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Summary
L'enterocolite necrotizzante (NEC) è la malattia gastrointestinale (GI) più grave che si verifica spesso nei neonati prematuri, in particolare nei neonati con peso alla nascita molto basso, con alta mortalità e patogenesi poco chiara. La causa del NEC può essere correlata ad anomalie del sistema immunitario infiammatorio. Un modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca immunitaria sulla malattia NEC. I modelli animali NEC di solito usano topi neonatali C57BL / 6J; I topi neonatali BALB/c sono usati raramente. Studi correlati hanno dimostrato che quando i topi sono infetti, la differenziazione delle cellule Th2 è predominante nei topi BALB / c rispetto ai topi C57BL / 6J. Gli studi hanno suggerito che la presenza e lo sviluppo di NEC sono associati ad un aumento delle cellule T helper di tipo 2 (Th2) e sono generalmente accompagnati da infezione. Pertanto, questo studio ha utilizzato topi BALB/c neonatali per indurre un modello NEC con caratteristiche cliniche e cambiamenti patologici intestinali simili a quelli osservati nei bambini con NEC. Ulteriori studi sono necessari per determinare se questo modello animale potrebbe essere utilizzato per studiare le risposte delle cellule Th2 in NEC.
Abstract
L'enterocolite necrotizzante (NEC) è la malattia gastrointestinale (GI) più grave che si verifica spesso nei neonati prematuri, in particolare nei neonati con peso alla nascita molto basso, con alta mortalità e patogenesi poco chiara. La causa del NEC può essere correlata ad anomalie del sistema immunitario infiammatorio. Un modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca immunitaria sulla malattia NEC. I modelli animali NEC di solito usano topi neonatali C57BL / 6J; I topi neonatali BALB/c sono usati raramente. Studi correlati hanno dimostrato che quando i topi sono infetti, la differenziazione delle cellule Th2 è predominante nei topi BALB / c rispetto ai topi C57BL / 6J. Gli studi hanno suggerito che la presenza e lo sviluppo di NEC sono associati ad un aumento delle cellule T helper di tipo 2 (Th2) e sono generalmente accompagnati da infezione. Pertanto, questo studio ha utilizzato topi BALB/c neonatali per indurre un modello NEC con caratteristiche cliniche e cambiamenti patologici intestinali simili a quelli osservati nei bambini con NEC. Ulteriori studi sono necessari per determinare se questo modello animale potrebbe essere utilizzato per studiare le risposte delle cellule Th2 in NEC.
Introduction
L'enterocolite necrotizzante (NEC), la più grave malattia gastrointestinale (GI), si verifica nella maggior parte dei neonati prematuri (>90%), in particolare quelli con peso alla nascita molto basso (VLBW)1. Nei neonati VLBW, l'incidenza della malattia varia dal 10% al 12% e la mortalità dei bambini con diagnosi di NEC è compresa tra il 20% e il 30%2,3. La causa del NEC può essere correlata a lesioni della mucosa, invasione da parte di batteri patogeni e alimentazione intestinale, che può portare a risposte infiammatorie e all'induzione di lesioni intestinali in ospiti sensibili3. La patogenesi del NEC non è chiara. Ricerche pertinenti mostrano che la risposta immunitaria del bambino affetto è anormale e la suscettibilità genetica, la tensione microvascolare e i cambiamenti batterici intestinali possono svolgere un ruolo importante nella malattia3.
Il modello animale NEC è uno strumento indispensabile per la ricerca sulla patogenesi del NEC. Le specie animali utilizzate per i modelli NEC sono maiali, ratti e topi. Tuttavia, a causa del lungo periodo di gestazione, dei cicli di crescita e dei costi elevati, negli ultimi anni i suini non sono stati la prima scelta per i modelli NEC e sono stati sostituiti con ratti o topi4. Poiché ci sono differenze nel background immunitario di diversi ceppi di topo5, diversi studi devono utilizzare diversi ceppi di topi per stabilire modelli animali NEC. I topi BALB/c hanno una caratteristica importante; quando sono infettati o affrontano danni esterni, la polarizzazione delle cellule TH2 durante l'infezione nei topi è significativamente più forte di quella in altri ceppi di topi6,7,8. Le cellule T helper svolgono un ruolo cruciale nella comparsa e nella progressione di NEC, in particolare lo sviluppo di cellule TH23,9,10,11. Pertanto, questo studio ha utilizzato topi BALB / c per stabilire il modello NEC, che potrebbe essere utile per la ricerca sulla malattia NEC sulle cellule T.
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Protocol
Questa ricerca è stata approvata dal Comitato etico medico del Guangzhou Women and Children's Medical Center (n. 174A01) e dal Comitato etico animale del Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center (IACUC-G160100). Tutti gli animali sono stati allevati nella stessa stanza in un ambiente specifico privo di agenti patogeni (SPF) e gli esperimenti sono stati condotti in un ambiente convenzionale. I topi utilizzati per l'allevamento avevano 7-8 settimane; i topi per indurre NEC (n = 72) sono stati separati dalla diga il giorno 4, e le dighe (n = 14) sono state tenute nella gabbia originale e allattate i topi del gruppo di controllo (Cont.) (n = 24).
1. Preparazione di reagenti e dispositivi
- Preparare il sostituto del latte per i topi BALB/c nel rapporto corrispondente (latte prematuro in polvere per bambini: latte di capra in polvere = 2:1).
NOTA: Le composizioni nutrizionali finali del latte artificiale12 sono riportate nella Tabella 1. - Soluzione di LPS (2,5 mg/mL)
- Sciogliere un totale di 10 mg di polvere di LPS in 4 ml di acqua distillata sterilizzata, mescolare bene e conservare in frigorifero a -20 °C dopo l'aliquotazione.
NOTA: la soluzione LPS viene conservata al buio a 2-8 °C per l'uso immediato o a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
- Sciogliere un totale di 10 mg di polvere di LPS in 4 ml di acqua distillata sterilizzata, mescolare bene e conservare in frigorifero a -20 °C dopo l'aliquotazione.
2. Indurre enterocolite necrotizzante nei topi neonatali BALB/c
- Dai da mangiare ai topi neonatali.
- Tenere i topi neonatali nella stessa gabbia con la diga, allattata dalla diga nei giorni 0-4.
- La notte del giorno 4 (quando i topi neonatali pesano 2,5-3 g), separare i topi neonatali nel gruppo NEC dalla diga per indurre NEC, tenerli in un'incubatrice per animali e nutrirli con la formula. Tuttavia, il gruppo Cont. è autorizzato a rimanere e ad essere alimentato dalla diga.
NOTA: I topi neonatali che sono separati dalla diga devono essere allevati in un'incubatrice a causa della loro debole regolazione della temperatura corporea.
- Preparare il tubo di gavage immergendolo in contenitori di alcol al 75% per 1-2 minuti e lavarli due volte in acqua pulita e a doppia distillazione.
NOTA: Per evitare la contaminazione incrociata tra i topi, il processo di cui sopra deve essere eseguito dopo aver alimentato ciascun topo. - Indurre il modello NEC.
- Prendi i topi neonatali dalla diga il giorno 4 e digiunali per una notte.
- Gavage i topi con LPS (20-30 μL alla volta) e nutrirli con la formula il giorno 5 (40-50 μL alla volta).
- Dal giorno 5 in poi, sottoporre i topi a un ciclo ipossia-reossigenazione-freddo-shock due volte al giorno per 5 giorni. Posizionare i topi in un dispositivo di ipossia al 5% di O2 per 90 s e riossigenarli per 3 minuti; ripetere questo processo cinque volte. Quindi, posizionare i topi in un ambiente a 4 ° C per 15 minuti e quindi trasferirli in un'incubatrice. Vedere la Figura 1A,B per il processo di induzione.
NOTA: Un ciclo di ipossia-reossigenazione-stimolazione del freddo è stato eseguito una volta al mattino e una volta nel pomeriggio. Una miscela di 5% O2 con 95% N2 è stata preparata nel contenitore e la concentrazione è stata misurata con un rilevatore di ossigeno.
- Osservare da vicino tutti i topi, pesarli ogni giorno, registrare la sopravvivenza dei topi durante il periodo di induzione e registrare le caratteristiche delle feci (con o senza feci appiccicose / feci sanguinolente).
NOTA: il modello NEC stabilito dura 5 giorni. - Il giorno 10 o prima, quando i topi mostrano sintomi NEC (ileo, ematochezia, diarrea)13, eutanasizzare i topi mediante anestesia per inalazione con isoflurano, quindi raccogliere immediatamente il tessuto intestinale. Non raccogliere tessuti dai topi che sono morti spontaneamente.
NOTA: In questo studio, il punto finale dell'eutenasia del topo è stato adattato quando il topo ha mostrato ematochezia e cianosi di tutto il corpo.
3. Gavage il mouse
- Fissare la testa del topo, tenendo il tubo gastrico nella mano destra. Inserire il tubo gastrico dall'angolo sinistro della bocca del mouse.
NOTA: La testa è stata fissata con l'indice sulla testa del mouse e premuta delicatamente all'indietro e verso il basso per evitare che il mouse si pieghi in avanti durante l'operazione e influenzi l'inserimento del tubo gastrico. - Spostare lentamente il tubo al centro della bocca. Dopo aver inserito il tubo di circa 2-3 cm, spingere 40-50 μL di formula o 20-30 μL di LPS nel tratto digestivo. Vedere la Figura 2A,B per il gavage.
NOTA: In circostanze normali, il tubo gastrico viene inserito nel tratto digestivo senza intoppi. Se il topo ha un forte riflesso di vomito, il tubo gastrico è stato inserito nella trachea per errore. Il tubo gastrico deve essere estratto delicatamente e il topo deve essere lasciato riposare per un po 'prima di tentare di nuovo il gavage. Inoltre, la procedura gavage viene utilizzata per indurre il modello di NEC prima dell'eutanasia dei topi.
4. Raccogliere campioni di tessuto intestinale fresco per la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E)
- Immergere il tessuto ileo fresco del topo in formalina al 10% per 24 ore.
- Incorporare i tessuti nella paraffina e tagliarli in sezioni da 4 μm.
- Deparaffinizzare le sezioni in xilene e reidratarle successivamente in etanolo assoluto, etanolo al 95%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata, immergendole per 5 minuti in ogni passaggio. Colorare le sezioni con soluzione di ematossilina per 5 minuti e differenziarle in acido cloridrico all'1% in alcool al 75% per 5 s. Infine, macchiarli con una soluzione di eosina per 1 minuto.
NOTA: Dopo la colorazione con soluzione di ematossilina, deve essere differenziato con acido cloridrico all'1% in etanolo per rimuovere la soluzione di ematossilina eccessivamente legata e il colorante citoplasmatico di ematossilina. La concentrazione dell'1% di acido cloridrico è adatta per il tessuto intestinale. - Esaminare l'istopatologia del tessuto intestinale con ingrandimento 40x.
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Representative Results
Il modello NEC murino BALB/c è stato indotto dall'alimentazione con formula, dall'alimentazione con LPS, dall'ipossia e dalla stimolazione a freddo. Durante il periodo di induzione, i topi sono stati osservati per patologia intestinale, caratteristiche delle feci, cambiamenti di peso corporeo e sopravvivenza giornaliera. Immagini rappresentative dell'intestino tenue durante l'induzione del NEC; i numeri nella foto rappresentano il punteggio di patologia intestinale da 0 (epitelio normale) a 4 (il più grave) (Figura 3A). Il punteggio di patologia intestinale era significativamente più alto nel gruppo NEC rispetto al gruppo Cont. (Figura 3B). I numeri nell'immagine rappresentano i punteggi delle feci da 0 (pellet ben formati) a 3 (feci liquide) (Figura 3C). Il giorno 10, i punteggi delle feci dei gruppi NEC erano significativamente più alti nel gruppo NEC, indicando che la disfunzione intestinale nel gruppo NEC era più grave (Figura 3D). Il giorno 5, il primo giorno di induzione del modello NEC, non c'era alcuna differenza significativa nelle dimensioni del corpo tra i due gruppi. Tuttavia, il giorno 10, i topi nel gruppo NEC erano significativamente più sottili e più piccoli dalla testa alla coda rispetto ai topi del gruppo Cont. (Figura 4A).
Durante i 5 giorni durante i quali è stato stabilito il modello, il peso dei topi nel gruppo NEC è aumentato lentamente o addirittura ha mostrato una crescita negativa e il tasso di sopravvivenza dei topi nel gruppo NEC è gradualmente diminuito rispetto al gruppo Cont. (Figura 4B, C). Inoltre, un altro lotto di topi è stato utilizzato per indurre il modello NEC ma senza raccogliere i tessuti; entro il giorno 13, tutti i topi di questo gruppo NEC erano morti e la curva di sopravvivenza era significativamente ridotta (Figura supplementare S1). La Figura 5A mostra la morfologia e i risultati patologici (necrosi del tessuto della mucosa intestinale) dell'area ileocecale resecata del tessuto intestinale da pazienti NEC in questo ospedale. In questo studio, i topi del gruppo NEC (1/13) hanno sviluppato emorragia ileocecale e necrosi (Figura 5B).
Figura 1: Induzione del processo del modello BALB/c NEC. (A) I topi del gruppo NEC sono stati separati dalla diga alla nascita fino all'età di 4 giorni (il giorno 4) e hanno digiunato quella notte. Il modello NEC è stato indotto dal giorno 5 in poi dopo la nascita ed è durato per 5 giorni. I campioni di tessuto intestinale sono stati raccolti il giorno 10 o prima. I topi del gruppo Cont. sono stati ospitati e allattati dalla diga. (B) La sequenza di operazioni per ogni giorno successivo all'introduzione del modello NEC. Abbreviazioni: Cont. = control; NEC = enterocolite necrotizzante; LPS = lipopolisaccaride. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gavage gastrico. (A) In questo studio è stato utilizzato un dispositivo gavage specializzato, che è stato combinato con un tubo di plastica e una siringa. (B) Il tubo di gavage è entrato dall'angolo della bocca con un angolo di 45° rispetto alla linea verticale. (C) Il tubo è stato lentamente spostato al centro della bocca del topo per garantire che il tubo gastrico e l'esofago fossero allo stesso livello verticale. Abbreviazioni: D= diametro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Modello NEC murino BALB/c. (A) Fotomicrografie del punteggio di patologia intestinale dei due gruppi, ad esempio, che mostrano mucosa intatta e normale nel gruppo Cont. (punteggio 0), separazione lieve del gonfiore sottomucoso o della lamina propria in due gruppi (punteggio 1), separazione moderata sottomucosa e/o lamina propria nel gruppo NEC (punteggio 2), separazione sottomucosa grave e/o lamina propria nel gruppo NEC (punteggio 3), scomparsa dei villi intestinali con necrosi intestinale nel gruppo NEC (punteggio 4). (B) I punteggi di patologia intestinale nei topi dopo induzione neC erano superiori a quelli del gruppo Cont. (n = 9 nel gruppo Cont., n = 35 nel gruppo NEC, *** P < 0,001 con il t-test dello studente). (C) Fotomicrografie di spartiti di feci di due gruppi, ad esempio, mostrando pellet ben formati nel gruppo Cont. (punteggio 0), feci formate in due gruppi (punteggio 1), feci semiformate nel gruppo NEC (punteggio 2) e feci liquide nel gruppo NEC (punteggio 3). (D) I punteggi delle feci nel gruppo NEC erano significativamente più alti di quelli nel gruppo Cont. (n = 6 nel gruppo Cont., n = 13 nel gruppo NEC, *** P < 0,001 con Student's t-test). Il triangolo rosso rappresenta la separazione della mucosa e della lamina propria e la freccia nera punta alle feci del topo. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: Cont. = control; NEC = enterocolite necrotizzante; HE = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto della forma corporea e della sopravvivenza dei topi tra il gruppo Cont. e il gruppo NEC. (A) L'aspetto dei due gruppi di topi il giorno 5 e il giorno 10. (B) Questa sezione mostra le variazioni di peso dei topi in due gruppi nel tempo; l'asse x rappresenta il numero di giorni dopo la nascita dei topi e l'asse y rappresenta le variazioni di peso dei topi; **P < 0,01, ***P < 0,001 con il t-test di Student per confrontare il gruppo Cont. (n = 10) e il gruppo NEC (n = 27) (C) Questa sezione mostra le curve di sopravvivenza dei topi nel gruppo di controllo (n = 10) e nel gruppo NEC (n = 25). Abbreviazioni: Cont. = control; NEC = enterocolite necrotizzante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Emorragia ileocecale nei bambini con NEC e topi con NEC. (A) Emorragia e necrosi dell'area ileocecale nei bambini con NEC. (B) Emorragia e necrosi nell'area ileocecale di topi con NEC (1/13); tuttavia, l'intestino dei topi nel gruppo Cont. era normale, senza emorragia e necrosi. Il triangolo nero si riferisce all'emorragia intestinale e alla necrosi, e la freccia rossa mostra emorragia e necrosi dell'area ileocecale. Barre di scala = 50 μm. Abbreviazioni: Cont. = control; NEC = enterocolite necrotizzante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composizione | Mouse (g/L) | Sostituto del latte (g/L) |
| proteina | 69-118 | 100 |
| grasso | 93-175 | 100 |
| carboidrato | 28-37 | 50 |
| calcio | 0.97-6.2 | 2.84 |
| fosforo | 1.6-2.72 | 1.62 |
| sodio | 0.66-1.4 | 1 |
| potassio | 1.08-1.7 | 1.2 |
| cloruro | 1.17-1.76 | 1.76 |
| magnesio | 0.0001-0.3 | >0.12 |
| zinco | 0.009-0.055 | 0.018 |
| ferro | 0.004-0.007 | 0.017 |
| rame | 0.0017-0.007 | 0.0018 |
Tabella 1: Ingredienti del latte in formula casearia.
Figura supplementare S1: La curva di sopravvivenza è stata significativamente ridotta nel gruppo NEC in modo che tutti i topi siano morti spontaneamente (n = 5 nel gruppo Cont., n = 10 nel gruppo NEC). Abbreviazioni: Cont. = control; NEC = enterocolite necrotizzante. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il NEC è l'emergenza del sistema gastrointestinale più comune per i neonati, con un'alta incidenza e mortalità, specialmente nei neonati prematuri1,2,3. Tuttavia, la sua patogenesi non è ancora chiara. Attualmente si ritiene che il danno alla mucosa, l'invasione di agenti patogeni e l'alimentazione enterale siano fattori ad alto rischio per NEC3. Ad oggi, gli animali utilizzati per il modello NEC sono principalmente maiali, ratti e topi. La maggior parte degli studi ha utilizzato topi neonatali C57BL/6 per indurre NEC13,14,15,16 e pochissimi studi hanno utilizzato topi neonatali BALB/c per indurre NEC. Tuttavia, i topi BALB / c hanno il vantaggio della polarizzazione delle cellule Th6,7,8, che giustifica ulteriori studi per determinare se possono essere un buon modello NEC per la ricerca delle cellule Th della malattia.
Abbiamo fatto riferimento allo standard di punteggio patologico Nadler del modello NEC17 e abbiamo scoperto che il punteggio del gruppo NEC era significativamente superiore a quello del gruppo di controllo. Un punteggio ≥ 2 indica NEC e il tasso di successo dell'induzione di NEC è del 38-50%, che è inferiore al tasso di successo del 77% della modellazione NEC nello studio di Caplan et al. (DOI: 10.3109 / 15513819409037698). Abbiamo anche valutato i punteggi delle feci18 dei due gruppi di topi e abbiamo scoperto che i punteggi del gruppo NEC erano più alti di quelli del gruppo di controllo. Più alto è il punteggio, più grave è la disfunzione intestinale. Tutti questi dati mostrano che l'istituzione del modello NEC ha avuto successo. Inoltre, è incoraggiante che il modello murino BALB/c neonatale di NEC possa simulare il NEC umano in una certa misura. Emorragia e necrosi si verificano nell'intestino dei bambini con NEC3,19; condizioni patologiche simili sono state osservate in questo modello.
Gavage è il passo chiave per indurre NEC nel modello murino. Se l'operazione gavage non è stata padroneggiata in modo competente, è stato facile posizionare erroneamente il tubo gastrico nella trachea e causare la morte del topo. Durante il gavage gastrico, il pollice sinistro, il dito medio e l'anulare venivano usati per bloccare entrambi i lati del busto del topo e l'indice veniva posizionato sulla testa per fissare il mouse in posizione. Questo per impedire al topo di muoversi e causare il danneggiamento dell'esofago da parte del tubo gastrico. Il tubo gastrico è stato inserito dall'angolo sinistro della bocca del topo. È solo quando il tubo gastrico entra nell'esofago senza intoppi senza resistenza che possiamo continuare a inserirlo. LPS o latte artificiale deve essere iniettato solo dopo aver inserito il tubo gastrico a 2-3 cm dal labbro inferiore del topo.
La lunghezza dell'ipossia deve essere attentamente monitorata. In questo studio, l'ipossia è durata per 90 s ogni volta. Se l'ipossia è troppo lunga, i topi non saranno in grado di tollerarla e moriranno. Questo modello può essere utilizzato per la ricerca sulle cellule immunitarie correlate a NEC, in particolare le cellule TH1 e TH23,9,10,11,20. In futuro, abbiamo in programma di indagare se questo modello è utile per studiare le risposte delle cellule Th2 in NEC. Inoltre, questo studio ha anche introdotto un nuovo metodo di punteggio delle feci per valutare la disfunzione intestinale nei topi con NEC18. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni a questo studio. Ad esempio, il tasso di successo del modello non era molto alto. Sono in corso sforzi per migliorare il metodo di modellazione NEC BALB/c per aumentare il tasso di successo regolando il livello di ipossia dal 5% O2 all'1% O2, come descritto in precedenza15.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Clinical Biological Resource Bank del Guangzhou Women and Children's Medical Center per aver fornito il campione clinico e il Guangzhou Forevergen Biosciences Laboratory Animal Center per la fornitura di topi. Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China grant 81770510 (R.Z.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | 100092683 | |
| Goat Milk powder | Petag | 71795558417 | |
| HE dye solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | G1003 | |
| Isoflurane | RWD, Shenzhen Reward Life Technology Co., LTD. | R510 | |
| LPS | Sigma-Adrich | L2880 | |
| Medical oxygen | various | various | |
| Microscope | NIKON | NIKON imaging system (DS-Ri2) | |
| Neutral resin | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | 10004160 | |
| Paraffin | various | various | |
| Premature baby milk powder | Abbott | 57430 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD. | 10023418 | |
| 1% Hydrochloric acid | various | various | |
| 10% Formalin | LEAGENE | DF0110 |
References
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Medicina Numero 177 Enterocolite necrotizzante Topi BALB/c Immunologia Cellule T helper tipo 2Erratum
Formal Correction: Erratum: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis
Posted by JoVE Editors on 03/07/2022.
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An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.
Figure 1 was updated from:
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.
