Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस का एक नवजात BALB / c माउस मॉडल

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63252
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Provincial Key Laboratory of Research in Structure Birth Defect Disease and Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) सबसे गंभीर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) बीमारी है जो अक्सर समय से पहले शिशुओं में होती है, विशेष रूप से बहुत कम जन्म के वजन वाले शिशुओं, उच्च मृत्यु दर और अस्पष्ट रोगजनन के साथ। एनईसी का कारण भड़काऊ प्रतिरक्षा नियामक प्रणाली असामान्यताओं से संबंधित हो सकता है। एक एनईसी पशु मॉडल एनईसी रोग प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है। एनईसी पशु मॉडल आमतौर पर C57BL / 6J नवजात चूहों का उपयोग करते हैं; BALB / c नवजात चूहों का उपयोग शायद ही कभी किया जाता है। संबंधित अध्ययनों से पता चला है कि जब चूहों को संक्रमित किया जाता है, तो C57BL / 6J चूहों की तुलना में BALB / c चूहों में Th2 सेल भेदभाव प्रमुख होता है। अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एनईसी की घटना और विकास टी सहायक टाइप 2 (टी 2) कोशिकाओं में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और आमतौर पर संक्रमण के साथ होता है। इसलिए, इस अध्ययन ने नवजात बीएएलबी / सी चूहों का उपयोग समान नैदानिक विशेषताओं और आंतों के रोग संबंधी परिवर्तनों के साथ एक एनईसी मॉडल को प्रेरित करने के लिए किया, जैसा कि एनईसी वाले बच्चों में देखा गया था। आगे के अध्ययन को यह निर्धारित करने के लिए वारंट किया गया है कि क्या इस पशु मॉडल का उपयोग एनईसी में Th2 सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) सबसे गंभीर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) बीमारी है जो अक्सर समय से पहले शिशुओं में होती है, विशेष रूप से बहुत कम जन्म के वजन वाले शिशुओं, उच्च मृत्यु दर और अस्पष्ट रोगजनन के साथ। एनईसी का कारण भड़काऊ प्रतिरक्षा नियामक प्रणाली असामान्यताओं से संबंधित हो सकता है। एक एनईसी पशु मॉडल एनईसी रोग प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है। एनईसी पशु मॉडल आमतौर पर C57BL / 6J नवजात चूहों का उपयोग करते हैं; BALB / c नवजात चूहों का उपयोग शायद ही कभी किया जाता है। संबंधित अध्ययनों से पता चला है कि जब चूहों को संक्रमित किया जाता है, तो C57BL / 6J चूहों की तुलना में BALB / c चूहों में Th2 सेल भेदभाव प्रमुख होता है। अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एनईसी की घटना और विकास टी सहायक टाइप 2 (टी 2) कोशिकाओं में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है और आमतौर पर संक्रमण के साथ होता है। इसलिए, इस अध्ययन ने नवजात बीएएलबी / सी चूहों का उपयोग समान नैदानिक विशेषताओं और आंतों के रोग संबंधी परिवर्तनों के साथ एक एनईसी मॉडल को प्रेरित करने के लिए किया, जैसा कि एनईसी वाले बच्चों में देखा गया था। आगे के अध्ययन को यह निर्धारित करने के लिए वारंट किया गया है कि क्या इस पशु मॉडल का उपयोग एनईसी में Th2 सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी), सबसे गंभीर गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) रोग, अधिकांश समय से पहले शिशुओं (>90%) में होता है, विशेष रूप से बहुत कम जन्म वजन (वीएलबीडब्ल्यू) 1 के साथ। वीएलबीडब्ल्यू शिशुओं में, बीमारी की घटना 10% से 12% तक होती है, और एनईसी के साथ निदान किए गए बच्चों की मृत्यु दर 20% और 30% 2,3 के बीच होती है। एनईसी का कारण म्यूकोसल चोटों, रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा आक्रमण, और आंतों के भोजन से संबंधित हो सकता है, जिससे भड़काऊ प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं और अतिसंवेदनशील मेजबानों में आंतों की चोटों का प्रेरण हो सकता है। एनईसी का रोगजनन अस्पष्ट है। प्रासंगिक शोध से पता चलता है कि प्रभावित शिशु की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया असामान्य है, और आनुवंशिक संवेदनशीलता, माइक्रोवैस्कुलर तनाव और आंतों के जीवाणु परिवर्तन रोग 3 में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।

एनईसी पशु मॉडल एनईसी के रोगजनन पर अनुसंधान के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है। एनईसी मॉडल के लिए उपयोग की जाने वाली जानवरों की प्रजातियां सूअर, चूहे और चूहे हैं। हालांकि, लंबे समय तक गर्भावस्था की अवधि, विकास चक्र और उच्च लागत के कारण, हाल के वर्षों में, सूअर एनईसी मॉडल के लिए पहली पसंद नहीं रहे हैं और चूहों या चूहों के साथ बदल दिए गए हैं। जैसा कि विभिन्न माउस उपभेदों की प्रतिरक्षा पृष्ठभूमि में अंतर हैं5, विभिन्न अध्ययनों को एनईसी पशु मॉडल स्थापित करने के लिए चूहों के विभिन्न उपभेदों का उपयोग करने की आवश्यकता है। BALB / c चूहों में एक महत्वपूर्ण विशेषता है; जब वे संक्रमित होते हैं या बाहरी क्षति का सामना करते हैं, तो चूहों में संक्रमण के दौरान TH2 कोशिकाओं का ध्रुवीकरण चूहों के अन्य उपभेदों की तुलना में काफी मजबूत होता है6,7,8। टी सहायक कोशिकाएं एनईसी की घटना और प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, विशेष रूप से TH2 cells3,9,10,11 के विकास में। इसलिए, इस अध्ययन ने एनईसी मॉडल स्थापित करने के लिए बीएएलबी / सी चूहों का उपयोग किया, जो टी कोशिकाओं पर एनईसी रोग अनुसंधान के लिए सहायक हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस शोध को गुआंगज़ौ महिला और बच्चों के मेडिकल सेंटर (NO. 174A01) की मेडिकल एथिक्स कमेटी और गुआंगज़ौ फॉरएवरजेन बायोसाइंसेज लेबोरेटरी एनिमल सेंटर (IACUC-G160100) की पशु नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी जानवरों को एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) वातावरण में एक ही कमरे में पैदा किया गया था, और प्रयोगों को एक पारंपरिक वातावरण में किया गया था। प्रजनन के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहे 7-8 सप्ताह पुराने थे; एनईसी (एन = 72) को प्रेरित करने के लिए चूहों को दिन 4 पर बांध से अलग कर दिया गया था, और बांधों (एन = 14) को मूल पिंजरे में रखा गया था और नियंत्रण (Cont.) समूह चूहों (एन = 24) को नर्स किया गया था।

1. अभिकर्मकों और उपकरणों की तैयारी

  1. इसी अनुपात में BALB / c चूहों के लिए दूध विकल्प तैयार करें (समय से पहले बेबी मिल्क पाउडर: बकरी का दूध पाउडर = 2: 1)।
    नोट: सूत्र milk12 की अंतिम पोषण रचनाओं को तालिका 1 में दिखाया गया है।
  2. LPS समाधान (2.5 mg/mL)
    1. स्टरलाइज़्ड डबल-आसुत पानी के 4 मिलीलीटर में कुल 10 मिलीग्राम एलपीएस पाउडर को भंग करें, अच्छी तरह से मिलाएं, और एलीकोटिंग के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में स्टोर करें।
      नोट: LPS समाधान तत्काल उपयोग के लिए 2-8 °C पर या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 °C पर अंधेरे में संग्रहीत किया जाता है।

2. नवजात BALB / सी चूहों में नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस को प्रेरित करना

  1. नवजात चूहों को खिलाएं।
    1. नवजात चूहों को बांध के साथ एक ही पिंजरे में रखें, दिन 0-4 पर बांध द्वारा नर्स किया गया।
    2. दिन 4 की रात को (जब नवजात चूहों का वजन 2.5-3 ग्राम होता है), एनईसी समूह में नवजात चूहों को एनईसी को प्रेरित करने के लिए बांध से अलग करें, उन्हें एक पशु इनक्यूबेटर में रखें, और उन्हें सूत्र के साथ खिलाएं। हालांकि, Cont. समूह के साथ रहने और बांध द्वारा खिलाया जा करने की अनुमति है।
      नोट: नवजात चूहों कि बांध से अलग कर रहे हैं उनके कमजोर शरीर के तापमान विनियमन के कारण एक इनक्यूबेटर में उठाया जाना चाहिए.
  2. गैवेज ट्यूब को 1-2 मिनट के लिए 75% अल्कोहल कंटेनरों में भिगोकर तैयार करें और उन्हें साफ, डबल-आसुत पानी में दो बार धोएं।
    नोट: चूहों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, प्रत्येक माउस को खिलाने के बाद उपरोक्त प्रक्रिया की जानी चाहिए।
  3. एनईसी मॉडल को प्रेरित करें।
    1. दिन 4 पर बांध से नवजात चूहों को ले लो और उन्हें एक रात के लिए उपवास करें।
    2. एलपीएस (एक समय में 20-30 μL) के साथ चूहों को गेज करें और उन्हें दिन 5 (एक समय में 40-50 μL) पर सूत्र के साथ खिलाएं।
    3. दिन 5 के बाद से, चूहों को 5 दिनों के लिए दिन में दो बार हाइपोक्सिया-रीऑक्सीजनेशन-कोल्ड-शॉक चक्र के अधीन करें। 90 s के लिए 5% O2 पर एक हाइपोक्सिया डिवाइस में चूहों को रखें और उन्हें 3 मिनट के लिए पुन: ऑक्सीजेनेट करें; इस प्रक्रिया को पांच बार दोहराएं। इसके बाद, चूहों को 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस वातावरण में रखें और फिर उन्हें इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। प्रेरण प्रक्रिया के लिए चित्र 1A, B देखें।
      नोट: हाइपोक्सिया-रीऑक्सीजनेशन-कोल्ड उत्तेजना का एक चक्र सुबह में एक बार और दोपहर में एक बार किया गया था। कंटेनर में 95% N2 के साथ 5% O2 का मिश्रण तैयार किया गया था, और एकाग्रता को ऑक्सीजन डिटेक्टर के साथ मापा गया था।
  4. सभी चूहों का बारीकी से निरीक्षण करें, उन्हें हर दिन वजन करें, प्रेरण अवधि के दौरान चूहों के अस्तित्व को रिकॉर्ड करें, और मल की विशेषताओं को रिकॉर्ड करें (चिपचिपा मल / खूनी मल के साथ या बिना)।
    नोट: स्थापित NEC मॉडल 5 दिनों के लिए रहता है।
  5. दिन 10 या उससे पहले, जब चूहों को एनईसी लक्षण (इलियस, हेमाटोचेज़िया, दस्त) 13 दिखाई देते हैं, तो आइसोफ्लुरेन के साथ साँस लेने वाले संज्ञाहरण द्वारा चूहों को euthanize करें, फिर तुरंत आंतों के ऊतकों को इकट्ठा करें। चूहों से ऊतकों को इकट्ठा न करें जो अनायास मर गए।
    नोट: इस अध्ययन में, माउस इच्छामृत्यु के अंत-बिंदु को अनुकूलित किया गया था जब माउस ने पूरे शरीर के हेमटोचेज़िया और सायनोसिस को प्रदर्शित किया था।

3. माउस गेवेज

  1. माउस सिर को ठीक करें, दाएं हाथ में गैस्ट्रिक ट्यूब को पकड़कर। माउस के मुंह के बाएं कोने से गैस्ट्रिक ट्यूब डालें।
    नोट: सिर माउस के सिर पर तर्जनी के साथ तय किया गया था और धीरे से पीछे और नीचे दबाया गया था ताकि माउस को ऑपरेशन के दौरान आगे झुकने और गैस्ट्रिक ट्यूब के सम्मिलन को प्रभावित करने से रोका जा सके।
  2. धीरे-धीरे ट्यूब को मुंह के केंद्र में ले जाएं। ट्यूब को लगभग 2-3 सेमी डालने के बाद, सूत्र के 40-50 μL या LPS के 20-30 μL को पाचन तंत्र में धकेलें। गैवेज के लिए चित्र 2A, B देखें।
    नोट: सामान्य परिस्थितियों में, गैस्ट्रिक ट्यूब को पाचन तंत्र में सुचारू रूप से डाला जाता है। यदि माउस में एक मजबूत उल्टी पलटा है, तो गैस्ट्रिक ट्यूब को गलती से श्वासनली में डाला गया है। गैस्ट्रिक ट्यूब को धीरे से बाहर निकाला जाना चाहिए और माउस को फिर से गैवेज का प्रयास करने से पहले थोड़ी देर के लिए आराम करने की अनुमति दी जानी चाहिए। इसके अलावा, गेवेज प्रक्रिया का उपयोग चूहों की इच्छामृत्यु से पहले एनईसी के मॉडल को प्रेरित करने के लिए किया जाता है।

4. hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला के लिए ताजा आंतों के ऊतक ों के नमूने ले लीजिए

  1. माउस से ताजा इलियम ऊतक को 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में विसर्जित करें।
  2. पैराफिन में ऊतकों को एम्बेड करें और उन्हें 4 μm वर्गों में स्लाइस करें।
  3. जाइलीन में वर्गों को deparaffinize और उन्हें निरपेक्ष इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और आसुत पानी में क्रमिक रूप से rehydrate, प्रत्येक चरण में 5 मिनट के लिए भिगोना। 5 मिनट के लिए hematoxylin समाधान के साथ वर्गों दाग और उन्हें 5 s के लिए 75% अल्कोहल में 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड में अंतर। अंत में, उन्हें 1 मिनट के लिए ईोसिन समाधान के साथ दाग दें।
    नोट: हेमेटोक्सिलिन समाधान के साथ धुंधला होने के बाद, इसे इथेनॉल में 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ विभेदित किया जाना चाहिए ताकि अत्यधिक बाध्य हेमेटोक्सिलिन समाधान और साइटोप्लाज्मिक हेमेटोक्सिलिन डाई को हटाया जा सके। 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड की एकाग्रता आंतों के ऊतकों के लिए उपयुक्त है।
  4. 40x आवर्धन पर आंतों के ऊतकों के हिस्टोपैथोलॉजी की जांच करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BALB / c माउस NEC मॉडल सूत्र खिला, LPS खिला, हाइपोक्सिया, और ठंड उत्तेजना द्वारा प्रेरित किया गया था। प्रेरण अवधि के दौरान, चूहों को आंतों की विकृति, मल विशेषताओं, शरीर के वजन में बदलाव और दैनिक अस्तित्व के लिए देखा गया था। एनईसी प्रेरण के दौरान छोटी आंत की प्रतिनिधि छवियां; चित्र में संख्याएं 0 (सामान्य उपकला) से 4 (सबसे गंभीर) (चित्रा 3 ए) तक आंतों के पैथोलॉजी स्कोर का प्रतिनिधित्व करती हैं। आंतों की पैथोलॉजी स्कोर एनईसी समूह में Cont. समूह (चित्रा 3 B) की तुलना में काफी अधिक था। चित्र में संख्याएं 0 (अच्छी तरह से गठित छर्रों) से 3 (तरल मल) (चित्रा 3 सी) तक मल स्कोर का प्रतिनिधित्व करती हैं। दिन 10 पर, एनईसी समूहों के मल स्कोर एनईसी समूह में काफी अधिक थे, यह दर्शाता है कि एनईसी समूह में आंतों की शिथिलता अधिक गंभीर थी (चित्रा 3 डी)। दिन 5 पर, एनईसी मॉडल के प्रेरण के पहले दिन, दो समूहों के बीच शरीर के आकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। हालांकि, दिन 10 पर, एनईसी समूह में चूहे कॉन्ट समूह (चित्रा 4 ए) में चूहों की तुलना में सिर से पूंछ तक काफी पतले और छोटे थे।

5 दिनों के दौरान, जिसके दौरान मॉडल स्थापित किया गया था, एनईसी समूह में चूहों का वजन धीरे-धीरे बढ़ गया या यहां तक कि नकारात्मक विकास भी दिखाया गया, और एनईसी समूह में चूहों की जीवित रहने की दर धीरे-धीरे कॉन्ट समूह (चित्रा 4 बी, सी) की तुलना में कम हो गई। इसके अलावा, चूहों के एक और बैच का उपयोग एनईसी मॉडल को प्रेरित करने के लिए किया गया था, लेकिन ऊतकों को इकट्ठा किए बिना; दिन 13 तक, इस एनईसी समूह में सभी चूहों की मृत्यु हो गई थी, और उत्तरजीविता वक्र काफी कम हो गया था (पूरक चित्रा S1)। चित्रा 5A इस अस्पताल में एनईसी रोगियों से आंतों के ऊतकों के उच्छेदित इलियोसेकल क्षेत्र के आकृति विज्ञान और रोग संबंधी परिणामों (आंतों के म्यूकोसल ऊतक के परिगलन) को दर्शाता है। इस अध्ययन में, एनईसी समूह (1/13) में चूहों ने इलियोसेकल रक्तस्राव और परिगलन विकसित किया (चित्रा 5 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: BALB / c NEC मॉडल प्रक्रिया का प्रेरण। (A) NEC समूह में चूहों को जन्म के समय बांध से अलग कर दिया गया था जब तक कि वे 4 दिन (दिन 4 पर) नहीं थे और उस रात उपवास करते थे। एनईसी मॉडल जन्म के बाद दिन 5 से प्रेरित किया गया था और 5 दिनों तक चला था। आंतों के ऊतकों के नमूने दिन 10 या उससे पहले एकत्र किए गए थे। Cont. समूह में चूहों को बांध के साथ रखा गया था और नर्स किया गया था। (बी) एनईसी मॉडल को प्रेरित करने के बाद प्रत्येक दिन के लिए संचालन का अनुक्रम। संक्षेप: Cont. = नियंत्रण; NEC = नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस; LPS = lipopolysaccharide कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: गैस्ट्रिक गैवेज( ए) इस अध्ययन में एक विशेष गैवेज डिवाइस का उपयोग किया गया था, जिसे प्लास्टिक ट्यूब और सिरिंज के साथ जोड़ा गया था। (बी) गैवेज ट्यूब मुंह के कोने से ऊर्ध्वाधर रेखा के लिए 45° कोण पर प्रवेश करती है। (सी) ट्यूब को धीरे-धीरे माउस के मुंह के केंद्र में ले जाया गया ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि गैस्ट्रिक ट्यूब और एसोफैगस एक ही ऊर्ध्वाधर स्तर पर थे। संक्षेप: D = व्यास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: BALB / c माउस NEC मॉडल( A) दो समूहों से आंतों के पैथोलॉजी स्कोर के फोटोमाइक्रोग्राफ, उदाहरण के लिए, Cont. समूह (स्कोर 0) में बरकरार और सामान्य म्यूकोसा दिखाना, दो समूहों में हल्के सबम्यूकोसल या लामिना प्रोपरिया सूजन अलगाव (स्कोर 1), एनईसी समूह (स्कोर 2) में मध्यम सबम्यूकोसल और / या लामिना प्रोपरिया पृथक्करण, गंभीर सबम्यूकोसल और / या एनईसी समूह में लामिना प्रोपरिया पृथक्करण (स्कोर 3), एनईसी समूह (स्कोर 3) में गंभीर सबम्यूकोसल और / या लामिना प्रोपरिया पृथक्करण, एनईसी समूह में आंतों परिगलन के साथ आंतों के विली गायब (स्कोर 4). (बी) एनईसी प्रेरण के बाद चूहों में आंतों की विकृति स्कोर कॉन्ट समूह की तुलना में अधिक था (एन = 9 कॉन्ट समूह में, एनईसी समूह में एन = 35, *** पी < छात्र के टी-टेस्ट के साथ 0.001)। (सी) दो समूहों से मल स्कोर के फोटोमाइक्रोग्राफ, उदाहरण के लिए, कॉन्ट समूह (स्कोर 0) में अच्छी तरह से गठित छर्रों को दिखाते हुए, दो समूहों (स्कोर 1) में स्टूल का गठन किया गया, एनईसी समूह (स्कोर 2) में अर्धनिर्मित मल, और एनईसी समूह (स्कोर 3) में तरल मल। (डी) एनईसी समूह में मल स्कोर Cont. समूह की तुलना में काफी अधिक थे (cont. समूह में n = 6, NEC समूह में n = 13, *** P < छात्र के t-test के साथ 0.001)। लाल त्रिकोण म्यूकोसा और लामिना प्रोपरिया के अलगाव का प्रतिनिधित्व करता है, और काला तीर माउस मल को इंगित करता है। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: Cont. = नियंत्रण; NEC = नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस; HE = hematoxylin और eosin कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Cont. समूह और NEC समूह के बीच शरीर के आकार और चूहों के अस्तित्व की तुलना। (A) दिन 5 और दिन 10 पर चूहों के दो समूहों की उपस्थिति। (बी) यह खंड समय के साथ दो समूहों में चूहों के वजन में परिवर्तन दिखाता है; एक्स-अक्ष चूहों के जन्म के बाद के दिनों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-अक्ष चूहों के वजन में बदलाव का प्रतिनिधित्व करता है; ** पी < 0.01, ****** पी < 0.001 छात्र के टी-टेस्ट के साथ Cont. समूह (n = 10) और NEC समूह (n = 27) (C) की तुलना करने के लिए यह अनुभाग नियंत्रण समूह (n = 10) और NEC समूह (n = 25) में चूहों के उत्तरजीविता वक्र को दर्शाता है। संक्षेप: Cont. = नियंत्रण; NEC = नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एनईसी के साथ बच्चों और एनईसी के साथ चूहों में इलियोसेकल रक्तस्राव। (ए) एनईसी वाले बच्चों में इलियोसेकल क्षेत्र के रक्तस्राव और परिगलन। (बी) एनईसी (1/13) के साथ चूहों के इलियोसेकल क्षेत्र में रक्तस्राव और परिगलन; हालांकि, Cont. समूह में चूहों की आंतें सामान्य थीं, रक्तस्राव और परिगलन के बिना। काला त्रिकोण आंतों के रक्तस्राव और परिगलन को संदर्भित करता है, और लाल तीर इलियोसेकल क्षेत्र के रक्तस्राव और परिगलन को दर्शाता है। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: Cont. = नियंत्रण; NEC = नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

संयोजन माउस (g/L) दूध का विकल्प (g/L)
प्रोटीन 69-118 100
चरबी 93-175 100
कार्बोहाइड्रेट 28-37 50
चूना 0.97-6.2 2.84
फास्फोरस 1.6-2.72 1.62
सोडियम 0.66-1.4 1
पोटैशियम 1.08-1.7 1.2
क्लोराइड 1.17-1.76 1.76
मैग्नेशियम 0.0001-0.3 >0.12
जस्ता 0.009-0.055 0.018
लोहा 0.004-0.007 0.017
तांबा 0.0017-0.007 0.0018

तालिका 1: डेयरी फार्मूला दूध सामग्री.

पूरक चित्रा S1: एनईसी समूह में उत्तरजीविता वक्र को काफी कम कर दिया गया था ताकि सभी चूहों की अनायास मृत्यु हो जाए (एन = 5 कॉन्ट समूह में, एनईसी समूह में एन = 10)। संक्षेप: Cont. = नियंत्रण; NEC = नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एनईसी नवजात शिशुओं के लिए सबसे आम गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सिस्टम आपातकाल है, जिसमें एक उच्च घटना और मृत्यु दर है, विशेष रूप से समय से पहले शिशुओं में 1,2,3। हालांकि, इसका रोगजनन अभी भी अस्पष्ट है। वर्तमान में यह माना जाता है कि म्यूकोसल क्षति, रोगज़नक़ आक्रमण, और एंटरल फीडिंग एनईसी 3 के लिए उच्च जोखिम वाले कारक हैं। आज तक, एनईसी मॉडल के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवर मुख्य रूप से सूअर, चूहे और चूहे हैं। अधिकांश अध्ययनों ने NEC13,14,15,16 को प्रेरित करने के लिए नवजात C57BL / 6 चूहों का उपयोग किया है, और बहुत कम अध्ययनों ने NEC को प्रेरित करने के लिए BALB / c नवजात चूहों का उपयोग किया है। हालांकि, BALB / c चूहों को Th सेल ध्रुवीकरण 6,7,8 का लाभ है, जो यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन को वारंट करता है कि क्या वे बीमारी के Th सेल अनुसंधान के लिए एक अच्छा NEC मॉडल हो सकते हैं।

हमने एनईसी मॉडल 17 के नेडलर पैथोलॉजिकल स्कोर मानक का उल्लेख किया और पाया कि एनईसी समूह का स्कोर नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक था। 2 ≥ स्कोर एनईसी को इंगित करता है, और एनईसी को प्रेरित करने की सफलता दर 38-50% है, जो कैप्लान एट अल द्वारा अध्ययन में एनईसी मॉडलिंग की 77% सफलता दर से कम है (डीओआई: 10.3109 / 15513819409037698)। हमने चूहों के दो समूहों के मल स्कोर 18 का भी मूल्यांकन किया और पाया कि एनईसी समूह के स्कोर नियंत्रण समूह की तुलना में अधिक थे। स्कोर जितना अधिक होगा, आंतों की शिथिलता उतनी ही गंभीर होगी। इन सभी आंकड़ों से पता चलता है कि एनईसी मॉडल की स्थापना सफल रही। इसके अलावा, यह उत्साहजनक है कि एनईसी का नवजात बीएएलबी / सी माउस मॉडल एक निश्चित सीमा तक मानव एनईसी का अनुकरण कर सकता है। रक्तस्राव और परिगलन एनईसी 3,19 के साथ बच्चों की आंतों में होता है; इसी तरह की रोग संबंधी स्थितियों को इस मॉडल में देखा गया था।

गैवेज माउस मॉडल में एनईसी को प्रेरित करने में महत्वपूर्ण कदम है। यदि गैवेज ऑपरेशन को कुशलता से महारत हासिल नहीं थी, तो गलती से गैस्ट्रिक ट्यूब को श्वासनली में रखना आसान था और माउस को मरने का कारण बनता था। गैस्ट्रिक गैवेज के दौरान, माउस के धड़ के दोनों किनारों को दबाने के लिए बाएं अंगूठे, मध्य उंगली और अनामिका उंगली का उपयोग किया गया था, और माउस को ठीक करने के लिए तर्जनी को सिर पर रखा गया था। यह माउस को चारों ओर घूमने से रोकने के लिए था और गैस्ट्रिक ट्यूब को अन्नप्रणाली को नुकसान पहुंचाने का कारण बनता था। गैस्ट्रिक ट्यूब माउस के मुंह के बाएं कोने से डाला गया था। यह केवल तब होता है जब गैस्ट्रिक ट्यूब प्रतिरोध के बिना आसानी से अन्नप्रणाली में प्रवेश करती है, तो हम इसे सम्मिलित करना जारी रख सकते हैं। माउस के निचले होंठ से गैस्ट्रिक ट्यूब को 2-3 सेमी डालने के बाद ही एलपीएस या फॉर्मूला दूध इंजेक्ट किया जाना चाहिए।

हाइपोक्सिया की लंबाई की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। इस अध्ययन में, हाइपोक्सिया हर बार 90 सेकंड तक चला। यदि हाइपोक्सिया बहुत लंबा है, तो चूहे इसे सहन करने में सक्षम नहीं होंगे और मर जाएंगे। इस मॉडल का उपयोग एनईसी से संबंधित प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से TH1 और TH2 कोशिकाओं 3,9,10,11,20 पर शोध करने के लिए किया जा सकता है। भविष्य में, हम यह जांचने की योजना बना रहे हैं कि क्या यह मॉडल एनईसी में Th2 सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। इसके अलावा, इस अध्ययन ने एनईसी 18 के साथ चूहों में आंतों की शिथिलता का मूल्यांकन करने के लिए मल स्कोरिंग की एक नई विधि भी पेश की। हालांकि, इस अध्ययन की कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, मॉडल की सफलता दर बहुत अधिक नहीं थी। 5% O2 से 1% O2 तक हाइपोक्सिया स्तर को समायोजित करके सफलता दर को बढ़ाने के लिए BALB / c NEC मॉडलिंग की विधि में सुधार करने के प्रयास चल रहे हैं, जैसा कि पहले वर्णित है15।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने नैदानिक नमूना प्रदान करने के लिए गुआंगज़ौ महिलाओं और बच्चों के मेडिकल सेंटर के नैदानिक जैविक संसाधन बैंक और चूहों को प्रदान करने के लिए गुआंगज़ौ फॉरएवरजेन बायोसाइंसेज लेबोरेटरी एनिमल सेंटर को धन्यवाद दिया। इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 81770510 (आरजेड) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 100092683
Goat Milk powder  Petag  71795558417
HE dye solution Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. G1003
Isoflurane RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD. R510  
LPS Sigma-Adrich L2880
Medical oxygen various various
Microscope NIKON NIKON imaging system (DS-Ri2)
Neutral resin Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 10004160
Paraffin various various
Premature baby milk powder Abbott 57430
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. 10023418
1% Hydrochloric acid various various
10% Formalin LEAGENE DF0110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horbar, J. D., et al. Mortality and neonatal morbidity among infants 501 to 1500 grams from 2000 to 2009. Pediatrics. 129 (6), 1019-1026 (2012).
  2. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  3. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  4. Sangild, P. T., et al. Invited Review: The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91 (10), 4713-4729 (2013).
  5. Cancro, M. P., Sigal, N. H., Klinman, N. R. Differential expression of an equivalent clonotype among BALB/c and C57BL/6 mice. Journal of Experimental Medicine. 147 (1), 1-12 (1978).
  6. Kuroda, E., Yamashita, U. Mechanisms of enhanced macrophage-mediated prostaglandin E2 production and its suppressive role in Th1 activation in Th2-dominant BALB/c mice. Journal of Immunology. 170 (2), 757-764 (2003).
  7. Fornefett, J., et al. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6 mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 20 (2), 101-110 (2018).
  8. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  9. Sproat, T., Payne, R. P., Embleton, N. D., Berrington, J., Hambleton, S. T cells in preterm infants and the influence of milk diet. Frontiers in Immunology. 11, 1035 (2020).
  10. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  11. Afrazi, A., et al. New insights into the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors and beyond. Pediatric Research. 69 (3), 183-188 (2011).
  12. Auestad, N., Korsak, R. A., Bergstrom, J. D., Edmond, J. Milk-substitutes comparable to rat's milk; their preparation, composition and impact on development and metabolism in the artificially reared rat. British Journal of Nutrition. 61 (3), 495-518 (1989).
  13. Liu, Y., et al. Lactoferrin-induced myeloid-derived suppressor cell therapy attenuates pathologic inflammatory conditions in newborn mice. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4261-4275 (2019).
  14. MohanKumar, K., et al. A murine neonatal model of necrotizing enterocolitis caused by anemia and red blood cell transfusions. Nature Communications. 10 (1), 3494 (2019).
  15. He, Y. M., et al. Transitory presence of myeloid-derived suppressor cells in neonates is critical for control of inflammation. Nature Medicine. 24 (2), 224-231 (2018).
  16. Cho, S. X., et al. Characterization of the pathoimmunology of necrotizing enterocolitis reveals novel therapeutic opportunities. Nature Communications. 11 (1), 5794 (2020).
  17. Halpern, M. D., et al. Decreased development of necrotizing enterocolitis in IL-18-deficient mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (1), 20-26 (2007).
  18. Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
  19. Nino, D. F., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Necrotizing enterocolitis: new insights into pathogenesis and mechanisms. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 13 (10), 590-600 (2016).
  20. Chuang, S. L., et al. Cow's milk protein-specific T-helper type I/II cytokine responses in infants with necrotizing enterocolitis. Pediatric Allergy & Immunology. 20 (1), 45-52 (2009).

Tags

चिकित्सा अंक 177 नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस BALB / c चूहों इम्यूनोलॉजी टी सहायक टाइप 2 कोशिकाओं

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis
Posted by JoVE Editors on 03/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.

Figure 1 was updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस का एक नवजात BALB / c माउस मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tian, Y., Huang, J., Fu, M., He, Q., … More

Tian, Y., Huang, J., Fu, M., He, Q., Chen, J., Chen, Y., Zhang, R., Zhong, W. A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. J. Vis. Exp. (177), e63252, doi:10.3791/63252 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter