Summary
Vi præsenterer en metode til evaluering af mikroRNA-ekspression i nyre og serum hos mus med aldersafhængig nedsat nyrefunktion ved kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion.
Abstract
MicroRNA'er (miRNA'er) er små, ikke-kodende RNA'er bestående af 21-25 baser. De oversættes ikke til proteiner, men arbejder snarere for at hindre funktionen af deres target messenger RNA'er (mRNA'er) ved at destabilisere dem og forstyrre deres oversættelse. Selvom miRNA-ekspressionsprofilerne i forskellige museorganer og væv er blevet undersøgt, har der ikke været nogen standardmetoder til oprensning og kvantificering af musenyrer og serummiRNA'er. Vi har etableret en effektiv og pålidelig metode til ekstraktion og evaluering af miRNA-ekspressionen i serum og nyre hos mus med aldersafhængig nedsat nyrefunktion.
Metoden anvender kvantitativ omvendt transkription-polymerasekædereaktion (qRT-PCR), og protokollen kræver seks trin: (1) forberedelse af ældningsaccelereret museresistens 1 (SAMR1) mus og senescensaccelererede museudsatte (SAMP1) mus; 2) udtagning af serumprøver fra disse mus 3) udtagning af en nyreprøve fra hver mus 4) ekstraktion af totalt RNA (herunder miRNA) fra nyre- og serumprøver fra hver mus (5) syntesen af komplementært DNA (cDNA) med omvendt transkription fra miRNA'et; (6) udførelse af en qRT-PCR ved hjælp af det opnåede cDNA.
Denne protokol blev brugt til at bekræfte, at ekspressionen af miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p sammenlignet med kontrollerne blev signifikant ændret i nyre og serum i en musemodel med aldersafhængig nedsat nyrefunktion. Denne protokol præciserede også forholdet mellem nyre og serum i musemodellen for aldersafhængig nedsat nyrefunktion. Denne protokol kan bruges til at bestemme miRNA-ekspression i nyre og serum hos mus med aldersafhængig nedsat nyrefunktion.
Introduction
Ekspressionen af forskellige mRNA'er, der spiller vigtige roller i både fysiologi og sygdom (f.eks. Inflammation, fibrose, metaboliske lidelser og kræft) er kendt for at være reguleret af miRNA'er, som er korte, ikke-kodende RNA'er, der forårsager nedbrydningen og hæmmer transkriptionen af mRNA1. Det er derfor muligt, at visse miRNA'er kan tjene som nye kandidatbiomarkører og / eller terapeutiske mål for forskellige sygdomme 2,3,4,5. Der er udført forskning på miRNA-ekspressionsprofiler i en række museorganer og væv (herunder hjerne6, hjerte7, lunge8, lever9 og nyre10). Der er dog ingen standard eller etablerede metoder til ekstraktion og evaluering af miRNA'er i nyrerne eller serum hos mus med aldersafhængig nedsat nyrefunktion.
Derfor etablerede vi en protokol, der kan bruges til pålideligt at rense og detektere miRNA-ekspression i serum og nyre hos mus med aldersafhængig nedsat nyrefunktion. Der er seks hovedtrin i protokollen: (1) forberedelse af både 50 uger gamle SAMR1-hanmus og SAMP1-hanmus; 2) ekstraktion af blodprøver fra den ringere vena cava af begge musestammer med efterfølgende anvendelse af et spytrør med heparin efterfulgt af centrifugering for at opnå en serumprøve (3) Nyreprøveekstraktion fra musene - en siliciumhomogenisator anvendes til at homogenisere nyreprøven separat, og prøven overføres derefter til et biopolymer-makuleringssystem på en mikrocentrifuge spinkolonne11; 4) total RNA-ekstraktion (indeholdende miRNA) fra serumprøverne ved anvendelse af en silicamembranbaseret spinkolonne12 og total RNA indeholdende miRNA-ekstraktion fra nyreprøverne ved anvendelse af en silicamembranbaseret spinkolonne11 5) syntese af komplementært DNA (cDNA) fra det totale RNA ved anvendelse af omvendt transkriptase, poly(A)polymerase og oligo-dT-primer13,14 og (6) endelig bestemmelse af miRNA-ekspression ved hjælp af qRT-PCR og et interkalerende farvestof13,14.
Denne nye protokol var baseret på undersøgelser, der lykkedes at ekstrahere og evaluere miRNA'er i forskellige typer væv11,12,13. Protokollens biopolymer-makuleringssystem blev demonstreret at være i stand til at rense total RNA af høj kvalitet fra væv11. Nøjagtigheden og følsomheden af aspekter af denne protokol, der anvendes til evaluering af miRNA-ekspression ved qRT-PCR med et interkalerende farvestof, er blevet fastslået13,14, for eksempel cDNA-syntesen med omvendt transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT-primere fra det ekstraherede totale RNA. Den nye protokol har flere fordele: enkelhed, tidsbesparelser og reducerede tekniske fejl. Det kan således bruges til undersøgelser, der kræver nøjagtig og følsom identifikation af nyre- og serum-miRNA-profiler. Undersøgelser af mange patologiske tilstande kan også udnytte den nye protokol.
MiRNA-ekspressionsprofilerne i SAMP1-mus, som er en model for aldersafhængig nedsat nyrefunktion, kan bestemmes som vist nedenfor. Hos mennesker er aldersafhængig nedsat nyrefunktion forbundet med progression af nyresvigt og er karakteriseret ved både en stigning i området for renal interstitiel fibrose og progressionen af glomerulosklerose15,16. Aldersafhængig nedsat nyrefunktion er også et vigtigt og hyppigt træk ved kronisk nyresygdom og nyresygdom i slutstadiet15,16.
Protocol
Forsøgsprotokollen blev godkendt af den dyreetiske komité ved Jichi Medical University og udført i overensstemmelse med Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals og dens retningslinjer for brug og pleje af forsøgsdyr. Denne protokol bruger fire 50 uger gamle SAMR1-hanmus og SAMP1-hanmus (40-45 g).
1. Indsamling af serumprøver
- Forbered følgende til hver mus: 30 G nåle med en 1,0 ml sprøjte, et 1,0 ml spitz centrifugeringsrør med heparin, 1,5 ml mikrocentrifugerør, isofluranbedøvelsesmiddel, et korkark, 70% ethanol, to vatpinde fugtet med fosfatbufferet saltvand (PBS), en petriskål med PBS, pincet og kirurgisk saks.
- Anæstetik musen med 1,5% isofluran og hold på 1,5%. Administrer et smertestillende middel (Meloxicam 5 mg / kg) subkutant, injicer derefter 1,0 ml 70% ethanol i maven og læg det i liggende stilling på korkpladen.
- Bekræft dybden af anæstesi ved forsvinden af pedaludtagningsrefleksen. Med pincet og kirurgisk saks skal du skære mavens hud. Skær musklerne og peritonealmembranen fra blæren til den nederste venstre kant af ribbenene.
- Brug pincetten til at løfte peritonealmembranen, og lav et lateralt snit i peritonealmembranens øverste kant med den kirurgiske saks. Fortsæt snittet langs ribbenenes nederste kant.
- Identificer den ringere vena cava ved hjælp af de to PBS-fugtede vatpinde. Indsæt en af 30 G-nålene med 1,0 ml sprøjten i den ringere vena cava, og træk derefter sprøjten. Træk nålen langsomt ud af den ringere vena cava for at undgå hæmolyse. Overfør blodet til 1,0 ml spitzrør med heparin og bland det derefter ved at vende røret flere gange.
BEMÆRK: Musen aflives ved cervikal dislokation. - Drej spitzrøret ved stuetemperatur (RT), 3.000 × g i 10 min.
- Aspirer supernatanten langsomt, sørg for, at den ikke indeholder sediment, og overfør den derefter til et ubrugt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Opbevar røret ved -80 °C før brug.
BEMÆRK: Hvis du fortsætter til trin 3 med det samme, behøver røret ikke opbevares ved -80 °C.
2. Indsamling af nyreprøver
- Forbered følgende for hver mus: 2,0 ml kryorør, isofluranbedøvelsesmiddel, et korkark, 70% ethanol, en petriskål med PBS, pincet og kirurgisk saks.
- Anæstetik musen med 1,5% isofluran og hold på 1,5%. Administrer et smertestillende middel (Meloxicam 5 mg/kg) subkutant, injicer derefter 1,0 ml 70% ethanol i maven, og læg det i liggende stilling på korkpladen.
- Bekræft dybden af anæstesi ved forsvinden af pedaludtagningsrefleksen. Brug pincetten og den kirurgiske saks til at lave et snit i maveskindet. Skær musklerne og peritonealmembranen fra blæren til den nederste venstre kant af ribbenene.
- Brug pincetten til at løfte peritonealmembranen og lav et lateralt snit i peritonealmembranens øvre kant med den kirurgiske saks. Fortsæt snittet langs ribbenenes nederste kant.
- Identificer den venstre nyre. Tilbagesvaling det med PBS for at skylle blodet fra karrene, indtil nyren får en gullig-hvid farve. Skær hele nyren først ved hjælp af kirurgisk saks til at skære den venstre nyrearterie og vene. Læg nyren i en petriskål og vask den forsigtigt med PBS.
BEMÆRK: Musen aflives ved cervikal dislokation. - Brug pincetten og den kirurgiske saks til at skære nyren i 10 mg prøver (10 mg er en passende prøvestørrelse til næste trin). Placer hver prøve af nyren i sit eget 2,0 ml kryorør. Luk rørets hætte.
- Til langtidsopbevaring overføres hvert kryorør til flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C.
3. Total RNA-ekstraktion fra en serumprøve
- Forbered først følgende emner: en hvirvelblander, phenol/guanidinbaseret lysisreagens, 80% ethanol, 100% ethanol, 100% chloroform, biopolymerspinkolonner (i 2,0 ml opsamlingsrør 11), membranforankrede spinkolonner (i 2,0 ml opsamlingsrør11), vaskebuffer #1 (dvs. vaskebuffer indeholdende guanidin og100% ethanol i et forhold på 1:2), vaskebuffer #2 (dvs. vaskebuffer indeholdende guanidin og 100% ethanol i et forhold på 1:4), RNasefrit vand, 1,5 ml mikrocentrifugerør og 2,0 ml mikrocentrifugerør.
- Først tages en 200 μL serumprøve i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og derefter tilsættes 1.000 μL phenol / guanidinbaseret lysisreagens. Vortex blandingen i 5 s.
- Inkuber prøven ved RT i 5 min.
- Der tilsættes 200 μL chloroform til serumprøven i røret, og slangehætten lukkes tæt. Vend røret 15x for at blande chloroformen og serumprøven.
- Hver prøve inkuberes ved RT i 3 min. Derefter drejes prøven ved 4 °C i 15 minutter ved 12.000 x g.
- Overfør 300 μL supernatant til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør uden at forstyrre pelleten. Tilsæt 450 μL 100% ethanol, og hvirvel røret i 5 s.
BEMÆRK: I alle de følgende trin skal du placere den membranforankrede spinkolonne til adskillelse af RNA og DNA i et 2,0 ml opsamlingsrør for at centrifuge det. - Fjern derefter 700 μL af prøven, læg den på en membranforankret centrifugeringssøjle, og luk hætten. Drej kolonnen ved RT i 15 s ved 8.000 × g, og lad supernatanten stå i kolonnen. Kassér den pille, der er tilbage i opsamlingsrøret.
- Der tilsættes 700 μL vaskebuffer #1, som er en del af serum/plasmasættet (se materialetabellen), til den membranforankrede centrifugeringssøjle for at rengøre prøven grundigt. Luk søjlehætten, og drej kolonnen ved RT i 15 s ved 8.000 × g, og lad supernatanten stå i kolonnen. Kassér den pille, der er tilbage i opsamlingsrøret.
- Til fjernelse af sporsalte skal du tage 500 μL vaskebuffer #2 og lægge den på en membranforankret centrifugeringssøjle. Når kolonnehætten er lukket, skal du dreje kolonnen ved RT i 15 s ved 8.000 × g og lade supernatanten være i kolonnen. Kassér pelleten i opsamlingsrøret.
- Til fjernelse af sporsalte skal du tage 500 μL 80% ethanol og lægge det på en membranforankret centrifugeringssøjle. Når kolonnehætten er lukket, skal du dreje kolonnen ved RT i 15 s ved 8.000 × g og lade supernatanten være i kolonnen. Kassér pelleten i opsamlingsrøret.
- Drej den membranforankrede centrifugeringssøjle igen ved RT i 5 minutter ved 15.000 × g.
- Efter overførsel af den membranforankrede spinkolonne til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør tilsættes 14 μL RNase-frit vand til søjlen for at opløse det samlede RNA. Når søjlehætten er lukket, skal du vente 5 minutter med røret tilbage ved RT. Drej kolonnen igen i 1 minut ved 15.000 × g ved RT.
- Rør opbevares med prøver ved -80 °C før brug.
4. Ekstraktion af total RNA fra en nyreprøve
- Forbered først følgende elementer: en siliciumhomogenisator, is, en hvirvelblander, 100% ethanol, 100% chloroform, biopolymerspinkolonner (i 2,0 ml opsamlingsrør 11), membranforankrede spinkolonner (i 2,0 ml opsamlingsrør11), phenol / guanidinbaseret lysisreagens, vaskebuffer # 1 (den samme buffer som trin 3.1.), vaskebuffer # 2 (den samme buffer som trin 3.1.), RNase-frit vand, 1,5 ml mikrocentrifugerør og 2,0 ml mikrocentrifugerør.
- Der anbringes en 10 mg nyreprøve i siliciumhomogenisatoren, og der tilsættes 700 μL phenol/guanidinbaseret lysisreagens.
- Indstil homogenisatoren. Tryk og drej forsigtigt homogenisatorens pistil mod nyreprøven for at homogenisere prøven. Fortsæt med at trykke og vride pistilen, indtil nyreprøven er fuldstændigt homogeniseret i det phenol/guanidinbaserede lysisreagens.
- For yderligere homogenisering skal du tage det homogeniserede lysat (i et 2,0 ml opsamlingsrør) og overføre det til en biopolymerspinkolonne.
- Centrifuge det homogeniserede lysat ved RT i 3 minutter ved 14.000 × g og derefter overføre hele den udfældede pellet til et ubrugt 1,5 ml mikrocentrifugerør for at invertere den udfældede pellet
- Bland pelleten med 140 μL chloroform i røret; Luk derefter rørhætten tæt. Vend røret 15x for at blande lysat og chloroform.
BEMÆRK: Kloroformen kan bruges sikkert uden hætte. - Inkuber prøven ved RT i 2-3 min. Prøven centrifugeres ved 4 °C i 15 minutter ved 12 000 × g.
- Overfør supernatanten (som normalt er ~ 300 μL) til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør uden at forstyrre bundfaldet. Tilsæt 1,5 gange dets volumen (som normalt er ~ 450 μL) 100% ethanol. Vortex blandingen i 5 s.
BEMÆRK: I alle de følgende trin skal du placere den membranforankrede spinkolonne til adskillelse af RNA og DNA i et 2,0 ml opsamlingsrør for at centrifuge det. - Der indlæses 700 μL prøve på en af de membranforankrede centrifugeringssøjler. Luk hætten og centrifuger søjlen ved 15.000 × g i 15 s. Kassér det udfældede lysat, der er tilbage i opsamlingsrøret.
- Tilsæt 700 μL vaskebuffer #1 til centrifugeringskolonnen for at vaske den grundigt. Luk hætten og centrifuger søjlen ved 15.000 × g i 15 s. Kassér det udfældede lysat, der er tilbage i opsamlingsrøret.
- Til fjernelse af spormængder af salt skal du lægge 500 μL vaskebuffer #2 på den membranforankrede centrifugeringssøjle. Efter lukning af søjlehætten centrifugeres søjlen ved 15.000 × g i 15 s. Kassér det udfældede lysat i opsamlingsrøret.
- Gentag trin 4.11.
- Centrifuger den membranforankrede centrifugeringssøjle igen i 1 minut ved 15.000 × g. Kassér det udfældede lysat i opsamlingsrøret.
- Tag den membranforankrede centrifugeringssøjle og overfør den til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør. Tilsæt 30 μL RNase-frit vand til søjlen for at opløse det samlede RNA. Når du har lukket søjlens hætte, skal du vente i 5 minutter med røret ved RT og derefter centrifuge søjlen i 1 minut ved 15.000 × g.
- Det totale volumen af prøven indeholdende total RNA overføres til et nyt mikrocentrifugerør. Placer røret på is, og mål den samlede RNA-koncentration ved spektrofotometri. Sørg for, at den samlede RNA-koncentration er ~ 300-1,500 ng / μL.
- Opbevar rør indeholdende prøver ved -80 °C før brug.
5. Syntese af cDNA med omvendt transkription af total RNA i serum
BEMÆRK: Minimumsoplysningerne til offentliggørelse af kvantitative retningslinjer for PCR-eksperimenter i realtid (MIQE) anbefaler at anvende bedre forsøgspraksis for at opnå pålidelige, utvetydige resultater17. I denne protokol syntetiseres cDNA fra det totale RNA oprenset i en to-trins procedure under anvendelse af omvendt transkriptase, poly (A) polymerase og oligo-dT-primere.
- Forbered følgende først: en hvirvelblander, en termisk cyklist, otte-brøndsstrimmelrør, hætten på hvert otte-strimmelrør, destilleret vand, is, det omvendte transkriptasesæt (se materialetabellen)13,14 i smeltet tilstand og 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Start den termiske cyklist.
- Forbered masterblandingsopløsningen; for at opnå i alt 8,0 μL masterblanding pr. otte-brøndstrimmelrør tilsættes 2,0 μL omvendt transkriptaseblanding (inkluderet i sættet) og 2,0 μL 10x nukleinsyreblanding til 4,0 μL omvendt transkriptionsbuffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der anbringes 8,0 μL af masterblandingsopløsningen i hvert rør i et strimmelrør med otte brønde.
- Anbring en 12 μL aliquot total RNA i hvert rør i otte-brøndstrimmelrøret, og luk rørets hætte. Centrifuge røret i 15 s ved RT og 2.000 × g.
- Rør anbringes i den termiske cyklist, og der inkuberes i 60 minutter ved 37 °C. Prøven inkuberes i yderligere 5 minutter ved 95 °C for at syntetisere cDNA'et.
- Efter inkubationen overføres cDNA til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fortynd cDNA ti gange (1:10) med destilleret vand. Hvirvel og centrifuge røret i 5 s ved RT og 2.000 × g.
- Opbevar det fortyndede cDNA midlertidigt på is. De fortyndede prøver opbevares ved -80 °C før brug.
6. Syntese af cDNA med omvendt transkription af total RNA i nyrerne
BEMÆRK: MIQE-retningslinjerne tilskynder til bedre eksperimentel praksis for at sikre pålidelige og utvetydige resultater17. Denne protokol bruger omvendt transkriptase, poly (A) polymerase og oligo dT-primere til at syntetisere cDNA fra 1,0 μg oprenset total RNA i en totrinsprocedure.
- Forbered først følgende: en hvirvelblander, en termisk cyklist, 1,5 ml mikrocentrifugerør, otte-brønds striprør, hætten på hvert otte-strimmelrør, destilleret vand, is og et omvendt transkriptasesæt (se materialetabellen)13,14 i smeltet tilstand.
- Start den termiske cyklist.
- Forbered masterblandingsopløsningen; for at opnå i alt 8,0 μL masterblandingsopløsning pr. rør tilsættes 2,0 μL af den omvendte transkriptaseblanding, der er inkluderet i sættet, og 2,0 μL 10x nukleinsyreblanding til 4,0 μL af den omvendte transkriptionsbuffer.
- Der tilsættes 8,0 μL masterblandingsopløsning til hvert rør i et otte-brønds strimmelrør.
- Juster den samlede RNA-tæthed som følger. Til separation af 1,0 μg total RNA fra en nyreprøve med 12 μL RNase-frit vand tages en passende mængde total RNA og overføres til destilleret vand ved hjælp af koncentrationen målt som beskrevet ovenfor (i trin 4.15.).
BEMÆRK: I nærvær af DNA-forurening forstærkes det forurenede DNA sammen af qRT-PCR. - Udfør den samme proces som beskrevet ovenfor i trin 5.5.-5.8.
7. qRT-PCR af miRNA
BEMÆRK: En interkalatormetode anvendes til qRT-PCR af miRNA'erne. Primere bruges til RNA: U6 lille nuklear 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p.
- Forbered følgende: en hvirvelblander, et realtids PCR-system, en 96-brønds reaktionsplade til qRT-PCR, klæbende film til 96-brønds reaktionspladen, klæbende filmapplikator, en 96-brønds centrifugerotor, miRNA-specifikke primere, et grønt farvestofbaseret PCR-sæt indeholdende 2x PCR-masterblanding og 10x universel primer (se materialetabellen)13,14, og et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Vortex følgende efter blanding af dem i et 1,5 ml mikrocentrifugerør: 6,25 μL destilleret vand, 1,25 μL hver af 5 μM miRNA-primer opløst i nukleasefrit vand, 12,5 μL 2x PCR-masterblanding og 2,5 μL 10x universal primer.
- Forbered og smelt cDNA syntetiseret som beskrevet i trin 5 (serum) eller trin 6 (nyre). Hvirvel og centrifuge cDNA i 5 s.
- Tag 22,5 μL aliquoter af reagenset (som beskrevet i trin 7.2 ovenfor) og anbring dem separat i hver brønd i 96-brøndpladen.
- Der tilsættes en 2,5 μL aliquot cDNA til hver brønd på pladen.
- For at fastgøre klæbefilmen til pladen skal du bruge klæbefilmapplikatoren. Centrifuge pladen i 30 s ved 1.000 x g i 96-brønds centrifugerotoren. Stabiliser reaktionen i bunden af hver brønd.
8. Brug af PCR-systemet og softwaren i realtid til at køre PCR-cykelprogrammet
- Begynd PCR-systemet i realtid. Placer pladen, der er oprettet som beskrevet i trin 7.6. i realtids PCR-systemet. Rediger indstillingerne; Angiv et navn til eksperimentet, og vælg derefter 96-brønd (0,2 ml ) som systemets eksperimenttype, Sammenlignende CT (ΔΔCT) som kvantificeringsmetode, standard som systemkørselstilstand og SYBR grønne reagenser som reagenser til detektering af målsekvensen.
- Angiv navne på prøven og mål-miRNA'erne, og navngiv prøven og mål-miRNA'et i hvert hul. Tildel duplikatprøver for at få data, der er egnede til at bekræfte resultaterne, og vælg en referenceprøve og den endogene kontrol. For at farvestoffet skal bruges som passiv reference, skal du vælge ingen. For at eliminere reagenskrydskontaminering skal du oprette negativ omvendt transkriptase og en ikke-skabelonkontrol til miRNA-ekspression.
- Sørg derefter for, at reaktionsvolumenet er indstillet til 20 μL , og at PCR-cyklusbetingelserne indstilles som følger: 95 °C i 15 minutter, derefter 40 denatureringscyklusser ved 94 °C i 15 s, udglødning ved 55 °C i 30 s og endelig forlængelse ved 70 °C i 30 s.
- Klik på analyser i systemets softwareprogram for at analysere qRT-PCR-dataene, når processen er afsluttet. Bekræft, at den tærskellinje, der automatisk vælges af programmet, passer til hver brønd.
- Kontroller tærskelcyklusværdien (CT) for de endogene kontrol- og mål-miRNA'er, der analyseres i hver prøve. Bestem CT-værdierne ved skæringspunktet mellem forstærkningskurven og tærskellinjen.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev RNU6-2 og miRNA-423-5p anvendt som endogene kontroller for mål-miRNA-ekspressionsniveauer, og ΔΔCT-metoden blev brugt til at bestemme de relative ekspressionsniveauer for hvert mål-miRNA18.
Representative Results
Til den aldersafhængige musemodel med nedsat nyrefunktion brugte vi 50 uger gamle SAMP1-hanmus, der vejer 40-45 g. Ca. 0,8 ml blod blev opsamlet pr. mus og overført til et 1,0 ml spidsrør med heparin, omvendt og centrifugeret. Hver nyre blev skyllet med PBS, dissekeret og opbevaret i flydende nitrogen til yderligere analyse. Halvtreds uger gamle SAMR1-mus fungerede som kontroller. Baseret på miRNA qRT-PCR-data opnået ved hjælp af denne aldersafhængige nyresvækkelsesmodel observerede vi, at nyreniveauet af miRNA-7219-5p var signifikant forøget, og nyreniveauet af miRNA-7218-5p var signifikant reduceret i SAMP1-musene sammenlignet med kontrollerne (figur 1). Serumniveauerne af både miRNA-7219-5p og miRNA-7218-5p blev øget betydeligt i SAMP1-musene sammenlignet med kontrollerne (figur 2). Ekspressionsniveauerne af miRNA-223-3p ændrede sig ikke i nogen af stammerne og mellem nyre og serum (figur 1 og figur 2).
Figur 1: Differentielt udtrykte mikroRNA'er i nyrerne hos SAMP1-mus. qRT-PCR-analyse af ekspressionen af miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p i SAMR1-mus (kontrol, n = 4) og SAMP1-mus (n = 4). Dataene er gennemsnitlige ± standardfejl (fejllinjer); t-tests blev brugt til at analysere forskelle mellem grupper; p < 0,05 blev betragtet som signifikant (*p < 0,05), n.s.: ikke signifikant. Forkortelser: miRNA = microRNA; SAMP1 = ældningsaccelereret muserisiko; SAMR1 = ældningsaccelereret musemodstand 1; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkription-polymerasekædereaktion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Differentielt udtrykte miRNA'er i serum af SAMP1-mus. qRT-PCR-analyse af ekspressionen af miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p i SAMR1-mus (kontrol, n = 4) og SAMP1-mus (n = 4). Dataene er gennemsnitlige ± SE (fejllinjer); T-tests blev brugt til at undersøge signifikante forskelle mellem grupper. *p < 0,05 ved t-test. Forkortelser: miRNA = microRNA; SAMP1 = ældningsaccelereret muserisiko; SAMR1 = ældningsaccelereret musemodstand 1; qRT-PCR = kvantitativ omvendt transkription-polymerasekædereaktion Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Ekspressionsniveauerne for mål-miRNA'erne blev med succes bestemt af den ovenfor beskrevne protokol ved anvendelse af qRT-PCR. Evalueringen af de ekstraherede miRNA'er er et vigtigt skridt i at opnå meningsfulde qRT-PCR-data. For at bekræfte den tilstrækkelige kvalitet af miRNA'er, før qRT-PCR udføres, bør spektrofotometri anvendes til at bestemme forholdet mellem absorbans ved 260 nm og det ved 280 nm. DNA-kontaminering kan forekomme, og/eller primerdimerer i hver brønd i reaktionspladen kan være til stede, hvis qRT-PCR ikke giver en enkelt PCR-forstærkning af den forventede længde og smeltetemperatur, eller hvis den tilvejebringer en monomodal smeltekurve.
MiRNA-ekspressionsniveauer kan evalueres ved flere andre metoder end qRT-PCR, herunder northern blotting, et mikroarray og ribonukleasebeskyttelsesassays. qRT-PCR-metoden er imidlertid en følsom, nøjagtig, enkel og reproducerbar procedure, der kræver et mindre prøvevolumen end dem, der kræves til northern blotting og ribonukleasebeskyttelsesassays19. Da mikroarrays kan måle ekspressionen af titusinder af miRNA'er samtidigt, kan de bruges til at identificere kandidat-miRNA-markører. Microarray-data viser også en høj samlet korrelation med data opnået ved qRT-PCR20. Der er imidlertid ikke opnået enighed om den optimale metode til sammenligning af mikroarraydata opnået i forskellige undersøgelser21.
Evalueringen af serummiRNA'er har følgende funktioner. For det første er det let at indsamle serum, og da serummiRNA'er er stabile mod frysning og optøning, temperatur og syre, kan miRNA'erne være gode biomarkører. For det andet er der høj homologi af miRNA'er blandt arter, og resultaterne af dyreforsøg ekstrapoleres let til mennesker. For det tredje har serummiRNA'er vist potentiale til anvendelse som terapeutiske lægemidler3. Flere undersøgelser har også vist, at ekspressionsniveauet af miRNA i organer er korreleret med miRNA i serum22,23,24. I den foreliggende undersøgelse viste miRNA-223-3p, hvis nyreniveauer ikke viste en signifikant forskel mellem SAMR1- og SAMP1-musene, heller ingen signifikant forskel mellem belastning i serumet. I modsætning hertil viste miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p, hvis nyreniveauer viste en signifikant forskel mellem SAMR1- og SAMP1-musene, betydelige forskelle mellem belastninger i serumet.
Denne protokol har følgende begrænsninger. For det første er dets anvendelighed ikke blevet verificeret i andre organer som lever og lunge, og for det andet er det ikke blevet testet på andre forsøgsdyr som rotter, hunde og svin. Flere forskergrupper har brugt denne protokol til oprensning og påvisning af miRNA'er ved qRT-PCR og rapporterede, at denne protokol muliggjorde oprensning af RNA af høj kvalitet fra væv og serum 13,14,22,23,24. Denne metode har vist sig at have høj nøjagtighed og følsomhed til påvisning af ekspression af miRNA'er 13,14,22,23,24. Den nuværende undersøgelses resultater viser, at denne protokol med succes kan detektere miRNA-ekspression i serum og nyre hos mus. Derfor kan protokollen bruges til at bestemme serum- og nyre-miRNA-ekspressionsprofilerne hos mus med en række patologier. På grund af protokollens enkelhed kan et stort antal prøver behandles samtidigt. Analyser af ekspressionen af mange miRNA'er i forskellige patologiske tilstande i nyrerne kan således anvende den protokol, der er beskrevet heri.
Der er visse aspekter af protokollen at huske på. For at undgå nedbrydning af de oprensede miRNA'er, der ville forekomme ved stuetemperatur, skal miRNA'erne opbevares på is. Nyreprøverne skal homogeniseres, indtil de er fuldstændigt opløst i lysisreagenset. Musenyre indeholder en betydelig mængde bindevæv, der er uopløseligt i lysisreagens, og der kræves derfor en søjlekværn til yderligere homogenisering. Derudover bør det passende endogene kontrol-miRNA (med stabil ekspression blandt prøverne) valideres under hele opsætningen af et qRT-PCR-eksperiment. Dette skyldes, at interferensen af forskellige stoffer under udførelsen af denne protokol kan ændre ekspressionsniveauerne for endogene kontrol-miRNA'er, hvilket muligvis kompromitterer resultaterne. Afslutningsvis beskriver dette papir en qRT-PCR-protokol til påvisning, oprensning og evaluering af miRNA-ekspression i serum og nyre hos mus med aldersafhængig nedsat nyrefunktion.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
- Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
- Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E.
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
- Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
- Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
- Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
- Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
- Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
- Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
- Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
- Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).
