מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

סיכום

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

תקציר

פגיעה בקרנית בפני השטח של העין, כולל כוויה כימית וטראומה, עלולה לגרום לצלקות קשות, סימפלפרון, מחסור בתאי גזע לימבליים בקרנית, ולגרום לפגם אפיתל גדול ומתמשך בקרנית. פגם אפיתל עם אטימות הקרנית הבאה וניאו-וסקולריזציה היקפית גורמים לליקוי ראייה בלתי הפיך ומעכבים ניהול עתידי, במיוחד קרטופלסטיקה. מכיוון שהמודל החייתי יכול לשמש כפלטפורמה יעילה לפיתוח תרופות, מפותחים כאן מודלים של פגיעה בקרנית העכבר וצריבה אלקלית לאפיתל קרנית ארנבת. ארנב לבן ניו זילנדי משמש במודל הכוויה האלקלי. ריכוזים שונים של נתרן הידרוקסידי יכולים להיות מיושמים על האזור המעגלי המרכזי של הקרנית במשך 30 שניות תחת הרדמה תוך שרירית ומקומית. לאחר השקיה איזוטונית תקינה של מי מלח, הוסר אפיתל קרנית רופף שאריות עם בור הקרנית עמוק עד לשכבת באומן בתוך אזור מעגלי זה. ריפוי פצעים תועד על ידי כתמים פלואורסצאין תחת אור כחול קובלט. עכברי C57BL/6 שימשו במודל הטראומטי של אפיתל קרנית מורין. הקרנית המרכזית של המורין סומנה באמצעות ניקוב עור, בקוטר 2 מ"מ, ולאחר מכן פוזרה על ידי מסיר טבעת חלודה בקרנית עם בור 0.5 מ"מ תחת סטריאוסקופ. מודלים אלה יכולים לשמש באופן פרוספקטיבי כדי לאמת את ההשפעה הטיפולית של טיפות עיניים או סוכנים מעורבים כגון תאי גזע, אשר עשויים להקל על התחדשות אפיתל הקרנית. על ידי התבוננות באטימות הקרנית, ניאו-וסקולריזציה היקפית וגודש בלחמית באמצעות סטריאומיקרוסקופ ותוכנות הדמיה, ניתן לנטר השפעות טיפוליות במודלים אלה של בעלי חיים.

מבוא

הקרנית האנושית מורכבת מחמש שכבות עיקריות וממלאת תפקיד מרכזי בשבירת העין לשמירה על חדות הראייה והשלמות המבנית להגנה על רקמות תוך עיניות¹. החלק החיצוני ביותר של הקרנית הוא אפיתל הקרנית, המורכב מחמש עד שש שכבות של תאים המתמיינים ברצף מתאי הבסיס ונעים כלפי מעלה כדי לנשור מפני השטח של העין¹. בהשוואה לקרנית בבני אדם ובארנבים ניו זילנדיים, לקרנית העכבר מבנה קרנית דומה, אך פריפריה דקה יותר מהחלק המרכזי בשל עובי מופחת באפיתל ובסטרומה². בגלל מיקומו הייחודי במערכת האופטית העינית, עלבונות חיצוניים רבים כגון פגיעה מכנית, חיסון חיידקי וחומרים כימיים עלולים לסכן בקלות את שלמות האפיתל ולהוביל עוד יותר לפגם אפיתל מסכן ראייה, קרטיטיס זיהומיות, המסת קרנית ואפילו ניקוב הקרנית.

למרות שחומרים טיפוליים שונים, כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, חומרים אנטי דלקתיים, מוצרי אוטו-סרום וקרומי מי שפיר כבר שימשו לשיפור אפיתל מחדש ולהפחתת צלקות, שיטות טיפול פוטנציאליות אחרות שיכולות לאפשר ריפוי פצעים, להפחית דלקת ולדכא היווצרות צלקות עדיין מפותחות ונבחנות על פלטפורמות שונות. הוצעו מודלים שונים של בעלי חיים לריפוי פצעי אפיתל בקרנית, ביניהם הסרת אפיתל קרנית באמצעות מסיר טבעות חלודה בקרנית בעכבר סוכרתי³, שריטות ליניאריות מעל אפיתל הקרנית של עכבר על ידי מחט סטרילית 25 גרם לחיסון חיידקי⁴, הסרה בעזרת טרפין של אפיתל הקרנית על ידי מסיר טבעת חלודה בקרנית⁵, צריבה אפיתל מעל מחצית הקרנית ולימבוס⁶ שחיקת קרנית ארנב בסיוע טרפין על ידי להב אזמל עמום⁷, ופגיעה בקרנית בקר על ידי הקפאת הבזק בחנקן נוזלי⁸.,

מלבד פגיעה מכנית באפיתל הקרנית, חומרים כימיים הם גם עלבונות נפוצים בפני השטח של העין, במיוחד חומרים חומציים ואלקליים. נתרן הידרוקסידי (NaOH, 0.1-1 N עבור 30-60 שניות) הוא אחד הכימיקלים הנפוצים במודלים של מורין וארנב של כוויות כימיות בקרנית 9,10,11,12,13. 100% אתנול הוחל גם על הקרנית במודל הכוויה הכימית של חולדה, ולאחר מכן גריטה מכנית נוספת באמצעות להב כירורגי¹⁴. מכיוון ששמירה על משטח עיני בריא מסתמכת על יחידות תפקודיות, כולל העפעפיים, בלוטות המייבומיאן, מערכת הדמעות, הלחמית והקרנית, למודלים של בעלי חיים in vivo יש כמה יתרונות על פני תאי אפיתל של הקרנית בתרבית ex vivo או רקמות הקרנית. במאמר זה, מודל העכבר של פצע שחיקה הקרנית, ואת מודל ארנב של כוויה אלקלית הקרנית מודגמים.

פרוטוקול

כל הליכי הניסוי במחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר בבית החולים לזכר צ'אנג גונג ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.

1. מודל ריפוי פצע Ex vivo של אפיתל הקרנית של העכבר

1. הכנת העכברים
   1. מתן הרדמה כללית לעכברי C57BL/6 על ידי אספקה תוך צפקית של קטמין הידרוכלוריד (80-100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
   2. ודא כי הרדמה כללית פועלת על ידי אישור אובדן תנועה לגירוי מזיק ואובדן רפלקס תיקון בעכברים.
   3. תקנו את העכברים ראש ביד ומרחו הרדמה מקומית על שתי העיניים עם טיפה אחת של 0.5% תמיסה אופתלמית פרופרקאין הידרוכלוריד (איור 1A). יש לחטא את משטח העין והעפעפיים שלוש פעמים עם 5% בטאדין.
2. יצירת מודל פצע אפיתל קרנית מורין
   הערה: בצע את ההליכים הבאים תחת סטריאומיקרוסקופ. פצע הקרנית נוצר in vivo, לא ex vivo, כדי לתפעל את גלגל העין טוב יותר וקרוב למצב בעולם האמיתי. זהו הליך סופני; לכן, נדרשים רק מכשירים נקיים (לא טכניקה סטרילית).
   1. סמן את הקרנית המרכזית של העכבר באמצעות ניקוב ביופסיה של העור (בקוטר 2 מ"מ) כדי לאשר אזור מוגבל היטב ומדיד היטב של הפצע.
   2. הכניסו פנימה בעדינות את הניקוב מעל הקרנית המרכזית כדי להשאיר סימן מעגלי (איור 1B). באמצעות מסיר טבעות חלודה ידני של הקרנית עם בור בקוטר 0.5 מ"מ, יש לכלות את אפיתל הקרנית עד לשכבת באומן כדי להבטיח שלא יפגעו בזו האחרונה (איור 1C). הסר את שאריות הרקמות הרופפות הפנימיות לשולי הפצע בעזרת מלקחיים בקרנית.
   3. אשרו את אזור ההטריה עם צביעת פלואורסצאין (איור 1D). כדי לבצע צביעה פלואורסצאין, לשים טיפה של מלוחים רגילים על נייר פלואורסצאין כדי להמיס פלואורסצאין, ולאחר מכן להניח את הטיפה המכילה פלואורסצאין על פגם אפיתל מורין כדי להמחיש אותו תחת אור כחול קובלט.
3. תרבות Ex vivo של מודל פצע שחיקת הקרנית מורין.
   1. עבור קצירת גלגלי העיניים murine, להמשיך כדלקמן.
   2. להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם לאחר גרימת הרדמה עם 5% isoflurane בתא זירוז. ודא כי ההרדמה פועלת על ידי אישור אובדן התנועה לגירוי מזיק ואובדן רפלקס הנכון בעכברים.
   3. לחץ בעדינות עם קצה המלקחיים על שולי המסלול העליונים והנחותים כדי לדחוף את גלגל העין החוצה. הכנס את קצה מספריים הקרנית סגור לתוך החלל retrobulbar לאורך קיר המסלול נחות, להבטיח לא לחדור את גלגל העין.
   4. החזק את גלגל העין יציב עם מלקחיים קרנית 0.3 מ"מ, ולאחר מכן לחתוך את עצב הראייה ואת הרקמה הרכה periorbital עם מספריים הקרנית כדי לבודד את גלגל העין.
   5. עבור טיפוח ex vivo של גלגלי עיניים murine, המשך כדלקמן.
   6. מכינים צלחת של 48 בארות עם שעווה מומסת בתוך הבאר ומחכים להתמצקות. בעזרת קצה המלקחיים יוצרים חור עגול על פני שעווה מוצקה להתאמת גלגלי העיניים.
   7. הניחו את גלגלי העיניים שנקטפו ישירות על צלחת של 48 בארות (איור 1E) עם תחתיות ודפנות מכוסות שעווה כדי לבסס ייצוב (איור 1F).
   8. תרבית את גלגלי העיניים עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 1% נסיוב בקר עוברי (FBS) באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ב 37 מעלות צלזיוס עם או בלי אנטיביוטיקה, בהתאם למטרת המחקר.
      הערה: אם המודל משמש לחקר ריפוי פצעי אפיתל בקרנית, תידרש אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום. עם זאת, אם מודל זה משמש להערכת היעילות של אנטיביוטיקה או סוכנים מעורבים, אנטיביוטיקה מניעתית לא יהיה צורך.
   9. לטבול את משטח העין עם מדיום התרבית מבלי לגרום גלגל העין לצוף.
   10. תעד את מהלך ריפוי הפצע על ידי צביעת פלואורסצאין (שלב 1.2.3) ואיסוף תמונות במצלמה דיגיטלית תחת אור כחול קובלט.
       הערה: בניסויים פרוספקטיביים עם מודלים של עכברים של פגיעה מכנית בקרנית, אלה שקיבלו שחיקה בקרנית ונבדקו עוד יותר ליעילות של חומרים טיפוליים נחשבים כקבוצת ניסוי, ואלה שקיבלו שחיקה בקרנית ללא טיפול נוסף נחשבים כקבוצת ביקורת שלילית.

2. מודל ארנב in vivo של פגיעה אלקלית בקרנית

הערה: במודל זה, נגרמת פגיעה בכוויה אלקלית ואחריה הטריה מכנית של אפיתל הקרנית כדי ליצור אזור פצע מוגדר היטב ואפילו לכימות לאחר מכן. יש לעקר את כל המכשירים לפני השימוש.

1. הכנת הארנב עם משככי כאבים לפני הניתוח, כולל הזרקה תוך שרירית של משככי כאבים מערכתיים וטיפות עיניים אקטואליות.
   1. מתן הרדמה כללית לארנבים לבנים בניו זילנד על ידי הזרקה תוך שרירית של קטמין הידרוכלוריד (35-44 מ"ג/ק"ג משקל גוף), מעורבב עם קסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ברגל האחורית.
   2. לאחר מיקום הארנב וכיסויו במגבת, מרחו הרדמה מקומית על עין ימין עם טיפה של 0.5% תמיסת עיניים פרופרקאין הידרוכלוריד (איור 2A) מתחת לסטריאומיקרוסקופ. יש לחטא את משטח העין והעפעפיים שלוש פעמים עם 5% בטאדין.
2. גרימת פגיעה בכוויה אלקלית מעל הקרנית
   1. מניחים ניירות סינון עגולים בקוטר 8 מ"מ (חתוכים באמצעות ניקוב 8 מ"מ) בכלי פטרי. בעזרת טפטפת, הוסיפו 0.5 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) לצלחת הפטרי כדי להשרות את ניירות הפילטר. יש לנקז את עודפי תמיסת NaOH מניירות הסינון לפני הנחתם על קרנית הארנב.
      אזהרה: 0.5 N NaOH עלול לגרום לפגיעה שחיקה חמורה ברקמות אנושיות. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול. אם העור או העיניים באים במגע עם טיפות NaOH, השקיה עם כמויות גדולות של מלוחים רגילים ועזרה רפואית נדרשים כדי להפחית נזק נוסף.
   2. לאחר שפתחתם את העפעפיים עם ספקולום עפעפיים ווידאתם שהקרום המניק של הארנב אינו מפריע להחדרת נייר סינון (איור 2B), הניחו את נייר הסינון המעגלי הספוג ב-0.5N NaOH על הקרנית המרכזית למשך 30 שניות, ואז הסירו אותו בעזרת מלקחיים (איור 2C).
   3. לאחר הסרת נייר המסנן, שטפו את משטח העין עם 10 מ"ל של מלח רגיל כדי לשטוף את החומר האלקלי.
3. השלמת פגם אפיתל בקרנית
   1. מפרקים את אפיתל הקרנית בתוך האזור האופוס עד לקרום באומן באמצעות מסיר טבעת חלודה בקרנית עם בור בקוטר 0.5 מ"מ (איור 2D).
   2. אשרו את אזור ההטריה עם כתמים פלואורסצאין מתחת לאור הכחול של קובלט והסירו שאריות אפיתל בקרנית באמצעות מלקחיים בקרנית (איור 2E).
4. מצב פצע מאובטח עם tarsorrhaphy
   1. ודא כי הקרום nictitating מכסה בצורה חלקה את פני השטח של העין ואת הפגם אפיתל הקרנית בצד האף. ודא שהקרום המנקב אינו מקופל או מעוות יותר מדי כדי להפריע לתהליך ריפוי הפצע ולניסוי.
   2. בצעו טרסורפיה זמנית עם או בלי חומרים מקומיים באמצעות תפר 6-0 כדי להגן על משטח העין ולמנוע מהארנב לשרוט אותו (איור 2F). ודא כי התפר עבור tarsorrhaphy הוא ב 3-4 מ"מ משולי העפעף העליון והתחתון עם 4-5 קשרים וקשרים ארוכים יותר כדי למנוע את הארנב לשבור את התפרים.
      הערה: אם הניסוי אינו מעורב במחקר אנטיביוטי, ניתן לשקול שימוש בחומרים מקומיים עם אנטיביוטיקה.
   3. במודל ארנב זה, אלו שקיבלו כוויה אלקלית והסרת אפיתל הקרנית נחשבו לקבוצת הביקורת.
      הערה: בניסויים פרוספקטיביים, הארנבים המקבלים פגיעה אלקלית בכוויה בקרנית ומטופלים נוספים בחומרים טיפוליים נתפסים כקבוצת ניסוי. הארנבים המקבלים טיפול בכוויות אלקליות בלבד, ללא טיפול נוסף, נחשבים לקבוצת ביקורת שלילית.
5. שיכוך כאבים לאחר הניתוח ושליטה בכאב
   1. להעריך את המצב הפיזיולוגי ואת רמות הכאב של USDA במשך 7 ימים לאחר ההליך, על ידי ניטור כאב ומצוקה אצל בעלי החיים. שקול את השימוש משחה tobramycin טיפה אחת של 0.5% proparacaine hydrochloride פתרון אופתלמי על פי התוצאה של ההערכה. מתן Buprenorphine HCl (0.03 מ"ג / ק"ג) כל 6-8 שעות במשך 3 ימים.
      הערה: למדידה יומית של אזור המום והשגחה לאחר ניתוח, ההליך שייך לקטגוריה D של USDA.

תוצאות

מודל ריפוי פצעים Ex vivo של אפיתל הקרנית של העכבר:
לאחר הטריה in vivo של אפיתל הקרנית של עכבר עם מסיר טבעת חלודה קרנית ידני, ניתן למצוא אזור קרנית מרכזי מדוכא קלות עם כתם פלואורסצאין חיובי באזור המרכזי של 2 מ"מ (איור 3A-B). לאחר קצירת גלגל העין של העכבר, הוא התקבע בקלות על צלחת תרבית מצופה שעווה בת 48 בארות ללא סיבוב משמעותי. בהתאם לפרוטוקול, תרבית ex vivo של גלגלי העיניים של מורין יכולה להיבדק...

דיון

מודלים של עכברים וארנבים של פגיעות בקרנית מספקים פלטפורמה שימושית של ex vivo ו-in vivo למעקב אחר ריפוי פצעים, בדיקת טיפולים חדשים ולימוד מנגנונים בסיסיים של ריפוי פצעים ומסלולי טיפול. מודלים שונים של בעלי חיים יכולים לשמש לניסוי לטווח קצר או ארוך, בהתאם למטרת המחקר. לדוגמה, לאחר יצירת פגם אפיתל בקרנית העכבר in vivo, פגם אפיתל מוגבל יכול לשמש לניטור חומרים טיפוליים נוזליים בנפח קטן. יחד עם זאת, ניתן להעריך יחידות תפקודיות סביב, כגון עפעפיים, מערכת הדמעות והלחמית, בתנאי in vivo, בניגוד ל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
6/0 Ethicon vicryl תפר	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer מכסה ספקולום	katena	K1-5355	15 מ"מ
מחזיק מחט Barraquer	Katena	K6-3310	ללא מנעול
Barron ואקום אגרוף 8.0 מ"מ	katena	K20-2108	לחיתוך נייר סינון
C57BL/6 עכברים	המרכז	הלאומי לחיות מעבדהRMRC11005	זן
עכבר מלקחיים Castroviejo 0.12 מ"מ	katena	K5-2500
מסיר טבעת חלודה קרנית עם 0.5 מ"מ	קוצים Algerbrush IITM; אלג'יר ציוד ושות', בע"מ לאגו ויסטה, טקסס	CHI-675	אפיתל הקרנית
	טויו רושי קאישה בע"מ	1.11
רצועות עיניים נתרן פלואורסצאין U.S.P	OPTITECH		צביעה לפגם באפיתל בקרנית
קטמין הידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	61763-23-3	הרדמה תוך צפקית או תוך שרירית
בעלי חיים של ארנבים לבנים בניו זילנד	, מועצת החקלאות,	דגמי ארנב
מנהלים מי מלח רגילים	טייוואן ביוטק ושות', בע"מ	100-120-1101
פרופרקאין	אלקון	ALC2UD09	הרדמה מקומית
אגרוף ביופסיה של העור 2 מ"מ	STIEFEL	22650
נתרן כלורי (NaOH)	סיגמא-אולדריץ'	1310-73-2	חומר כימי לכוויות אלקליות
סטריאומיקרוסקופ	קרל זייס מדיטק, דבלין, קליפורניה	מיקרוסקופ	SV11
ווסטקוט טנוטומיה מספריים בינוני		katena K4-3004
קסילזין הידרוכלוריד 23.32 מ"ג/10 מ"ל	Elanco בריאות בעלי חיים קוריאה ושות', בע"מ.	047-956	הרדמה תוך צפקית או תוך שרירית

להסרת נייר סינון OPTFL100 חומרי המכון לחקריואן לניתוח