Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63252
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Provincial Key Laboratory of Research in Structure Birth Defect Disease and Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי C57BL / 6J. מחקרים הראו כי התרחשות והתפתחות של NEC קשורים לעלייה בתאי T helper מסוג 2 (Th2) ובדרך כלל מלווים בזיהום. לכן, מחקר זה השתמש בעכברים BALB / c יילודים כדי לגרום למודל NEC עם מאפיינים קליניים דומים ושינויים פתולוגיים במעיים כמו אלה שנצפו אצל ילדים עם NEC. מחקר נוסף הוא מוצדק כדי לקבוע אם מודל זה בעלי חיים יכול לשמש כדי ללמוד תגובות תא Th2 ב NEC.

Abstract

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי C57BL / 6J. מחקרים הראו כי התרחשות והתפתחות של NEC קשורים לעלייה בתאי T helper מסוג 2 (Th2) ובדרך כלל מלווים בזיהום. לכן, מחקר זה השתמש בעכברים BALB / c יילודים כדי לגרום למודל NEC עם מאפיינים קליניים דומים ושינויים פתולוגיים במעיים כמו אלה שנצפו אצל ילדים עם NEC. מחקר נוסף הוא מוצדק כדי לקבוע אם מודל זה בעלי חיים יכול לשמש כדי ללמוד תגובות תא Th2 ב NEC.

Introduction

נמק enterocolitis (NEC), המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI), מתרחשת ברוב הפגים (>90%), במיוחד אלה עם משקל לידה נמוך מאוד (VLBW)1. בתינוקות פולקסווגן, שכיחות המחלה נעה בין 10% ל -12%, ותמותת הילדים שאובחנו עם NEC היא בין 20% ל -30% 2,3. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לפציעות רירית, פלישה על ידי חיידקים פתוגניים, והאכלת מעיים, אשר יכול להוביל לתגובות דלקתיות ואת אינדוקציה של פציעות מעיים ב המארחים הרגישים3. הפתוגנזה של NEC אינה ברורה. מחקרים רלוונטיים מראים כי התגובה החיסונית של התינוק המושפע היא חריגה, ורגישות גנטית, מתח מיקרו-וסקולרי ושינויים חיידקיים במעיים עשויים למלא תפקידים חשובים במחלה3.

מודל בעלי החיים NEC הוא כלי חיוני למחקר על הפתוגנזה של NEC. מיני בעלי החיים המשמשים למודלים של NEC הם חזירים, חולדות ועכברים. עם זאת, בשל תקופת ההיריון הארוכה, מחזורי הצמיחה והעלויות הגבוהות, בשנים האחרונות החזירים לא היו הבחירה הראשונה עבור דגמי NEC והוחלפו בחולדות או בעכברים4. מכיוון שיש הבדלים ברקע החיסוני של זני עכבר שונים5, מחקרים שונים צריכים להשתמש בזנים שונים של עכברים כדי להקים מודלים של בעלי חיים NEC. לעכברי BALB/c יש תכונה חשובה; כאשר הם נגועים או להתמודד עם נזק חיצוני, הקיטוב של תאי TH2 במהלך זיהום בעכברים הוא חזק משמעותית מזה בזנים אחרים של עכברים6,7,8. תאי עוזר T ממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות ובהתקדמות של NEC, במיוחד הפיתוח של תאי TH23,9,10,11. לכן, מחקר זה השתמש בעכברים BALB / c כדי להקים את מודל NEC, אשר עשוי להיות מועיל עבור מחקר מחלת NEC על תאי T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של המרכז הרפואי לנשים וילדים בגואנגג'ואו (מס '174A01) והוועדה האתית לבעלי חיים של גואנגג'ואו Forevergen Biosciences המעבדה לביוסיות מרכז בעלי חיים (IACUC-G160100). כל בעלי החיים גודלו באותו חדר בסביבה ספציפית ללא פתוגנים (SPF), וניסויים בוצעו בסביבה קונבנציונלית. העכברים ששימשו לרבייה היו בני 7-8 שבועות; העכברים לגרימת NEC (n = 72) הופרדו מהסכר ביום 4, והסכרים (n = 14) הוחזקו בכלוב המקורי וטיפלו בעכברים קבוצתיים (Cont.) (n = 24).

1. הכנת ריאגנטים ומכשירים

  1. הכן את תחליף החלב לעכברי BALB / c ביחס המקביל (אבקת חלב פגה: אבקת חלב עיזים = 2:1).
    הערה: ההרכבים התזונתיים הסופיים של חלב פורמולה12 מוצגים בטבלה 1.
  2. פתרון LPS (2.5 מ"ג/מ"ל)
    1. ממיסים בסך הכל 10 מ"ג אבקת LPS ב-4 מ"ל של מים מעוקרים עם זיקוק כפול, מערבבים היטב ומאחסנים במקרר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחר ההדבקה.
      הערה: פתרון LPS מאוחסן בחושך ב 2-8 °C (8 °F) לשימוש מיידי או ב -20 °C (20 °F) לאחסון לטווח ארוך.

2. לגרום לנמק enterocolitis בעכברים BALB / c יילודים

  1. להאכיל את העכברים יילודים.
    1. שמור את העכברים יילודים באותו כלוב עם הסכר, מטופל על ידי הסכר בימים 0-4.
    2. בליל יום 4 (כאשר העכברים היולדות שוקלים 2.5-3 גרם), להפריד את העכברים היילוד בקבוצת NEC מן הסכר כדי לגרום NEC, לשמור אותם באינקובטור בעלי חיים, ולהאכיל אותם עם נוסחה. עם זאת, הקבוצה Cont. מותר להישאר עם ולהיות מוזן על ידי הסכר.
      הערה: עכברים יילודים המופרדים מהסכר חייבים להיות מורמים באינקובטור בגלל ויסות טמפרטורת הגוף החלשה שלהם.
  2. הכן את צינור gavage על ידי השרייתו ב 75% מיכלי אלכוהול במשך 1-2 דקות ולשטוף אותם פעמיים במים נקיים, מזוקקים כפול.
    הערה: כדי למנוע זיהום צולב בין העכברים, יש לבצע את התהליך לעיל לאחר האכלת כל עכבר.
  3. לגרום למודל NEC.
    1. קח את העכברים הילודים מהסכר ביום 4 וצום אותם ללילה אחד.
    2. Gavage העכברים עם LPS (20-30 μL בכל פעם) ולהאכיל אותם עם נוסחה ביום 5 (40-50 μL בכל פעם).
    3. מיום 5 ואילך, הכפיפו את העכברים למחזור היפוקסיה-ראוקסיגניה-הלם קר פעמיים ביום במשך 5 ימים. מניחים את העכברים במכשיר היפוקסיה ב 5% O2 עבור 90 s ו reoxygenate אותם במשך 3 דקות; חזור על תהליך זה חמש פעמים. לאחר מכן, מניחים את העכברים בסביבה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן מעבירים אותם לאינקובטור. ראו איור 1A,B לתהליך האינדוקציה.
      הערה: מחזור של גירוי היפוקסיה-reoxygenation-קר בוצע פעם בבוקר ופעם אחר הצהריים. תערובת של 5% O2 עם 95% N2 הוכן במיכל, והריכוז נמדד עם גלאי חמצן.
  4. התבונן מקרוב בכל העכברים, שקול אותם כל יום, תיעד את הישרדות העכברים במהלך תקופת האינדוקציה, ותיעד את מאפייני הצואה (עם או בלי שרפרפים דביקים / שרפרפים מדממים).
    הערה: דגם NEC שנקבע נמשך 5 ימים.
  5. ביום 10 או מוקדם יותר, כאשר העכברים מראים תסמיני NEC (ileus, hematochezia, שלשולים)13, להרדים את העכברים על ידי הרדמה שאיפה עם איזופלוריין, ואז מיד לאסוף את רקמת המעי. אל תאסוף רקמות מהעכברים שמתו באופן ספונטני.
    הערה: במחקר זה, נקודת הקצה של המתת חסד העכבר הותאמה כאשר העכבר הציג המטוצ'זיה וכיחלון של כל הגוף.

3. גבאג' העכבר

  1. תקן את ראש העכבר, מחזיק את צינור הקיבה ביד ימין. הכנס את צינור הקיבה מהפינה השמאלית של פי העכבר.
    הערה: הראש תוקן עם האצבע המורה על ראשו של העכבר ולחץ בעדינות אחורה ולמטה כדי למנוע מהעכבר להתכופף קדימה במהלך הניתוח ולהשפיע על החדרת צינור הקיבה.
  2. לאט להזיז את הצינור למרכז הפה. לאחר החדרת הצינור כ 2-3 ס"מ, לדחוף 40-50 μL של נוסחה או 20-30 μL של LPS לתוך מערכת העיכול. ראו איור 2A,B עבור ה-gavage.
    הערה: בנסיבות רגילות, צינור הקיבה מוכנס למערכת העיכול בצורה חלקה. אם לעכבר יש רפלקס הקאות חזק, צינור הקיבה הוכנס לקנה הנשימה בטעות. צינור הקיבה חייב להיות שלף בעדינות את העכבר מותר לנוח לזמן מה לפני ניסיון gavage שוב. בנוסף, הליך gavage משמש כדי לגרום למודל של NEC לפני המתת חסד של עכברים.

4. לאסוף דגימות רקמת מעיים טריות עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) כתמים

  1. יש לטבול את רקמת האיליום הטרייה מהעכבר ב-10% פורמלין למשך 24 שעות.
  2. מטמיעים את הרקמות בפרפין ופורסים אותן ל-4 מיקרומטר.
  3. הפוך את החלקים בקסילן לטהר אותם ברציפות באתנול מוחלט, 95% אתנול, 80% אתנול, 80% אתנול, 70% אתנול, ומים מזוקקים, השריה במשך 5 דקות בכל שלב. להכתים את החלקים עם פתרון המטוקסילין במשך 5 דקות ולהבדיל אותם 1% חומצה הידרוכלורית ב 75% אלכוהול עבור 5 s. לבסוף, להכתים אותם עם פתרון אאוזין במשך 1 דקות.
    הערה: לאחר כתמים עם פתרון המטוקסילין, זה חייב להיות מובחן עם 1% חומצה הידרוכלורית באתנול כדי להסיר פתרון המטוקסילין קשור יתר על המידה וצבע המטוקסילין ציטופלסמי. הריכוז של 1% חומצה הידרוכלורית מתאים לרקמת המעי.
  4. בדוק את ההיסטופתולוגיה של רקמת המעי בהגדלה של פי 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מודל NEC עכבר BALB / c הושרה על ידי האכלת פורמולה, האכלת LPS, היפוקסיה, וגירוי קר. במהלך תקופת האינדוקציה, העכברים נצפו עבור פתולוגיה מעיים, מאפייני הצואה, שינויים במשקל הגוף, והישרדות יומיומית. תמונות מייצגות של המעי הדק במהלך אינדוקציה NEC; המספרים בתמונה מייצגים את ציון פתולוגיית המעי מ- 0 (אפיתל רגיל) ל- 4 (החמור ביותר) (איור 3A). הציון של פתולוגיה מעיים היה גבוה משמעותית בקבוצת NEC מאשר בקבוצת Cont. (איור 3B). המספרים בתמונה מייצגים ציוני שרפרף מ-0 (כדוריות מעוצבות היטב) ל-3 (שרפרפים נוזליים) (איור 3C). ביום 10, ציוני הצואה של קבוצות NEC היו גבוהים משמעותית בקבוצת NEC, מה שמצביע על כך שתפקוד לקוי של המעיים בקבוצת NEC היה חמור יותר (איור 3D). ביום 5, היום הראשון של אינדוקציה של מודל NEC, לא היה הבדל משמעותי בגודל הגוף בין שתי הקבוצות. עם זאת, ביום העשירי, העכברים בקבוצת NEC היו רזים יותר באופן משמעותי וקטנים יותר מהראש לזנב מאשר העכברים בקבוצת Cont. (איור 4A).

במהלך 5 הימים שבהם נקבע המודל, משקלם של העכברים בקבוצת NEC עלה לאט או אפילו הראה צמיחה שלילית, ושיעור ההישרדות של העכברים בקבוצת NEC ירד בהדרגה בהשוואה לקבוצת Cont. (איור 4B, C). בנוסף, קבוצה נוספת של עכברים שימשה כדי לגרום למודל NEC אך מבלי לאסוף את הרקמות; עד היום ה-13, כל העכברים בקבוצת NEC זו מתו, ועקומת ההישרדות צומצמה באופן משמעותי (איור S1 משלים). איור 5A מציג את המורפולוגיה והתוצאות הפתולוגיות (נמק של רקמת הרירית במעיים) של אזור האיליוצ'קל החתוך של רקמת המעי מחולי NEC בבית החולים הזה. במחקר זה, העכברים בקבוצת NEC (1/13) פיתחו דימום אילאוצ'קל ונמק (איור 5B).

Figure 1
איור 1: אינדוקציה של תהליך מודל BALB/c NEC. (א) העכברים בקבוצת NEC הופרדו מהסכר בלידה עד גיל 4 ימים (ביום 4) וצמו באותו לילה. מודל NEC הושרה מיום 5 ואילך לאחר הלידה ונמשך 5 ימים. דגימות רקמת מעיים נאספו ביום 10 או מוקדם יותר. העכברים בקבוצת קונט שוכנו ומטופלים על ידי הסכר. (ב) רצף הפעולות עבור כל יום לאחר גרימת מודל NEC. קיצורים: Cont. = שליטה; NEC = נמק enterocolitis; LPS = ליפופוליסכריד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: Gavage קיבה. (A) נעשה שימוש במכשיר gavage מיוחד במחקר זה, אשר שולב עם צינור פלסטיק ומזרק. (B) צינור הגבאג' נכנס מפינת הפה בזווית של 45° לקו האנכי. (ג) הצינור הועבר באיטיות למרכז פיו של העכבר כדי להבטיח שצינור הקיבה והוושט יהיו באותה רמה אנכית. קיצורים: D = קוטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מודל NEC של עכבר BALB/c. (A) פוטומיקוגרפיות של ציון פתולוגיית המעי משתי הקבוצות, למשל, המציגות רירית שלמה ונורמלית בקבוצת Cont. (ציון 0), הפרדת נפיחות תת-קומוניסטית קלה או למינה פרופריה בשתי קבוצות (ציון 1), הפרדת תת-קומוניזם מתונה ו/או למינה פרופריה בקבוצת NEC (ציון 2), הפרדת תת-מולקולה ו/או למינה פרופריה חמורה בקבוצת NEC (ציון 3), היעלמות villi מעיים עם נמק מעיים בקבוצת NEC (ציון 4). (B) ציוני פתולוגיית המעיים בעכברים לאחר אינדוקציה NEC היו גבוהים יותר מאלה של קבוצת Cont. (n = 9 בקבוצת Cont. , n = 35 בקבוצת NEC, *** P < 0.001 עם מבחן t של התלמיד). (ג) פוטומיקוגרפיות של ציוני שרפרף משתי קבוצות, למשל, המציגות כדורים מעוצבים היטב בקבוצת Cont. (ציון 0), נוצרו שרפרפים בשתי קבוצות (ציון 1), שרפרפים בעלי צורה למחצה בקבוצת NEC (ציון 2) ושרפרפים נוזליים בקבוצת NEC (ציון 3). (D) ציוני הצואה בקבוצת NEC היו גבוהים משמעותית מזה שבקבוצה Cont. (n = 6 בקבוצת Cont. , n = 13 בקבוצת NEC, *** P < 0.001 עם מבחן t של סטודנט). המשולש האדום מייצג את ההפרדה בין רירית לאמינה פרופריה, והחץ השחור מצביע על צואת עכבר. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: Cont. = control; NEC = נמק enterocolitis; הוא = המטוקסילין ואאוזין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השוואה בין צורת הגוף להישרדותם של עכברים בין קבוצת Cont. לבין קבוצת NEC. (A) הופעתן של שתי קבוצות העכברים ביום 5 וביום העשירי. (ב) סעיף זה מציג את שינויי המשקל של העכברים בשתי קבוצות לאורך זמן; ציר ה- x מייצג את מספר הימים לאחר לידת העכברים, וציר ה- y מייצג את שינויי המשקל של העכברים; **P < 0.01, ***P < 0.001 עם מבחן t של סטודנט כדי להשוות את קבוצת Cont. (n = 10) ואת קבוצת NEC (n = 27) (C) סעיף זה מציג את עקומות ההישרדות של עכברים בקבוצת הביקורת (n = 10) וקבוצת NEC (n = 25). קיצורים: Cont. = שליטה; NEC = נמק enterocolitis. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: דימום Ileocecal בילדים עם NEC ועכברים עם NEC. (A) דימום ונמק של אזור ileocecal אצל ילדים עם NEC. (B) דימום ונמק באזור ileocecal של עכברים עם NEC (1/13); עם זאת, המעיים של העכברים בקבוצת Cont. היו נורמליים, ללא דימום ונמק. המשולש השחור מתייחס לדימום מעיים ונמק, והחץ האדום מראה דימום ונמק של אזור האיליוצ'קל. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: Cont. = control; NEC = נמק enterocolitis. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הרכב עכבר (g/L) תחליף חלב (g/L)
חלבון 69-118 100
שומן 93-175 100
פחמימות 28-37 50
סידן 0.97-6.2 2.84
זרחן 1.6-2.72 1.62
נתרן 0.66-1.4 1
אשלגן 1.08-1.7 1.2
כלוריד 1.17-1.76 1.76
מגנזיום 0.0001-0.3 >0.12
אבץ 0.009-0.055 0.018
ברזל 0.004-0.007 0.017
נחושת 0.0017-0.007 0.0018

טבלה 1: רכיבי חלב בנוסחת חלב.

איור S1 משלים: עקומת ההישרדות צומצמה באופן משמעותי בקבוצת NEC כך שכל העכברים מתו באופן ספונטני (n = 5 בקבוצת Cont. , n = 10 בקבוצת NEC). קיצורים: Cont. = שליטה; NEC = נמק enterocolitis. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

NEC הוא מצב החירום הנפוץ ביותר במערכת העיכול עבור יילודים, עם שכיחות גבוהה ותמותה, במיוחד בפגים 1,2,3. עם זאת, הפתוגנזה שלה עדיין לא ברורה. הוא האמין כיום כי נזק הרירית, פלישת פתוגן, האכלה אנטאלית הם גורמי סיכון גבוה עבור NEC3. עד כה, בעלי החיים המשמשים למודל NEC הם בעיקר חזירים, חולדות ועכברים. רוב המחקרים השתמשו בעכברים יילודים C57BL/6 כדי לגרום NEC13,14,15,16, ומעט מאוד מחקרים השתמשו בעכברים יילודים BALB / c כדי לגרום NEC. עם זאת, עכברי BALB / c יש את היתרון של קיטוב התא Th 6,7,8, אשר מצדיק מחקר נוסף כדי לקבוע אם הם יכולים להיות מודל NEC טוב לחקר התא Th של המחלה.

התייחסנו לסטנדרט הציון הפתולוגי של נדלר מודל 17 ומצאנו שהציון של קבוצת NEC היה גבוה משמעותית מזה של קבוצת הביקורת. ציון ≥ 2 מציין NEC, ושיעור ההצלחה של גרימת NEC הוא 38-50%, הנמוך משיעור ההצלחה של 77% הצלחה של מודלים NEC במחקר על ידי קפלן ואח ' (DOI:10.3109/15513819409037698). הערכנו גם את ציוני השרפרף18 של שתי קבוצות העכברים ומצאנו כי הציונים של קבוצת NEC היו גבוהים יותר מאלה של קבוצת הביקורת. ככל שהציון גבוה יותר, כך תפקוד המעיים חמור יותר. כל הנתונים האלה מראים כי הקמת מודל NEC הצליחה. בנוסף, זה מעודד כי מודל העכבר BALB / c היילוד של NEC יכול לדמות NEC אנושי במידה מסוימת. דימום ונמק מתרחשים במעיים של ילדים עם NEC3,19; תנאים פתולוגיים דומים נצפו במודל זה.

Gavage הוא שלב המפתח בגרימת NEC במודל העכבר. אם פעולת gavage לא הייתה בשליטה במיומנות, זה היה קל בטעות למקם את צינור הקיבה לתוך קנה הנשימה ולגרום לעכבר למות. במהלך gavage קיבה, האגודל השמאלי, האצבע האמצעית, ואצבע הטבעת שימשו כדי להדק את שני צידי פלג הגוף העליון של העכבר, ואת האצבע המורה הונח על הראש כדי לתקן את העכבר במקום. זה היה כדי למנוע מהעכבר לנוע ולגרום לצינור הקיבה לפגוע בוושט. צינור הקיבה הוכנס מהפינה השמאלית של פיו של העכבר. רק כאשר צינור הקיבה נכנס לוושט בצורה חלקה ללא התנגדות נוכל להמשיך להכניס אותו. LPS או חלב נוסחה צריך להיות מוזרק רק לאחר החדרת צינור הקיבה 2-3 ס"מ מהשפה התחתונה של העכבר.

אורך היפוקסיה צריך להיות במעקב קפדני. במחקר זה, היפוקסיה נמשכה 90 שניות בכל פעם. אם היפוקסיה ארוכה מדי, העכברים לא יוכלו לסבול את זה וימותו. מודל זה עשוי לשמש לחקר תאי מערכת החיסון הקשורים ל- NEC, במיוחד תאי TH1 ו- TH23,9,10,10,11,20. בעתיד, אנו מתכננים לחקור אם מודל זה שימושי כדי ללמוד תגובות תא Th2 ב- NEC. בנוסף, מחקר זה הציג גם שיטה חדשה של ניקוד צואה כדי להעריך תפקוד לקוי של המעיים בעכברים עם NEC18. עם זאת, יש כמה מגבלות למחקר זה. לדוגמה, שיעור ההצלחה של המודל לא היה גבוה במיוחד. המאמצים נמשכים כדי לשפר את השיטה של BALB / c NEC מודלים כדי להגדיל את שיעור ההצלחה על ידי התאמת רמת היפוקסיה מ 5% O2 ל 1% O2, כפי שתואר בעבר15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לבנק המשאבים הביולוגיים הקליניים של המרכז הרפואי לנשים ולילדים בגואנגג'ואו על מתן המדגם הקליני ומרכז בעלי החיים של המעבדה לביו-מדעי גואנגג'ואו פוראברגן על אספקת עכברים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענק 81770510 (R.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 100092683
Goat Milk powder  Petag  71795558417
HE dye solution Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. G1003
Isoflurane RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD. R510  
LPS Sigma-Adrich L2880
Medical oxygen various various
Microscope NIKON NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 10004160
Paraffin various various
Premature baby milk powder Abbott 57430
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 10023418
1% Hydrochloric acid various various
10% Formalin LEAGENE DF0110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horbar, J. D., et al. Mortality and neonatal morbidity among infants 501 to 1500 grams from 2000 to 2009. Pediatrics. 129 (6), 1019-1026 (2012).
  2. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  3. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  4. Sangild, P. T., et al. Invited Review: The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91 (10), 4713-4729 (2013).
  5. Cancro, M. P., Sigal, N. H., Klinman, N. R. Differential expression of an equivalent clonotype among BALB/c and C57BL/6 mice. Journal of Experimental Medicine. 147 (1), 1-12 (1978).
  6. Kuroda, E., Yamashita, U. Mechanisms of enhanced macrophage-mediated prostaglandin E2 production and its suppressive role in Th1 activation in Th2-dominant BALB/c mice. Journal of Immunology. 170 (2), 757-764 (2003).
  7. Fornefett, J., et al. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 20 (2), 101-110 (2018).
  8. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  9. Sproat, T., Payne, R. P., Embleton, N. D., Berrington, J., Hambleton, S. T cells in preterm infants and the influence of milk diet. Frontiers in Immunology. 11, 1035 (2020).
  10. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  11. Afrazi, A., et al. New insights into the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors and beyond. Pediatric Research. 69 (3), 183-188 (2011).
  12. Auestad, N., Korsak, R. A., Bergstrom, J. D., Edmond, J. Milk-substitutes comparable to rat's milk; their preparation, composition and impact on development and metabolism in the artificially reared rat. British Journal of Nutrition. 61 (3), 495-518 (1989).
  13. Liu, Y., et al. Lactoferrin-induced myeloid-derived suppressor cell therapy attenuates pathologic inflammatory conditions in newborn mice. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4261-4275 (2019).
  14. MohanKumar, K., et al. A murine neonatal model of necrotizing enterocolitis caused by anemia and red blood cell transfusions. Nature Communications. 10 (1), 3494 (2019).
  15. He, Y. M., et al. Transitory presence of myeloid-derived suppressor cells in neonates is critical for control of inflammation. Nature Medicine. 24 (2), 224-231 (2018).
  16. Cho, S. X., et al. Characterization of the pathoimmunology of necrotizing enterocolitis reveals novel therapeutic opportunities. Nature Communications. 11 (1), 5794 (2020).
  17. Halpern, M. D., et al. Decreased development of necrotizing enterocolitis in IL-18-deficient mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (1), 20-26 (2007).
  18. Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
  19. Nino, D. F., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Necrotizing enterocolitis: new insights into pathogenesis and mechanisms. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 13 (10), 590-600 (2016).
  20. Chuang, S. L., et al. Cow's milk protein-specific T-helper type I/II cytokine responses in infants with necrotizing enterocolitis. Pediatric Allergy & Immunology. 20 (1), 45-52 (2009).

Tags

רפואה גיליון 177 אנטרוקוליטיס נמק עכברי BALB/C אימונולוגיה T helper סוג 2 תאים

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis
Posted by JoVE Editors on 03/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.

Figure 1 was updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tian, Y., Huang, J., Fu, M., He, Q., … More

Tian, Y., Huang, J., Fu, M., He, Q., Chen, J., Chen, Y., Zhang, R., Zhong, W. A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (177), e63252, doi:10.3791/63252 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter