Summary
加齢性腎機能障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を提示する。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、21〜25塩基からなる小さなノンコーディングRNAです。それらはタンパク質に翻訳されるのではなく、標的メッセンジャーRNA(mRNA)を不安定にし、翻訳を破壊することによって、それらの機能を妨げる働きをします。さまざまなマウスの臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルが調査されていますが、マウスの腎臓および血清miRNAを精製および定量するための標準的な方法はありませんでした。我々は、加齢性腎障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を抽出および評価するための有効かつ信頼性の高い方法を確立しました。
この方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を使用し、プロトコルには6つのステップが必要です:(1)老化加速マウス耐性1(SAMR1)マウスおよび老化加速マウス伏せ(SAMP1)マウスの準備。(2)これらのマウスから血清試料を抽出する工程;(3)各マウスから腎臓試料を抽出する工程;(4)各マウスの腎臓および血清サンプルからトータルRNA(miRNAを含む)を抽出する工程;(5)miRNAからの逆転写を伴う相補的DNA(cDNA)の合成;(6)得られたcDNAを用いてqRT-PCRを行う工程。
このプロトコルを使用して、対照と比較して、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が、加齢性腎障害のマウスモデルの腎臓および血清において有意に変化したことを確認した。このプロトコールはまた、加齢性腎障害のマウスモデルの腎臓と血清との関係を明らかにした。このプロトコルは、加齢依存性腎機能障害を有するマウスの腎臓および血清におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。
Introduction
生理機能と疾患(炎症、線維症、代謝障害、がんなど)の両方で重要な役割を果たす様々なmRNAの発現は、mRNA1の分解を引き起こして転写を阻害する短いノンコーディングRNAであるmiRNAによって制御されていることが知られています。したがって、特定のmiRNAがさまざまな疾患の新しい候補バイオマーカーおよび/または治療標的として役立つ可能性があります2,3,4,5。さまざまなマウスの臓器や組織(脳6、心臓7、肺8、肝臓9、腎臓10など)におけるmiRNA発現プロファイルに関する研究が行われています。しかし、加齢依存性腎障害を有するマウスの腎臓または血清中のmiRNAを抽出および評価するための標準的または確立された方法はありません。
そこで、加齢依存性腎機能障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を確実に精製および検出するために使用できるプロトコルを確立しました。プロトコルには6つの主要なステップがあります:(1)50週齢のSAMR1オスマウスとSAMP1オスマウスの両方の準備。(2)両系統のマウスの下大静脈から血液試料を抽出し、その後ヘパリンを含むスピッツ管を使用し、続いて遠心分離して、血清試料を得る工程;(3)マウスからの腎臓サンプル抽出-シリコンホモジナイザーを使用して腎臓サンプルを個別にホモジナイズし、サンプルをマイクロ遠心スピンカラム11上の生体高分子細断システムに移します。(4)シリカ膜ベースのスピンカラム12を用いた血清試料からのトータルRNA(miRNA含有)抽出、およびシリカ膜ベースのスピンカラム11を用いた腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNA抽出;(5)逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを用いた全RNAからの相補的DNA(cDNA)の合成13,14;(6)最後に、qRT-PCRおよびインターカレーティング色素を用いたmiRNA発現の測定13、14。
この新しいプロトコルは、さまざまな種類の組織でmiRNAを抽出して評価することに成功した研究に基づいていました11,12,13。プロトコルのバイオポリマーシュレッダーシステムは、組織から高品質のトータルRNAを精製できることが実証されました11。インターカレーティング色素を用いたqRT-PCRによるmiRNA発現の評価に使用されるこのプロトコルの側面の精度と感度は確立されており13,14、例えば、抽出された全RNAからの逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびoligo-dTプライマーによるcDNA合成。新しいプロトコルには、シンプルさ、時間の節約、技術的エラーの削減など、いくつかの利点があります。したがって、腎臓および血清miRNAプロファイルの正確で高感度な同定を必要とする調査に使用できます。多くの病理学的状態の研究も新しいプロトコルを利用することができます。
加齢性腎障害のモデルであるSAMP1マウスにおけるmiRNA発現プロファイルは、以下に示すように決定することができる。ヒトでは、加齢性腎障害は腎不全の進行に関連しており、腎間質線維症の領域の増加と糸球体硬化症の進行の両方を特徴としています15,16。加齢性腎障害も慢性腎臓病および末期腎疾患の重要かつ頻繁な特徴である15,16。
Protocol
実験プロトコルは、自治医科大学の動物倫理委員会によって承認され、自治医科大学実験動物ガイドおよびその実験動物の使用と管理に関するガイドラインに従って実施されました。このプロトコルは、4匹の50週齢のSAMR1オスマウスとSAMP1オスマウス(40〜45 g)を使用します。
1.血清サンプル収集
- 各マウスについて以下を準備します:1.0 mLシリンジ付き30 G針、ヘパリンを含む1.0 mLスピッツ遠心分離チューブ、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、イソフルラン麻酔薬、コルクシート、70%エタノール、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で湿らせた2つの綿棒、PBS、ピンセット、および外科用はさみを備えたペトリ皿。
- マウスを1.5%イソフルランで麻酔し、1.5%に維持する。鎮痛剤(メロキシカム5 mg / kg)を皮下投与し、1.0 mLの70%エタノールを腹部に注入し、コルクシートの仰臥位に置きます。.
- ペダル離脱反射の消失による麻酔深度を確認する。ピンセットと外科用ハサミで、腹部の皮膚を切開します。筋肉と腹膜を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。
- ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで腹膜の上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。
- PBSで湿らせた2本の綿棒を使用して、下大静脈を特定します。1.0 mLシリンジを含む30 G針の1本を下大静脈に挿入し、シリンジを引きます。溶血を避けるために、下大静脈から針をゆっくりと引き出します。血液をヘパリンと一緒に1.0mLスピッツチューブに移し、チューブを数回反転させて混合します。
注:マウスは頸部脱臼によって安楽死させられます。 - スピッツ管を室温(RT)で3,000 × g で10分間回転させます。
- 上清をゆっくりと吸引し、沈殿物が含まれていないことを確認してから、未使用の1.5mLマイクロ遠心チューブに移します。
- 使用前にチューブを-80°Cで保管してください。
注意: すぐにステップ3に進む場合は、チューブを-80°Cで保管する必要はありません。
2.腎臓サンプルの収集
- 各マウスについて、2.0 mLクライオチューブ、イソフルラン麻酔薬、コルクシート、70%エタノール、PBS付きペトリ皿、ピンセット、および外科用はさみを準備します。
- マウスを1.5%イソフルランで麻酔し、1.5%に維持する。鎮痛剤(メロキシカム5 mg / kg)を皮下投与し、1.0 mLの70%エタノールを腹部に注入し、コルクシートの仰臥位に置きます。.
- ペダル離脱反射の消失による麻酔深度を確認する。ピンセットと外科用ハサミを使用して、腹部の皮膚を切開します。筋肉と腹膜を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。
- ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで腹膜の上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。
- 左腎臓を特定します。腎臓が黄白色に変わるまで血管から血液を洗い流すためにPBSでそれを再流します。最初に外科用ハサミを使用して腎臓全体を切除し、左腎動脈と静脈を切断します。腎臓をペトリ皿に入れ、PBSで慎重に洗います。
注:マウスは頸部脱臼によって安楽死させられます。 - ピンセットと外科用ハサミを使用して、腎臓を10 mgのサンプルにカットします(10 mgは次のステップに適したサンプルサイズです)。腎臓の各サンプルを独自の2.0 mLクライオチューブに入れます。チューブのキャップを閉じます。
- 長期保存の場合は、各クライオチューブを液体窒素に移し、-80°Cで保存します。
3. 血清サンプルからの全RNA抽出
- 最初に次の項目を準備します:ボルテックスミキサー、フェノール/グアニジンベースの溶解試薬、80%エタノール、100%エタノール、100%クロロホルム、生体高分子スピンカラム(2.0 mL収集チューブ11内)、メンブレンアンカースピンカラム(2.0 mL収集チューブ11内)、洗浄バッファー#1(すなわち、グアニジンと100%エタノールを1:2の比率で含む洗浄バッファー)、洗浄バッファー#2(すなわち、 グアニジンと100%エタノールを1:4の比率で含む洗浄バッファー)、RNaseフリー水、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、および2.0 mLマイクロ遠心チューブ。
- まず、1.5 mLの微量遠心チューブに200 μLの血清サンプルを採取し、次に1,000 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。混合物を5秒間ボルテックスします。
- サンプルをRTで5分間インキュベートします。
- チューブ内の血清サンプルに200 μLのクロロホルムを加え、チューブキャップをしっかりと閉じます。チューブを15倍反転させて、クロロホルムと血清サンプルを混合します。
- 各サンプルをRTで3分間インキュベートします。次に、サンプルを4°Cで12,000 x gで15分間回転させます。
- ペレットを乱すことなく、300 μLの上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。450 μLの100%エタノールを加え、チューブを5秒間ボルテックスします。
注:以下のすべてのステップで、RNAとDNAを分離するためのメンブレンアンカースピンカラムを2.0 mLの収集チューブに入れて遠心分離します。 - 次に、700 μLのサンプルを取り出し、メンブレンアンカースピンカラムにロードして、キャップを閉じます。カラムをRTで8,000 × gで15秒間回転させ 、 上清をカラムに残します。収集チューブに残っているペレットを廃棄します。
- 血清/プラズマキットの一部である700 μLの洗浄バッファー#1( 材料表を参照)をメンブレンアンカースピンカラムに追加して、サンプルを完全に洗浄します。カラムキャップを閉じ、カラムを8,000 × gで15秒間RTで回転させ 、 上清をカラムに残します。収集チューブに残っているペレットを廃棄します。
- 微量塩を除去するには、500 μLの洗浄バッファー#2を取り、メンブレンアンカースピンカラムにロードします。カラムキャップを閉じた後、カラムをRTで8,000 × gで15秒間回転させ 、 上清をカラムに残します。 ペレットを収集チューブに廃棄します。
- 微量塩を除去するには、500 μLの80%エタノールを取り、膜固定スピンカラムにロードします。カラムキャップを閉じた後、カラムをRTで8,000 × gで15秒間回転させ 、 上清をカラムに残します。 ペレットを収集チューブに廃棄します。
- メンブレンアンカースピンカラムを再びRTで15,000 × gで5分間スピンします。
- メンブレンアンカースピンカラムを新しい1.5 mL収集チューブに移した後、14 μLのRNaseフリー水をカラムに加え、全RNAを溶解します。カラムキャップを閉じた後、チューブをRTに残した状態で5分間待ちます。 RTで15,000 × g でカラムを再度1分間回転させます。
- 使用前にサンプルと一緒にチューブを-80°Cで保管してください。
4.腎臓サンプルからの総RNAの抽出
- シリコンホモジナイザー、氷、ボルテックスミキサー、エタノール100%、クロロホルム100%、生体高分子スピンカラム(2.0 mL収集チューブ11)、メンブレンアンカースピンカラム(2.0 mL収集チューブ11)、フェノール/グアニジン系溶解試薬、洗浄バッファー#1(ステップ3.1と同じバッファー)、洗浄バッファー#2(ステップ3.1と同じバッファー) RNaseフリー水、1.5 mL マイクロ遠心チューブ、および 2.0 mL マイクロ遠心チューブ。
- 10 mgの腎臓サンプルをシリコンホモジナイザーに入れ、700 μLのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。
- ホモジナイザーをセットアップします。ホモジナイザーの乳棒を腎臓サンプルにそっと押し付けてひねり、サンプルを均質化します。腎臓サンプルがフェノール/グアニジンベースの溶解試薬で完全に均質になるまで、乳棒を押したりひねったりし続けます。
- さらに均質化するには、均質化したライセート(2.0 mL収集チューブ内)を取り、バイオポリマースピンカラムに移します。
- ホモジナイズしたライセートをRTで14,000 × g で3分間遠心分離し、沈殿したペレット全体を未使用の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移して沈殿したペレットを反転させます。
- ペレットをチューブ内の140μLのクロロホルムと混合します。次に、チューブキャップをしっかりと閉じます。チューブを15倍反転させて、ライセートとクロロホルムを混合します。
注意: クロロホルムはフードなしで安全に使用できます。 - サンプルをRTで2〜3分間インキュベートします。サンプルを4°Cで12,000 × gで15分間遠心分離します。
- 沈殿物を乱すことなく、上清(通常は~300 μL)を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。100%エタノールの1.5倍の容量(通常は~450μL)を追加します。混合物を5秒間ボルテックスします。
注:以下のすべてのステップで、RNAとDNAを分離するためのメンブレンアンカースピンカラムを2.0 mLの収集チューブに入れて遠心分離します。 - 700 μLのサンプルをメンブレンアンカースピンカラムの1つにロードします。キャップを閉じ、カラムを15,000 × g で15秒間遠心分離します。収集チューブに残っている沈殿したライセートを廃棄します。
- 700 μLの洗浄バッファー#1をスピンカラムに加え、完全に洗浄します。キャップを閉じ、カラムを15,000 × g で15秒間遠心分離します。収集チューブに残っている沈殿したライセートを廃棄します。
- 微量の塩を除去するには、500 μLの洗浄バッファー#2をメンブレンアンカースピンカラムにロードします。カラムキャップを閉じた後、カラムを15,000 × g で15秒間遠心分離します。沈殿したライセートを回収チューブに捨てます。
- 手順 4.11 を繰り返します。
- メンブレンアンカースピンカラムを15,000 × gで1分間遠心分離します。沈殿したライセートを回収チューブに捨てます。
- メンブレンアンカースピンカラムを取り、新しい1.5 mL収集チューブに移します。30 μLのRNaseフリー水をカラムに加え、全RNAを溶解します。カラムのキャップを閉じた後、チューブをRTにして5分間待ってから、15,000 × gで1分間遠心分離します。
- 総RNAを含むサンプルの全量を新しいマイクロ遠心チューブに移します。チューブを氷上に置き、分光光度法により総RNA濃度を測定します。総RNA濃度が~300-1,500 ng/μLであることを確認してください。
- サンプルの入ったチューブは、使用前に-80°Cで保管してください。
5. 血清中の全RNAの逆転写によるcDNAの合成
注:定量的リアルタイムPCR実験(MIQE)ガイドラインの公開に関する最小限の情報は、信頼できる明確な結果を得るために、より良い実験方法を使用することを推奨しています17。このプロトコルでは、cDNAは、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびoligo-dTプライマーを使用して2段階の手順で精製された全RNAから合成されます。
- 最初に次のものを準備します:ボルテックスミキサー、サーマルサイクラー、8ウェルストリップチューブ、各8ストリップチューブのキャップ、蒸留水、氷、溶融状態の逆転写酵素キット(材料表を参照)13,14、および1.5 mLマイクロ遠心チューブ。
- サーマルサイクラーを起動します。
- マスターミックス溶液を調製します。8ウェルストリップチューブあたり合計8.0 μLのマスターミックスを得るには、1.5 mLマイクロ遠心チューブに2.0 μLの逆転写酵素ミックス(キットに含まれています)と2.0 μLの10x核酸ミックスを4.0 μLの逆転写バッファーに加えます。
- 8.0 μLのマスターミックス溶液を8ウェルストリップチューブの各チューブに入れます。
- 8ウェルストリップチューブの各チューブに12 μLの総RNAアリコートを入れ、チューブのキャップを閉じます。チューブをRTで15秒間、2,000 × gで遠心分離します。
- チューブをサーマルサイクラーに入れ、37°Cで60分間インキュベートします。 サンプルを95°Cでさらに5分間インキュベートし、cDNAを合成します。
- インキュベーション後、cDNAを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。cDNAを蒸留水で10倍(1:10)に希釈します。チューブをRTで5秒間、2,000 × gでボルテックスして遠心分離します。
- 希釈したcDNAを一時的に氷上に保存します。希釈したサンプルは、使用前に-80°Cで保存してください。
6. 腎臓における全RNAの逆転写によるcDNAの合成
注:MIQEガイドラインは、信頼性が高く明確な結果を保証するために、より良い実験慣行を奨励しています17。このプロトコルは、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを使用して、1.0 μgの精製トータルRNAから2段階の手順でcDNAを合成します。
- まず、ボルテックスミキサー、サーマルサイクラー、1.5 mLマイクロ遠心チューブ、8ウェルストリップチューブ、各8ストリップチューブのキャップ、蒸留水、氷、および逆転写酵素キット(材料表を参照)を準備します13,14溶融状態。
- サーマルサイクラーを起動します。
- マスターミックス溶液を調製します。チューブあたり合計8.0 μLのマスターミックス溶液を得るには、キットに含まれている逆転写酵素ミックス2.0 μLと10x核酸ミックス2.0 μLを4.0 μLの逆転写バッファーに加えます。
- 8.0 μLのマスターミックス溶液を8ウェルストリップチューブの各チューブに加えます。
- 総RNA密度を以下のように調整する。腎臓サンプルから1.0 μgのトータルRNAを12 μLのRNaseフリー水で分離するには、適量のトータルRNAを取り、上記のように測定された濃度を使用して蒸留水に移します(ステップ4.15)。
注:DNA汚染の存在下では、汚染されたDNAはqRT-PCRによって共増幅されます。 - 上記の手順5.5.-5.8で説明したのと同じプロセスを実行します。
7. マイクロRNAのqRT-PCR
注:miRNAのqRT-PCRにはインターカレーター法が使用されます。プライマーはRNAに使用されます:U6小核2(RNU6-2)、miRNA-223-3p、miRNA-423-5p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5p。
- ボルテックスミキサー、リアルタイムPCRシステム、qRT-PCR用の96ウェル反応プレート、96ウェル反応プレート用接着フィルム、接着フィルムアプリケーター、96ウェル遠心分離機ローター、miRNA特異的プライマー、2x PCRマスターミックスおよび10xユニバーサルプライマーを含む緑色色素ベースのPCRキット(材料表を参照)13,14、 1.5mLの微量遠心チューブ。
- 1.5 mLの微量遠心チューブで混合した後、蒸留水6.25 μL、ヌクレアーゼフリー水に溶解した5 μM miRNAプライマー各1.25 μL、2x PCRマスターミックス12.5 μL、10xユニバーサルプライマー2.5 μLをボルテックスします。
- ステップ5(血清)またはステップ6(腎臓)に記載のように合成されたcDNAを調製し、融解する。cDNAをボルテックスして5秒間遠心分離します。
- 22.5 μLの試薬アリコート(上記のステップ7.2を参照)を取り、96ウェルプレートの各ウェルに別々に配置します。
- プレートの各ウェルに2.5 μLのcDNAアリコートを追加します。
- 粘着フィルムをプレートに固定するには、粘着フィルムアプリケーターを使用します。プレートを96ウェル遠心分離機ローターで1,000 x g で30秒間遠心分離します。各ウェルの底で反応を安定させます。
8.リアルタイムPCRシステムとソフトウェアを使用してPCRサイクリングプログラムを実行する
- リアルタイム PCR システムを開始します。手順7.6の説明に従って作成したプレートを配置します。リアルタイムPCRシステムで。設定を変更します。実験の名前を入力し、システムの実験タイプとして 96ウェル(0.2 mL)、 定量方法として 比較CT(ΔΔCT)、 システム実行モードとして 標準 、およびターゲット配列を検出するための試薬として SYBR Green Reagents を選択します。
- サンプルとターゲット miRNA の名前を指定し、各ウェルのサンプルとターゲット miRNA に名前を付けます。重複サンプルを割り当てて結果の確認に適したデータを取得し、参照サンプルと内在性コントロールを選択します。パッシブリファレンスとして使用する染料については、「 なし」を選択します。試薬のクロスコンタミネーションを排除するには、陰性の逆転写酵素とmiRNA発現の非テンプレートコントロールを設定します。
- 次に、反応量が 20 μL に設定され、PCRサイクル条件が次のように設定されていることを確認します:95°Cで15分間、次に94°Cで15秒間40サイクルの変性、55°Cで30秒間アニーリング、最後に70°Cで30秒間伸長します。
- システムのソフトウェアプログラムで[分析]をクリックして、プロセス完了後にqRT-PCRデータを 分析 します。プログラムによって自動的に選択された閾値線が各ウェルに適していることを確認します。
- 各サンプルで分析された内在性コントロールおよび標的miRNAの閾値サイクル(CT)値を確認します。増幅曲線と閾値線の交点によってCT値を決定する。
注:本研究では、RNU6-2およびmiRNA-423-5pを標的miRNA発現量の内在性コントロールとして使用し、ΔΔCT法を使用して各標的miRNA18の相対発現レベルを決定しました。
Representative Results
加齢性腎障害マウスモデルでは、体重40〜45gの50週齢SAMP1雄マウスを使用し、マウスあたり約0.8mLの血液を採取し、ヘパリンを入れた1.0mLスピッツチューブに移し、倒立させ、遠心分離した。各腎臓をPBSですすぎ、解剖し、さらなる分析のために液体窒素に保存しました。50週齢のSAMR1マウスが対照として役立った。この加齢性腎障害モデルを用いて得られたmiRNA qRT-PCRデータに基づいて、SAMP1マウスでは、対照と比較してmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが大幅に低下していることが観察されました(図1)。miRNA-7219-5pとmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルは、対照と比較してSAMP1マウスで有意に増加しました(図2)。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの系統でも、また腎臓と血清の間でも変化しませんでした(図1および図2)。
図1:SAMP1マウスの腎臓における発現差のあるマイクロRNA 。 SAMR1マウス(対照、n = 4)およびSAMP1マウス(n = 4)におけるmiRNA-223-3p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pの発現のqRT-PCR分析。データは標準誤差(エラーバー)±平均値です。 T検定は、グループ間の差を分析するために使用されました。p < 0.05は有意と見なされました(*P < 0.05)、N.S.:有意ではありません。略語:マイクロRNA =マイクロRNA;SAMP1 =老化加速マウスが起こりやすい;SAMR1 = 老化加速マウス抵抗性1;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SAMP1マウスの血清中の発現差のあるmiRNA 。 SAMR1マウス(対照、n = 4)およびSAMP1マウス(n = 4)におけるmiRNA-223-3p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pの発現のqRT-PCR分析。データはSE(エラーバー)±平均値です。 T検定は、群間の有意差を調べるために用いられた。*p < t検定で0.05。略語:マイクロRNA =マイクロRNA;SAMP1 =老化加速マウスが起こりやすい;SAMR1 = 老化加速マウス抵抗性1;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
標的miRNAの発現レベルは、qRT−PCRを用いた上述のプロトコルによって首尾よく決定された。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るための重要なステップです。qRT-PCRを実行する前にmiRNAの適切な品質を確認するには、分光光度法を使用して、260 nmの吸光度と280 nmの吸光度の比を決定する必要があります。qRT-PCRが予想される長さと融解温度の単一のPCR増幅を提供しない場合、またはモノモーダル融解曲線を提供する場合、DNA汚染が発生する可能性があり、および/または反応プレートの各ウェルにプライマーダイマーが存在する可能性があります。
MiRNA発現レベルは、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、リボヌクレアーゼ保護アッセイなど、qRT-PCR以外のいくつかの方法で評価できます。ただし、qRT-PCR法は、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイに必要なサンプル量よりも少ないサンプル量を必要とする、高感度、正確、単純、かつ再現性のある手順です19。マイクロアレイは数万個のmiRNAの発現を同時に測定できるため、候補となるmiRNAマーカーの同定に使用できます。マイクロアレイデータはまた、qRT−PCR20によって得られたデータと高い全体的な相関を示す。しかし、異なる研究で得られたマイクロアレイデータを比較するための最適な方法論に関してはコンセンサスに達していません21。
血清miRNAの評価には以下のような特徴があります。まず、血清の採取が容易であり、血清miRNAは凍結融解、温度、酸に対して安定であるため、miRNAは優れたバイオマーカーになり得ます。第二に、種間のmiRNAの高い相同性があり、動物実験の結果はヒトに容易に外挿されます。第三に、血清miRNAは治療薬としての可能性を示しています3。いくつかの研究はまた、臓器におけるmiRNAの発現レベルが血清中のmiRNAと相関していることを実証している22,23,24。本試験において、miRNA-223-3pは、腎臓レベルがSAMR1マウスとSAMP1マウスとの間に有意差を示さなかったが、血清中にも系統間有意差を示さなかった。対照的に、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pは、腎臓レベルがSAMR1マウスとSAMP1マウスの間で有意差を示したが、血清中にかなりの系統間差異を示した。
このプロトコルには、次の制限があります。第一に、その有用性は肝臓や肺などの他の臓器で検証されておらず、第二に、ラット、イヌ、ブタなどの他の実験動物ではテストされていません。いくつかの研究グループは、qRT-PCRによるmiRNAの精製と検出にこのプロトコルを使用し、このプロトコルが組織および血清からの高品質のRNAの精製を可能にすることを報告しました13,14,22,23,24。この方法は、miRNA13、14、22、23、24の発現を検出するための高い精度および感度を有することが実証されている。本研究の結果は、このプロトコルがマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を首尾よく検出できることを示しています。したがって、このプロトコルを使用して、さまざまな病状を持つマウスの血清および腎臓miRNA発現プロファイルを決定することができます。プロトコルがシンプルなため、多数のサンプルを同時に処理できます。腎臓の様々な病的状態における多くのmiRNAの発現の分析は、したがって、本明細書に記載のプロトコールを使用することができる。
覚えておくべきプロトコルの特定の側面があります。室温で起こる精製されたmiRNAの分解を避けるために、miRNAは氷上に保たれなければなりません。腎臓サンプルは、溶解試薬に完全に溶解するまで均質化する必要があります。マウス腎臓には、溶解試薬に不溶性の結合組織が大量に含まれているため、さらなる均質化にはカラムシュレッダーが必要です。さらに、適切な内因性コントロールmiRNA(サンプル間で安定した発現を有する)は、qRT-PCR実験のセットアップ全体を通して検証する必要があります。これは、このプロトコルの実行中のさまざまな物質の干渉が内因性コントロールmiRNAの発現レベルを変化させ、結果を損なう可能性があるためです。結論として、この論文は、加齢性腎機能障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現の検出、精製、および評価のためのqRT-PCRプロトコルについて述べる。
Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
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