Summary
Ici, des modèles animaux basés sur la souris et le lapin sont développés pour les lésions mécaniques et chimiques de l’épithélium cornéen afin de cribler de nouveaux traitements et le mécanisme sous-jacent.
Abstract
Les lésions cornéennes à la surface oculaire, y compris les brûlures chimiques et les traumatismes, peuvent causer de graves cicatrices, un symblepharon, un déficit en cellules souches limbiques cornéennes et entraîner un défaut épithélial cornéen important et persistant. Un défaut épithélial avec l’opacité cornéenne suivante et une néovascularisation périphérique entraînent une déficience visuelle irréversible et entravent la prise en charge future, en particulier la kératoplastie. Étant donné que le modèle animal peut être utilisé comme une plate-forme de développement de médicaments efficace, des modèles de lésion cornéenne à la souris et de brûlure alcaline à l’épithélium cornéen de lapin sont développés ici. Le lapin blanc de Nouvelle-Zélande est utilisé dans le modèle de brûlure alcaline. Différentes concentrations d’hydroxyde de sodium peuvent être appliquées sur la zone circulaire centrale de la cornée pendant 30 s sous anesthésie intramusculaire et topique. Après une abondante irrigation isotonique normale de la solution saline, l’épithélium cornéen lâche résiduel a été enlevé avec une bavure cornéenne profondément jusqu’à la couche de Bowman dans cette zone circulaire. La cicatrisation des plaies a été documentée par coloration à la fluorescéine sous lumière bleu cobalt. Des souris C57BL/6 ont été utilisées dans le modèle traumatique de l’épithélium cornéen murin. La cornée centrale murine a été marquée à l’aide d’un poinçon cutané de 2 mm de diamètre, puis débridée par un dissolvant d’anneau de rouille cornéenne avec une bavure de 0,5 mm sous stéréomicroscope. Ces modèles peuvent être utilisés prospectivement pour valider l’effet thérapeutique des gouttes ophtalmiques ou des agents mixtes tels que les cellules souches, qui facilitent potentiellement la régénération épithéliale cornéenne. En observant l’opacité cornéenne, la néovascularisation périphérique et la congestion conjonctivale avec un stéréomicroscope et un logiciel d’imagerie, les effets thérapeutiques de ces modèles animaux peuvent être surveillés.
Introduction
La cornée humaine se compose de cinq couches principales et joue un rôle central dans la réfraction oculaire pour maintenir l’acuité visuelle et l’intégrité structurelle afin de protéger les tissus intraoculaires1. La partie la plus externe de la cornée est l’épithélium cornéen, composé de cinq à six couches de cellules qui se différencient séquentiellement des cellules basales et se déplacent vers le haut pour se détacher de la surface oculaire1. Comparée à la cornée chez l’homme et le lapin néo-zélandais, la cornée de souris a une structure cornéenne similaire, mais une périphérie plus mince que la partie centrale en raison d’une épaisseur réduite de l’épithélium et du stroma2. En raison de sa position unique dans le système optique oculaire, de nombreuses agressions externes telles que les blessures mécaniques, l’inoculation bactérienne et les agents chimiques peuvent facilement mettre en danger l’intégrité épithéliale et entraîner un défaut de l’épithélium menaçant la vision, une kératite infectieuse, une fusion de la cornée et même une perforation cornéenne.
Bien que divers agents thérapeutiques, tels que les lubrifiants, les antibiotiques, les agents anti-inflammatoires, les produits auto-sérums et la membrane amniotique aient déjà été utilisés pour améliorer la réépithélialisation et réduire les cicatrices, d’autres modalités de traitement potentielles pouvant permettre la cicatrisation des plaies, réduire l’inflammation et supprimer la formation de cicatrices sont encore en cours de développement et de test sur différentes plateformes. Divers modèles animaux pour la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes ont été proposés, y compris l’ablation de l’épithélium cornéen avec un dissolvant de l’anneau de rouille cornéenne chez la sourisdiabétique 3, les rayures linéaires sur l’épithélium cornéen de souris par une aiguille stérile de 25 G pour l’inoculation bactérienne4, l’élimination assistée par tréphine de l’épithélium par un dissolvant de l’anneau de rouille cornéenne5, la cautérisation épithéliale sur la moitié de la cornée et des limbes6 , abrasion cornéenne du lapin facilitée par la tréphine par une lame de scalpel émoussée7, et lésion de la cornée bovine par congélation instantanée dans de l’azote liquide8.
Outre les lésions mécaniques de l’épithélium cornéen, les agents chimiques sont également des insultes courantes à la surface oculaire, en particulier les agents acides et alcalins. L’hydroxyde de sodium (NaOH, 0,1-1 N pendant 30-60 s) est l’un des produits chimiques couramment utilisés dans les modèles murins et lapins de brûlure chimique cornéenne 9,10,11,12,13. L’éthanol à 100% avait également été appliqué sur la cornée dans le modèle de brûlure chimique chez le rat, suivi d’un grattage mécanique supplémentaire à l’aide d’une lame chirurgicale14. Étant donné que le maintien d’une surface oculaire saine repose sur des unités fonctionnelles, notamment les paupières, les glandes de Meibomius, le système lacrymal, la conjonctive et la cornée, les modèles animaux in vivo présentent certains avantages par rapport aux cellules épithéliales cornéennes ou aux tissus cornéens en culture ex vivo. Dans cet article, le modèle murin de plaie d’abrasion cornéenne et le modèle de lapin de brûlure alcaline cornéenne sont démontrés.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales dans les études animales ont été approuvées par le comité d’éthique de la recherche de l’hôpital Chang Gung Memorial et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen de souris
- Préparation des souris
- Administrer une anesthésie générale à des souris C57BL/6 par administration intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine (80-100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (5-10 mg/kg de poids corporel).
- Assurez-vous que l’anesthésie générale fonctionne en confirmant la perte de mouvement due à un stimulus nocif et la perte du réflexe de redressement chez la souris.
- Fixez la tête des souris à la main et appliquez une anesthésie topique sur les deux yeux avec une goutte de solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5 % (Figure 1A). Désinfectez la surface oculaire et les couvercles trois fois avec de la bétadine à 5%.
- Création d’un modèle de plaie épithéliale cornéenne murine
REMARQUE: Effectuez les procédures ci-dessous sous un stéréomicroscope. La plaie cornéenne a été créée in vivo, et non ex vivo, pour mieux manipuler le globe oculaire et se rapprocher de la situation réelle. Il s’agit d’une procédure terminale; Par conséquent, seuls des instruments propres (pas de technique stérile) sont nécessaires.- Marquez la cornée centrale de la souris à l’aide d’un poinçon de biopsie cutanée (2 mm de diamètre) pour confirmer une zone bien circonscrite et bien mesurable de la plaie.
- Indentez doucement le poinçon sur la cornée centrale pour laisser une marque circulaire (Figure 1B). À l’aide d’un dissolvant d’anneau antirouille cornéen portatif avec une bavure de 0,5 mm, débrider l’épithélium cornéen jusqu’à la couche de Bowman en veillant à ne pas endommager cette dernière (figure 1C). Retirez les tissus résiduels et lâches à l’intérieur du bord de la plaie à l’aide d’une pince cornéenne.
- Confirmer la zone de débridement avec coloration à la fluorescéine (figure 1D). Pour effectuer la coloration à la fluorescéine, mettez une goutte de solution saline normale sur un papier de fluorescéine pour dissoudre la fluorescéine, puis placez la goutte contenant de la fluorescéine sur le défaut épithélial murin pour le visualiser sous la lumière bleu cobalt.
- Culture ex vivo du modèle murin de plaie cornéenne abrasive.
- Pour récolter les globes oculaires murins, procédez comme suit.
- Sacrifier les souris par luxation cervicale après avoir induit une anesthésie avec 5% d’isoflurane dans une chambre d’induction. Assurez-vous que l’anesthésie fonctionne en confirmant la perte de mouvement due à un stimulus nocif et la perte du réflexe de redressement chez la souris.
- Appuyez doucement avec la pointe de la pince sur les bords orbitaux supérieurs et inférieurs pour pousser le globe oculaire vers l’extérieur. Introduisez la pointe des ciseaux cornéens fermés dans l’espace rétrobulbaire le long de la paroi orbitale inférieure, en veillant à ne pas pénétrer dans le globe oculaire.
- Maintenez le globe oculaire stable avec une pince cornéenne de 0,3 mm, puis coupez le nerf optique et les tissus mous périorbitaires avec des ciseaux cornéens pour isoler le globe oculaire.
- Pour la culture ex vivo de globes oculaires murins, procédez comme suit.
- Préparez une plaque de 48 puits avec de la cire fondue à l’intérieur du puits et attendez la solidification. Avec la pointe de pince conjonctive, créez un trou rond à la surface de la cire solidifiée pour accueillir les globes oculaires.
- Placez les globes oculaires récoltés directement sur la plaque de 48 puits (figure 1E) avec des fonds et des parois latérales recouverts de cire pour établir la stabilisation (figure 1F).
- Culture des globes oculaires avec le milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 1 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 à 37 °C avec ou sans antibiotiques, selon le but de l’étude.
REMARQUE: Si le modèle est utilisé pour étudier la cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes, des antibiotiques seraient nécessaires pour prévenir l’infection. Cependant, si ce modèle est utilisé pour évaluer l’efficacité des antibiotiques ou des agents mixtes, les antibiotiques prophylactiques ne seraient pas nécessaires. - Immergez la surface oculaire avec le milieu de culture sans faire flotter le globe oculaire.
- Documenter le déroulement de la cicatrisation des plaies par coloration à la fluorescéine (étape 1.2.3) et recueillir des photographies avec un appareil photo numérique sous lumière bleu cobalt.
NOTE: Dans les expériences prospectives avec des modèles de souris de lésions cornéennes mécaniques, celles qui reçoivent une abrasion cornéenne et testées davantage pour l’efficacité des agents thérapeutiques sont considérées comme un groupe expérimental, et celles qui reçoivent une abrasion cornéenne sans traitement supplémentaire sont considérées comme un groupe témoin négatif.
2. Modèle in vivo de lapin de lésion alcaline cornéenne
REMARQUE: Dans ce modèle, une brûlure alcaline est induite suivie d’un débridement mécanique de l’épithélium cornéen pour générer une zone de plaie bien définie et uniforme pour une quantification ultérieure. Stériliser tous les instruments avant utilisation.
- Préparation du lapin avec analgésie préopératoire, y compris injection intramusculaire d’analgésiques systémiques et de gouttes ophtalmiques topiques.
- Administrer une anesthésie générale à des lapins blancs néo-zélandais par injection intramusculaire de chlorhydrate de kétamine (35-44 mg / kg de poids corporel), mélangé à de la xylazine (5-10 mg / kg de poids corporel) à la patte arrière.
- Après avoir positionné le lapin et l’avoir recouvert d’une serviette, appliquer une anesthésie topique sur l’œil droit avec une goutte de solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5% (Figure 2A) au stéréomicroscope. Désinfectez la surface oculaire et les couvercles trois fois avec de la bétadine à 5%.
- Induire une brûlure alcaline sur la cornée
- Placer les papiers filtres circulaires d’un diamètre de 8 mm (coupés à l’aide d’un poinçon de 8 mm) dans une boîte de Pétri. À l’aide d’un compte-gouttes, ajouter de l’hydroxyde de sodium 0,5 N (NaOH) dans la boîte de Petri pour faire tremper les papiers filtres. Égoutter l’excès de solution de NaOH des papiers filtres avant de les placer sur la cornée de lapin.
ATTENTION : 0,5 N NaOH peut causer de graves lésions érosives aux tissus humains. Portez des gants lors de la manipulation. Si la peau ou les yeux entrent en contact avec des gouttelettes de NaOH, une irrigation avec de grandes quantités de solution saline normale et une aide médicale sont nécessaires pour réduire les dommages supplémentaires. - Après avoir ouvert les paupières avec un spéculum de couvercle et confirmé que la membrane nictitante de lapin n’interfère pas avec l’insertion de papier filtre (Figure 2B), placez le papier filtre circulaire imbibé de NaOH 0,5 N sur la cornée centrale pendant 30 s, puis retirez-le avec une pince (Figure 2C).
- Après avoir retiré le papier filtre, rincer la surface oculaire avec 10 ml de solution saline normale pour éliminer les matières alcalines.
- Placer les papiers filtres circulaires d’un diamètre de 8 mm (coupés à l’aide d’un poinçon de 8 mm) dans une boîte de Pétri. À l’aide d’un compte-gouttes, ajouter de l’hydroxyde de sodium 0,5 N (NaOH) dans la boîte de Petri pour faire tremper les papiers filtres. Égoutter l’excès de solution de NaOH des papiers filtres avant de les placer sur la cornée de lapin.
- Compléter le défaut épithélial cornéen
- Débrider l’épithélium cornéen dans la zone opacifiée jusqu’à la membrane de Bowman à l’aide d’un dissolvant d’anneau de rouille cornéenne avec une bavure de 0,5 mm (Figure 2D).
- Confirmer la zone de débridement avec coloration à la fluorescéine sous la lumière bleu cobalt et enlever l’épithélium cornéen résiduel à l’aide d’une pince cornéenne (Figure 2E).
- Sécuriser l’état de la plaie avec tarsorrhaphie
- Confirmer que la membrane nictitante recouvre en douceur la surface oculaire et le défaut épithélial cornéen du côté nasal. Assurez-vous que la membrane nictitante n’est pas trop pliée ou déformée pour interférer avec le processus de cicatrisation des plaies et l’expérience.
- Effectuer une tarsorrhaphie temporaire avec ou sans agents topiques en utilisant une suture 6-0 pour protéger la surface oculaire et empêcher le lapin de la gratter (Figure 2F). Assurez-vous que la suture pour la tarsorraphie est à 3-4 mm des bords supérieurs et inférieurs de la paupière avec 4-5 attaches et des nœuds plus longs pour empêcher le lapin de casser les sutures.
REMARQUE: Si l’expérience n’est pas impliquée dans une étude sur les antibiotiques, des agents topiques avec des antibiotiques pourraient être envisagés. - Dans ce modèle de lapin, ceux qui ont reçu une brûlure alcaline et l’ablation de l’épithélium cornéen ont été considérés comme le groupe témoin.
REMARQUE: Dans les expériences prospectives, les lapins recevant une lésion cornéenne de brûlure alcaline et traités avec des agents thérapeutiques sont considérés comme un groupe expérimental. Les lapins recevant uniquement un traitement contre les brûlures alcalines, sans autre traitement, sont considérés comme un groupe témoin négatif.
- Analgésie postopératoire et contrôle de la douleur
- Évaluer l’état physiologique et les niveaux de douleur de l’USDA pendant 7 jours après la procédure, en surveillant la douleur et la détresse chez les animaux. Envisager l’utilisation d’une pommade à la tobramycine et d’une goutte de solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5% en fonction du résultat de l’évaluation. Administrer Buprénorphine HCl (0,03 mg / kg) toutes les 6-8 heures pendant 3 jours.
REMARQUE: Pour la mesure quotidienne de la zone de défaut et l’observation après la chirurgie, la procédure appartient à la catégorie D de l’USDA.
- Évaluer l’état physiologique et les niveaux de douleur de l’USDA pendant 7 jours après la procédure, en surveillant la douleur et la détresse chez les animaux. Envisager l’utilisation d’une pommade à la tobramycine et d’une goutte de solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne à 0,5% en fonction du résultat de l’évaluation. Administrer Buprénorphine HCl (0,03 mg / kg) toutes les 6-8 heures pendant 3 jours.
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Representative Results
Modèle de cicatrisation ex vivo de l’épithélium cornéen de la souris:
Après débridement in vivo de l’épithélium cornéen de souris avec un dissolvant d’anneau de rouille cornéen portatif, une zone cornéenne centrale légèrement déprimée avec une coloration positive à la fluorescéine peut être trouvée dans la zone centrale de 2 mm (Figure 3A-B). Après avoir récolté le globe oculaire de la souris, il a été facilement fixé sur une plaque de culture de 48 puits enduite de cire sans rotation significative. Conformément au protocole, la culture ex vivo des globes oculaires murins peut être examinée et documentée quotidiennement dans une plaque de culture de 48 puits sous un stéréomicroscope (figure 3C). Un jour après avoir débridé l’épithélium cornéen murin, un défaut épithélial circulaire coloré à la fluorescéine mesurant 2 mm de diamètre peut être révélé sur des photographies numériques obtenues sous lumière bleu cobalt (Figure 3D). Une marge initiale de plaie colorée de façon irrégulière ou une coloration négative à la fluorescéine signifie une ablation incomplète ou échouée de l’épithélium cornéen. Dans le processus normal de cicatrisation des plaies, le défaut épithélial cornéen guérira avec une zone colorée à la fluorescéine réduite en 2-3 jours.
Modèle in vivo de lapin de lésion alcaline cornéenne :
Avant toute procédure, l’épithélium cornéen de lapin intact ne peut pas être coloré par coloration à la fluorescéine. Après avoir créé une lésion alcaline à l’épithélium cornéen du lapin, une coloration positive à la fluorescéine peut être observée avec ou sans lumière bleu cobalt sur la cornée centrale avec une marge circulaire claire et complète (Figure 4A-B et Figure 5B). Une coloration incomplète avec une zone non remplie représente des tissus épithéliaux cornéens résiduels ou une coloration défaillante. Au cours d’un suivi régulier, la plaie épithéliale cornéenne se réépithélialise avec la croissance du pannus du limbe, suivie d’une réduction de la zone colorée (Figure 5C). Le défaut épithélial guérit en 3-4 semaines. Si un ulcère cornéen, un dellen, un défaut épithélial important ou un écoulement blanchâtre ou muqueux massif se développe brusquement, une tarsorrhaphie peu sûre, des sutures exposées, une membrane nictitante mal positionnée ou un corps étranger dans la conjonctive palpébrale doivent être envisagés.
Figure 1 : Procédures pour mettre en place un modèle murin de lésion mécanique cornéenne. (A) L’anesthésie topique est appliquée avant la procédure. (B) Une légère indentation est effectuée sur la cornée centrale avec une tréphine de biopsie cutanée de 2 mm. (C) Le dissolvant d’anneau de rouille cornéenne est utilisé pour enlever l’épithélium cornéen central. (D) Un défaut épithélial est coloré à la fluorescéine pour confirmer la zone du défaut et la comparer avec la région marquée en B. (E,F) Le globe oculaire de la souris est récolté et transféré sur une plaque de 48 puits recouverte de cire au préalable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Étapes pour construire un modèle de lapin de lésion cornéenne alcaline. (A) Une anesthésie topique est appliquée sur la surface oculaire. (B) Un spéculum de paupière est utilisé pour ouvrir les paupières supérieures et inférieures, sans plier ni presser la membrane nictitante. (C) Un papier filtre trépané imbibé de NaOH (8 mm de diamètre) est placé sur la cornée centrale. (D) Le dissolvant d’anneau de rouille cornéenne est utilisé pour débrider l’épithélium central de 8 mm jusqu’à la couche de Bowman. (E) Le défaut de l’épithélium est coloré à la fluorescéine. (F) Après la procédure, une tarsorrhaphie est effectuée pour protéger la plaie des égratignures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats positifs et négatifs dans un modèle murin de lésion mécanique cornéenne. (A) Épithélium cornéen de souris intact sans aucune coloration avant l’intervention. (B) Coloration positive in vivo à la fluorescéine sur la plaie cornéenne murine sans lumière bleu cobalt. (C) Culture ex vivo du globe oculaire de souris sans ajout de coloration à la fluorescéine avant ajout du milieu de culture. (D) Coloration positive à la fluorescéine sur défaut épithélial cornéen dans un modèle murin ex vivo. Le défaut épithélial de 2 mm guérit généralement en 2-3 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats de la coloration à la fluorescéine dans un modèle de lapin de lésion alcaline cornéenne. (A) Coloration positive à la fluorescéine sous lumière bleu cobalt. La photographie a été prise juste après la lésion cornéenne mécanique. (B) Une coloration positive avec un colorant fluorescéine a également pu être observée sur la surface oculaire du lapin sans lumière bleu cobalt. (C) Coloration négative sur la surface oculaire cicatrisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Évolution temporelle de la cicatrisation et apparition de la réépithélialisation dans un modèle de lapin de lésion alcaline cornéenne. (A) La réépithélialisation chez les modèles de souris et de lapins prend 2-3 jours et 3-4 semaines, respectivement. (B) Un défaut épithélial de 8 mm coloré à la fluorescéine après brûlure alcaline dans un modèle de lapin. La lumière bleu cobalt a été utilisée comme source de lumière. La photo a été prise juste après la blessure alcaline. (C) Un défaut épithélial cicatrisé dans l’œil de lapin 3 semaines après une lésion alcaline, montrant une zone de tache réduite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les modèles de lésions cornéennes chez la souris et le lapin fournissent une plate-forme ex vivo et in vivo utile pour surveiller la cicatrisation des plaies, tester de nouveaux traitements et étudier les mécanismes sous-jacents de la cicatrisation des plaies et des voies de traitement. Différents modèles animaux peuvent être utilisés pour une expérience à court ou à long terme, selon le but de la recherche. Par exemple, après avoir créé un défaut épithélial sur la cornée de souris in vivo, un défaut épithélial confiné pourrait être utilisé pour surveiller les agents thérapeutiques liquides dans un petit volume. Dans le même temps, les unités fonctionnelles environnantes, telles que les paupières, le système lacrymal et la conjonctive, peuvent être évaluées dans des conditions in vivo, par opposition à des conditions de culture cellulaire ou de culture ex vivo . La tarsorrhaphie peut encore être nécessaire dans cette situation si les mouvements des souris peuvent affecter la condition expérimentale. Il est plus facile d’observer et de quantifier une plaie circulaire qu’une simple plaie linéaire à rayures4. Cependant, le poinçonnage cutané pour créer une ligne de démarcation sur la cornée doit être fait avec soin sans couper à travers la membrane de Bowman, ce qui laissera autrement une blessure cornéenne profonde ou une plaie pénétrante. La plaie cornéenne mécanique pourrait également être créée par un tréphine cornéen de 8 mm et une lame de scalpel dans un lapin modèle15, dans lequel une plaie plus profonde jusqu’au stroma antérieur plutôt qu’à l’épithélium cornéen a été présentée.
L’élimination de l’anneau de rouille cornéenne est une autre question cruciale qui mérite d’être mentionnée. Étant donné que le globe oculaire de la souris est petit, une ablation excessive ou sous-ablation de l’épithélium cornéen peut se produire, affectant ainsi la précision de la recherche. Le marquage de la cornée avec un poinçon de biopsie cutanée et une opération guidée par fluorescéine aidera à réduire ces erreurs. Bien que des lames de cautérisation et de scalpel aient été proposées comme outils pour enlever l’épithélium cornéen dans les modèles animaux6,7, les dommages sur la surface oculaire peuvent ne pas être facilement contrôlés et reproduits de la même manière, ce qui peut conduire à des résultats incohérents dans d’autres expériences.
Par rapport à la condition in vivo, les globes oculaires de souris cultivés ex vivo dans des plaques de 48 puits sont plus faciles à manipuler en raison d’un plus grand espace de travail sur les plaques et peuvent être utilisés pour tester des agents complexes dans divers milieux de culture en même temps, tels que les lentilles de contact à élution médicamenteuse et les thérapies cellulaires. Lorsque les globes oculaires de souris sont récoltés et transférés sur une plaque de 48 puits, une protection méticuleuse de la cornée est importante pour éviter des dommages artificiels supplémentaires à la surface oculaire et la rupture des globes oculaires. Pour l’étude suivante, le globe oculaire peut être fixé dans le puits recouvert de paraffine avec la cornée tournée vers le haut et immergée dans un milieu de culture. Des globes oculaires flottants ou rotatifs ou une cornée déshydratée entraveront les résultats. Étant donné que ce modèle murin ex vivo se concentre sur les changements sur la surface oculaire, d’autres unités fonctionnelles, telles que la glande lacrymale et les paupières, ne sont pas abordées dans ce modèle ex vivo . Le modèle de souris ex vivo réduit également le coût de reproduction et de logement des souris et économise de l’espace expérimental par rapport au modèle animal in vivo . Ce modèle convient à une étude à court terme plutôt qu’à long terme, car une infection tissulaire potentielle et une défaillance d’organe peuvent se développer à long terme.
Bien que le modèle murin coûte moins cher et puisse être mis à l’échelle en laboratoire, une petite surface limite potentiellement l’observation des changements détaillés de la cornée tels que le dépôt de lipides et la néovascularisation par stéréomicroscopes. Au lieu de cela, un modèle de lapin de lésion cornéenne avec un plus grand diamètre du globe oculaire peut généralement compenser cet inconvénient. En ajustant la concentration de NaOH et le temps de trempage, différents degrés de la gravité de la brûlure alcaline cornéenne peuvent être créés. Dans les modèles de brûlures chimiques chez le rat, 1 N NaOH a été utilisé pour tremper la cornée avec du papier filtre de 3 mm pendant 40 s et du papier filtre de 4 mm pendant 20 s, fournissant une zone d’observation similaire mais plus petite16,17. Pour maintenir la taille et la concentration de la combustion alcaline constante, un poinçon neuf et tranchant est suggéré en préparation de papier filtre de 8 mm pour éviter toute fibre ou coin non rempli à la marge du papier. Une irrigation suffisante pour éliminer les agents chimiques de la surface oculaire et du sac conjonctival est nécessaire pour réduire les dommages continus à l’extérieur de la plaie. Étant donné que la membrane nictitante de lapin peut interférer avec la procédure expérimentale et induire de la douleur lorsqu’elle est corrodée par des agents alcalins, elle doit être soigneusement protégée et remise en position physiologique après la procédure pour réduire l’inflammation supplémentaire sur la surface oculaire. Après la procédure de brûlure alcaline, la plaie cornéenne du lapin peut être protégée par une tarsorrhaphie ou un autre matériau tel que des lentilles de contact pour garantir la qualité et la cohérence des expériences.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
L’étude a été financée par le Conseil de l’énergie atomique de Taïwan (subvention n° A-IE-01-03-02-02), le ministère de la Science et de la Technologie (subvention n° NMRPG3E6202-3) et le projet de recherche médicale Chang Gung (subvention n° CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
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