Summary
我们提出了一种通过定量逆转录聚合酶链反应评估年龄依赖性肾损伤小鼠肾脏和血清中microRNA表达的方法。
Abstract
MicroRNA（miRNA）是由21-25个碱基组成的小的非编码RNA。它们不被翻译成蛋白质，而是通过破坏它们的稳定性和破坏它们的翻译来阻碍其靶信使RNA（mRNA）的功能。尽管已经研究了各种小鼠器官和组织中的miRNA表达谱，但还没有纯化和定量小鼠肾脏和血清miRNA的标准方法。我们已经建立了一种有效可靠的方法来提取和评估年龄依赖性肾损伤小鼠血清和肾脏中的miRNA表达。
该方法使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），该方案需要六个步骤：（1）制备衰老加速小鼠抗性1（SAMR1）小鼠和衰老加速小鼠俯卧位（SAMP1）小鼠;（2）从这些小鼠中提取血清样品;（3）从每只小鼠中提取肾脏样本;（4）从每只小鼠的肾脏和血清样品中提取总RNA（包括miRNA）;（5）从miRNA逆转录合成互补DNA（cDNA）;（6）使用获得的cDNA进行qRT-PCR。
该协议用于确认，与对照相比，miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p的表达在年龄依赖性肾损伤小鼠模型的肾脏和血清中显着改变。该协议还阐明了年龄依赖性肾损伤小鼠模型的肾脏和血清之间的关系。该协议可用于确定具有年龄依赖性肾损伤的小鼠的肾脏和血清中的miRNA表达。
Introduction
已知在生理和疾病（例如炎症、纤维化、代谢紊乱和癌症）中起重要作用的各种 mRNA 的表达受 miRNA 的调节，miRNA 是导致降解和抑制 mRNA1 转录的短非编码 RNA。因此，某些miRNA有可能作为各种疾病的新候选生物标志物和/或治疗靶点2，3，4，5。已经对各种小鼠器官和组织（包括大脑6，心脏7，肺8，肝脏9和肾脏10）中的miRNA表达谱进行了研究。然而，没有标准或既定的方法来提取和评估年龄依赖性肾损伤小鼠肾脏或血清中的miRNA。
因此，我们建立了一个方案，可用于可靠地纯化和检测年龄依赖性肾损伤小鼠血清和肾脏中的miRNA表达。该方案有六个主要步骤：（1）制备50周龄的SAMR1雄性小鼠和SAMP1雄性小鼠;（2）从两种小鼠品系的下腔静脉中提取血液样本，随后使用带有肝素的斯皮茨管，然后离心，以获得血清样品;（3）从小鼠-A硅均质器中提取肾脏样品分别对肾脏样品进行均质，然后将样品转移到微量离心机离心柱11上的生物聚合物粉碎系统中;（4）使用基于硅胶膜的离心柱12 从血清样品中提取总RNA（含miRNA），并使用基于硅胶膜的离心柱11从肾脏样品中提取含有miRNA的总RNA;（5）使用逆转录酶，聚（A）聚合酶和寡核苷酸-dT引物13，14从总RNA合成互补DNA（cDNA）;（6）最后，使用qRT-PCR和插层染料13，14测定miRNA表达。
这个新方案是基于成功提取和评估各种类型的组织中miRNA的研究11，12，13。该协议的生物聚合物粉碎系统被证明能够从组织中纯化高质量的总RNA11。已经建立了该协议用于通过qRT-PCR与插层染料评估miRNA表达的各个方面的准确性和灵敏度13，14，例如，使用逆转录酶，聚（A）聚合酶和寡核苷酸dT引物从提取的总RNA中合成cDNA。新协议有几个优点：简单、节省时间和减少技术错误。因此，它可用于需要准确和灵敏地鉴定肾脏和血清 miRNA 谱的研究。许多病理状况的研究也可以利用新协议。
SAMP1小鼠中的miRNA表达谱是年龄依赖性肾损伤的模型，可以如下图所示确定。在人类中，年龄依赖性肾损伤与肾功能衰竭的进展有关，其特征在于肾间质纤维化面积的增加和肾小球硬化的进展15，16。年龄依赖性肾功能损害也是慢性肾脏病和终末期肾病的重要且常见的特征15，16。
Protocol
该实验方案经吉智医科大学动物伦理委员会批准，并按照《吉智医科大学实验动物指南》及其关于实验动物使用和护理的指南进行。该方案使用四只50周龄的SAMR1雄性小鼠和SAMP1雄性小鼠（40-45g）。
1. 血清样本采集
- 为每只小鼠准备以下内容：带有1.0 mL注射器的30 G针头，带有肝素的1.0 mL spitz离心管，1.5 mL微量离心管，异氟醚麻醉剂，软木板，70%乙醇，两个用磷酸盐缓冲盐水（PBS）润湿的棉签，带有PBS，镊子和手术剪刀的培养皿。
- 用1.5%异氟醚麻醉小鼠并保持在1.5%。皮下注射镇痛药（美洛昔康5mg / kg），然后将1.0mL的70%乙醇注射到其腹部，并将其置于软木板上的仰卧位置。
- 通过踏板撤回反射的消失来确认麻醉深度。用镊子和手术剪刀切开腹部皮肤。切开肌肉和腹膜从膀胱到肋骨左下边缘。
- 用镊子提起腹膜，用手术剪刀在腹膜的上边缘做一个侧切口。继续沿着肋骨的最低边缘切口。
- 使用两根 PBS 湿棉签识别下腔静脉。将带有1.0 mL注射器的30 G针头之一插入下腔静脉，然后拉动注射器。将针头缓慢拉出下腔静脉以避免溶血。将血液转移到装有肝素的 1.0 mL spitz 管中，然后通过倒置试管数次进行混合。
注意：小鼠因颈椎脱位而被安乐死。 - 在室温（RT），3，000× g 下旋转斯皮茨管10分钟。
- 缓慢吸出上清液，确保其不含沉淀物，然后将其转移到未使用的 1.5 mL 微量离心管中。
- 使用前将试管储存在-80°C。
注意：如果立即进行步骤3，则无需将试管储存在-80°C。
2. 肾脏样本采集
- 为每只小鼠准备以下内容：2.0 mL冷冻管，异氟烷麻醉剂，软木板，70%乙醇，带有PBS的培养皿，镊子和手术剪刀。
- 用1.5%异氟醚麻醉小鼠并保持在1.5%。皮下注射镇痛药（美洛昔康5mg / kg），然后将1.0mL的70%乙醇注射到其腹部，并将其置于软木板上的仰卧位置。
- 通过踏板撤回反射的消失来确认麻醉深度。使用镊子和手术剪刀在腹部皮肤上切开一个切口。切开肌肉和腹膜从膀胱到肋骨左下边缘。
- 使用镊子提起腹膜，并用手术剪刀在腹膜的上边缘做一个侧切口。继续沿着肋骨的最低边缘切口。
- 识别左肾。用PBS回流以冲洗血管中的血液，直到肾脏变成黄白色。首先用手术剪刀切除整个肾脏，切断左肾动脉和静脉。将肾脏放入培养皿中，并用PBS仔细清洗。
注意：小鼠因颈椎脱位而被安乐死。 - 使用镊子和手术剪刀将肾脏切成10毫克的样本（10毫克是下一步的合适样本量）。将每个肾脏样本放入其自己的 2.0 mL 冷冻管中。关闭管子的盖子。
- 对于长期储存，将每个冷冻管转移到液氮中并将其储存在-80°C。
3. 从血清样品中提取总RNA
- 首先准备以下物品：涡旋混合器、苯酚/胍基裂解试剂、80% 乙醇、100% 乙醇、100% 氯仿、生物聚合物离心柱（在 2.0 mL 收集管 11 中）、膜锚定离心柱（在 2.0 mL 收集管11 中）、洗涤缓冲液 #1（即含有胍和100% 乙醇的洗涤缓冲液，比例为 1：2）、洗涤缓冲液 #2（即， 含有胍和 100% 乙醇的洗涤缓冲液，比例为 1：4）、无 RNase 的水、1.5 mL 微量离心管和 2.0 mL 微量离心管。
- 首先，在 1.5 mL 微量离心管中取 200 μL 血清样品，然后加入 1，000 μL 苯酚/胍基裂解试剂。涡旋混合物5秒。
- 将样品在室温下孵育5分钟。
- 向试管中的血清样品中加入 200 μL 氯仿，并紧紧关闭管盖。将试管倒置15倍以混合氯仿和血清样品。
- 将每个样品在室温下孵育3分钟。接下来，在4°C下以12，000× g旋转样品15分钟。
- 将 300 μL 上清液转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，而不会干扰沉淀。加入 450 μL 100% 乙醇，涡旋管 5 秒。
注意：在以下所有步骤中，将用于分离RNA和DNA的膜锚定离心柱置于2.0 mL收集管中以离心。 - 然后，取出 700 μL 样品，将其加载到膜锚定的离心柱上，并盖上盖子。以8，000 × g 在室温下旋转色谱柱15秒，并将上清液留在色谱柱中。丢弃收集管中残留的颗粒。
- 将 700 μL 洗涤缓冲液 #1（血清/血浆试剂盒的一部分）（参见 材料表）添加到膜锚定离心柱中，以彻底清洁样品。关闭柱盖，以8，000 × g在室温下旋转色谱柱15秒 ， 并将上清液留在柱中。丢弃收集管中残留的颗粒。
- 为了去除痕量盐，取 500 μL 洗涤缓冲液 #2 并将其加载到膜锚定的离心柱上。关闭柱盖后，以8，000 × g在室温下旋转色谱柱15秒 ， 并将上清液留在柱中。 将颗粒丢弃在收集管中。
- 为了去除痕量盐，取 500 μL 80% 乙醇并将其加载到膜锚定的离心柱上。关闭柱盖后，以8，000 × g在室温下旋转色谱柱15秒 ， 并将上清液留在柱中。 将颗粒丢弃在收集管中。
- 在室温下以15，000 × g再次旋转膜锚定的离心柱5分钟。
- 将膜锚定的离心柱转移到新的 1.5 mL 收集管中后，向色谱柱中加入 14 μL 不含 RNase 的水以溶解总 RNA。关闭柱盖后，在室温下放置管子等待5分钟。 在室温下以15，000 × g 再次旋转色谱柱1分钟。
- 使用前将装有样品的试管储存在-80°C。
4. 从肾脏样本中提取总RNA
- 首先准备以下物品：硅均质器，冰，涡旋混合器，100%乙醇，100%氯仿，生物聚合物离心柱（在2.0 mL收集管11中），膜锚定离心柱（在2.0 mL收集管11中），基于苯酚/胍的裂解试剂，洗涤缓冲液#1（与步骤3.1相同的缓冲液），洗涤缓冲液#2（与步骤3.1相同的缓冲液）， 不含 RNase 的水、1.5 mL 微量离心管和 2.0 mL 微量离心管。
- 将 10 mg 肾脏样品放入硅均质器中，并加入 700 μL 基于苯酚/胍的裂解试剂。
- 设置均质机。轻轻按压并扭转均质器的杵对肾脏样品，使样品均质化。继续按压和扭转杵，直到肾脏样品在基于苯酚/胍的裂解试剂中完全匀浆。
- 为了进一步匀浆，取匀浆裂解物（在2.0 mL收集管中）并将其转移到生物聚合物离心柱中。
- 将匀浆裂解物在室温下以 14，000 × g 离心 3 分钟，然后将整个沉淀沉淀沉淀转移到未使用的 1.5 mL 微量离心管中以倒置沉淀沉淀
- 将沉淀与管中的 140 μL 氯仿混合;然后，紧紧关闭管盖。将试管倒置15倍以混合裂解物和氯仿。
注意：氯仿可以在没有头罩的情况下安全使用。 - 将样品在室温下孵育2-3分钟。将样品在4°C下以12，000× g离心15分钟。
- 将上清液（通常为 ~300 μL）转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，而不会干扰沉淀物。加入其体积的 1.5 倍（通常为 ~450 μL）的 100% 乙醇。涡旋混合物5秒。
注意：在以下所有步骤中，将用于分离RNA和DNA的膜锚定离心柱置于2.0 mL收集管中以离心。 - 将 700 μL 样品加载到其中一个膜锚定离心柱上。关闭盖子并以15，000 × g 离心柱15秒。丢弃剩余在收集管中的沉淀裂解物。
- 向离心柱中加入 700 μL 洗涤缓冲液 #1 以彻底洗涤。关闭盖子并将色谱柱以15，000 × g 离心15秒。丢弃剩余在收集管中的沉淀裂解物。
- 为了去除痕量的盐，将500 μL洗涤缓冲液#2加载到膜锚定的离心柱上。关闭柱盖后，将柱子以15，000 × g 离心15秒。将沉淀的裂解物丢弃在收集管中。
- 重复步骤 4.11。
- 再次以15，000 ×g离心膜锚定离心柱1分钟。将沉淀的裂解物丢弃在收集管中。
- 取膜锚定离心柱并将其转移到新的 1.5 mL 收集管中。向色谱柱中加入 30 μL 不含 RNase 的水以溶解总 RNA。关闭柱盖后，用管在室温下等待5分钟，然后以15，000 × g离心柱1分钟。
- 将含有总RNA的样品总体积转移到新的微量离心管中。将试管放在冰上，并通过分光光度法测量总RNA浓度。确保总RNA浓度为~300-1，500 ng/μL。
- 使用前将含有样品的试管储存在-80°C。
5. 血清中总RNA逆转录cDNA的合成
注意：发布定量实时PCR实验（MIQE）指南的最少信息建议使用更好的实验实践来获得可靠，明确的结果17。在该协议中，cDNA是使用逆转录酶，聚（A）聚合酶和寡核苷酸-dT引物从两步程序中纯化的总RNA合成的。
- 首先准备以下内容：涡旋混合器，热循环仪，八孔试管，每个八条管的盖子，蒸馏水，冰，熔融状态下的逆转录试剂盒（参见 材料表）13，14 和1.5mL微量离心管。
- 启动热循环仪。
- 准备预混液;要获得每 8 孔试管总共 8.0 μL 预混液，请将 2.0 μL 逆转录酶混合物（包含在试剂盒中）和 2.0 μL 10X 核酸混合物添加到 1.5 mL 微量离心管中的 4.0 μL 逆转录缓冲液中。
- 将 8.0 μL 预混液放入八孔试管的每个管中。
- 将 12 μL 等分试样的总 RNA 放入八孔试管的每个试管中，并关闭试管的盖子。在室温下和2，000 × g下离心管15秒。
- 将管放入热循环仪中，并在37°C下孵育60分钟。 将样品在95°C下再孵育5分钟以合成cDNA。
- 孵育后，将cDNA转移到新的1.5 mL微量离心管中。用蒸馏水将cDNA稀释十倍（1：10）。涡旋并在室温下和2，000 × g下离心管5秒。
- 将稀释的cDNA暂时储存在冰上。使用前将稀释的样品储存在-80°C。
6. 肾脏中总RNA逆转录cDNA的合成
注：MIQE指南鼓励更好的实验实践，以确保可靠和明确的结果17。该协议使用逆转录酶，聚（A）聚合酶和寡核苷酸dT引物，以两步程序从1.0μg纯化的总RNA合成cDNA。
- 首先，准备以下内容：涡旋混合器，热循环仪，1.5 mL微量离心管，八孔试管，每个八条管的盖子，蒸馏水，冰和逆转录试剂盒（参见 材料表）13，14 在熔化状态下。
- 启动热循环仪。
- 准备预混液;要获得每管总共 8.0 μL 预混液，请将试剂盒中包含的 2.0 μL 逆转录酶混合物和 2.0 μL 10X 核酸混合物添加到 4.0 μL 逆转录缓冲液中。
- 向八孔试管的每个试管中加入 8.0 μL 预混液。
- 按如下方式调整总RNA密度。为了用12μL无RNase的水从肾脏样品中分离1.0μg总RNA，取适量的总RNA并使用如上所述测量的浓度将其转移到蒸馏水中（在步骤4.15中）。
注意：在存在DNA污染的情况下，受污染的DNA通过qRT-PCR共扩增。 - 执行与上述步骤 5.5.-5.8 中所述的相同的过程。
7. miRNA 的 qRT-PCR
注意：插入器方法用于miRNA的qRT-PCR。引物用于RNA：U6小核2（RNU6-2），miRNA-223-3p，miRNA-423-5p，miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p。
- 准备以下内容：涡旋混合器、实时荧光定量 PCR 系统、用于 qRT-PCR 的 96 孔反应板、用于 96 孔反应板的粘合膜、胶膜涂抹器、96 孔离心机转子、miRNA 特异性引物、包含 2x PCR 预混液和 10x 通用引物的绿色染料 PCR 试剂盒（参见材料表）13，14， 和一个 1.5 mL 微量离心管。
- 在 1.5 mL 微量离心管中混合后涡旋以下物质：6.25 μL 蒸馏水、溶解在无核酸酶水中的 5 μM miRNA 引物各 1.25 μL、12.5 μL 2x PCR 预混液和 2.5 μL 10x 通用引物。
- 制备并融化步骤5（血清）或步骤6（肾脏）中所述合成的cDNA。涡旋并离心cDNA5秒。
- 取 22.5 μL 等分试样的试剂（如上述步骤 7.2. 所述），并将它们分别放入 96 孔板的每个孔中。
- 向板的每个孔中加入 2.5 μL 等分试样的 cDNA。
- 要将粘合膜固定到板上，请使用胶膜涂抹器。在96孔离心机转子中以1，000 x g 离心板30秒。稳定每个孔底部的反应。
8. 使用实时荧光定量 PCR 系统和软件运行 PCR 循环程序
- 启动实时荧光定量 PCR 系统。放置按照步骤7.6中所述创建的板。在实时荧光定量 PCR 系统中。修改设置;提供实验名称，然后选择 96孔（0.2 mL） 作为系统的实验类型， 比较CT（ΔΔCT） 作为定量方法， 标准 作为系统运行模式，选择 SYBR绿色 试剂作为检测目标序列的试剂。
- 提供样品和目标miRNA的名称，并命名每个孔中的样品和目标miRNA。分配重复样品以获得适合确认结果的数据，并选择参考样品和内源性对照。要使染料用作被动参比，请选择 “无”。为了消除试剂交叉污染，设置阴性的逆转录酶和miRNA表达的非模板对照。
- 接下来，确保反应体积设置为 20μL ，PCR循环条件设置如下：95°C变性15分钟，然后在94°C下变性40个循环15秒，在55°C下退火30秒，最后在70°C下延伸30秒。
- 在系统软件程序中 单击分析， 在该过程完成后分析 qRT-PCR 数据。确认程序自动选择的阈值线是否适合每个孔。
- 检查每个样品中分析的内源性对照和靶 miRNA 的阈值循环 （CT） 值。通过扩增曲线和阈值线的交点确定CT值。
注意：在本研究中，RNU6-2和miRNA-423-5p用作靶miRNA表达水平的内源性对照，并使用ΔΔCT方法确定每个靶miRNA18的相对表达水平。
Representative Results
对于年龄依赖性肾损伤小鼠模型，我们使用体重40-45g的50周龄SAMP1雄性小鼠，每只小鼠收集约0.8mL血液，并将其转移到装有肝素的1.0 mL spitz管中，倒置并离心。每个肾脏用PBS冲洗，解剖并储存在液氮中以供进一步分析。50周龄的SAMR1小鼠作为对照。基于使用该年龄依赖性肾损伤模型获得的miRNA qRT-PCR数据，我们观察到与对照组相比，SAMP1小鼠的miRNA-7219-5p肾脏水平显着增加，miRNA-7218-5p的肾脏水平显着降低（图1）。与对照组相比，SAMP1小鼠中miRNA-7219-5p和miRNA-7218-5p的血清水平显着增加（图2）。miRNA-223-3p的表达水平在任一菌株中以及肾脏和血清之间均未改变（图1和图2）。
图 1：SAMP1 小鼠肾脏中差异表达的 microRNA。 对 miRNA-223-3p、miRNA-7218-5p 和 miRNA-7219-5p 在 SAMR1 小鼠（对照组，n = 4）和 SAMP1 小鼠（n = 4）中的表达进行 qRT-PCR 分析。数据是标准误差（误差线）±平均值;t检验用于分析组间差异;p < 0.05被认为是显著的（*p <0.05），NS：不显著。缩写：miRNA = microRNA;SAMP1 = 衰老加速小鼠倾向;SAMR1 = 衰老加速小鼠抗性 1;qRT-PCR = 定量逆转录聚合酶链反应。请点击此处查看此图的大图。
图 2：SAMP1 小鼠血清中差异表达的 miRNA。 对 miRNA-223-3p、miRNA-7218-5p 和 miRNA-7219-5p 在 SAMR1 小鼠（对照组，n = 4）和 SAMP1 小鼠（n = 4）中的表达进行 qRT-PCR 分析。数据是平均±标准误差线;t检验用于调查组间显著差异。*p < 0.05 通过 t 检验。缩写：miRNA = microRNA;SAMP1 = 衰老加速小鼠倾向;SAMR1 = 衰老加速小鼠抗性 1;qRT-PCR = 定量逆转录聚合酶链反应 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
使用qRT-PCR通过上述方案成功测定了靶miRNA的表达水平。评估提取的miRNA是获得有意义的qRT-PCR数据的重要步骤。为了在进行qRT-PCR之前确认miRNA的足够质量，应使用分光光度法来确定260nm处的吸光度与280nm处的吸光度之比。如果qRT-PCR不能提供预期长度和熔解温度的单次PCR扩增，或者如果它提供单峰熔解曲线，则可能发生DNA污染，和/或反应板每个孔中的引物二聚体可能存在。
MiRNA 表达水平可以通过 qRT-PCR 以外的几种方法进行评估，包括北方印迹、微阵列和核糖核酸酶保护测定。然而，qRT-PCR方法是一种灵敏、准确、简单且可重现的程序，与北方印迹和核糖核酸酶保护测定所需的样品量相比，需要的样品量更小19。由于微阵列可以同时测量数万个miRNA的表达，因此它们可用于鉴定候选miRNA标记。微阵列数据还显示出与qRT-PCR 20获得的数据的高度总体相关性。然而，对于比较不同研究中获得的微阵列数据的最佳方法尚未达成共识21。
血清miRNA的评估具有以下特点。首先，它很容易收集血清，并且由于血清miRNA对冻融，温度和酸稳定，因此miRNA可以成为良好的生物标志物。其次，物种间miRNA具有很高的同源性，动物实验的结果很容易外推到人类身上。第三，血清miRNA已显示出用作治疗药物的潜力3。一些研究还表明，器官中miRNA的表达水平与血清22，23，24中的miRNA相关。在本研究中，miRNA-223-3p的肾脏水平在SAMR1和SAMP1小鼠之间没有显着差异，血清中也没有显示显着的菌株间差异。相比之下，miRNA-7218-5p和miRNA-7219-5p的肾脏水平在SAMR1和SAMP1小鼠之间显示出显着差异，在血清中显示出相当大的菌株间差异。
此协议具有以下限制。首先，它的有用性尚未在肝脏和肺等其他器官中得到验证，其次，它尚未在其他实验动物（如大鼠，狗和猪）上进行测试。几个研究小组已经使用该协议通过qRT-PCR纯化和检测miRNA，并报告说该协议能够从组织和血清13，14，22，23，24中纯化高质量的RNA。该方法已被证明对检测miRNA 13，14，22，23，24的表达具有很高的准确性和灵敏度。本研究结果表明，该方案可以成功检测小鼠血清和肾脏中的miRNA表达。因此，该协议可用于确定具有多种病理的小鼠的血清和肾脏miRNA表达谱。由于协议的简单性，可以同时处理大量样品。分析许多miRNA在肾脏的各种病理条件下的表达，因此，可以使用本文描述的方案。
协议的某些方面需要牢记。为了避免在室温下发生的纯化miRNA降解，必须将miRNA保存在冰上。肾脏样品必须均质化，直到它们完全溶解在裂解试剂中。小鼠肾脏含有大量不溶于裂解试剂的结缔组织，因此需要柱撕碎机进行进一步匀浆。此外，在qRT-PCR实验的整个设置过程中，应验证适当的内源性对照miRNA（在样品中具有稳定的表达）。这是因为在该协议执行过程中各种物质的干扰可以改变内源性对照miRNA的表达水平，从而可能损害结果。总之，本文描述了一种qRT-PCR方案，用于检测，纯化和评估年龄依赖性肾损伤小鼠血清和肾脏中miRNA表达。
Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
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