenfor synsfeltet til den høye NA-objektivlinsen.
    14. Senk objektivet langsomt, og sørg for at målet ikke kommer i fysisk kontakt med hodet. I CCD-kameraprogramvaren slutter du å flytte målsettingen når toppen av hodet er synlig. Sett z-plasseringen til 0 μm.
      MERK: Pass på at det ikke er luftbobler under objektivlinsen når du bruker et mål for vanninnlevelse.
    15. Slå av LED-lyskilden og lukk den mørke gardinen rundt systemet.
    16. Sett bildeinnsamlingsprogramvaren til Multiphoton GG-modus for 3P-bildebehandling og sett strømmen under objektivlinsen til mindre enn 1 mW (med ~1 MHz pulsrepetisjonshastighet).
    17. Endre motorinnstillingsknappen fra Base til Objective på motorstyringen.
    18. Skru ned lysene i rommet.
    19. Slå på AVDRAG-ene og åpne 15:00 eksitasjonskildelukkeren. Påse at en omriss av beinet vises i fluorescenssignalkanalen på grunn av autofluorescens og i THG-signalkanalen på grunn av THG i beinet (figur 2C).
    20. Utfør bildebehandling på forskjellige dybder ved å øke effektnivået ved avbildning dypere.
  2. Intravital avbildning i musehjernen
    MERK: Injiser 5 % glukose i den bedøvede musen hver time under avbildning; dosen er basert på kroppsvekt (10 μL/g).
    1. Sett bildeinnsamlingsprogramvaren til Multiphoton GG-modus for 3P-bildebehandling og sett strømmen under objektivlinsen til mindre enn 1 mW (med ~1 MHz pulsrepetisjonshastighet).
      MERK: Kontroller at operasjonsvinduet er plassert vinkelrett på objektivlinsen for å redusere avvik. Finjustering utføres ved å vippe stereotaxisk apparat.
    2. Flytt objektivet nær vinduet og bruk vann mellom målet og kranialvinduet; sett akseverdiene for alle motorer til null.
      MERK: Lysabsorpsjon i H2O ved ~1700 nm er stor, noe som reduserer lasereffekten på ~ 1700 nm betydelig etter en dybde på ~ 1-2 mm vann. For ~1700 nm eksitasjon, bruk D2O, som har mye mindre absorpsjon ved 1700 nm, for vann nedsenking for å redusere absorpsjon med vann.
    3. Klikk på Live-knappen i bildeanskaffelsesprogramvaren og åpne PMT-kanaler, for eksempel en fluorescenssignalkanal og en THG-signalkanal. Juster PMT-forsterkningen og bakgrunnsnivået etter behov.
    4. Beveg deg sakte opp i objektivet for å finne vindusflaten ved å overvåke THG-kanalen fra de store blodkarene og vindusglassoverflaten. Juster vindusretningen (se merknaden i trinn 4.2.12) om nødvendig. Null motorene for å definere overflaten av hjernen.
    5. Utfør bildebehandling og juster effektnivået i henhold til bildedybden.

Representative Results

Vellykket fullføring av denne protokollen vil resultere i et riktig justert mikroskop med optimale lysparametere (f.eks. pulsvarighet, NA) og dyrepreparater som passer for in vivo 15:00. Det kommersielt tilgjengelige 3P-oppsettet består av passende speil og linser for både ~ 1300 nm og ~ 1700 nm; Derfor er det ikke nødvendig med noen endring i optikk når eksitasjonsbølgelengden byttes mellom 1300 nm og 1700 nm. Hvis linsene i et 3P-oppsett ikke har et passende belegg på 1300 og 1700 nm, må disse byttes ut med passende for å redusere lasereffekttapet. Med optimalisert 15:00 og riktig dyreforberedelse kan in vivo fluorescens og THG-bilder med høy kontrast samles dypt inne i hjernen.

Figur 3 viser representative 3P-bilder av intakt voksen sebrafisk. Høyoppløselig, ikke-invasiv og dyp avbildning av genetisk merkede nevroner i den voksne sebrafiskhjernen oppnås ved hjelp av 15:00. Selv om avbildning i telencephalon-regionen har blitt rapportert i den voksne sebrafiskhjernen ved hjelp av2PM 24,25,26,27, 3PM gir tilgang til hele telencephalon og regioner som er mer utfordrende eller umulige å observere ved hjelp av andre teknikker. Fordelingen av cellelag i det optiske tectum og cerebellum kan observeres i figur 3C. I en vellykket bildebehandlingsøkt er beinet synlig i THG-kanalen og nevroner synlige i fluorescenskanalen. For voksen sebrafiskavbildning ble kamerafunksjonen til mikroskopet brukt til å finne fisken (figur 3A). Dette trinnet er ikke nødvendig for musehjerneavbildning, da glassvinduet er stort nok til å gjøre hjernen lett tilgjengelig. Høyoppløselige strukturelle bilder av voksen sebrafiskhjerne ble oppnådd ved hjelp av systemet som er beskrevet i de forrige avsnittene. Skallen ses i THG-kanalen (figur 3B), som hjelper til med å navigere i hjernen og finne den øverste overflaten. Som observert i figur 3C, kan nevroner skille seg ut med et høyt signal-til-bakgrunn-forhold (SBR) dypt i den voksne hjernen. Vevet over hjernen er synlig i fluorescenskanalen på grunn av autofluorescens.

Figur 4 viser flerfargede 3P-bilder av GCaMP6s-merkede nevroner (grønn) og Texas Rødmerkede blodårer (rød) sammen med THG (blå) signaler i den voksne musehjernen med 1340 nm eksitasjon10. Bildene er gjengitt fra tidligere arbeid10. I figur 4 ble pulsenergien i fokus opprettholdt ved ~ 1,5 nJ i hele dybden for å oppnå tilstrekkelig fluorescens og THG-signaler, og maksimal gjennomsnittlig lasereffekt var ~ 70 mW. Pulsvarigheten ble justert til ~ 60 fs, og den effektive NA var ~ 0,8. Med optimalisering av 3PM-oppsettet ble bilder med høy kontrast oppnådd ned til 1,2 mm fra hjerneoverflaten, i CA1 hippocampus-regionen (figur 4A, B). Figur 4C,D viser Ca2+ aktivitetsspor av GCaMP6s-merkede nevroner på en dybde på 750 μm for en 10 min opptaksøkt, som viser høy opptaksgjengivelse.

Hvis eksitasjonslaseren er feiljustert, kan avvik i signallysstyrken over synsfeltet observeres. I tillegg, hvis laserparametrene, for eksempel pulsvarigheten, eksitasjonspulsenergien i fokus og den effektive NA, ikke er optimalisert, vil THG-bildet fra fiskeskallen eller kraniotomivinduet i musehjernen ikke være synlig og / eller krever høy eksitasjonspulsenergi (f.eks. >2 nJ / puls i fokus). Derfor kan THG-signalene på hjerneoverflaten brukes som en indikator for et optimalisert 3PM-oppsett før du starter dypvevsavbildning.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av et oppsett kl. 15.00. Bølgelengden til eksitasjonslaseren er satt til ~ 1300 nm eller ~ 1700 nm, utgang fra idlerporten til NOPA. Prismeparkompressoren og Si-platekompressoren brukes til henholdsvis ~ 1300 nm og ~ 1700 nm laser for å prechirp eksitasjonslaserpulsen. Laserstrålene ~1300 nm og ~1700 nm kan byttes med flipperspeil. Signalporten til NOPA brukes til å innhente utløsersignalet. En halv bølgeplate og en PBS brukes til å kontrollere eksitasjonskraften. Fluorescens og THG oppdages av GaAsP PMTs. Passende kombinasjoner av dikroiske speil og bandpassfiltre brukes til å skille fluorescens- og THG-signalene. Forkortelser: 15:00 = tre-foton mikroskopi; NOPA = ikke-kollineær optisk parametrisk forsterker; PBS = polariserende strålesplitter; THG = tredje harmonisk generasjon; DAQ = datainnsamling; PMT = fotomultiplikatorrør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative skjermbilder for intravital avbildning i fisk (protokolldel 4.1). (A) Kameramodusvisning av bildeanskaffelsesprogramvaren med 4x objektiv på plass. Viktige funksjoner i programvaren er skissert og nummerert som følger: 1. Bildemodus for bildeinnhentingsprogramvaren. Modusalternativene er Kamera, Multifoton og Multiphoton GG. For hvitt lysbilde med CCD-kamera er kameramodus valgt. 2. Ved å klikke på Live-knappen slås kameraet (eller PMTs hvis i multifoton alternativer), og en sanntidsvisning av mikroskopet kan observeres. 3. I kategorien Opptaksoppsett er de ønskede bildebehandlingsparametrene (strøm, plassering, dybde) angitt. 4. I Capture-fanen tilordnes en mappeplassering for bildene som skal lagres. Bildet kan startes i denne kategorien. Z Control-innstillingen styrer bildedybden ved å flytte z-trinnmotoren. 6. Representativt bilde av et sebrafiskhode. Rostralsiden av hodet er til venstre. (B) Representativ visning av kameramodus med 25x objektiv. (C) Representativ visning av Multiphoton GG-modus som inneholder THG-bildet av bildet sett i (B). Forkortelser: CCD = lade-koblet enhet; PMT = fotomultiplier rør; THG = tredje harmonisk generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative bilder av den voksne sebrafiskhjernen som er anskaffet med bildeinnhentingsprogramvaren. (A) Kameramodusbilde av voksen sebrafiskhode ervervet med en 4x objektiv linse. Toppen av bildet er rostralretningen. OT-lobene og CB er skissert. (B) Representativt bilde ervervet i Multiphoton GG-modus med et 25x objektiv som inneholder THG-bildet av (A). (C) Fluorescensbilder av voksen sebrafiskhjerne i skjæringspunktet mellom cerebellum og det optiske tectum der GFP uttrykkes i cytoplasma av nevroner i ulike dybder. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: OT = optisk tectam; CB = cerebellum; THG = tredje harmonisk generasjon; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Flerfarget 15:00 av GCaMP6s-merkede nevroner (grønn), Texas Rødmerkede blodårer (rød) og tredje harmonisk generasjon (blå) ved 1340 nm eksitasjon i musehjernen. (A) Z-stack-bilder ned til 1200 μm fra hjerneoverflaten med et synsfelt på 270 x 270 μm (512 x 512 piksler per ramme). Lasereffekten ble variert i henhold til bildedybden for å opprettholde ~ 1,5 nJ pulsenergi i fokus. Maksimal gjennomsnittlig effekt under målet var 70 mW. (B) Valgte 2D-bilder på ulike bildedybder. (C) Aktivitetsregistreringssted på 750 μm under dura med et synsfelt på 270 x 270 μm (256 x 256 piksler). (D) Spontane hjerneaktivitetsspor registrert i en våken mus fra de merkede nevronene som er angitt i (C). Bildefrekvensen var 8,3 Hz, med en pikselboetid på 0,51 μs. Laserrepetisjonshastigheten var 2 MHz, og den gjennomsnittlige effekten under objektivet var 56 mW. Hvert spor ble normalisert til grunnlinjen og lavpass filtrert ved hjelp av et hammingvindu på 0,72s tidskonstant. Skalastenger = 50 μm. Denne figuren og figurlegenden er gjengitt fra 10. Forkortelse: 15:00 = tre-foton mikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Effektiv dempingslengde i neocortex i musehjernen. EAL (magenta linje) beregnes fra vevspredning (rød linje) og vannabsorpsjon i vevet (blå linje), forutsatt 75% vannsammensetning. De svarte stjernene indikerer rapporterte eksperimentelle data fra EAL i neocortex av musehjernen 3,21,28,29. Vær oppmerksom på at EAL varierer i forskjellige vev. Forkortelse: EAL = effektiv dempingslengde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksitasjon bølgelengde
(nm)		 Nedsenking vann Maksimal lasereffekt
(mW)		 Maksimal pulsenergi i fokus*
(nJ)		 Typisk EAL i musebarken
(μm)		 Bildedybde i musebarken**
(mm)		 Pulsenergi under målet***
(nJ)		 Maksimal laserrepetisjonshastighet****
(MHz)
1300 H2O eller D2O Equation 3100 Equation 32 ~300 0.8 ~14 ~7
1.2 ~55 ~2
1.6 ~210 ~0,5
2.1 ~1100 ~0.1
1700 D2O Equation 350 Equation 33 ~400 0.8 ~7 ~7
1.2 ~20 ~2.5
1.6 ~55 ~1
2.1 ~190 ~0,3

Tabell 1: Typiske 3P eksitasjonsforhold for musebarkavbildning.
*Med et høyt NA-mål (~1.0), pulsbredde på ~50 fs og typiske fluoroforer som fluorescerende proteiner (f.eks. GFP og RFP).
** Med antagelsen om at EAL er ensartet i hele cortex.
For å oppnå ~1 nJ/puls i fokus, beregnet fra EAL og bildedybden.
Beregnet ut fra pulsenergien under målet og maksimal tillatt lasereffekt.
Forkortelser: 3P = tre-foton; IT = numerisk blenderåpning. GFP = grønt fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; EAL = effektiv dempingslengde.

Discussion

Denne protokollen forklarer trinnvise prosedyrer for å sette opp 3P-avbildning med et kommersielt mikroskop og laserkilde. Sammenlignet med 14:00, har 15:00 en fordel i applikasjoner som krever optisk tilgang i de dypere områdene som i musen hjernen hippocampus. Selv om 15:00 for det meste brukes i nevrovitenskap, kan 15:00 potensielt brukes i andre vev som lymfeknuter, bein og svulster for dypvevsobservasjon.

Det er viktig å kontrollere at bildesystemet fungerer nær skuddstøygrensen, noe som sikrer at deteksjons- og datainnsamlingselelektronikken bidrar med ubetydelig støy til bildet etter PMT-ene. Usikkerheten i antall fotoner som oppdages er fundamentalt begrenset av fotonskuddsstøy. Skuddstøybegrenset ytelse kan oppnås i et typisk multifotonmikroskop ved hjelp av en fotodetektor med høy forsterkning (f.eks. en PMT). Fotonskuddsstøy følger en Poisson statistisk fordeling, der standardavviket for fordelingen er lik kvadratroten av gjennomsnittet av fordelingen. Følg trinn 1.14 i protokolldelen for å kontrollere den begrensede ytelsen for skuddstøy.

For å unngå lysdemping ved H2O er det nyttig å bruke D2O til nedsenking, spesielt for ~ 1700 nm eksitasjon. Når D2O brukes, er det viktig å oppdatere D2O hver ~10 min eller bruke et stort volum D2O for å unngå D2O/ H2O utveksling under bildebehandling. Man kan også forsegle D2O fra rommiljøet3. Hvis en objektiv linse med lang arbeidsavstand (WD) (f.eks. WD ved 4 mm eller lenger) brukes til avbildning, kan nedsenkningsvæsketykkelsen overstige 2-3 mm. Den økte tykkelsen gjør H2O absorpsjon ikke ubetydelig selv ved ~ 1300 nm21. Derfor kan D2O være nødvendig selv for 1300 nm 3PM når du bruker en lang WD objektiv.

Ettersom 3P-fluorescensintensiteten avhenger av kuben til eksitasjonspulsenergien i fokus (Eq. (1)), er det spesielt viktig å stille inn riktig lasereffekt for å oppnå tilstrekkelige 3P fluorescenssignaler samtidig som termisk og ikke-lineær skade i levende vev unngås. Den gjennomsnittlige lasereffekten bør holdes under terskelen for termisk skade. I musehjernen, for eksempel for å unngå termisk vevsskade, bør den gjennomsnittlige kraften på musens hjerneoverflate holdes på eller under ~ 100 mW for ~ 1300 nm eksitasjon på en dybde på 1 mm og med et synsfelt (FOV) på 230 μm x 230 μm21. På samme måte bør gjennomsnittseffekten på ~ 1700 nm holdes på eller under ~ 50 mW ved ~ 1 mm dybde og en FOV på ~ 230 μm x 230 μm (upubliserte data). Videre, for å unngå eksitasjonsmetning og potensiell ikke-lineær skade, bør eksitasjonspulsenergien holdes på Equation 3henholdsvis 2 nJ og Equation 33 nJ for ~ 1300 nm og ~ 1700 nm eksitasjon, henholdsvis30.

På grunn av lysabsorpsjon og spredning i vev, dempes pulsenergien i fokus til 1/e (~ 37%) etter penetrasjon av vev med 1 EAL. EAL varierer i forskjellige vev og med eksitasjonsbølgelengdene, for eksempel i neocortex av musehjernen, er EAL ~ 300 μm og ~ 400 μm ved ~ 1300 nm og ~ 1700 nm, henholdsvis 3,29 (figur 5). For å holde den samme pulsenergien i fokus (f.eks. 1 nJ/puls) på en dybde på n EALer, må overflatepulsenergien multipliseres med 1 nJ × en. For rask bildebehandling av strukturell og funksjonell dynamikk er en eksitasjonslaser med høy repetisjonshastighet (ved 1 MHz eller høyere) ønskelig å oppnå en høy bildefrekvens 5,6,7,10. Pulsenergibehovet og den gjennomsnittlige laserkraftgrensen begrenser imidlertid gjeldende repetisjonshastighet.

For eksempel, når vi ser for oss en moderat dyp region ved 4 EALer (dvs. ~ 1,2 mm i musebarken med 1300 nm eksitasjon), kreves ~ 55 nJ / puls på overflaten for å holde 1 nJ / puls i fokus. Når den gjennomsnittlige strømbegrensningen er 100 mW, kan vi bruke en laserrepetisjonshastighet på ~ 2 MHz. Men for å se dypere på en dybde på 7 EALer, kreves ~1100 nJ/puls på overflaten for å opprettholde 1 nJ/puls i fokus. Forutsatt at maksimal gjennomsnittlig effekt er 100 mW for å unngå termisk skade, bør laserrepetisjonshastigheten reduseres til 0,1 MHz for å oppnå en 1100 nJ / puls på overflaten. Tabell 1 oppsummerer typiske bildeforhold i musens hjernebark. Legg merke til at bildedybden i tabell 1 forutsetter at EAL er ensartet i hele musebarken.

Videre, på grunn av laserkraftbegrensningen i dypvev 15:00, eksisterer en avveining mellom bildefrekvensen og bildepikselstørrelsen, noe som er spesielt viktig for funksjonell bildebehandling som kalsiumavbildning. Den maksimale tilgjengelige laserrepetisjonshastigheten bestemmes på hver dybde basert på den nødvendige pulsenergien i fokus og den gjeldende gjennomsnittlige lasereffekten som beskrevet ovenfor, for eksempel 2 MHz på en dybde som tilsvarer ~ 4 EALer med 1300 nm eksitasjon. Generelt krever bildebehandling minst én puls per piksel. Følgelig bestemmes minimum tilgjengelig pikselboetid av laserrepetisjonshastigheten, for eksempel 0,5 μs / piksel med 2 MHz eksitasjon.

For å holde den høye romlige oppløsningen (~ 1 μm i laterale) i 3P-bilder, er det ideelt å sette 1 piksel til et område på ~ 1 μm2, for eksempel 256 x 256 piksler for en FOV på 250 x 250 μm2. For å utføre rask bildebehandling med en betydelig stor FOV (f.eks. 250 x 250 μm2 med 256 x 256 piksler), gir henholdsvis 0,5 MHz, 1 MHz og 2 MHz pulsrepetisjonshastigheter teoretisk maksimal bildefrekvens på henholdsvis ~ 7,6, ~ 15 og ~ 30 bilder / s. På samme måte er optimaliseringen av laserrepetisjonshastigheten viktig, avhengig av måldybden, skannehastigheten og FOV, for å bruke tilstrekkelig pulsenergi under terskelen for termisk skade. For å øke bildehastigheten kan en adaptiv eksitasjonskilde brukes til å konsentrere alle eksitasjonspulsene på nevronene (dvs. interesseregioner) ved å levere laserpulser på forespørsel til nevronene31.

15:00 er fordelaktig sammenlignet med 14:00 i dyp avbildning i levende vev og gjennom svært spredningsmedier som hodeskalle, bein og det hvite materielaget (dvs. den eksterne kapselen) i musehjernen. Jo lengre EAL og den ikke-lineære eksitasjonen med høyere rekkefølge av 3PE fordeler dypvevsavbildning. For eksempel, til bilde GCaMP6 i musebarken, er 2P fluorescenssignal med 920 nm eksitasjon høyere enn 3P fluorescenssignal med 1300 nm eksitasjon i grunne områder ved Equation 3690 μm (dvs. ~ 2,3 EALer ved 1300 nm)21. På grunn av den lengre EAL på 1300 nm sammenlignet med 920 nm, gir 3PE imidlertid sterkere fluorescens enn 2P-eksitasjon (2PE) på en dybde på ~ 690 μm og dypere21. Denne dybden er definert som "signalovergangsdybde", der fluorescenssignalstyrkene til 2PE og 3PE er identiske med samme repetisjonshastighet og samme maksimale tillatte gjennomsnittlige krefter21. Signalovergangsdybden avhenger av eksitasjonsbølgelengdene for 2PE og 3PE og fluoroforen.

I praksis tillater 920 nm eksitasjon høyere gjennomsnittlig lasereffekt enn 1300 nm eksitasjon på grunn av mindre vannabsorpsjon. Den høyere gjennomsnittlige effekten til 2PE vil imidlertid bare presse signalets crossover-dybde med 0,9 EALer4. I tillegg, når prøven er tett merket, har 3PE den ekstra fordelen med mye høyere SBR. Derfor, selv før du når signalovergangslengden, kan 15:00 være bedre for bildebehandling enn 14:00. For eksempel, når du forestiller deg musen hjernen vaskulaturen, som har en volumfraksjon (dvs. merkingstetthet) på ~ 2%, 1300 nm 3PM med 100 mW eksitasjonskraft overgår 920 nm 2PM med 200 mW eksitasjonskraft i en dybde på ~ 700 μm for fluorescein.

15:00 har også en fordel når du ser gjennom et tynt, men svært spredningslag som kan forvrenge punktspredningsfunksjonen til eksitasjonsstrålen og generere en defokusbakgrunn4. For eksempel, gjennom den intakte skallen i musehjernen, lider 2PM-bilder av defokusbakgrunnen selv på den grunne dybden av <100 μm fra hjerneoverflaten13. En lignende defokusbakgrunn ble observert i 14:00 med 1280 nm eksitasjon gjennom det hvite stoffet i musehjernen32. Derfor, når vev er avbildet gjennom uklare lag, er 3PM å foretrekke fremfor 14:00 for høykontrastbilder uavhengig av merketettheten.

Vi rapporterte nylig en perle fantom og teoretisk analyse som viser at bildedybdegrensen på 15:00 er over 8 EALs33; 8 EALer tilsvarer ~3 mm med ~1700 nm eksitasjon i musebarken. Den tilgjengelige laseren har imidlertid ikke nok pulsenergi til å oppnå 8 EALer i musehjernen. Videreutvikling av sterkere lasere vil presse den nåværende bildedybdegrensen på 15:00.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub og NIH 1U01NS103516.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% Povidone-iodine Amazon NDC 67818-155-32 Aceptical cleaning of surgical areas
70% Ethanol Thermo Fisher Scientific CAS 64-17-5 Aceptical cleaning of surgical areas
Agarose Sigma A4718-256 Preparing zebrafish chamber
Atropine Cornell Veterinary Care
Bergamo II Thorlabs Multiphoton Imaging Microscope
Bupivacaine Cornell Veterinary Care
Dexamethasone Cornell Veterinary Care
Donut shape glass (ID4.5, OD6.5) Potomac Photonics Cover glass used for craniotomy
eye ointment (or topical ophthalmic ointment) Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Used as a lubricant to prevent irritation or to relieve dryness of the eye during surgery and anesthesia
GaAsP Amplified PMT Thorlabs PMT2100 PMT detector
Glucose Cornell Veterinary Care
Glycopyrrolate Cornell Veterinary Care
Heater (800 W) Finnex Aquarium heater for zebrafish water)
Isoflurane USP 250 mL Piramal NDC 66794-0013-25 For anesthesia of mice
Ketoprofen Cornell Veterinary Care
Kimwipes Kimtech Laboratory tissue for preparing zebrafish
Nanofil syringe (10 micrometer) with 36 G needle WPI NANOFIL + NF36BV Syringe and needle for injection of pancuronium bromide
Optical Adhesive Norland NOA 68 To stick round coverslip and donut shape glass together.
Pancuronium Bromide Cornell Veterinary Care
Peristaltic Pump Elemental Science ESI MP2 Water pump for zebrafish setup
Polyethylene tubing (I.D. 0.58 mm., O.D. 0.965 mm.) Elemental Science MP2 pump tubing Tubing that goes in the mouth of the zebrafish
Round Cover Slip German Glass #1.5, 5 mm Electron Microscopy Sciences 7229605 Cover glass used for craniotomy
Spirit-NOPA Spectra Physics Tunable Optical Parametric Amplifier
SR400 Stanford Research Systems SR400 Photon counter
Standard Photodiode Power Sensor Thorlabs S122C Power detector
Sterilized phosphate buffered saline (PBS) Millipore Sigma SKU 806552-500ml Used during mouse brain surgery
Surgical drape Dynarex disposable towel drape 4410 For aceptical mouse surgery
Thin strip boxing wax Corning Rubber Co., Inc. Holding tubing in place in zebrafish chamber
ThorImage Thorlabs Image acquisition software
Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt) MP 103106 Zebrafish anesthesia and euthanasia
Tygon tubing (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.) Tygon Tubing for water flow for zebrafish preparation
VaporGuard VetEquip 931401 For recycling isoflurane
Vetbond tissue adhesive 3M 1469SB To glue the glass window on the mouse skull, and to glue the laboratory tissue when preparing the fish.
XLPLN25XWMP2 Olympus Multiphoton Excitation Dedicated Objective

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  3. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).
  4. Wang, T., Xu, C. Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain. Optica. 7 (8), 947-960 (2020).
  5. Ouzounov, D. G., et al. In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain. Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).
  6. Weisenburger, S., et al. Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy. Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).
  7. Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy. Nature Communications. 10, 177 (2019).
  8. Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 7 (1), (2020).
  9. Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light, Science & Applications. 7, 12 (2018).
  10. Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain. Science Advances. 7 (12), 3531 (2021).
  11. Liu, H., et al. In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots. Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).
  12. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  13. Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
  14. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).
  15. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680 (2008).
  16. Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528 (2016).
  17. Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642 (2017).
  18. Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).
  19. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  20. Horton, N. G., Xu, C. Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).
  21. Wang, T., et al. Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain. eLife. 9, 53205 (2020).
  22. Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).
  23. Huang, K. -H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  24. Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish. Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).
  25. Li, J., et al. Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).
  26. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  27. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  28. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  29. Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).
  30. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  31. Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy. Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).
  32. Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014 (2011).
  33. Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy. Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 179 Trefoton fluorescensavbildning intravital avbildning dypvevsobservasjon neuroimaging musehjerne sebrafiskhjerne
Dypvev tre-foton fluorescens mikroskopi i intakt mus og sebrafisk hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hontani, Y., Akbari, N., Kolkman, K. … More

Hontani, Y., Akbari, N., Kolkman, K. E., Wu, C., Xia, F., Choe, K., Wang, G. Z., Sokolova, M., Fetcho, J. R., Xu, C. Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (179), e63213, doi:10.3791/63213 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter