Summary
Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.
Abstract
La lesión corneal en la superficie ocular, incluyendo quemaduras químicas y traumatismos, puede causar cicatrices graves, simblefarón, deficiencia de células madre limbares corneales y provocar un defecto epitelial corneal grande y persistente. El defecto epitelial con la siguiente opacidad corneal y la neovascularización periférica resultan en una discapacidad visual irreversible y dificultan el manejo futuro, especialmente la queratoplastia. Dado que el modelo animal se puede utilizar como una plataforma efectiva de desarrollo de fármacos, aquí se desarrollan modelos de lesión corneal en el ratón y quemaduras alcalinas en el epitelio corneal del conejo. El conejo blanco de Nueva Zelanda se utiliza en el modelo de quema alcalina. Se pueden aplicar diferentes concentraciones de hidróxido de sodio en el área circular central de la córnea durante 30 s bajo anestesia intramuscular y tópica. Después de una copiosa irrigación salina normal isotónica, se eliminó el epitelio corneal suelto residual con rebaba corneal profundamente hasta la capa de Bowman dentro de esta área circular. La cicatrización de heridas se documentó mediante tinción con fluoresceína bajo luz azul cobalto. Se utilizaron ratones C57BL/6 en el modelo traumático de epitelio corneal murino. La córnea central murina se marcó con un punzón de piel, de 2 mm de diámetro, y luego se desbridó con un removedor de anillo de óxido corneal con una rebaba de 0,5 mm bajo un microscopio estereoscópico. Estos modelos se pueden utilizar prospectivamente para validar el efecto terapéutico de gotas para los ojos o agentes mixtos como las células madre, que potencialmente facilitan la regeneración epitelial corneal. Al observar la opacidad corneal, la neovascularización periférica y la congestión conjuntival con estereomicroscopio y software de imágenes, se pueden monitorear los efectos terapéuticos en estos modelos animales.
Introduction
La córnea humana consta de cinco capas principales y desempeña un papel fundamental en la refracción ocular para mantener la agudeza visual y la integridad estructural para proteger los tejidos intraoculares1. La parte más externa de la córnea es el epitelio corneal, compuesto por cinco a seis capas de células que se diferencian secuencialmente de las células basales y se mueven hacia arriba para desprenderse de la superficie ocular1. En comparación con la córnea en humanos y conejos de Nueva Zelanda, la córnea de ratón tiene una estructura corneal similar, pero una periferia más delgada que la parte central debido a un grosor reducido en el epitelio y el estroma2. Debido a su posición única en el sistema óptico ocular, muchos insultos externos como lesiones mecánicas, inoculación bacteriana y agentes químicos pueden poner en peligro fácilmente la integridad epitelial y provocar un defecto epitelial que amenaza la visión, queratitis infecciosa, fusión corneal e incluso perforación corneal.
Aunque varios agentes terapéuticos, como lubricantes, antibióticos, agentes antiinflamatorios, productos de autosuero y membrana amniótica ya se han utilizado para mejorar la reepitelización y reducir las cicatrices, otras posibles modalidades de tratamiento que pueden permitir la cicatrización de heridas, reducir la inflamación y suprimir la formación de cicatrices todavía se están desarrollando y probando en diferentes plataformas. Se han propuesto varios modelos animales para la cicatrización de heridas epiteliales corneales, incluida la eliminación del epitelio corneal con un removedor de anillo de óxido corneal en ratón diabético3, rasguños lineales sobre el epitelio corneal del ratón mediante una aguja estéril de 25 G para la inoculación bacteriana4, eliminación asistida por trepines del epitelio corneal mediante removedor de anillo de óxido corneal5, cauterización epitelial sobre la mitad de la córnea y el limbo6 , abrasión corneal de conejo facilitada por trefina por una hoja de bisturí opaca7, y lesión de la córnea bovina por congelación repentina en nitrógeno líquido8.
Además de la lesión mecánica al epitelio corneal, los agentes químicos también son insultos comunes a la superficie ocular, especialmente los agentes ácidos y alcalinos. El hidróxido de sodio (NaOH, 0.1-1 N para 30-60 s) es uno de los productos químicos comúnmente utilizados en modelos murinos y de conejo de quemaduras químicas corneales 9,10,11,12,13. El etanol al 100% también se había aplicado a la córnea en el modelo de quemadura química de rata, seguido de un desguace mecánico adicional utilizando una cuchilla quirúrgica14. Dado que el mantenimiento de una superficie ocular sana depende de unidades funcionales, incluidos los párpados, las glándulas de Meibomio, el sistema lagrimal, la conjuntiva y la córnea, los modelos animales in vivo tienen algunos méritos sobre las células epiteliales de córnea cultivadas ex vivo o los tejidos corneales. En este artículo, se demuestra el modelo de ratón de la herida por abrasión corneal y el modelo de conejo de quemadura alcalina corneal.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales en estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación del Chang Gung Memorial Hospital y se adhirieron a la declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.
1. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón
- Preparación de los ratones
- Administrar anestesia general a ratones C57BL/6 mediante administración intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (80-100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal).
- Asegúrese de que la anestesia general esté funcionando confirmando la pérdida de movimiento a un estímulo nocivo y la pérdida del reflejo de enderezamiento en ratones.
- Fijar la cabeza de los ratones a mano y aplicar anestesia tópica en ambos ojos con una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% (Figura 1A). Desinfecte la superficie ocular y los párpados tres veces con betadina al 5%.
- Creación de un modelo murino de herida epitelial corneal
NOTA: Realice los siguientes procedimientos bajo un microscopio estereoscópico. La herida corneal se creó in vivo, no ex vivo, para manipular el globo ocular mejor y cerca de la situación del mundo real. Este es un procedimiento terminal; por lo tanto, solo se requieren instrumentos limpios (no técnicos estériles).- Marque la córnea central del ratón con un punzón de biopsia de piel (2 mm de diámetro) para confirmar un área bien circunscrita y bien medible de la herida.
- Aplique suavemente la punzón sobre la córnea central para dejar una marca circular (Figura 1B). Utilizando un removedor de anillo de óxido corneal de mano con una rebaba de 0,5 mm, desbridar el epitelio corneal hasta la capa de Bowman asegurándose de no dañar este último (Figura 1C). Retire los tejidos sueltos residuales internos al margen de la herida con fórceps corneales.
- Confirmar el área de desbridamiento con tinción fluoresceínica (Figura 1D). Para realizar la tinción con fluoresceína, coloque una gota de solución salina normal en un papel de fluoresceína para disolver la fluoresceína, y luego coloque la gota que contiene fluoresceína sobre el defecto epitelial murino para visualizarlo bajo la luz azul cobalto.
- Cultivo ex vivo del modelo murino de herida por abrasión corneal.
- Para cosechar los globos oculares murinos, proceda de la siguiente manera.
- Sacrificar los ratones por luxación cervical después de inducir la anestesia con isoflurano al 5% en una cámara de inducción. Asegúrese de que la anestesia esté funcionando confirmando la pérdida de movimiento a un estímulo nocivo y la pérdida del reflejo de enderezamiento en ratones.
- Presione suavemente con la punta de los fórceps en los bordes orbitales superior e inferior para empujar el globo ocular hacia afuera. Introduzca la punta de las tijeras corneales cerradas en el espacio retrobulbar a lo largo de la pared orbital inferior, asegurándose de no penetrar en el globo ocular.
- Mantenga el globo ocular firme con pinzas corneales de 0,3 mm y luego corte el nervio óptico y el tejido blando periorbitario con tijeras corneales para aislar el globo ocular.
- Para el cultivo ex vivo de globos oculares murinos, proceda de la siguiente manera.
- Prepare una placa de 48 pocillos con cera derretida dentro del pozo y espere a que se solidifique. Con la punta de las pinzas de la conjuntiva, cree un orificio redondo en la superficie de cera solidificada para acomodar los globos oculares.
- Coloque los globos oculares cosechados directamente sobre la placa de 48 pocillos (Figura 1E) con fondos y paredes laterales cubiertos de cera para establecer la estabilización (Figura 1F).
- Cultivar los globos oculares con el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 1% de suero fetal bovino (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% deCO2 a 37 °C con o sin antibióticos, dependiendo del propósito del estudio.
NOTA: Si el modelo se utiliza para estudiar la cicatrización de heridas epiteliales corneales, se requerirían antibióticos para prevenir la infección. Sin embargo, si este modelo se utiliza para evaluar la eficacia de los antibióticos o agentes mixtos, los antibióticos profilácticos no serían necesarios. - Sumerja la superficie ocular con el medio de cultivo sin hacer que el globo ocular flote.
- Documente el curso de la cicatrización de heridas mediante tinción con fluoresceína (paso 1.2.3) y la recopilación de fotografías con una cámara digital bajo luz azul cobalto.
NOTA: En experimentos prospectivos con modelos de ratones de lesión corneal mecánica, aquellos que recibieron abrasión corneal y probaron más a fondo la eficacia de los agentes terapéuticos se consideran un grupo experimental, y aquellos que reciben abrasión corneal sin tratamiento adicional se consideran un grupo de control negativo.
2. Modelo de conejo in vivo de lesión alcalina corneal
NOTA: En este modelo, se induce una lesión por quemadura alcalina seguida de un desbridamiento mecánico del epitelio corneal para generar un área bien definida y uniforme de la herida para su posterior cuantificación. Esterilice todos los instrumentos antes de usarlos.
- Preparación del conejo con analgesia preoperatoria, incluida la inyección intramuscular de analgésicos sistémicos y gotas tópicas para los ojos.
- Administrar anestesia general a conejos blancos de Nueva Zelanda mediante inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina (35-44 mg/kg de peso corporal), mezclado con xilazina (5-10 mg/kg de peso corporal) en la pata trasera.
- Después de colocar el conejo y cubrirlo con una toalla, aplique anestesia tópica sobre el ojo derecho con una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% (Figura 2A) bajo un microscopio estereoscópico. Desinfecte la superficie ocular y los párpados tres veces con betadina al 5%.
- Inducir lesiones por quemaduras alcalinas sobre la córnea
- Coloque papeles de filtro circulares con un diámetro de 8 mm (cortados con un punzón de 8 mm) en una placa de Petri. Con un gotero, agregue hidróxido de sodio (NaOH) de 0,5 N en la placa de Petri para remojar los papeles de filtro. Drene el exceso de solución de NaOH de los papeles de filtro antes de colocarlos en la córnea del conejo.
PRECAUCIÓN: 0.5 N NaOH puede causar lesiones erosivas graves a los tejidos humanos. Use guantes cuando manipule. Si la piel o los ojos entran en contacto con gotitas de NaOH, se requiere irrigación con grandes cantidades de solución salina normal y ayuda médica para reducir el daño adicional. - Después de abrir los párpados con un espéculo del párpado y confirmar que la membrana nictitante del conejo no está interfiriendo con la inserción del papel de filtro (Figura 2B), coloque el papel de filtro circular empapado en NaOH 0.5 N en la córnea central durante 30 s, y luego retírelo con fórceps (Figura 2C).
- Después de retirar el papel de filtro, enjuague la superficie ocular con 10 ml de solución salina normal para eliminar el material alcalino.
- Coloque papeles de filtro circulares con un diámetro de 8 mm (cortados con un punzón de 8 mm) en una placa de Petri. Con un gotero, agregue hidróxido de sodio (NaOH) de 0,5 N en la placa de Petri para remojar los papeles de filtro. Drene el exceso de solución de NaOH de los papeles de filtro antes de colocarlos en la córnea del conejo.
- Defecto epitelial corneal completo
- Desacredite el epitelio corneal dentro del área opacificada hasta la membrana de Bowman usando un removedor de anillo de óxido corneal con una rebaba de 0,5 mm (Figura 2D).
- Confirme el área de desbridamiento con tinción fluoresceínica bajo la luz azul cobalto y retire el epitelio corneal residual utilizando fórceps corneales (Figura 2E).
- Condición segura de la herida con tarsorrafia
- Confirme que la membrana nictitante cubre suavemente la superficie ocular y el defecto epitelial corneal en el lado nasal. Asegúrese de que la membrana nictitante no esté doblada o distorsionada demasiado para interferir con el proceso de curación de heridas y el experimento.
- Realizar una tarsorrafia temporal con o sin agentes tópicos utilizando una sutura 6-0 para proteger la superficie ocular y evitar que el conejo se rasque (Figura 2F). Asegúrese de que la sutura para la tarsorrafia esté a 3-4 mm de los márgenes superior e inferior del párpado con 4-5 lazos y nudos más largos para evitar que el conejo rompa las suturas.
NOTA: Si el experimento no está involucrado en un estudio de antibióticos, se podrían considerar agentes tópicos con antibióticos. - En este modelo de conejo, aquellos que recibieron quemaduras alcalinas y extirpación del epitelio corneal fueron considerados como el grupo de control.
NOTA: En experimentos prospectivos, los conejos que reciben lesiones corneales por quemaduras alcalinas y se tratan posteriormente con agentes terapéuticos se consideran un grupo experimental. Los conejos que reciben tratamiento de quemaduras alcalinas solamente, sin tratamiento adicional, se consideran un grupo de control negativo.
- Analgesia postoperatoria y control del dolor
- Evaluar la condición fisiológica y los niveles de dolor del USDA durante 7 días después del procedimiento, mediante el monitoreo del dolor y la angustia en los animales. Considere el uso de ungüento de tobramicina y una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% de acuerdo con el resultado de la evaluación. Administrar buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) cada 6-8 horas durante 3 días.
NOTA: Para la medición diaria del área defectuosa y la observación después de la cirugía, el procedimiento pertenece a la categoría D del USDA.
- Evaluar la condición fisiológica y los niveles de dolor del USDA durante 7 días después del procedimiento, mediante el monitoreo del dolor y la angustia en los animales. Considere el uso de ungüento de tobramicina y una gota de solución oftálmica de clorhidrato de proparacaína al 0,5% de acuerdo con el resultado de la evaluación. Administrar buprenorfina HCl (0,03 mg/kg) cada 6-8 horas durante 3 días.
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Representative Results
Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón:
Después del desbridamiento in vivo del epitelio corneal del ratón con removedor de anillo de óxido corneal de mano, se puede encontrar un área corneal central ligeramente deprimida con tinción positiva de fluoresceína en el área central de 2 mm (Figura 3A-B). Después de cosechar el globo ocular del ratón, se fijó fácilmente en una placa de cultivo de 48 pocillos recubierta de cera sin rotación significativa. Siguiendo el protocolo, el cultivo ex vivo de los globos oculares murinos puede examinarse y documentarse diariamente dentro de una placa de cultivo de 48 pocillos bajo un microscopio estereoscópico (Figura 3C). Un día después de desbridar el epitelio corneal murino, un defecto epitelial circular teñido con fluoresceína medido de 2 mm de diámetro puede revelarse en fotografías digitales obtenidas bajo luz azul cobalto (Figura 3D). El margen inicial de la herida teñido irregularmente o la tinción fluoresceínica negativa significa la extirpación incompleta o fallida del epitelio corneal. En el proceso normal de cicatrización de heridas, el defecto epitelial corneal sanará con un área reducida teñida con fluoresceína en 2-3 días.
Modelo de conejo in vivo de lesión alcalina corneal:
Antes de cualquier procedimiento, el epitelio corneal de conejo intacto no se puede teñir con tinción fluoresceínica. Después de crear una lesión alcalina en el epitelio corneal del conejo, se puede observar tinción positiva de fluoresceína con o sin luz azul cobalto sobre la córnea central con un margen circular claro y completo (Figura 4A-B y Figura 5B). La tinción incompleta con área sin relleno representa tejidos epiteliales corneales residuales o tinción fallida. Durante el seguimiento regular, la herida epitelial corneal se vuelve a epitelizar con crecimiento interno de pannus del limbo, seguido de una reducción del área teñida (Figura 5C). El defecto epitelial se cura en 3-4 semanas. Si se desarrolla abruptamente una úlcera corneal, un defecto epitelial grande o un defecto epitelial grande o una secreción blanquecina o mucosa masiva, tarsorrafia insegura, suturas expuestas, una membrana nictitante mal posicionada o un cuerpo extraño dentro de la conjuntiva palpebral.
Figura 1: Procedimientos para configurar un modelo de ratón de lesión mecánica corneal . (A) Se aplica anestesia tópica antes del procedimiento. (B) Se realiza una hendidura suave sobre la córnea central con una biopsia de piel trefina de 2 mm. (C) El removedor del anillo de óxido corneal se utiliza para eliminar el epitelio corneal central. (D) Un defecto epitelial se tiñe con fluoresceína para confirmar el área del defecto y compararlo con la región marcada en B. (E,F) El globo ocular del ratón se cosecha y se transfiere a una placa de 48 pocillos cubierta con cera de antemano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos para construir un modelo de conejo de lesión corneal alcalina . (A) Se aplica anestesia tópica a la superficie ocular. (B) Se utiliza un espéculo de párpado para abrir los párpados superior e inferior, sin doblar o apretar la membrana nictitante. (C) Se coloca un papel de filtro trepinado empapado en NaOH (8 mm de diámetro) sobre la córnea central. (D) El removedor de anillo de óxido corneal se utiliza para desbridar el epitelio central de 8 mm hasta la capa de Bowman. (E) El defecto del epitelio se tiñe con fluoresceína. (F) Después del procedimiento, se realiza una tarsorrafia para proteger la herida de rasguños. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados positivos y negativos en un modelo de ratón de lesión mecánica corneal . (A) Epitelio corneal de ratón intacto sin ninguna tinción antes del procedimiento. (B) Tinción positiva in vivo con fluoresceína en la herida corneal murina sin luz azul cobalto. (C) Cultivo ex vivo del globo ocular del ratón sin agregar tinción de fluoresceína antes de agregar el medio de cultivo. (D) Tinción positiva con fluoresceína en defecto epitelial corneal en modelo de ratón ex vivo . El defecto epitelial de 2 mm generalmente se cura dentro de 2-3 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados de la tinción con fluoresceína en un modelo de conejo de lesión alcalina corneal. (A) Tinción positiva de fluoresceína bajo luz azul cobalto. La fotografía fue tomada justo después de la lesión corneal mecánica. (B) También se pudo observar tinción positiva con colorante fluoresceína en la superficie ocular del conejo sin luz azul cobalto. (C) Tinción negativa en la superficie ocular cicatrizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Curso temporal de la cicatrización de heridas y aparición de reepitelización en un modelo de conejo de lesión alcalina corneal . (A) La reepitelización en modelos de ratón y conejo toma 2-3 días y 3-4 semanas, respectivamente. (B) Un defecto epitelial de 8 mm teñido con fluoresceína después de una quemadura alcalina en un modelo de conejo. La luz azul cobalto se utilizó como fuente de luz. La fotografía fue tomada justo después de la lesión alcalina. (C) Un defecto epitelial curado en el ojo de conejo 3 semanas después de la lesión alcalina, que muestra un área de tinción reducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los modelos de ratón y conejo de lesión corneal proporcionan una plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorear la cicatrización de heridas, probar nuevas terapias y estudiar los mecanismos subyacentes de las vías de curación y tratamiento de heridas. Se pueden utilizar diferentes modelos animales para un experimento a corto o largo plazo, dependiendo del propósito de la investigación. Por ejemplo, después de crear un defecto epitelial en la córnea de ratón in vivo, se podría usar un defecto epitelial confinado para monitorear agentes terapéuticos líquidos en un volumen pequeño. Al mismo tiempo, las unidades funcionales circundantes, como los párpados, el sistema lagrimal y la conjuntiva, se pueden evaluar en condiciones de in vivo, a diferencia del cultivo celular o las condiciones de cultivo ex vivo . La tarsorrafia todavía puede ser necesaria en esta situación si los movimientos de los ratones pueden afectar la condición experimental. Es más fácil observar y cuantificar una herida circular que una simple herida lineal por rasguño4. Sin embargo, el punzón de piel para crear una línea de demarcación en la córnea debe hacerse con cuidado sin cortar a través de la membrana de Bowman, que de lo contrario dejará una lesión corneal profunda o una herida penetrante. La herida corneal mecánica también podría ser creada por un trepano corneal de 8 mm y una hoja de bisturí en un conejo modelo15, en el que se presentó una herida más profunda hasta el estroma anterior en lugar del epitelio corneal.
La eliminación del anillo de óxido corneal es otro tema fundamental que vale la pena mencionar. Dado que el globo ocular del ratón es pequeño, puede producirse una extracción excesiva o insuficiente del epitelio corneal, lo que afecta la precisión de la investigación. Marcar la córnea con un punzón de biopsia de piel y una operación guiada por fluoresceína ayudará a reducir estos errores. Aunque las hojas de cauterio y bisturí han sido propuestas como herramientas para eliminar el epitelio corneal en modelos animales6,7, el daño sobre la superficie ocular puede no ser fácilmente controlado y reproducido de la misma manera, lo que potencialmente conduce a resultados inconsistentes en experimentos posteriores.
En comparación con la condición in vivo, los globos oculares de ratón cultivados ex vivo en placas de 48 pocillos son más fáciles de manipular debido a un espacio de trabajo más grande en las placas y se pueden usar para probar agentes complejos en varios medios de cultivo al mismo tiempo, como lentes de contacto liberadores de fármacos y terapias celulares. Cuando los globos oculares de ratón se cosechan y se transfieren a una placa de 48 pocillos, la protección meticulosa de la córnea es importante para evitar daños artificiales adicionales en la superficie ocular y la ruptura de los globos oculares. Para el siguiente estudio, el globo ocular se puede fijar dentro del pocillo recubierto de parafina con la córnea hacia arriba y sumergirse dentro de un medio de cultivo. Los globos oculares flotantes o giratorios o la córnea deshidratada dificultarán los resultados. Dado que este modelo de ratón ex vivo se centra en los cambios sobre la superficie ocular, otras unidades funcionales, como la glándula lagrimal y los párpados, no se discuten en este modelo ex vivo . El modelo de ratón ex vivo también reduce el costo de criar y alojar ratones y ahorra espacio experimental, en comparación con el modelo animal in vivo . Este modelo es adecuado para un estudio a corto plazo, en lugar de uno a largo plazo, ya que la posible infección tisular y la insuficiencia orgánica pueden desarrollarse a largo plazo.
Aunque el modelo de ratón cuesta menos y se puede ampliar en el laboratorio, una pequeña área de superficie limita potencialmente la observación de cambios detallados de la córnea, como la deposición de lípidos y la neovascularización mediante microscopios estereoscópicos. En cambio, un modelo de conejo de lesión corneal con un diámetro mayor del globo ocular generalmente puede compensar esta desventaja. Al ajustar la concentración de NaOH y el tiempo de remojo, se pueden crear diferentes grados de la gravedad de la quemadura alcalina corneal. En modelos de quemaduras químicas en ratas, se utilizó NaOH 1 N para remojar la córnea con papel de filtro de 3 mm durante 40 s y papel de filtro de 4 mm durante 20 s, proporcionando un área similar pero más pequeña para la observación16,17. Para mantener la quemadura alcalina constante en tamaño y concentración, se sugiere un punzón nuevo y afilado en preparación de papel de filtro de 8 mm para evitar cualquier fibra o esquina sin relleno en el margen del papel. Se requiere suficiente irrigación para eliminar los agentes químicos de la superficie ocular y el saco conjuntival para reducir el daño continuo fuera de la herida. Dado que la membrana nictitante de conejo puede interferir con el procedimiento experimental e inducir dolor cuando se corroe con agentes alcalinos, debe protegerse cuidadosamente y volver a colocarse en posición fisiológica después del procedimiento para reducir la inflamación adicional sobre la superficie ocular. Después del procedimiento de quemadura alcalina, la herida corneal del conejo puede protegerse con tarsorrafia u otro material como lentes de contacto para asegurar la calidad y consistencia de los experimentos.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
El estudio fue financiado por el Consejo de Energía Atómica de Taiwán (Subvención No. A-IE-01-03-02-02), el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Subvención No. NMRPG3E6202-3) y el Proyecto de Investigación Médica Chang Gung (Subvención No. CMRPG3H1281).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
