Summary
כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.
Abstract
פגיעה בקרנית בפני השטח של העין, כולל כוויה כימית וטראומה, עלולה לגרום לצלקות קשות, סימפלפרון, מחסור בתאי גזע לימבליים בקרנית, ולגרום לפגם אפיתל גדול ומתמשך בקרנית. פגם אפיתל עם אטימות הקרנית הבאה וניאו-וסקולריזציה היקפית גורמים לליקוי ראייה בלתי הפיך ומעכבים ניהול עתידי, במיוחד קרטופלסטיקה. מכיוון שהמודל החייתי יכול לשמש כפלטפורמה יעילה לפיתוח תרופות, מפותחים כאן מודלים של פגיעה בקרנית העכבר וצריבה אלקלית לאפיתל קרנית ארנבת. ארנב לבן ניו זילנדי משמש במודל הכוויה האלקלי. ריכוזים שונים של נתרן הידרוקסידי יכולים להיות מיושמים על האזור המעגלי המרכזי של הקרנית במשך 30 שניות תחת הרדמה תוך שרירית ומקומית. לאחר השקיה איזוטונית תקינה של מי מלח, הוסר אפיתל קרנית רופף שאריות עם בור הקרנית עמוק עד לשכבת באומן בתוך אזור מעגלי זה. ריפוי פצעים תועד על ידי כתמים פלואורסצאין תחת אור כחול קובלט. עכברי C57BL/6 שימשו במודל הטראומטי של אפיתל קרנית מורין. הקרנית המרכזית של המורין סומנה באמצעות ניקוב עור, בקוטר 2 מ"מ, ולאחר מכן פוזרה על ידי מסיר טבעת חלודה בקרנית עם בור 0.5 מ"מ תחת סטריאוסקופ. מודלים אלה יכולים לשמש באופן פרוספקטיבי כדי לאמת את ההשפעה הטיפולית של טיפות עיניים או סוכנים מעורבים כגון תאי גזע, אשר עשויים להקל על התחדשות אפיתל הקרנית. על ידי התבוננות באטימות הקרנית, ניאו-וסקולריזציה היקפית וגודש בלחמית באמצעות סטריאומיקרוסקופ ותוכנות הדמיה, ניתן לנטר השפעות טיפוליות במודלים אלה של בעלי חיים.
Introduction
הקרנית האנושית מורכבת מחמש שכבות עיקריות וממלאת תפקיד מרכזי בשבירת העין לשמירה על חדות הראייה והשלמות המבנית להגנה על רקמות תוך עיניות1. החלק החיצוני ביותר של הקרנית הוא אפיתל הקרנית, המורכב מחמש עד שש שכבות של תאים המתמיינים ברצף מתאי הבסיס ונעים כלפי מעלה כדי לנשור מפני השטח של העין1. בהשוואה לקרנית בבני אדם ובארנבים ניו זילנדיים, לקרנית העכבר מבנה קרנית דומה, אך פריפריה דקה יותר מהחלק המרכזי בשל עובי מופחת באפיתל ובסטרומה2. בגלל מיקומו הייחודי במערכת האופטית העינית, עלבונות חיצוניים רבים כגון פגיעה מכנית, חיסון חיידקי וחומרים כימיים עלולים לסכן בקלות את שלמות האפיתל ולהוביל עוד יותר לפגם אפיתל מסכן ראייה, קרטיטיס זיהומיות, המסת קרנית ואפילו ניקוב הקרנית.
למרות שחומרים טיפוליים שונים, כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, חומרים אנטי דלקתיים, מוצרי אוטו-סרום וקרומי מי שפיר כבר שימשו לשיפור אפיתל מחדש ולהפחתת צלקות, שיטות טיפול פוטנציאליות אחרות שיכולות לאפשר ריפוי פצעים, להפחית דלקת ולדכא היווצרות צלקות עדיין מפותחות ונבחנות על פלטפורמות שונות. הוצעו מודלים שונים של בעלי חיים לריפוי פצעי אפיתל בקרנית, ביניהם הסרת אפיתל קרנית באמצעות מסיר טבעות חלודה בקרנית בעכבר סוכרתי3, שריטות ליניאריות מעל אפיתל הקרנית של עכבר על ידי מחט סטרילית 25 גרם לחיסון חיידקי4, הסרה בעזרת טרפין של אפיתל הקרנית על ידי מסיר טבעת חלודה בקרנית5, צריבה אפיתל מעל מחצית הקרנית ולימבוס6 שחיקת קרנית ארנב בסיוע טרפין על ידי להב אזמל עמום7, ופגיעה בקרנית בקר על ידי הקפאת הבזק בחנקן נוזלי8.,
מלבד פגיעה מכנית באפיתל הקרנית, חומרים כימיים הם גם עלבונות נפוצים בפני השטח של העין, במיוחד חומרים חומציים ואלקליים. נתרן הידרוקסידי (NaOH, 0.1-1 N עבור 30-60 שניות) הוא אחד הכימיקלים הנפוצים במודלים של מורין וארנב של כוויות כימיות בקרנית 9,10,11,12,13. 100% אתנול הוחל גם על הקרנית במודל הכוויה הכימית של חולדה, ולאחר מכן גריטה מכנית נוספת באמצעות להב כירורגי14. מכיוון ששמירה על משטח עיני בריא מסתמכת על יחידות תפקודיות, כולל העפעפיים, בלוטות המייבומיאן, מערכת הדמעות, הלחמית והקרנית, למודלים של בעלי חיים in vivo יש כמה יתרונות על פני תאי אפיתל של הקרנית בתרבית ex vivo או רקמות הקרנית. במאמר זה, מודל העכבר של פצע שחיקה הקרנית, ואת מודל ארנב של כוויה אלקלית הקרנית מודגמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי במחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר בבית החולים לזכר צ'אנג גונג ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה.
1. מודל ריפוי פצע Ex vivo של אפיתל הקרנית של העכבר
- הכנת העכברים
- מתן הרדמה כללית לעכברי C57BL/6 על ידי אספקה תוך צפקית של קטמין הידרוכלוריד (80-100 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
- ודא כי הרדמה כללית פועלת על ידי אישור אובדן תנועה לגירוי מזיק ואובדן רפלקס תיקון בעכברים.
- תקנו את העכברים ראש ביד ומרחו הרדמה מקומית על שתי העיניים עם טיפה אחת של 0.5% תמיסה אופתלמית פרופרקאין הידרוכלוריד (איור 1A). יש לחטא את משטח העין והעפעפיים שלוש פעמים עם 5% בטאדין.
- יצירת מודל פצע אפיתל קרנית מורין
הערה: בצע את ההליכים הבאים תחת סטריאומיקרוסקופ. פצע הקרנית נוצר in vivo, לא ex vivo, כדי לתפעל את גלגל העין טוב יותר וקרוב למצב בעולם האמיתי. זהו הליך סופני; לכן, נדרשים רק מכשירים נקיים (לא טכניקה סטרילית).- סמן את הקרנית המרכזית של העכבר באמצעות ניקוב ביופסיה של העור (בקוטר 2 מ"מ) כדי לאשר אזור מוגבל היטב ומדיד היטב של הפצע.
- הכניסו פנימה בעדינות את הניקוב מעל הקרנית המרכזית כדי להשאיר סימן מעגלי (איור 1B). באמצעות מסיר טבעות חלודה ידני של הקרנית עם בור בקוטר 0.5 מ"מ, יש לכלות את אפיתל הקרנית עד לשכבת באומן כדי להבטיח שלא יפגעו בזו האחרונה (איור 1C). הסר את שאריות הרקמות הרופפות הפנימיות לשולי הפצע בעזרת מלקחיים בקרנית.
- אשרו את אזור ההטריה עם צביעת פלואורסצאין (איור 1D). כדי לבצע צביעה פלואורסצאין, לשים טיפה של מלוחים רגילים על נייר פלואורסצאין כדי להמיס פלואורסצאין, ולאחר מכן להניח את הטיפה המכילה פלואורסצאין על פגם אפיתל מורין כדי להמחיש אותו תחת אור כחול קובלט.
- תרבות Ex vivo של מודל פצע שחיקת הקרנית מורין.
- עבור קצירת גלגלי העיניים murine, להמשיך כדלקמן.
- להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם לאחר גרימת הרדמה עם 5% isoflurane בתא זירוז. ודא כי ההרדמה פועלת על ידי אישור אובדן התנועה לגירוי מזיק ואובדן רפלקס הנכון בעכברים.
- לחץ בעדינות עם קצה המלקחיים על שולי המסלול העליונים והנחותים כדי לדחוף את גלגל העין החוצה. הכנס את קצה מספריים הקרנית סגור לתוך החלל retrobulbar לאורך קיר המסלול נחות, להבטיח לא לחדור את גלגל העין.
- החזק את גלגל העין יציב עם מלקחיים קרנית 0.3 מ"מ, ולאחר מכן לחתוך את עצב הראייה ואת הרקמה הרכה periorbital עם מספריים הקרנית כדי לבודד את גלגל העין.
- עבור טיפוח ex vivo של גלגלי עיניים murine, המשך כדלקמן.
- מכינים צלחת של 48 בארות עם שעווה מומסת בתוך הבאר ומחכים להתמצקות. בעזרת קצה המלקחיים יוצרים חור עגול על פני שעווה מוצקה להתאמת גלגלי העיניים.
- הניחו את גלגלי העיניים שנקטפו ישירות על צלחת של 48 בארות (איור 1E) עם תחתיות ודפנות מכוסות שעווה כדי לבסס ייצוב (איור 1F).
- תרבית את גלגלי העיניים עם מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 1% נסיוב בקר עוברי (FBS) באטמוספירה לחה של 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס עם או בלי אנטיביוטיקה, בהתאם למטרת המחקר.
הערה: אם המודל משמש לחקר ריפוי פצעי אפיתל בקרנית, תידרש אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום. עם זאת, אם מודל זה משמש להערכת היעילות של אנטיביוטיקה או סוכנים מעורבים, אנטיביוטיקה מניעתית לא יהיה צורך. - לטבול את משטח העין עם מדיום התרבית מבלי לגרום גלגל העין לצוף.
- תעד את מהלך ריפוי הפצע על ידי צביעת פלואורסצאין (שלב 1.2.3) ואיסוף תמונות במצלמה דיגיטלית תחת אור כחול קובלט.
הערה: בניסויים פרוספקטיביים עם מודלים של עכברים של פגיעה מכנית בקרנית, אלה שקיבלו שחיקה בקרנית ונבדקו עוד יותר ליעילות של חומרים טיפוליים נחשבים כקבוצת ניסוי, ואלה שקיבלו שחיקה בקרנית ללא טיפול נוסף נחשבים כקבוצת ביקורת שלילית.
2. מודל ארנב in vivo של פגיעה אלקלית בקרנית
הערה: במודל זה, נגרמת פגיעה בכוויה אלקלית ואחריה הטריה מכנית של אפיתל הקרנית כדי ליצור אזור פצע מוגדר היטב ואפילו לכימות לאחר מכן. יש לעקר את כל המכשירים לפני השימוש.
- הכנת הארנב עם משככי כאבים לפני הניתוח, כולל הזרקה תוך שרירית של משככי כאבים מערכתיים וטיפות עיניים אקטואליות.
- מתן הרדמה כללית לארנבים לבנים בניו זילנד על ידי הזרקה תוך שרירית של קטמין הידרוכלוריד (35-44 מ"ג/ק"ג משקל גוף), מעורבב עם קסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ברגל האחורית.
- לאחר מיקום הארנב וכיסויו במגבת, מרחו הרדמה מקומית על עין ימין עם טיפה של 0.5% תמיסת עיניים פרופרקאין הידרוכלוריד (איור 2A) מתחת לסטריאומיקרוסקופ. יש לחטא את משטח העין והעפעפיים שלוש פעמים עם 5% בטאדין.
- גרימת פגיעה בכוויה אלקלית מעל הקרנית
- מניחים ניירות סינון עגולים בקוטר 8 מ"מ (חתוכים באמצעות ניקוב 8 מ"מ) בכלי פטרי. בעזרת טפטפת, הוסיפו 0.5 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) לצלחת הפטרי כדי להשרות את ניירות הפילטר. יש לנקז את עודפי תמיסת NaOH מניירות הסינון לפני הנחתם על קרנית הארנב.
אזהרה: 0.5 N NaOH עלול לגרום לפגיעה שחיקה חמורה ברקמות אנושיות. יש ללבוש כפפות בעת הטיפול. אם העור או העיניים באים במגע עם טיפות NaOH, השקיה עם כמויות גדולות של מלוחים רגילים ועזרה רפואית נדרשים כדי להפחית נזק נוסף. - לאחר שפתחתם את העפעפיים עם ספקולום עפעפיים ווידאתם שהקרום המניק של הארנב אינו מפריע להחדרת נייר סינון (איור 2B), הניחו את נייר הסינון המעגלי הספוג ב-0.5N NaOH על הקרנית המרכזית למשך 30 שניות, ואז הסירו אותו בעזרת מלקחיים (איור 2C).
- לאחר הסרת נייר המסנן, שטפו את משטח העין עם 10 מ"ל של מלח רגיל כדי לשטוף את החומר האלקלי.
- מניחים ניירות סינון עגולים בקוטר 8 מ"מ (חתוכים באמצעות ניקוב 8 מ"מ) בכלי פטרי. בעזרת טפטפת, הוסיפו 0.5 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) לצלחת הפטרי כדי להשרות את ניירות הפילטר. יש לנקז את עודפי תמיסת NaOH מניירות הסינון לפני הנחתם על קרנית הארנב.
- השלמת פגם אפיתל בקרנית
- מפרקים את אפיתל הקרנית בתוך האזור האופוס עד לקרום באומן באמצעות מסיר טבעת חלודה בקרנית עם בור בקוטר 0.5 מ"מ (איור 2D).
- אשרו את אזור ההטריה עם כתמים פלואורסצאין מתחת לאור הכחול של קובלט והסירו שאריות אפיתל בקרנית באמצעות מלקחיים בקרנית (איור 2E).
- מצב פצע מאובטח עם tarsorrhaphy
- ודא כי הקרום nictitating מכסה בצורה חלקה את פני השטח של העין ואת הפגם אפיתל הקרנית בצד האף. ודא שהקרום המנקב אינו מקופל או מעוות יותר מדי כדי להפריע לתהליך ריפוי הפצע ולניסוי.
- בצעו טרסורפיה זמנית עם או בלי חומרים מקומיים באמצעות תפר 6-0 כדי להגן על משטח העין ולמנוע מהארנב לשרוט אותו (איור 2F). ודא כי התפר עבור tarsorrhaphy הוא ב 3-4 מ"מ משולי העפעף העליון והתחתון עם 4-5 קשרים וקשרים ארוכים יותר כדי למנוע את הארנב לשבור את התפרים.
הערה: אם הניסוי אינו מעורב במחקר אנטיביוטי, ניתן לשקול שימוש בחומרים מקומיים עם אנטיביוטיקה. - במודל ארנב זה, אלו שקיבלו כוויה אלקלית והסרת אפיתל הקרנית נחשבו לקבוצת הביקורת.
הערה: בניסויים פרוספקטיביים, הארנבים המקבלים פגיעה אלקלית בכוויה בקרנית ומטופלים נוספים בחומרים טיפוליים נתפסים כקבוצת ניסוי. הארנבים המקבלים טיפול בכוויות אלקליות בלבד, ללא טיפול נוסף, נחשבים לקבוצת ביקורת שלילית.
- שיכוך כאבים לאחר הניתוח ושליטה בכאב
- להעריך את המצב הפיזיולוגי ואת רמות הכאב של USDA במשך 7 ימים לאחר ההליך, על ידי ניטור כאב ומצוקה אצל בעלי החיים. שקול את השימוש משחה tobramycin טיפה אחת של 0.5% proparacaine hydrochloride פתרון אופתלמי על פי התוצאה של ההערכה. מתן Buprenorphine HCl (0.03 מ"ג / ק"ג) כל 6-8 שעות במשך 3 ימים.
הערה: למדידה יומית של אזור המום והשגחה לאחר ניתוח, ההליך שייך לקטגוריה D של USDA.
- להעריך את המצב הפיזיולוגי ואת רמות הכאב של USDA במשך 7 ימים לאחר ההליך, על ידי ניטור כאב ומצוקה אצל בעלי החיים. שקול את השימוש משחה tobramycin טיפה אחת של 0.5% proparacaine hydrochloride פתרון אופתלמי על פי התוצאה של ההערכה. מתן Buprenorphine HCl (0.03 מ"ג / ק"ג) כל 6-8 שעות במשך 3 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל ריפוי פצעים Ex vivo של אפיתל הקרנית של העכבר:
לאחר הטריה in vivo של אפיתל הקרנית של עכבר עם מסיר טבעת חלודה קרנית ידני, ניתן למצוא אזור קרנית מרכזי מדוכא קלות עם כתם פלואורסצאין חיובי באזור המרכזי של 2 מ"מ (איור 3A-B). לאחר קצירת גלגל העין של העכבר, הוא התקבע בקלות על צלחת תרבית מצופה שעווה בת 48 בארות ללא סיבוב משמעותי. בהתאם לפרוטוקול, תרבית ex vivo של גלגלי העיניים של מורין יכולה להיבדק ולתועד מדי יום בתוך צלחת תרבית של 48 בארות תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 3C). יום לאחר הטריסת אפיתל הקרנית המורין, פגם אפיתל עגול אחד מוכתם בפלואורסצאין שנמדד בקוטר 2 מ"מ יכול להתגלות בתצלומים דיגיטליים שהתקבלו תחת אור כחול קובלט (איור 3D). שולי פצע ראשוניים מוכתמים באופן לא סדיר או כתמים פלואורסצאין שליליים פירושם הסרה לא שלמה או כושלת של אפיתל הקרנית. בתהליך הרגיל של ריפוי פצעים, פגם אפיתל הקרנית יחלים עם אזור מוכתם פלואורסצאין מופחת בתוך 2-3 ימים.
מודל ארנב in vivo של פגיעה אלקלית בקרנית:
לפני כל הליך, אפיתל קרנית ארנב שלם לא יכול להיות מוכתם עם כתמים פלואורסצאין. לאחר יצירת פגיעה אלקלית באפיתל הקרנית של הארנב, ניתן לראות צביעה פלואורסצאין חיובית עם או בלי אור כחול קובלט מעל הקרנית המרכזית עם שוליים עגולים ברורים ושלמים (איור 4A-B ואיור 5B). כתם לא שלם עם שטח לא ממולא מייצג שאריות של רקמות אפיתל בקרנית או כתמים כושלים. במהלך מעקב קבוע, פצע האפיתל של הקרנית עובר אפיתל מחדש עם צמיחה של פאנוס מהלימבוס, ולאחר מכן אזור מוכתם מופחת (איור 5C). פגם האפיתל מחלים תוך 3-4 שבועות. אם כיב בקרנית, דלן, פגם אפיתל גדול, או הפרשות לבנבנות או ריריות מסיביות מתפתחות בפתאומיות, יש לשקול טרסורפיה לא בטוחה, תפרים חשופים, קרום ניקוטי במיקום שגוי, או גוף זר בתוך לחמית מישושית.
איור 1: הליכים להגדרת מודל עכברי של פגיעה מכנית בקרנית . (A) הרדמה מקומית מיושמת לפני ההליך. (B) הזחה עדינה נעשית מעל הקרנית המרכזית עם ביופסיית עור טרפין בקוטר 2 מ"מ. (C) מסיר טבעת חלודה בקרנית משמש להסרת אפיתל הקרנית המרכזי. (D) פגם אפיתל מוכתם בפלואורסצאין כדי לאשר את אזור הפגם ולהשוות אותו לאזור המסומן ב-B. (ה,ו) גלגל העין של העכבר נקצר ומועבר לצלחת בת 48 בארות מכוסה שעווה לפני כן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שלבים לבניית מודל ארנב של פגיעה אלקלית בקרנית . (A) הרדמה מקומית מיושמת על משטח העין. (B) ספקולום עפעפיים משמש לפתיחת העפעפיים העליונים והתחתונים, מבלי לקפל או לסחוט את קרום הניקוט. (C) נייר פילטר טרפי ספוג NaOH (בקוטר 8 מ"מ) מונח על הקרנית המרכזית. (D) מסיר טבעות חלודה בקרנית משמש לפירוק האפיתל המרכזי בקוטר 8 מ"מ עד לשכבת באומן. (E) פגם האפיתל מוכתם בפלואורסצאין. (F) לאחר ההליך, tarsorrhaphy מבוצע כדי להגן על הפצע מפני שריטות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות חיוביות ושליליות במודל עכברי של פגיעה מכנית בקרנית . (A) אפיתל קרנית עכבר שלם ללא כל כתמים לפני ההליך. (B) צביעה חיובית In vivo עם פלואורסצאין על פצע הקרנית ללא אור כחול קובלט. (C) תרבית Ex vivo של גלגל העין של העכבר מבלי להוסיף כתם פלואורסצאין לפני הוספת מדיום תרבית. (D) צביעה חיובית עם פלואורסצאין על פגם אפיתל בקרנית במודל עכבר ex vivo . פגם אפיתל 2 מ"מ בדרך כלל לרפא בתוך 2-3 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות של צביעת פלואורסצאין במודל ארנב של פגיעה אלקלית בקרנית. (A) צביעת פלואורסצאין חיובית תחת אור כחול קובלט. התמונה צולמה מיד לאחר הפגיעה המכנית בקרנית. (B) צביעה חיובית בצבע פלואורסצאין ניתן לראות גם על פני העין של הארנב ללא אור כחול קובלט. (C) כתמים שליליים על משטח העין שנרפא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מהלך הזמן של ריפוי פצעים והופעת אפיתל מחדש במודל ארנב של פגיעה אלקלית בקרנית. (A) אפיתל מחדש במודלים של עכברים וארנבים אורך 2-3 ימים ו-3-4 שבועות, בהתאמה. (B) פגם אפיתל בקוטר 8 מ"מ המוכתם בפלואורסצאין לאחר כוויה אלקלית בדגם ארנב. אור כחול קובלט שימש כמקור האור. התמונה צולמה מיד לאחר הפציעה האלקלית. (C) פגם אפיתל שנרפא בעין הארנב 3 שבועות לאחר הפגיעה האלקלית, המראה שטח כתמים מופחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים של עכברים וארנבים של פגיעות בקרנית מספקים פלטפורמה שימושית של ex vivo ו-in vivo למעקב אחר ריפוי פצעים, בדיקת טיפולים חדשים ולימוד מנגנונים בסיסיים של ריפוי פצעים ומסלולי טיפול. מודלים שונים של בעלי חיים יכולים לשמש לניסוי לטווח קצר או ארוך, בהתאם למטרת המחקר. לדוגמה, לאחר יצירת פגם אפיתל בקרנית העכבר in vivo, פגם אפיתל מוגבל יכול לשמש לניטור חומרים טיפוליים נוזליים בנפח קטן. יחד עם זאת, ניתן להעריך יחידות תפקודיות סביב, כגון עפעפיים, מערכת הדמעות והלחמית, בתנאי in vivo, בניגוד לתרבית תאים או תנאי תרבית ex vivo . Tarsorrhaphy עשוי עדיין להידרש במצב זה אם תנועות עכברים עשויות להשפיע על מצב הניסוי. קל יותר להתבונן ולכמת פצע מעגלי מאשר פצע שריטה ליניארי פשוט4. עם זאת, ניקוב עור כדי ליצור קו תיחום על הקרנית צריך להיעשות בזהירות מבלי לחתוך דרך קרום באומן, אשר אחרת ישאיר פגיעה עמוקה בקרנית או פצע חודר. הפצע המכני של הקרנית יכול להיווצר גם על ידי טרפין קרנית 8 מ"מ ולהב אזמל בדגם ארנב15, שבו הוצג פצע עמוק יותר עד לסטרומה הקדמית ולא לאפיתל הקרנית.
הסרת טבעת חלודה בקרנית היא נושא מרכזי נוסף שראוי להזכיר. מכיוון שגלגל העין של העכבר קטן, הסרת יתר או הסרת חסר של אפיתל הקרנית יכולה להתרחש ובכך להשפיע על דיוק המחקר. סימון הקרנית באמצעות ניקוב ביופסיית עור וניתוח מונחה פלואורסצאין יסייע להפחית טעויות אלו. למרות שלהבי צריבה ואזמל הוצעו ככלים להסרת אפיתל הקרנית במודלים של בעלי חיים6,7, הנזק על פני השטח של העין לא יכול להיות נשלט בקלות ולשכפל באותו אופן, מה שעלול להוביל לתוצאות לא עקביות בניסויים נוספים.
בהשוואה למצב in vivo, גלגלי עיניים של עכבר בתרבית ex vivo בצלחות 48 בארות קלים יותר למניפולציה בשל מרחב עבודה גדול יותר על הצלחות וניתן להשתמש בהם לבדיקת חומרים מורכבים במדיומים שונים של תרבית בו זמנית, כגון עדשות מגע פולטות תרופות וטיפולים תאיים. כאשר קוצרים גלגלי עיניים של עכבר ומעבירים אותם לצלחת בת 48 בארות, חשוב להקפיד על הגנה על הקרנית כדי למנוע נזק מלאכותי נוסף למשטח העין וקרע של גלגלי העיניים. במחקר הבא, ניתן לקבע את גלגל העין בתוך באר מצופה פרפין כאשר הקרנית פונה כלפי מעלה ושקועה בתוך מדיום תרבית. גלגלי עיניים צפים או מסתובבים או קרנית מיובשת יעכבו את התוצאות. מכיוון שמודל עכבר ex vivo זה מתמקד בשינויים על פני השטח של העין, יחידות פונקציונליות אחרות, כגון בלוטת הדמעות והעפעפיים, אינן נדונות במודל ex vivo זה. מודל עכבר Ex vivo גם מוזיל את עלות הגידול והשיכון של עכברים וחוסך שטח ניסוי, בהשוואה למודל בעלי חיים in vivo. מודל זה מתאים למחקר קצר טווח, ולא לטווח ארוך, שכן זיהום פוטנציאלי ברקמות ואי ספיקת איברים עלולים להתפתח בטווח הארוך.
למרות שמודל העכבר עולה פחות וניתן להגדיל אותו במעבדה, שטח פנים קטן עשוי להגביל את התצפית של שינויים מפורטים של הקרנית כגון שקיעת שומנים וניאו-וסקולריזציה על ידי סטריאומיקרוסקופים. במקום זאת, מודל ארנב של פגיעה בקרנית עם קוטר גדול יותר של גלגל העין יכול בדרך כלל לפצות על חסרון זה. על ידי התאמת ריכוז NaOH וזמן ההשרייה, ניתן ליצור הרחבות שונות של חומרת הכוויה האלקלית בקרנית. במודלים של כוויות כימיות של חולדות, 1 N NaOH שימש להשרות את הקרנית עם נייר סינון 3 מ"מ עבור 40 שניות ונייר סינון 4 מ"מ עבור 20 שניות, מה שסיפק שטח דומה אך קטן יותר לתצפית16,17. כדי לשמור על צריבה אלקלית עקבית בגודל ובריכוז, מומלץ להשתמש בניקוב חדש וחד לגמרי בהכנת נייר מסנן בקוטר 8 מ"מ כדי למנוע סיב או פינה לא ממולאת בשולי הנייר. נדרשת השקיה מספקת כדי לשטוף חומרים כימיים מפני השטח של העין ושק הלחמית כדי להפחית את הנזק המתמשך מחוץ לפצע. מכיוון שקרום ניקוטי ארנב עלול להפריע להליך ניסיוני ולגרום לכאב כאשר הוא נשחק על ידי חומרים אלקליים, יש להגן עליו בזהירות ולהחזיר אותו למצב פיזיולוגי לאחר ההליך כדי להפחית דלקת נוספת על פני העין. לאחר הליך של כוויה אלקלית, פצע הקרנית ארנב יכול להיות מוגן על ידי tarsorrhaphy או חומר אחר כגון עדשת מגע כדי להבטיח איכות ועקביות של ניסויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחקר מומן על ידי המועצה לאנרגיה אטומית של טייוואן (מענק מס' A-IE-01-03-02-02), משרד המדע והטכנולוגיה (מענק מס' NMRPG3E6202-3) ופרויקט המחקר הרפואי צ'אנג גונג (מענק מס' CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
