Summary
Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.
Abstract
Hoornvliesbeschadiging aan het oculaire oppervlak, inclusief chemische verbranding en trauma, kan ernstige littekens, symblepharon, corneale limbale stamcellendeficiëntie veroorzaken en resulteren in een groot, aanhoudend cornea-epitheeldefect. Epitheeldefect met de volgende cornea-opaciteit en perifere neovascularisatie resulteren in onomkeerbare visuele stoornissen en belemmeren toekomstig management, met name keratoplastiek. Omdat het diermodel kan worden gebruikt als een effectief platform voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, worden hier modellen van hoornvliesbeschadiging aan de muis en alkaliverbranding aan hoornvliesepitheel van konijnen ontwikkeld. Nieuw-Zeelands wit konijn wordt gebruikt in het alkalibrandmodel. Verschillende concentraties natriumhydroxide kunnen gedurende 30 s onder intramusculaire en topische anesthesie op het centrale cirkelvormige gebied van het hoornvlies worden aangebracht. Na overvloedige isotone normale zoutoplossingsirrigatie werd het resterende losse cornea-epitheel verwijderd met corneale braam diep tot aan de Bowman's laag binnen dit cirkelvormige gebied. Wondgenezing werd gedocumenteerd door fluoresceïnekleuring onder kobaltblauw licht. C57BL/6 muizen werden gebruikt in het traumatische model van murine corneale epitheel. Het muriene centrale hoornvlies werd gemarkeerd met een huidpons, 2 mm in diameter, en vervolgens gedebrideerd door een corneale roestringverwijderaar met een 0,5 mm braam onder een stereomicroscoop. Deze modellen kunnen prospectief worden gebruikt om het therapeutische effect van oogdruppels of gemengde middelen zoals stamcellen te valideren, die mogelijk cornea-epitheelregeneratie vergemakkelijken. Door cornea-opaciteit, perifere neovascularisatie en conjunctivale congestie te observeren met stereomicroscoop en beeldvormingssoftware, kunnen therapeutische effecten in deze diermodellen worden gevolgd.
Introduction
Het menselijk hoornvlies bestaat uit vijf grote lagen en speelt een cruciale rol in oculaire breking om de gezichtsscherpte en structurele integriteit te behouden voor de bescherming van intraoculaire weefsels1. Het buitenste deel van het hoornvlies is het hoornvliesepitheel, bestaande uit vijf tot zes lagen cellen die achtereenvolgens differentiëren van de basale cellen en omhoog bewegen om van het oculaire oppervlak af te werpen1. Vergeleken met het hoornvlies bij mensen en Nieuw-Zeelandse konijnen heeft het hoornvlies van muizen een vergelijkbare hoornvliesstructuur, maar dunnere periferie dan het centrale deel vanwege een verminderde dikte in het epitheel en het stroma2. Vanwege de unieke positie in het oculaire optische systeem, kunnen veel externe beledigingen zoals mechanisch letsel, bacteriële inenting en chemische agentia gemakkelijk de epitheliale integriteit in gevaar brengen en verder leiden tot een gezichtsbedreigend epitheeldefect, infectieuze keratitis, smelten van het hoornvlies en zelfs corneaperforatie.
Hoewel verschillende therapeutische middelen, zoals smeermiddelen, antibiotica, ontstekingsremmende middelen, autoserumproducten en vruchtwatermembraan al zijn gebruikt om de re-epithelisatie te verbeteren en littekens te verminderen, worden andere potentiële behandelingsmodaliteiten die wondgenezing mogelijk maken, ontstekingen verminderen en littekenvorming onderdrukken nog steeds ontwikkeld en getest op verschillende platforms. Er zijn verschillende diermodellen voor cornea-epitheliale wondgenezing voorgesteld, waaronder verwijdering van cornea-epitheel met een cornearoestringverwijderaar bij diabetische muis3, lineaire krassen over het cornea-epitheel van de muis door een steriele naald van 25 G voor bacteriële inenting4, trephine-geassisteerde verwijdering van het cornea-epitheel door cornearoestringverwijderaar5, epitheliale cauterie over de helft van het hoornvlies en limbus6 , trephine-gefaciliteerde hoornvliesslijtage door een afgestompt scalpelmes7, en runderhoornvliesletsel door flitsbevriezing in vloeibare stikstof8.
Anders dan mechanisch letsel aan het hoornvliesepitheel, zijn chemische agentia ook veel voorkomende beledigingen voor het oogoppervlak, vooral zure en alkalische middelen. Natriumhydroxide (NaOH, 0,1-1 N voor 30-60 s) is een van de meest gebruikte chemicaliën in muizen- en konijnenmodellen van corneale chemische verbranding 9,10,11,12,13. 100% ethanol was ook toegepast op het hoornvlies in het chemische brandmodel van de rat, gevolgd door extra mechanische sloop met behulp van een chirurgisch mes14. Aangezien het behoud van een gezond oculair oppervlak afhankelijk is van functionele eenheden, waaronder de oogleden, Meibom-klieren, traansysteem, het bindvlies en het hoornvlies, hebben in vivo diermodellen enkele verdiensten ten opzichte van ex vivo gekweekte cornea-epitheelcellen of hoornvliesweefsels. In dit artikel worden het muismodel van cornea-schaafwond en het konijnenmodel van cornea-alkaliverbranding gedemonstreerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures in dierstudies werden goedgekeurd door de Research Ethics Committee in het Chang Gung Memorial Hospital en hielden zich aan de ARVO-verklaring voor gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.
1. Ex vivo wondgenezingsmodel van het hoornvliesepitheel van de muis
- Bereiding van de muizen
- Dien algemene anesthesie toe aan C57BL/6-muizen door intraperitoneale toediening van ketaminehydrochloride (80-100 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (5-10 mg/kg lichaamsgewicht).
- Zorg ervoor dat algemene anesthesie werkt door bewegingsverlies te bevestigen tot een schadelijke stimulus en verlies van rechtrichtreflex bij muizen.
- Bevestig de muizen met de hand en breng plaatselijke anesthesie aan op beide ogen met één druppel 0,5% proparacaïnehydrochloride oftalmische oplossing (figuur 1A). Desinfecteer het oculaire oppervlak en de deksels drie keer met 5% betadine.
- Creatie van murine corneale epitheliale wondmodel
OPMERKING: Voer de onderstaande procedures uit onder een stereomicroscoop. De hoornvlieswond is in vivo gemaakt, niet ex vivo, om de oogbol beter en dicht bij de echte situatie te manipuleren. Dit is een terminale procedure; Daarom zijn alleen schone instrumenten (geen steriele techniek) nodig.- Markeer het centrale hoornvlies van de muis met behulp van een huidbiopsie (2 mm in diameter) om een goed afgebakend en goed meetbaar gebied van de wond te bevestigen.
- Laat de pons voorzichtig over het centrale hoornvlies glijden om een cirkelvormige markering achter te laten (figuur 1B). Met behulp van een handbediende corneale roestringverwijderaar met een 0,5 mm braam, debrideer het cornea-epitheel tot aan de laag van de Bowman om ervoor te zorgen dat deze laatste niet wordt beschadigd (figuur 1C). Verwijder de achtergebleven, losse weefsels binnenin de wondrand met een hoornvliestang.
- Bevestig het debridementgebied met fluoresceïnekleuring (figuur 1D). Om fluoresceïnekleuring uit te voeren, plaatst u een druppel normale zoutoplossing op een fluoresceïnepapier om fluoresceïne op te lossen en plaatst u vervolgens de fluoresceïnehoudende druppel op murine-epitheeldefect om het onder kobaltblauw licht te visualiseren.
- Ex vivo kweek van het muriene corneale schuurwondmodel.
- Ga voor het oogsten van de murine oogbollen als volgt te werk.
- Offer de muizen op door cervicale dislocatie na het induceren van anesthesie met 5% isofluraan in een inductiekamer. Zorg ervoor dat de anesthesie werkt door het verlies van beweging te bevestigen aan een schadelijke stimulus en verlies van rechtrichtreflex bij muizen.
- Druk zachtjes met de punt van de tang op de superieure en inferieure orbitale randen om de oogbol naar buiten te duwen. Breng de punt van de gesloten hoornvliesschaar in de retrobulbaire ruimte langs de inferieure orbitale wand en zorg ervoor dat u de oogbol niet binnendringt.
- Houd de oogbol stabiel met een hoornvliestang van 0,3 mm en snijd vervolgens de oogzenuw en het periorbitale zachte weefsel af met een hoornvliesschaar om de oogbol te isoleren.
- Voor ex vivo kweken van muriene oogbollen, ga als volgt te werk.
- Maak een plaat met 48 putten met gesmolten was in de put en wacht op stolling. Maak met de punt van de bindtang een rond gat op het oppervlak van gestolde was voor het accommoderen van de oogbollen.
- Plaats de geoogste oogbollen direct op de 48-putplaat (figuur 1E) met met was bedekte bodems en zijwanden om stabilisatie tot stand te brengen (figuur 1F).
- Kweek de oogbollen met Dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) met 1% foetaal runderserum (FBS) in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 bij 37 °C met of zonder antibiotica, afhankelijk van het doel van het onderzoek.
OPMERKING: Als het model wordt gebruikt voor het bestuderen van cornea-epitheliale wondgenezing, zijn antibiotica nodig om infectie te voorkomen. Als dit model echter wordt gebruikt om de werkzaamheid van antibiotica of gemengde middelen te evalueren, zouden profylactische antibiotica niet nodig zijn. - Dompel het oogoppervlak onder met het kweekmedium zonder dat de oogbol gaat zweven.
- Documenteer het verloop van de wondgenezing door fluoresceïnekleuring (stap 1.2.3) en het verzamelen van foto's met een digitale camera onder kobaltblauw licht.
OPMERKING: In prospectieve experimenten met muizenmodellen van mechanisch hoornvliesletsel worden degenen die hoornvliesslijtage ontvangen en verder getest op de werkzaamheid van therapeutische middelen beschouwd als een experimentele groep en degenen die corneaslijtage ontvangen zonder verdere behandeling worden beschouwd als een negatieve controlegroep.
2. In vivo konijnenmodel van alkaliletsel aan het hoornvlies
OPMERKING: In dit model wordt een alkalibrandwond geïnduceerd, gevolgd door mechanisch debridement van het hoornvliesepitheel om een goed gedefinieerd en gelijkmatig wondgebied te genereren voor latere kwantificering. Steriliseer alle instrumenten voor gebruik.
- Voorbereiding van het konijn met preoperatieve analgesie, inclusief intramusculaire injectie van systemische analgetica en actuele oogdruppels.
- Dien algemene anesthesie toe aan Nieuw-Zeelandse witte konijnen door intramusculaire injectie van ketaminehydrochloride (35-44 mg / kg lichaamsgewicht), gemengd met xylazine (5-10 mg / kg lichaamsgewicht) aan de achterpoot.
- Nadat u het konijn hebt gepositioneerd en bedekt met een handdoek, brengt u plaatselijke anesthesie aan op het rechteroog met een druppel van 0,5% proparacaïnehydrochloride oftalmische oplossing (figuur 2A) onder een stereomicroscoop. Desinfecteer het oculaire oppervlak en de deksels drie keer met 5% betadine.
- Het induceren van alkalibrandwond over het hoornvlies
- Plaats cirkelvormig filterpapier met een diameter van 8 mm (gesneden met een pons van 8 mm) in een petrischaaltje. Voeg met behulp van een druppelaar 0,5 N natriumhydroxide (NaOH) toe aan de petrischaal om het filterpapier te laten weken. Giet de overtollige NaOH-oplossing af van de filterpapieren voordat u ze op het hoornvlies van het konijn plaatst.
LET OP: 0,5 N NaOH kan ernstige erosieve schade aan menselijke weefsels veroorzaken. Draag handschoenen bij het hanteren. Als de huid of de ogen in contact komen met NaOH-druppels, zijn irrigatie met grote hoeveelheden normale zoutoplossing en medische hulp vereist om verdere schade te verminderen. - Nadat u de oogleden hebt geopend met een ooglidspeculum en hebt bevestigd dat het konijnenmembraan het inbrengen van filtreerpapier niet verstoort (figuur 2B), plaatst u het in 0,5 N NaOH gedrenkte cirkelvormige filtreerpapier gedurende 30 s op het centrale hoornvlies en verwijdert u het vervolgens met een tang (figuur 2C).
- Na het verwijderen van het filtreerpapier spoelt u het oogoppervlak af met 10 ml normale zoutoplossing om alkalisch materiaal uit te spoelen.
- Plaats cirkelvormig filterpapier met een diameter van 8 mm (gesneden met een pons van 8 mm) in een petrischaaltje. Voeg met behulp van een druppelaar 0,5 N natriumhydroxide (NaOH) toe aan de petrischaal om het filterpapier te laten weken. Giet de overtollige NaOH-oplossing af van de filterpapieren voordat u ze op het hoornvlies van het konijn plaatst.
- Voltooiing van cornea-epitheeldefect
- Debride het cornea-epitheel binnen het opacified gebied tot aan het membraan van de Bowman met behulp van een corneale roestringverwijderaar met een 0,5 mm braam (figuur 2D).
- Bevestig het debridementgebied met fluoresceïnekleuring onder het kobaltblauwe licht en verwijder het resterende hoornvliesepitheel met behulp van een hoornvliestang (figuur 2E).
- Veilige wondconditie met tarsorrhaphy
- Controleer of het nictitating membraan het oculaire oppervlak en het cornea-epitheeldefect aan de neuszijde soepel bedekt. Zorg ervoor dat het nictitating membraan niet te veel wordt gevouwen of vervormd om het proces van wondgenezing en het experiment te verstoren.
- Voer een tijdelijke tarsorrhafie uit met of zonder actuele middelen met behulp van een 6-0-hechting om het oculaire oppervlak te beschermen en te voorkomen dat het konijn eraan krabt (figuur 2F). Zorg ervoor dat de hechtdraad voor tarsorrhafy zich op 3-4 mm van de bovenste en onderste dekselranden bevindt met 4-5 banden en langere knopen om te voorkomen dat het konijn de hechtingen breekt.
OPMERKING: Als het experiment niet betrokken is bij een antibioticastudie, kunnen topische middelen met antibiotica worden overwogen. - In dit konijnenmodel werden degenen die alkaliverbranding en verwijdering van hoornvliesepitheel kregen beschouwd als de controlegroep.
OPMERKING: In prospectieve experimenten worden de konijnen die alkalibrandhoornvliesletsel krijgen en verder worden behandeld met therapeutische middelen gezien als een experimentele groep. De konijnen die alleen een alkalibrandbehandeling krijgen, zonder verdere behandeling, worden beschouwd als een negatieve controlegroep.
- Postoperatieve analgesie en pijnbestrijding
- Beoordeel de fysiologische toestand en USDA-pijnniveaus gedurende 7 dagen na de procedure, door pijn en angst bij de dieren te controleren. Overweeg het gebruik van tobramycinezalf en één druppel 0,5% proparacaïnehydrochloride oftalmische oplossing volgens het resultaat van de beoordeling. Dien Buprenorfine HCl (0,03 mg/kg) elke 6-8 uur gedurende 3 dagen toe.
OPMERKING: Voor dagelijkse meting van het defectgebied en observatie na de operatie behoort de procedure tot USDA-categorie D.
- Beoordeel de fysiologische toestand en USDA-pijnniveaus gedurende 7 dagen na de procedure, door pijn en angst bij de dieren te controleren. Overweeg het gebruik van tobramycinezalf en één druppel 0,5% proparacaïnehydrochloride oftalmische oplossing volgens het resultaat van de beoordeling. Dien Buprenorfine HCl (0,03 mg/kg) elke 6-8 uur gedurende 3 dagen toe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo wondgenezingsmodel van het hoornvliesepitheel van de muis:
Na in vivo debridement van het cornea-epitheel van muizen met handbediende cornearoestringverwijderaar, kan een licht verlaagd centraal hoornvliesgebied met positieve fluoresceïnevlek worden gevonden in het centrale gebied van 2 mm (figuur 3A-B). Na het oogsten van de oogbol van de muis, kon deze gemakkelijk worden bevestigd op een met was bedekte kweekplaat met 48 putten zonder noemenswaardige rotatie. Volgens het protocol kan ex vivo kweek van de muriene oogbollen dagelijks worden onderzocht en gedocumenteerd in een 48-well kweekplaat onder een stereomicroscoop (figuur 3C). Een dag na het debriding van het murine cornea-epitheel, kan een cirkelvormig fluoresceïne-gekleurd epitheeldefect met een diameter van 2 mm worden onthuld in digitale foto's die zijn verkregen onder kobaltblauw licht (figuur 3D). Initieel onregelmatig gekleurde wondrand of negatieve fluoresceïnekleuring betekent onvolledige of mislukte verwijdering van het hoornvliesepitheel. In het normale proces van wondgenezing zal het cornea-epitheeldefect binnen 2-3 dagen genezen met een verminderd fluoresceïnekleurig gebied.
In vivo konijnenmodel van alkaliletsel aan het hoornvlies:
Vóór elke procedure kan intact hoornvliesepitheel van konijnen niet worden gekleurd met fluoresceïnekleuring. Na het creëren van alkalischade aan het hoornvliesepitheel van het konijn, kan positieve fluoresceïnekleuring worden waargenomen met of zonder kobaltblauw licht over het centrale hoornvlies met een duidelijke en volledige cirkelvormige marge (figuur 4A-B en figuur 5B). Onvolledige kleuring met niet-gevuld gebied vertegenwoordigt resterende cornea-epitheelweefsels of mislukte kleuring. Tijdens regelmatige follow-up epitheliseert de cornea-epitheelwond opnieuw met ingroei van pannus uit de limbus, gevolgd door verminderd gekleurd gebied (figuur 5C). Het epitheeldefect geneest binnen 3-4 weken. Als hoornvlieszweren, dellen, groot epitheeldefect of massale witachtige of slijmerige afscheiding zich abrupt ontwikkelen, moeten onveilige tarsorrhaphy, blootgestelde hechtingen, een verkeerd gepositioneerd nictitating membraan of een vreemd lichaam in palpebrale conjunctiva worden overwogen.
Figuur 1: Procedures voor het opzetten van een muismodel van mechanisch letsel aan het hoornvlies . (A) Topische anesthesie wordt toegepast vóór de procedure. (B) Zachte inkeping wordt gedaan over het centrale hoornvlies met een 2 mm huidbiopsie trephine. (C) Corneale roestringverwijderaar wordt gebruikt om het centrale cornea-epitheel te verwijderen. (D) Een epitheeldefect wordt gekleurd met fluoresceïne om het defecte gebied te bevestigen en te vergelijken met het in B gemarkeerde gebied. (E,F) De oogbol van de muis wordt geoogst en vooraf overgebracht op een plaat met 48 putten bedekt met was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stappen om een konijnenmodel van alkali hoornvliesletsel op te bouwen . (A) Topische anesthesie wordt toegepast op het oculaire oppervlak. (B) Een ooglidspeculum wordt gebruikt om de bovenste en onderste oogleden te openen, zonder het nictitating membraan te vouwen of te knijpen. (C) Een in NaOH gedrenkt trephined filterpapier (8 mm in diameter) wordt op het centrale hoornvlies geplaatst. (D) Corneale roestringverwijderaar wordt gebruikt om het centrale epitheel van 8 mm tot aan de Bowman's laag te debrideren. (E) Het epitheeldefect is gekleurd met fluoresceïne. (F) Na de procedure wordt tarsorrhafie uitgevoerd om de wond te beschermen tegen krassen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Positieve en negatieve resultaten in een muismodel van mechanisch letsel aan het hoornvlies . (A) Intact hoornvliesepitheel van muizen zonder enige kleuring vóór de procedure. (B) In vivo positieve kleuring met fluoresceïne op de muriene hoornvlieswond zonder kobaltblauw licht. (C) Ex vivo cultuur van de oogbol van de muis zonder toevoeging van fluoresceïnevlek alvorens kweekmedium toe te voegen. (D) Positieve kleuring met fluoresceïne op cornea-epitheeldefect in ex vivo muismodel. Het 2 mm epitheeldefect geneest over het algemeen binnen 2-3 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Resultaten van fluoresceïnekleuring in een konijnenmodel van corneale alkaliletsel . (A) Positieve fluoresceïnekleuring onder kobaltblauw licht. De foto is genomen vlak na het mechanische hoornvliesletsel. (B) Positieve kleuring met fluoresceïnekleurstof kon ook worden waargenomen op het oogoppervlak van konijnen zonder kobaltblauw licht. (C) Negatieve kleuring op het genezen oogoppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Tijdsverloop van wondgenezing en verschijning van re-epithelisatie in een konijnenmodel van corneale alkalischade. (A) Re-epithelisatie in muis- en konijnenmodellen duurt respectievelijk 2-3 dagen en 3-4 weken. (B) Een epitheeldefect van 8 mm gekleurd met fluoresceïne na alkaliverbranding in een konijnenmodel. Kobaltblauw licht werd gebruikt als lichtbron. De foto is genomen vlak na de alkaliblessure. (C) Een genezen epitheeldefect in het konijnenoog 3 weken na alkaliletsel, met een verminderd vlekgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muis- en konijnenmodellen van hoornvliesletsel bieden een nuttig ex vivo en in vivo platform voor het monitoren van wondgenezing, het testen van nieuwe therapieën en het bestuderen van onderliggende mechanismen van wondgenezing en behandelingstrajecten. Verschillende diermodellen kunnen worden gebruikt voor een kortlopend of langlopend experiment, afhankelijk van het doel van het onderzoek. Bijvoorbeeld, na het creëren van een epitheeldefect op het hoornvlies van de muis in vivo, kan een beperkt epitheeldefect worden gebruikt om vloeibare therapeutische middelen in een klein volume te controleren. Tegelijkertijd kunnen omliggende functionele eenheden, zoals oogleden, traansysteem en het bindvlies, worden geëvalueerd onder in vivo-omstandigheden , in tegenstelling tot celkweek- of ex-vivocultuuromstandigheden . Tarsorrhafie kan in deze situatie nog steeds nodig zijn als de bewegingen van muizen de experimentele toestand kunnen beïnvloeden. Het is gemakkelijker om een cirkelvormige wond waar te nemen en te kwantificeren dan een eenvoudige lineaire kraswond4. Huidpons om een demarcatielijn op het hoornvlies te creëren, moet echter zorgvuldig worden gedaan zonder door het membraan van de Bowman te snijden, wat anders een diepe hoornvliesbeschadiging of een doordringende wond zal achterlaten. De mechanische hoornvlieswond kon ook worden gemaakt door een 8 mm corneale trephine en een scalpelblad in een konijnenmodel15, waarbij een diepere wond tot voorste stroma in plaats van het cornea-epitheel werd gepresenteerd.
Het verwijderen van cornearoestringen is een ander cruciaal probleem dat het vermelden waard is. Omdat de oogbol van de muis klein is, kan over- of onderverwijdering van het hoornvliesepitheel optreden, waardoor de nauwkeurigheid van het onderzoek wordt beïnvloed. Het markeren van het hoornvlies met een huidbiopsie en fluoresceïnegeleide operatie zal helpen deze fouten te verminderen. Hoewel cauterie- en scalpelbladen in diermodellen6,7 zijn voorgesteld als hulpmiddelen om hoornvliesepitheel te verwijderen, kan de schade aan het oogoppervlak mogelijk niet gemakkelijk worden gecontroleerd en op dezelfde manier worden gereproduceerd, wat mogelijk leidt tot inconsistente resultaten in verdere experimenten.
In vergelijking met de in vivo toestand zijn ex vivo gekweekte muizenoogbollen in 48-putplaten gemakkelijker te manipuleren vanwege een grotere werkruimte op de platen en kunnen ze worden gebruikt om complexe middelen tegelijkertijd in verschillende kweekmedia te testen, zoals medicijn-eluterende contactlenzen en celtherapieën. Wanneer muizenoogbollen worden geoogst en overgebracht op een plaat met 48 putten, is een zorgvuldige bescherming van het hoornvlies belangrijk om extra kunstmatige schade aan het oogoppervlak en scheuring van de oogbollen te voorkomen. Voor het volgende onderzoek kan de oogbol worden gefixeerd in de met paraffine bedekte put met het hoornvlies naar boven gericht en ondergedompeld in een kweekmedium. Zwevende of roterende oogbollen of uitgedroogd hoornvlies zullen de resultaten belemmeren. Aangezien dit ex vivo muismodel zich richt op veranderingen over het oogoppervlak, worden andere functionele eenheden, zoals traanklier en oogleden, niet besproken in dit ex vivo model. Ex vivo muismodel verlaagt ook de kosten van het fokken en huisvesten van muizen en bespaart experimentele ruimte, in vergelijking met in vivo diermodel. Dit model is geschikt voor een kortetermijnstudie in plaats van een langetermijnstudie, omdat potentiële weefselinfectie en orgaanfalen zich op de lange termijn kunnen ontwikkelen.
Hoewel het muismodel minder kost en in het laboratorium kan worden opgeschaald, beperkt een klein oppervlak mogelijk de waarneming van gedetailleerde veranderingen van het hoornvlies, zoals lipideafzetting en neovascularisatie door stereomicroscopen. In plaats daarvan kan een konijnenmodel van hoornvliesletsel met een grotere diameter van de oogbol dit nadeel over het algemeen compenseren. Door de concentratie van NaOH en de inweektijd aan te passen, kunnen verschillende graden van de ernst van de alkaliverbranding van het hoornvlies worden gecreëerd. In chemische brandmodellen bij ratten werd 1 N NaOH gebruikt om het hoornvlies te weken met 3 mm filterpapier voor 40 s en 4 mm filterpapier voor 20 s, wat een vergelijkbaar maar kleiner gebied voor observatie16,17 opleverde. Om de alkaliverbranding consistent te houden in grootte en concentratie, wordt een gloednieuwe en scherpe pons voorgesteld bij de bereiding van 8 mm filterpapier om vezels of ongevulde hoeken aan de papierrand te vermijden. Voldoende irrigatie om chemische middelen van het oogoppervlak en de conjunctivale zak weg te spoelen, is vereist om continue schade buiten de wond te verminderen. Aangezien het nictiterende membraan van konijnen de experimentele procedure kan verstoren en pijn kan veroorzaken wanneer het wordt gecorrodeerd door alkali-middelen, moet het zorgvuldig worden beschermd en na de procedure weer in een fysiologische positie worden gebracht om extra ontsteking over het oogoppervlak te verminderen. Na de procedure van alkaliverbranding kan de hoornvlieswond van het konijn worden beschermd door tarsorrhaphy of ander materiaal zoals contactlenzen om de kwaliteit en consistentie van experimenten te waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De studie werd gefinancierd door de Atomic Energy Council of Taiwan (Grant No. A-IE-01-03-02-02), Ministry of Science and Technology (Grant No. NMRPG3E6202-3) en Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
