Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת של ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63258
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

Summary

אנו מציגים שיטה להערכת ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך.

Abstract

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם רנ"א קטנים ולא מקודדים המורכבים מ-21-25 בסיסים. הם אינם מתורגמים לחלבונים אלא פועלים כדי לעכב את תפקודם של רנ"א שליח המטרה שלהם (mRNA) על ידי ערעור יציבותם ושיבוש התרגום שלהם. למרות שפרופילי ביטוי ה-miRNA באיברי עכברים שונים וברקמות שונות נחקרו, לא היו שיטות סטנדרטיות לטיהור וכימות של כליות עכברים ו-miRNAs בסרום. ביססנו שיטה יעילה ואמינה לחילוץ והערכה של ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.

השיטה משתמשת בתגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז (qRT-PCR), והפרוטוקול דורש שישה שלבים: (1) הכנת עכברי התנגדות עכברים מואצים 1 (SAMR1) ועכברי עכברים המואצים על ידי סנסנציה (SAMP1); (2) הפקת דגימות סרום מעכברים אלה; (3) הוצאת דגימת כליה מכל עכבר; (4) חילוץ RNA כולל (כולל miRNA) מדגימות כליות וסרום מכל עכבר; (5) סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) עם שעתוק הפוך מה-miRNA; (6) ביצוע qRT-PCR באמצעות ה-cDNA המתקבל.

פרוטוקול זה שימש כדי לאשר כי, בהשוואה לבקרים, הביטוי של miRNA-7218-5p ו- miRNA-7219-5p השתנה באופן משמעותי בכליות ובסרום של מודל עכבר של פגיעה כלייתית תלוית גיל. פרוטוקול זה גם הבהיר את הקשר בין הכליה לסרום של מודל העכבר של פגיעה כלייתית תלוית גיל. פרוטוקול זה יכול לשמש לקביעת ביטוי miRNA בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.

Introduction

ידוע כי הביטוי של mRNA שונים הממלאים תפקידים חשובים הן בפיזיולוגיה והן במחלות (למשל, דלקת, פיברוזיס, הפרעות מטבוליות וסרטן) מווסת על ידי miRNAs, שהם רנ"א קצרים ולא מקודדים הגורמים להתפרקות ומעכבים את שעתוק ה-mRNA1. ייתכן, אם כן, כי miRNAs מסוימים יכולים לשמש סמנים ביולוגיים מועמדים חדשים ו / או מטרות טיפוליות למחלות שונות 2,3,4,5. נערכו מחקרים על פרופילי ביטוי miRNA במגוון איברים ורקמות של עכברים (כולל מוח6, לב7, ריאה8, כבד9 וכליה10). עם זאת, אין שיטות סטנדרטיות או מבוססות לחילוץ והערכה של miRNAs בכליות או בסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.

לכן, קבענו פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לטהר ולזהות באופן אמין ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל. ישנם שישה שלבים עיקריים בפרוטוקול: (1) הכנה של עכברים זכרים SAMR1 בני 50 שבועות ועכברים זכרים SAMP1; (2) הפקת דגימות דם מהווריד הנבוב התחתון של שני זני העכברים, עם שימוש לאחר מכן בצינור שפיץ עם הפרין, ואחריו צנטריפוגה, כדי לקבל דגימת סרום; (3) מיצוי דגימת כליה מהעכברים - הומוגנייזר סיליקון משמש להומוגניזציה של דגימת הכליה בנפרד, ולאחר מכן הדגימה מועברת למערכת גריסת ביופולימרים על עמוד ספין מיקרוצנטריפוגה11; (4) סה"כ מיצוי RNA (המכיל miRNA) מדגימות הסרום תוך שימוש בעמודת ספין12 מבוססת ממברנת סיליקה וסך RNA המכיל מיצוי miRNA מדגימות הכליה תוך שימוש בעמודת ספין מבוססת קרום סיליקה11; (5) סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) מסך הרנ"א באמצעות טרנסקריפטאז הפוך, פולי(A) פולימראז ופריימר אוליגו-dT13,14; ו-(6) לבסוף, קביעת ביטוי miRNA באמצעות qRT-PCR וצבע אינטרקלציה13,14.

פרוטוקול חדש זה התבסס על מחקרים שהצליחו לחלץ ולהעריך miRNAs בסוגים שונים של רקמות11,12,13. מערכת גריסת הביופולימרים של הפרוטוקול הוכחה כבעלת יכולת לטהר RNA כולל באיכות גבוהה מרקמות11. הדיוק והרגישות של היבטים של פרוטוקול זה המשמשים להערכת ביטוי miRNA על ידי qRT-PCR עם צבע אינטרקלציה נקבעו13,14, לדוגמה, סינתזת cDNA עם טרנסקריפטאז הפוך, פולי(A) פולימראז ופריימרים oligo-dT מהרנ"א הכולל שחולץ. לפרוטוקול החדש מספר יתרונות: פשטות, חיסכון בזמן וצמצום טעויות טכניות. זה יכול, אם כן, לשמש לחקירות הדורשות זיהוי מדויק ורגיש של פרופילי miRNA כליות וסרום. מחקרים של מצבים פתולוגיים רבים יכולים גם הם להשתמש בפרוטוקול החדש.

פרופילי הביטוי miRNA בעכברי SAMP1, שהם מודל של פגיעה כלייתית תלוית גיל, ניתנים לקביעה כפי שמוצג להלן. אצל בני אדם, פגיעה כלייתית תלוית גיל קשורה להתקדמות של אי ספיקת כליות ומאופיינת הן על ידי עלייה באזור של פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי והן על ידי התקדמות של glomerulosclerosis15,16. פגיעה כלייתית תלוית גיל היא גם מאפיין חשוב ושכיח של מחלת כליות כרונית ומחלת כליות סופנית15,16.

Protocol

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ובוצע בהתאם למדריך האוניברסיטה הרפואית של ג'יצ'י לחיות מעבדה והנחיותיו בנוגע לשימוש וטיפול בחיות ניסוי. פרוטוקול זה משתמש בארבעה עכברים זכרים SAMR1 בני 50 שבועות ובעכברים זכרים SAMP1 (40-45 גרם).

1. איסוף דגימות בסרום

  1. הכינו את הדברים הבאים לכל עכבר: מחטי 30 G עם מזרק 1.0 מ"ל, צינור צנטריפוגה ספיץ 1.0 מ"ל עם הפרין, צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, הרדמה איזופלוראן, יריעת שעם, 70% אתנול, שני מקלוני צמר גפן טבולים בתמיסת מלח עם פוספט (PBS), צלחת פטרי עם PBS, פינצטה ומספריים כירורגיים.
  2. הרדמת העכבר עם 1.5% איזופלוראן ולשמור על 1.5%. לתת משכך כאבים (Meloxicam 5 מ"ג / ק"ג) תת עורית, ולאחר מכן להזריק 1.0 מ"ל של 70% אתנול לתוך הבטן שלה ומניחים אותו במצב שכיבה על יריעת הפקק.
  3. אשר את עומק ההרדמה על ידי היעלמות רפלקס נסיגת הדוושה. עם פינצטה ומספריים כירורגיים, לחתוך את העור של הבטן. חותכים את השרירים ואת קרום הצפק משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות.
  4. השתמש בפינצטה כדי להרים את קרום הצפק, ולעשות חתך לרוחב בקצה העליון של קרום הצפק עם מספריים כירורגי. ממשיכים את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות.
  5. זהה את הווריד הנבוב התחתון באמצעות שני מקלוני הכותנה הלחים של PBS. הכנס אחת ממחטי 30 G עם מזרק 1.0 מ"ל לתוך הווריד הנבוב התחתון ולאחר מכן למשוך את המזרק. משוך את המחט מתוך הווריד הנבוב התחתון באיטיות כדי למנוע המוליזה. העבר את הדם לצינור spitz 1.0 מ"ל עם הפרין ולאחר מכן לערבב אותו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
    הערה: העכבר מורדם על ידי נקע צוואר הרחם.
  6. סובב את צינור השפיץ בטמפרטורת החדר (RT), 3,000 × גרם למשך 10 דקות.
  7. שאפו את הסופרנטנט באיטיות, וודאו שהוא אינו מכיל משקעים, ולאחר מכן העבירו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל שאינו בשימוש.
  8. יש לאחסן את השפופרת בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש.
    הערה: אם ממשיכים לשלב 3 באופן מיידי, אין צורך לאחסן את הצינור בטמפרטורה של −80 °C.

2. איסוף דגימות כליה

  1. הכן את הדברים הבאים עבור כל עכבר: 2.0 mL cryotubes, הרדמה איזופלוראן, גיליון שעם, 70% אתנול, צלחת פטרי עם PBS, פינצטה, ומספריים כירורגיים.
  2. הרדמת העכבר עם 1.5% איזופלוראן ולשמור על 1.5%. לתת משכך כאבים (Meloxicam 5 מ"ג / ק"ג) תת עורית, ולאחר מכן להזריק 1.0 מ"ל של 70% אתנול לתוך הבטן שלה, ומניחים אותו במצב שכיבה על יריעת הפקק.
  3. אשר את עומק ההרדמה על ידי היעלמות רפלקס נסיגת הדוושה. השתמש בפינצטה ובמספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בעור הבטן. חותכים את השרירים ואת קרום הצפק משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות.
  4. השתמש בפינצטה כדי להרים את קרום הצפק ולבצע חתך לרוחב בקצה העליון של קרום הצפק עם מספריים כירורגיים. ממשיכים את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות.
  5. זהה את הכליה השמאלית. ריפלוקס זה עם PBS כדי לשטוף את הדם מן כלי הדם עד הכליה הופכת צבע צהבהב לבן. כלו את הכליה כולה תחילה באמצעות מספריים כירורגיים כדי לנתק את עורק הכליה השמאלי ואת הווריד. מניחים את הכליה בצלחת פטרי ושוטפים אותה בזהירות עם PBS.
    הערה: העכבר מורדם על ידי נקע צוואר הרחם.
  6. השתמש בפינצטה ובמספריים הכירורגיים כדי לחתוך את הכליה לדגימות של 10 מ"ג (10 מ"ג הוא גודל מדגם מתאים לשלב הבא). מניחים כל דגימה של הכליה ב cryotube 2.0 מ"ל משלה. סגור את מכסה הצינור.
  7. לאחסון לטווח ארוך, העבר כל cryotube לחנקן נוזלי ואחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס.

3. סה"כ מיצוי RNA מדגימת סרום

  1. הכינו תחילה את הפריטים הבאים: מערבל מערבולות, מגיב ליזיס על בסיס פנול/גואנידין, 80% אתנול, 100% אתנול, 100% כלורופורם, עמודות ספין ביופולימריות (בצינורות איסוף של 2.0 מ"ל 11), עמודי ספין מעוגנים בממברנה (בצינורות איסוף של 2.0 מ"ל11), חיץ כביסה #1 (כלומר, חיץ כביסה המכיל גואנידיןו-100% אתנול ביחס של 1:2), חיץ כביסה #2 (כלומר, חיץ רחצה המכיל גואנידין ו-100% אתנול ביחס של 1:4), מים ללא RNase, צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וצינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל.
  2. ראשית, קח דגימת סרום של 200 μL בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ולאחר מכן הוסף 1,000 μL של מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות.
  3. דגירה של הדגימה ב-RT למשך 5 דקות.
  4. הוסף 200 μL של כלורופורם לדגימת הסרום בצינור וסגור את מכסה הצינור בחוזקה. הפוך את הצינור פי 15 כדי לערבב את הכלורופורם ואת דגימת הסרום.
  5. כל דגימה דוגרת ב- RT למשך 3 דקות. לאחר מכן, סובב את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם.
  6. העבר את 300 μL של supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל מבלי להפריע לכדור. מוסיפים 450 μL של 100% אתנול, ומערבבים את הצינור במשך 5 שניות.
    הערה: בכל השלבים הבאים, מקם את עמודת הספין המעוגנת בממברנה להפרדת RNA ו- DNA בצינור איסוף של 2.0 מ"ל כדי לבצע צנטריפוגה.
  7. לאחר מכן, הסר 700 μL של הדגימה, לטעון אותו על עמוד ספין מעוגן ממברנה, ולסגור את הפקק. סובב את העמודה ב-RT במשך 15 שניות ב-8,000 × גרם, והשאר את הסופר-נאטנט בעמודה. השליכו את הכדור שנותר בצינור האיסוף.
  8. הוסף 700 μL של מאגר כביסה #1 המהווה חלק מהסרום/ערכת הפלזמה (ראה טבלת החומרים) לעמודת הספין המעוגנת בממברנה כדי לנקות את הדגימה ביסודיות. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה ב- RT למשך 15 שניות ב- 8,000 × גרם, והשאר את הסופר-נאטנט בעמודה. השליכו את הכדור שנותר בצינור האיסוף.
  9. להסרת מלחי קורט, קח 500 μL של מאגר לשטוף #2 ולטעון אותו על עמוד ספין מעוגן ממברנה. לאחר סגירת מכסה העמודה, סובב את העמודה ב- RT למשך 15 שניות ב- 8,000 × גרם, והשאר את ה- supernatant בעמודה. השליכו את הכדור בצינור האיסוף.
  10. להסרת מלחי קורט, לקחת 500 μL של 80% אתנול לטעון אותו על עמוד ספין מעוגן קרום. לאחר סגירת מכסה העמודה, סובב את העמודה ב- RT למשך 15 שניות ב- 8,000 × גרם, והשאר את ה- supernatant בעמודה. השליכו את הכדור בצינור האיסוף.
  11. סובב שוב את עמודת הספין המעוגנת בממברנה ב-RT למשך 5 דקות ב-15,000 × גרם.
  12. לאחר העברת עמודת הספין המעוגנת בממברנה לצינור איסוף חדש של 1.5 מ"ל, הוסיפו 14 מיקרון של מים נטולי RNase לעמודה כדי להמיס את הרנ"א הכולל. לאחר סגירת מכסה העמודה, המתן 5 דקות עם הצינור שנותר ב- RT. סובב את העמודה שוב למשך דקה אחת ב- 15,000 × גרם ב- RT.
  13. יש לאחסן את הצינורות עם דגימות בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש.

4. מיצוי סך הרנ"א מדגימת כליה

  1. הכינו תחילה את הפריטים הבאים: הומוגנייזר סיליקון, קרח, מערבל מערבולות, 100% אתנול, 100% כלורופורם, עמודות ספין ביופולימריות (בצינורות איסוף של 2.0 מ"ל 11), עמודי ספין מעוגנים בממברנה (בצינורות איסוף של 2.0 מ"ל11), ריאגנט ליזה מבוסס פנול/גואנידין, מאגר שטיפה #1 (אותו חיץ כמו שלב 3.1.), מאגר כביסה #2 (אותו חיץ כמו שלב 3.1.), מים ללא RNase, צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וצינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל.
  2. יש להניח דגימת כליה של 10 מ"ג בסיליקון הומוגנייזר, ולהוסיף 700 μL של מגיב ליזה על בסיס פנול/גואנידין.
  3. הגדר את ההומוגנייזר. לחצו בעדינות וסובבו את המזיק של ההומוגנייזר כנגד דגימת הכליה כדי ליצור הומוגניזציה של הדגימה. המשיכו ללחוץ ולסובב את המזיק עד שדגימת הכליה תהיה הומוגנית לחלוטין בריאגנט המבוסס על פנול/גואנידין.
  4. להומוגניזציה נוספת, קח את הליזאט ההומוגני (בצינור איסוף של 2.0 מ"ל) והעבר אותו לעמודת ספין ביופולימר.
  5. צנטריפוגה הליזאט ההומוגני ב-RT למשך 3 דקות ב-14,000 × גרם ולאחר מכן העברת כל הכדור המשופע לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל שאינו בשימוש כדי להפוך את הכדור המשופע
  6. מערבבים את הכדור עם 140 μL של כלורופורם בצינור; לאחר מכן, סגור את מכסה הצינור בחוזקה. הפוך את הצינור פי 15 כדי לערבב את הליזאט והכלורופורם.
    הערה: ניתן להשתמש בכלורופורם בבטחה ללא מכסה מנוע.
  7. דגירה של הדגימה ב-RT למשך 2-3 דקות. צנטריפוגה של הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב-12,000 × גרם.
  8. העבר את הסופר-נטנט (שהוא בדרך כלל ~ 300 μL) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל, מבלי להפריע למשקע. הוסף פי 1.5 מנפחו (שהוא בדרך כלל ~ 450 μL) של 100% אתנול. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות.
    הערה: בכל השלבים הבאים, מקם את עמודת הספין המעוגנת בממברנה להפרדת RNA ו- DNA בצינור איסוף של 2.0 מ"ל כדי לבצע צנטריפוגה.
  9. טען 700 μL של דגימה על אחד מעמודי הספין המעוגנים בממברנה. סגרו את המכסה וצנטריפוגה של העמודה ב-15,000 × גרם למשך 15 שניות. יש להשליך את הליזאט המשופע שנותר בצינור האיסוף.
  10. הוסף 700 μL של מאגר כביסה #1 לעמודת הסיבוב כדי לשטוף אותו ביסודיות. סגרו את המכסה וצנטריפוגה של העמודה ב-15,000 × גרם למשך 15 שניות. יש להשליך את הליזאט המשופע שנותר בצינור האיסוף.
  11. להסרת כמויות קורט של מלח, לטעון 500 μL של מאגר לשטוף #2 על עמוד ספין מעוגן ממברנה. לאחר סגירת מכסה העמודה, צנטריפוגה העמודה ב 15,000 × גרם במשך 15 שניות. השליכו את הליזאט המואץ בצינור האיסוף.
  12. חזור על שלב 4.11.
  13. צנטריפוגה עמודת ספין מעוגן קרום שוב במשך דקה אחת ב 15,000 × גרם. השליכו את הליזאט המואץ בצינור האיסוף.
  14. קח את עמוד הספין המעוגן בממברנה והעבר אותו לצינור איסוף חדש של 1.5 מ"ל. הוסיפו 30 μL של מים נטולי RNase לעמודה כדי להמיס את הרנ"א הכולל. לאחר סגירת מכסה העמודה, המתן 5 דקות עם הצינור ב- RT, ולאחר מכן צנטריפוגה של העמודה למשך דקה אחת ב- 15,000 × גרם.
  15. העבר את הנפח הכולל של הדגימה המכילה RNA כולל לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש. מניחים את הצינור על קרח, ומודדים את ריכוז הרנ"א הכולל על ידי ספקטרופוטומטריה. ודא שריכוז הרנ"א הכולל הוא ~300-1,500 ng/μL.
  16. יש לאחסן צינורות המכילים דגימות בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש.

5. סינתזה של cDNA עם שעתוק הפוך של סך RNA בסרום

הערה: המידע המינימלי לפרסום הנחיות כמותי לניסויי PCR בזמן אמת (MIQE) ממליץ להשתמש בשיטות ניסוי טובות יותר כדי להשיג תוצאות אמינות וחד-משמעיות17. בפרוטוקול זה, cDNA מסונתז מסך הרנ"א המטוהר בהליך דו-שלבי באמצעות טרנסקריפטאז הפוך, פולי(A) פולימראז ופריימרים oligo-dT.

  1. הכן תחילה את הדברים הבאים: מערבל מערבולות, מחזור תרמי, צינורות רצועה של שמונה בארות, המכסה של כל צינור בעל שמונה רצועות, מים מזוקקים, קרח, ערכת הטרנסקריפטאז ההפוכה (ראה טבלת החומרים)13,14 במצב המומס, וצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הפעל את מחזור תרמי.
  3. הכן את פתרון תערובת האב; כדי לקבל סך של 8.0 μL של תערובת מאסטר לכל צינור רצועה של שמונה בארות, הוסף 2.0 μL של תערובת טרנסקריפטאז הפוכה (כלולה בערכה) ו-2.0 μL של תערובת של 10x חומצות גרעין ל-4.0 μL של חיץ שעתוק הפוך בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  4. הנח 8.0 μL של תמיסת תערובת האב בכל צינור של צינור רצועה שמונה בארות.
  5. מניחים 12 μL aliquot של RNA כולל בכל צינור של צינור רצועת שמונה בארות, ולסגור את מכסה הצינור. צנטריפוגה של הצינור במשך 15 שניות ב- RT ו- 2,000 × גרם.
  6. מניחים את הצינור במחזור התרמי ודוגרים במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. דגירה של הדגימה למשך 5 דקות נוספות ב-95 מעלות צלזיוס דקה כדי לסנתז את ה-cDNA.
  7. לאחר הדגירה, העבירו את ה-cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל. יש לדלל את ה-cDNA פי עשרה (1:10) במים מזוקקים. מערבולת וצנטריפוגה של הצינור במשך 5 שניות ב-RT ו-2,000 × גרם.
  8. אחסנו את ה-cDNA המדולל באופן זמני על קרח. יש לאחסן את הדגימות המדוללות בטמפרטורה של −80°C לפני השימוש.

6. סינתזה של cDNA עם שעתוק הפוך של RNA הכולל בכליות

הערה: הנחיות MIQE מעודדות שיטות ניסוי טובות יותר כדי להבטיח תוצאות אמינות וחד משמעיות17. פרוטוקול זה משתמש ב-reverse transcriptase, poly(A) polymerase ו-oligo dT פריימרים כדי לסנתז cDNA מ-1.0 מיקרוגרם של רנ"א מטוהר בהליך דו-שלבי.

  1. ראשית, הכינו את הדברים הבאים: מערבל מערבולות, מחזור תרמי, צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, צינורות רצועה של שמונה בארות, המכסה של כל צינור בעל שמונה רצועות, מים מזוקקים, קרח וערכת טרנסקריפטאז הפוכה (ראו טבלת חומרים)13,14 במצב מומס.
  2. הפעל את מחזור תרמי.
  3. הכן את פתרון תערובת האב; כדי לקבל סך של 8.0 μL של תמיסת תערובת מאסטר לכל צינור, הוסף 2.0 μL של תערובת transcriptase הפוכה הכלולה בערכה ו 2.0 μL של תערובת חומצת גרעין 10x ל 4.0 μL של חיץ שעתוק הפוך.
  4. הוסף 8.0 μL של תמיסת תערובת האב לכל צינור של צינור רצועה שמונה בארות.
  5. התאם את צפיפות הרנ"א הכוללת באופן הבא. להפרדת 1.0 מיקרוגרם של RNA כולל מדגימת כליה עם 12 μL של מים נטולי RNase, קח כמות מתאימה של RNA כולל והעבר אותו למים מזוקקים באמצעות הריכוז שנמדד כמתואר לעיל (בשלב 4.15.).
    הערה: בנוכחות זיהום דנ"א, הדנ"א המזוהם מוגבר במשותף על-ידי qRT-PCR.
  6. בצע את אותו התהליך המתואר לעיל בשלבים 5.5.-5.8.

7. qRT-PCR של miRNA

הערה: שיטת אינטרקלטור משמשת עבור qRT-PCR של miRNAs. פריימרים משמשים לרנ"א: U6 גרעיני קטן 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p ו- miRNA-7219-5p.

  1. הכן את הדברים הבאים: מערבל מערבולות, מערכת PCR בזמן אמת, צלחת תגובה 96 בארות עבור qRT-PCR, סרט דבק עבור צלחת התגובה 96-well, אפליקטור סרט דבק, רוטור צנטריפוגה 96-well, פריימרים ספציפיים miRNA, ערכת PCR מבוססת צבע ירוק המכילה 2x PCR מאסטר תערובת ו 10x פריימר אוניברסלי (ראה טבלת החומרים)13,14, וצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. מערבולות את הדברים הבאים לאחר ערבובם בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל: 6.25 μL של מים מזוקקים, 1.25 μL כל אחד של 5 μM miRNA פריימר מומס במים נטולי נוקלאז, 12.5 μL של 2x PCR תערובת מאסטר, ו 2.5 μL של 10x פריימר אוניברסלי.
  3. הכינו והמיסו את ה-cDNA המסונתז כמתואר בשלב 5 (סרום) או שלב 6 (כליות). מערבולת וצנטריפוגה של ה-cDNA במשך 5 שניות.
  4. קח 22.5 μL aliquots של מגיב (כמתואר בשלב 7.2. לעיל) ולהניח אותם בנפרד בכל באר של צלחת 96 באר.
  5. הוסף 2.5 μL aliquot של cDNA לכל באר של הצלחת.
  6. כדי להצמיד את סרט ההדבקה לצלחת, השתמש באפליקטור סרט הדבקה. צנטריפוגה את הצלחת במשך 30 שניות ב 1,000 x גרם ברוטור צנטריפוגה 96 באר. ייצוב התגובה בתחתית כל באר.

8. שימוש במערכת ותוכנת PCR בזמן אמת להפעלת תוכנית מחזור PCR

  1. התחל את מערכת ה-PCR בזמן אמת. הנח את הצלחת שנוצרה כמתואר בשלב 7.6. במערכת PCR בזמן אמת. שנה את ההגדרות; ספק שם לניסוי, ולאחר מכן בחר 96-well (0.2 מ"ל ) כסוג הניסוי של המערכת, CT השוואתי (ΔΔCT) כשיטת הכמות, סטנדרטי כמצב הפעלת המערכת, וריאגנטים ירוקים של SYBR כריאגנטים לזיהוי רצף המטרה.
  2. ספק שמות עבור הדגימה ועבור miRNAs היעד, ותן שם לדגימה ול- miRNA היעד בכל באר. הקצה דגימות כפולות כדי לקבל נתונים המתאימים לאישור התוצאות, ובחר דגימת ייחוס ואת הבקרה האנדוגנית. כדי שהצבע ישמש כהפניה הפסיבית, בחר ללא. כדי למנוע זיהום צולב מגיב, הגדר טרנסקריפטאז הפוך שלילי ובקרה שאינה תבנית לביטוי miRNA.
  3. לאחר מכן, ודא שנפח התגובה מוגדר ל - 20 μL ותנאי מחזור ה- PCR מוגדרים כדלקמן: 95 ° C למשך 15 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב- 94 ° C למשך 15 שניות, חישול ב- 55 ° C למשך 30 שניות, ולבסוף הארכה ב- 70 ° C למשך 30 שניות.
  4. לחץ על נתח בתוכנת המערכת כדי לנתח את נתוני qRT-PCR לאחר השלמת התהליך. ודא ששורת הסף שנבחרה באופן אוטומטי על-ידי התוכנית מתאימה לכל באר.
  5. בדוק את ערך מחזור הסף (CT) של הבקרה האנדוגנית ואת miRNAs היעד שנותחו בכל דגימה. קבע את ערכי ה- CT לפי ההצטלבות של עקומת ההגברה וקו הסף.
    הערה: במחקר הנוכחי, RNU6-2 ו- miRNA-423-5p שימשו כבקרות אנדוגניות עבור רמות ביטוי miRNA מטרה, ושיטת ΔΔCT שימשה כדי לקבוע את רמות הביטוי היחסיות של כל miRNA מטרה18.

Representative Results

עבור מודל עכברי הפגיעה הכלייתית תלוי הגיל, השתמשנו בעכברים זכרים SAMP1 בני 50 שבועות במשקל 40-45 גרם. כ-0.8 מ"ל דם נאסף לכל עכבר והועבר לצינור שפיץ של 1.0 מ"ל עם הפרין, הפוך וצנטריפוגה. כל כליה נשטפה ב-PBS, נותחה ואוחסנה בחנקן נוזלי לצורך ניתוח נוסף. עכברי SAMR1 בני חמישים שבועות שימשו כבקרה. בהתבסס על נתוני miRNA qRT-PCR שהתקבלו באמצעות מודל זה של פגיעה כלייתית תלוית גיל, ראינו שרמת הכליות של miRNA-7219-5p עלתה באופן משמעותי ורמת הכליות של miRNA-7218-5p ירדה במידה ניכרת בעכברי SAMP1 בהשוואה לבקרים (איור 1). רמות ה-miRNA-7219-5p וה-miRNA-7218-5p בסרום היו גבוהות משמעותית בעכברי SAMP1 בהשוואה לבקרים (איור 2). רמות הביטוי של miRNA-223-3p לא השתנו באף אחד מהזנים ובין הכליות לסרום (איור 1 ואיור 2).

Figure 1
איור 1: מיקרו-רנ"א המתבטא באופן דיפרנציאלי בכליות של עכברי SAMP1. ניתוח qRT-PCR של הביטוי של miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p ו-miRNA-7219-5p בעכברי SAMR1 (בקרה, n = 4) ובעכברי SAMP1 (n = 4). הנתונים ממוצעים ± שגיאת תקן (קווי שגיאה); מבחני t שימשו לניתוח הבדלים בין קבוצות; p < 0.05 נחשב משמעותי (*p < 0.05), n.s.: לא משמעותי. קיצורים: miRNA = מיקרו-רנ"א; SAMP1 = עכבר מואץ מואץ; SAMR1 = התנגדות עכבר מואצת סנסנציה 1; qRT-PCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: miRNAs המתבטאים באופן דיפרנציאלי בסרום של עכברי SAMP1. ניתוח qRT-PCR של הביטוי של miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p ו-miRNA-7219-5p בעכברי SAMR1 (בקרה, n = 4) ובעכברי SAMP1 (n = 4). הנתונים ממוצעים ± SE (קווי שגיאה); מבחני T שימשו כדי לחקור הבדלים משמעותיים בין קבוצות. *P < 0.05 על ידי T-test. קיצורים: miRNA = מיקרו-רנ"א; SAMP1 = עכבר מואץ מואץ; SAMR1 = התנגדות עכבר מואצת סנסנציה 1; qRT-PCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

רמות הביטוי של miRNAs היעד נקבעו בהצלחה על ידי הפרוטוקול המתואר לעיל באמצעות qRT-PCR. הערכת ה-miRNAs שחולצו היא שלב חשוב בהשגת נתוני qRT-PCR משמעותיים. כדי לאשר את האיכות הנאותה של miRNAs לפני ביצוע qRT-PCR, יש להשתמש בספקטרופוטומטריה כדי לקבוע את יחס הספיגה ב-260 ננומטר לזה שב-280 ננומטר. זיהום דנ"א עלול להתרחש, ו/או דימרים ראשוניים בכל באר של לוחית התגובה עשויים להיות נוכחים אם qRT-PCR אינו מספק הגברה אחת של PCR של האורך הצפוי וטמפרטורת ההיתוך, או אם הוא מספק עקומת התכה מונומודלית.

ניתן להעריך את רמות הביטוי של MiRNA במספר שיטות שאינן qRT-PCR, כולל כתם צפוני, מיקרו-מערך ומבחני הגנה על ריבונוקלאז. עם זאת, שיטת qRT-PCR היא הליך רגיש, מדויק, פשוט וניתן לשחזור הדורש נפח דגימה קטן יותר מאלו הנדרשים למבחני הגנה מפני כתמים צפוניים וריבונוקלאז19. מאחר שמיקרו-מערכים יכולים למדוד את הביטוי של עשרות אלפי miRNAs בו-זמנית, ניתן להשתמש בהם כדי לזהות סמני miRNA מועמדים. נתוני Microarray מראים גם מתאם כולל גבוה עם נתונים המתקבלים על ידי qRT-PCR20. עם זאת, לא הושגה הסכמה לגבי המתודולוגיה האופטימלית להשוואת נתוני מיקרו-מערך שהתקבלו במחקרים שונים21.

ההערכה של miRNAs בסרום יש את התכונות הבאות. ראשית, קל לאסוף סרום, וכיוון ש-miRNAs בסרום יציבים נגד הקפאה והפשרה, טמפרטורה וחומצה, ה-miRNAs יכולים להיות סמנים ביולוגיים טובים. שנית, יש הומולוגיה גבוהה של miRNAs בין מינים, ותוצאות ניסויים בבעלי חיים ניתנות לאקסטרפולציה בקלות לבני אדם. שלישית, miRNAs בסרום הראו פוטנציאל לשימוש כתרופות טיפוליות3. מספר מחקרים הראו גם כי רמת הביטוי של miRNA באיברים מתואמת עם miRNA בסרום 22,23,24. במחקר הנוכחי, miRNA-223-3p, שגם רמות הכליות שלו לא הראו הבדל משמעותי בין עכברי SAMR1 ו-SAMP1, לא הראו הבדל משמעותי בין הזנים בסרום. לעומת זאת, miRNA-7218-5p ו-miRNA-7219-5p, שרמות הכליות שלהן הראו הבדל משמעותי בין עכברי SAMR1 ו-SAMP1, הראו הבדלים ניכרים בין הזנים בסרום.

לפרוטוקול זה יש את המגבלות הבאות. ראשית, התועלת שלו לא אומתה באיברים אחרים כגון הכבד והריאות, ושנית, הוא לא נבדק על חיות מעבדה אחרות כגון חולדות, כלבים וחזירים. מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקול זה לטיהור וזיהוי של miRNAs על ידי qRT-PCR ודיווחו כי פרוטוקול זה איפשר טיהור של RNA באיכות גבוהה מרקמות וסרום 13,14,22,23,24. שיטה זו הוכחה כבעלת דיוק ורגישות גבוהים לאיתור ביטוי של miRNAs 13,14,22,23,24. תוצאות המחקר הנוכחי מראות כי פרוטוקול זה יכול לזהות בהצלחה ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים. לכן, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לקבוע את פרופילי הביטוי miRNA בסרום ובכליות בעכברים עם מגוון פתולוגיות. בשל פשטות הפרוטוקול, ניתן לעבד מספר רב של דגימות בו זמנית. ניתוחים של ביטוי של miRNAs רבים בתנאים פתולוגיים שונים של הכליה יכול, ובכך, להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן.

ישנם היבטים מסוימים של הפרוטוקול שיש לזכור. כדי למנוע את ההתפרקות של ה-miRNAs המטוהרים שיתרחשו בטמפרטורת החדר, יש לשמור את ה-miRNAs על קרח. דגימות הכליות חייבות להיות הומוגניות עד שהן מומסות לחלוטין במגיב התזה. כליות עכבר מכילות כמות משמעותית של רקמת חיבור שאינה מסיסה במגיב תזה, ולכן נדרשת מגרסת עמודים להמשך הומוגניזציה. בנוסף, יש לאמת את miRNA הבקרה האנדוגנית המתאימה (עם ביטוי יציב בין הדגימות) לאורך כל ההתקנה של ניסוי qRT-PCR. הסיבה לכך היא שהתערבות של חומרים שונים במהלך הביצועים של פרוטוקול זה יכולה לשנות את רמות הביטוי של miRNAs בקרה אנדוגנית, ואולי לפגוע בתוצאות. לסיכום, מאמר זה מתאר פרוטוקול qRT-PCR לזיהוי, טיהור והערכה של ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

ללא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.0 mL spitz with heparin Greiner-bio-one 450534
Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) Qiagen 79216 Wash buffer 2
Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) Qiagen 1067933 Wash buffer 1
MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR Thermo Fisher Scientific 4316813 96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific 4311971 Adhesive film for 96-well reaction plate
miRNA-223-3p primer Qiagen MS00003871 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU
G-3'
miRNA-423-5p primer Qiagen MS00012005 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU
UU-3'
miRNA-7218-5p primer Qiagen MS00068067 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG
-3'
miRNA-7219-5p primer Qiagen MS00068081 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA
GA-3'
miRNeasy Mini kit Qiagen 217004 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
miRNeasy Serum/Plasma kit Qiagen 217184 Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube
miScript II RT kit (reverse transcription buffer) Qiagen 218161 Reverse transcriptase kit
miScript SYBR Green PCR kit Qiagen 218073 Green dye-based PCR kit
QIA shredder Qiagen 79654 Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube
QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) Qiagen 79306 Phenol/guanidine-based lysis reagent
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. Thermo Fisher Scientific 4472380 Real-time PCR instrument software
RNase-free water Qiagen 129112
RNU6-2 primer Qiagen MS00033740 Not disclosed due to confidentiality
SAMP1 male mice Nippon SLC Corporation Not assigned
SAMR1 male mice Nippon SLC Corporation Not assigned
Takara biomasher standard Takara Bio 9790B Silicon homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
  2. Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
  3. Lu, T. X., Rothenberg, M. E. MicroRNA. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).
  4. McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
  5. Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
  6. Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
  7. Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
  8. Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
  9. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
  10. Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
  11. Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
  12. Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
  13. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
  14. Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
  15. Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
  16. Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
  17. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  18. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  19. Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
  20. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
  22. Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
  23. Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
  24. Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).

Tags

גנטיקה גיליון 182 ביולוגיה מולקולרית מיקרו-רנ"א דנ"א משלים פגיעה כלייתית תלוית גיל כליות סרום qRT-PCR
הערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת של ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H.,… More

Yanai, K., Kaneko, S., Ishii, H., Aomatsu, A., Ishibashi, K., Morishita, Y. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment. J. Vis. Exp. (182), e63258, doi:10.3791/63258 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter